用于细胞治疗的可植入装置及相关方法

优先权要求

本申请要求2018年9月27日提交的美国临时申请号62/737,835以及 2019年3月27日提交的美国临时申请号62/824,768的优先权。将前述申请中的每一个的披露内容通过引用以其全文并入本文。

序列表

本申请含有一份已经以ASCII格式电子递交的序列表并且将该序列表通过引用以其全文特此结合。所述ASCII副本创建于2019年9月20日，名为S2225-7026WO_SL且大小是213,209字节。

背景技术

通过植入经工程化以生产能够治疗慢性和遗传性疾病的治疗物质的细胞来治疗此类疾病具有令人兴奋的、改善患有此类疾病的患者的健康的潜力。为了完全实现这一潜力，必须保护植入的细胞免受患者的免疫应答，使其保持活力，并且植入的细胞还必须能够在数周、数月甚至更长的时间内产生治疗水平的所需治疗物质。一种用于进行此类细胞疗法的探索性方法是将工程化细胞包封到半透性装置(例如水凝胶胶囊)中，其目的是使装置结构将细胞与免疫系统细胞隔离，同时允许营养物质进入细胞且使产生的治疗物质离开细胞。需要改进这种通用方法，以实现可植入装置中所容纳的活细胞的存活力和/或生产力的增加。

发明内容

本文披露了一种装置，所述装置包括(i)至少一个细胞容纳隔室，所述细胞容纳隔室包含含有第一细胞结合物质(CBS)的聚合物组合物，以及多个细胞。在实施例中，聚合物组合物包含与第一CBS相同或不同的一种或多种另外的细胞结合物质。在实施例中，细胞容纳隔室中一种或多种细胞结合物质的量是在体外(例如，当在细胞培养基中孵育装置时)或体内(例如，当将装置植入或以其他方式施用于测试受试者时)有效增加细胞的存活力和 /或增加细胞的生产力的量。

在实施例中，CBS是细胞结合肽(CBP)或细胞结合多肽(CBPP)。在实施例中，CBS包含经由接头共价附接到聚合物分子上的CBP(“CBP-聚合物”)。在实施例中，CBS包含无接头的、共价附接到聚合物分子上的CBP。在实施例中，细胞容纳隔室中的聚合物组合物包含一种或多种另外的CBP- 聚合物，所述CBP-聚合物包含不同的细胞结合肽，所述细胞结合肽共价附接到与第一CBP-聚合物中存在的聚合物相同或不同类型的聚合物。在实施例中，本文所述的包封在装置中的细胞，相比于当包封在缺少细胞结合肽的、基本上类似的装置(即，CBS无效参比胶囊或颗粒，如本文定义的)中时，植入后在一个或多个时间点表达高至少1.25倍、1.5倍、2倍、5倍、8倍、或10倍的量的治疗剂。

本文描述了用于在本披露装置中使用的多种细胞结合肽。在实施例中，细胞结合肽长度为40个氨基酸或更少(例如，35、30或更少)或25个氨基酸或更少(例如，20、15、10或更少)并且包含用于细胞粘附分子(CAM) 的配体的细胞结合序列。在实施例中，细胞结合肽基本上由本文表1中所示的细胞结合序列组成。在实施例中，细胞结合序列是RGD(SEQ IDNO:43) 或RGDSP(SEQ ID NO:59)。在实施例中，细胞结合肽的氨基端经由氨基酸接头共价附接到聚合物。在实施例中，接头中的氨基酸是非手性的。在实施例中，氨基酸接头基本上由一至三个甘氨酸残基或一至三个β-丙氨酸残基组成。在实施例中，细胞结合肽基本上由RGD(SEQ ID NO:43)或RGDSP (SEQ ID NO:59)组成并且接头基本上由单个甘氨酸残基或单个β-丙氨酸残基组成。

在一方面，第一CBP-聚合物中的聚合物是多糖或其他水凝胶形成聚合物。在实施例中，第二CBP-聚合物以及存在的任何其他CBP-聚合物中的聚合物也是水凝胶形成聚合物。在一些实施例中，细胞容纳隔室中的每种CBP- 聚合物中的水凝胶形成聚合物是多糖。在一些实施例中，细胞容纳隔室中的每种CBP-聚合物中的水凝胶形成聚合物是藻酸盐。在一些实施例中，每种 CBP-聚合物中的藻酸盐分子量为大于75kDa(例如，75kDa至250kDa)并且G:M比为大于或等于1.5。

在实施例中，存在于第一隔室中(例如，在用于形成第一隔室的聚合物溶液中)的每种CBP-聚合物具有的细胞结合肽密度(通过燃烧分析(例如，如本文实例1中所述的)测量的％氮)为至少约0.05％氮(例如，约0.1％、 0.2％和0.3％氮)或在约0.05％、0.1％、0.2％和0.3％氮中的任一种(作为下限值)和4％、3％、2％和1％氮(作为上限值)中的任一种之间的范围内。在实施例中，第一隔室中的CBP-聚合物是经GRGDSP(SEQ ID NO:60)共价修饰的藻酸盐，其近似分子量为75kDa至150kD、G:M比≥1.5。

在其他实施例中，在第一隔室中(例如，在用于形成第一隔室的聚合物溶液中)每种CBP-聚合物(例如，GRGDSP-藻酸盐)中的接头-RGD部分 (例如，GRGDSP(SEQ ID NO:60))的密度通过定量肽缀合测定，例如通过本文所述的定量肽缀合测定来测量。在实施例中，细胞是工程化ARPE-19 细胞，CBP-聚合物中的接头-RGD部分是GRGDSP(SEQ ID NO:60)，该聚合物是具有75kDa至150kDa的近似分子量和G:M比≥1.5的藻酸盐(例如藻酸钠)，并且测量的缀合密度表示为微摩尔GRGDSP(SEQ ID NO:60)/g 溶液(例如盐溶液)中的GRGDSP-藻酸盐，溶液粘度为80-120cP。在实施例中，这样的GRGDSP-藻酸盐溶液(MMW-Alg，G:M比≥1.5)的缀合密度是约0.1至1.0微摩尔/g或约0.2至约0.8、约0.3至约0.7或约0.3至约 0.6微摩尔/g中的任一个。在实施例中，工程化ARPE-19细胞包括FVIII BDD 蛋白的外源编码序列，例如SEQ ID NO:15。在实施例中，外源编码序列可操作地连接至启动子序列，例如，SEQ IDNO:26的核苷酸337-2069。

在实施例中，细胞容纳隔室还包含与CBP-聚合物中的聚合物相同或不同的、未修饰的水凝胶形成聚合物。在实施例中，CBP-聚合物和未修饰的聚合物两者都是藻酸盐，其分子量为75kDa(例如，75kDa至150kDa)并且 G:M比为大于或等于1.5。

细胞容纳隔室中的多个细胞(例如，活细胞)(例如，活的细胞)可以作为单细胞、细胞簇(例如，作为球状体)存在或附着于微载体。在一些实施例中，第一隔室中的多个活细胞是至少100、250、500、750、1,000、2,500、 5,000、10,000、25,000、或50,000个细胞。在实施例中，多个包括衍生自细胞系并被工程化为表达治疗剂的细胞。在实施例中，细胞系是内皮、上皮、成纤维细胞、角质形成细胞或间充质细胞系，例如本文表5中列出的可商购的细胞系。在实施例中，多个细胞是工程化视网膜色素上皮(RPE细胞)，例如，从ARPE-19细胞系工程化的细胞。在一些实施例中，多个细胞能够表达治疗剂，例如，当装置植入受试者中时。

在一方面，由多个细胞表达的治疗剂是生物或化学分子(例如，核酸、多肽、脂质、糖或小分子)，其在将装置植入受试者(例如人)中时能够直接或间接地赋予治疗益处。在实施例中，治疗剂是由细胞分泌的蛋白质，并且其替代或增加受试者中缺失或缺乏的内源性蛋白质，例如，改善血友病患者的血液凝结的凝血蛋白或介导有毒代谢物的清除(否则该代谢物会在体内积累)的酶。在另一个实施例中，治疗剂是细胞分泌的物质，其执行或介导对受试者产生治疗益处的功能，例如抑制性RNA分子，该抑制性RNA分子抑制受试者中内源性细胞表达一种或多种蛋白质以产生治疗益处。在一些实施例中，该治疗剂是例如有用于治疗受试者中的凝血障碍或溶酶体贮积病的替代疗法或替代蛋白。在一些实施例中，治疗剂是可用于治疗凝血障碍的多肽，例如因子VIII蛋白或其变体、因子IX蛋白或其变体或因子VII蛋白或其变体。

在一些实施例中，该装置还包括至少一种用于减轻异物反应(FBR)的器件，例如，当将该装置植入受试者体内或之上时，减轻FBR。本文描述了该装置的用于减轻FBR的多种器件。在实施例中，用于减轻FBR的器件包含球形和线性尺寸的组合，例如，直径为至少1毫米(mm)，例如约1.25mm、约1.5mm、约2.0mm、约2.5mm、约3.0mm。在实施例中，器件包括由环绕细胞容纳隔室的生物相容性聚合物形成的屏障隔室，以及任选地由环绕该屏障隔室的生物相容性聚合物形成的第三隔室，以在第一隔室的细胞和受试者的免疫系统之间提供附加的生物相容性物理屏障。在实施例中，生物相容性聚合物是藻酸盐。

在另一个实施例中，用于减轻FBR的器件包含减轻FBR的化合物，例如，本文所述的去纤维化(afibrotic)化合物。在实施例中，去纤维化化合物被布置在该装置的外表面上。在另一个实施例中，器件包括环绕第一隔室并且包含经去纤维化化合物共价修饰的聚合物(“去纤维化聚合物”，如本文定义的)的屏障隔室。在一些实施例中，去纤维化化合物共价附接到装置外表面并且附接到屏障隔室内的聚合物，并且任选地附接到细胞容纳隔室内的聚合物。在实施例中，屏障隔室包含与去纤维化聚合物中的聚合物相同或不同的、未修饰的聚合物。

在实施例中，去纤维化化合物是具有式(I)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中变量A、L

在一方面，本披露的装置是两隔室水凝胶胶囊(例如，微胶囊(直径小于1mm)或毫胶囊(millicapsule，直径至少1mm))，其中包含多个细胞(例如，活细胞)和一个或多个CBP-聚合物的细胞容纳隔室(例如，内隔室) 被包含去纤维化聚合物的屏障隔室(例如，外隔室)环绕。在实施例中，去纤维化化合物是具有式(I)的化合物。在实施例中，屏障隔室包含两种或更多种经不同的式(I)化合物修饰的去纤维化聚合物且包含相同或不同的水凝胶形成聚合物。在一些实施例中，内细胞容纳隔室包含去纤维化聚合物，所述去纤维化聚合物包含(i)与外屏障隔室中的一种或多种去纤维化化合物相同或不同的、具有式(I)的化合物和(ii)与内隔室中的CBP-聚合物或与屏障隔室中的一种或多种去纤维化聚合物相同或不同的聚合物。在实施例中，屏障隔室包含去纤维化聚合物与未修饰的水凝胶形成聚合物的混合物。在实施例中，未修饰的水凝胶形成聚合物是藻酸盐，其分子量为150kDa至 250kDa，并且G:M比为大于或等于1.5。

在实施例中，本披露的多隔室水凝胶胶囊中的隔室具有近似相等的体积，例如，方差小于20％、10％或5％。在实施例中，本披露的水凝胶胶囊具有两个隔室并且是球形的，具有约0.5mm至约1.5mm、约0.8mm至约 1.2mm、或约1.0mm至约1.5mm的直径。在实施例中，第二隔室的厚度是约10至约500微米、10至约300微米、约20至约150微米、或约40至约 75微米。

在另一方面，本披露的装置包括第二多个细胞，所述第二多个细胞被包封在第一细胞容纳隔室或第二细胞容纳隔室中。在实施例中，第二多个细胞从与第一多个细胞相同、但是表达不同治疗剂的细胞系工程化。在另一个实施例中，第二多个细胞从与第一多个细胞不同、但是表达与第一多个细胞相同的治疗剂的细胞系工程化。

在另一方面，本披露的特征在于包含多个(3、6、12、25、50或更多个中至少任一个)本文所述的细胞容纳装置的制品(例如，组合物)。在一个实施例中，多个装置中的一个或多个是如下装置，所述装置包含(i)细胞容纳隔室，所述细胞容纳隔室包含多个细胞(例如，活细胞)，所述细胞被包封在聚合物组合物中，所述聚合物组合物包含经第一细胞结合肽共价修饰的第一聚合物(第一CBP-聚合物)，其中当将所述装置植入到受试者中时，所述细胞能够表达治疗剂；以及当将所述装置植入到所述受试者中时，用于减轻异物反应(FBR)的器件。在一些实施例中，多个装置中的至少75％、80％、 85％、90％、95％、99％、或更多装置是球形水凝胶胶囊。在一些实施例中，制品是药学上可接受的组合物。

在另一方面，本披露的特征在于将本文所述的装置或装置制品植入受试者中的方法。在另一方面，本披露的特征在于向受试者提供治疗剂的方法，所述方法包括向该受试者施用本文所述的一个或多个装置，其中在施用后所施用的一个或多个装置中的多个细胞具有产生治疗剂的能力。在另一方面，本披露的特征在于对需要治疗剂的受试者进行治疗的方法，所述方法包括向该受试者施用本文所述的装置中的一个或多个，其中所施用的一个或多个装置具有产生治疗剂的能力。在一些实施例中，施用步骤包括在受试者中植入包含多个装置的药学上可接受的制品，这些装置中的每个具有产生治疗剂的能力。在一些实施例中，该受试者是哺乳动物(例如人)。

在另一方面，本披露的特征在于评估本文所述的装置的方法。在一些实施例中，该方法包括提供本文所述的装置并评估装置的结构或功能参数。在一些实施例中，该方法包括针对以下中的一个或多个评估本文所述的制品内该装置或这些装置：a)细胞存活力和b)生产的治疗剂的量。在一些实施例中，在(i)装置(或装置的制品)形成或(ii)施用装置(或装置的制品)至受试者后至少1、5、10、20、30、60、90或120天进行评估。在实施例中，评估还包括在植入受试者后至少10、20、30、60、90或120天评价装置(或制品中的装置)的纤维化的量和/或结构完整性。在一些实施例中，受试者是哺乳动物(例如，小鼠(例如，免疫活性小鼠)、非人灵长类、人)。

在此阐述了本公开的一个或多个实施例的细节。根据具体实施方式、附图、实例和权利要求，本公开的其他特征、目的和优点将显而易见。

附图说明

图1说明了本披露的示例性球形水凝胶两隔室胶囊，其中线表示：由共价附接到细胞结合肽的聚合物形成的第一内隔室和包封在其中的细胞；第二隔室；以及布置在第二隔室内和胶囊表面上两者的去纤维化化合物。图1将“GRGDSP”披露为SEQ ID NO:60。

图2是柱状图，其显示经工程化以表达FVIII-BDD蛋白的ARPE19细胞 (ARPE-19:FVIII-BDD细胞)然后包封在由不包含细胞结合位点(对照)或包含如以下实例2中所述的细胞结合位点的藻酸盐溶液形成的单隔室水凝胶胶囊中的体外生产力。

图3是显示两隔室水凝胶胶囊植入裸鼠后2周血浆FVIIII-BDD水平的条形图，其中第二隔室由去纤维化藻酸盐和未修饰的藻酸盐的混合物形成，且第一隔室由ARPE-19:FVIII-BDD细胞在本文实例中描述的测试CBP-藻酸盐溶液中的悬浮液(VLVG-4GRGDSP、1G-RGD:0.41)或去纤维化藻酸盐+ 未修饰的藻酸盐混合物(对照)形成。

图4A和4B是条形图，显示了两隔室水凝胶胶囊在植入之前(初始) 和IP植入小鼠后1个月(最终)的细胞/胶囊的数目(图4A)和机械强度(图4B)，其中第二隔室由去纤维化藻酸盐和未修饰的藻酸盐的混合物形成，且第一隔室由ARPE-19:FVIII-BDD细胞在包含CBP-藻酸盐的测试藻酸盐溶液中的悬浮液(VLVG-4GRGDSP、1G-RGD:0.41)、HA、或胶原蛋白I或去纤维化藻酸盐+未修饰的藻酸盐混合物(对照)形成。

图5是显示两隔室水凝胶胶囊植入裸鼠后2周血浆FVIIII-BDD水平的条形图，其中第二隔室由去纤维化藻酸盐和未修饰的藻酸盐的混合物形成，且第一隔室由ARPE-19:FVIII-BDD细胞在本文实例中描述的测试CBP-藻酸盐溶液中的悬浮液(1G RGD:0.41、MVG-GRGDSP、4G-RGD:0.53)或去纤维化藻酸盐+未修饰的藻酸盐混合物(对照)形成。

图6显示具有50:50的内:外隔室体积比的两隔室水凝胶毫胶囊的明场图像。第二(外)隔室包含中或高缀合去纤维化藻酸盐。内隔室包含中度缀合的去纤维化藻酸盐(对照)或CBP-藻酸盐(RGD)，带有或不带有(RGD，空的)经工程化以表达外源蛋白的示例性RPE细胞。植入C57/BL6小鼠后 11天，针对纤维化的存在对胶囊进行了成像。

图7是柱状图，其显示了植入含有经工程化以表达FIX蛋白的RPE细胞的两隔室水凝胶胶囊2周后，裸鼠中FIX的血浆水平。将RPE细胞包封在具有如下不同藻酸盐组合物的第一隔室中：无细胞结合肽(对照)，经由具有单个甘氨酸残基的接头(1G-RGD:0.41或4G接头(SEQ ID NO：61)) 用不同密度的RGD肽修饰的藻酸盐(4G-RGD:0.53、0.96、1.77和2.95)。

图8是柱状图，其显示了植入含有经工程化以表达FIX蛋白的RPE细胞的两隔室水凝胶胶囊2周后，裸鼠中FIX的血浆水平。将RPE细胞包封在具有如下不同藻酸盐组合物的第一隔室中：无细胞结合肽(对照)，用 1G-RGD、4G-DGEA或4G-PHSRN或与其他CBP藻酸盐混合的1G-RGD的组合修饰的藻酸盐(1G-RGD:0.41、4G-DGEA、1:1 1G-RGD:0.41/4G-DGEA、 1:11G-RGD:0.41/4G-PHSRN、1:1:1 1G-RGD:0.41/4G-DGEA/4G-PHSRN)。

图9是柱状图，其显示了植入含有经工程化以表达FIX蛋白的RPE细胞的两隔室水凝胶胶囊2周后，裸鼠中FIX的血浆水平。将RPE细胞包封在具有不同1G-RGD密度(0、0.22、0.33、0.72和1.47％N)的第一隔室中。

图10是柱状图，其显示了植入含有经工程化以表达PTH蛋白的RPE细胞的两隔室水凝胶胶囊2周后，裸鼠中PTH的血浆水平。将RPE细胞包封在具有不同对照或1G-RGD:0.72聚合物的第一隔室中。

图11显示两隔室水凝胶毫胶囊的明场图像，其中第二(外)隔室包含中或高缀合去纤维化藻酸盐。内隔室包含中度缀合的去纤维化藻酸盐(对照) 或CBP-藻酸盐(RGD)，带有或不带有(RGD，空的)经工程化以表达外源蛋白的示例性RPE细胞。

图12显示两隔室水凝胶毫胶囊的明场图像，其中第二(外)隔室包含中或高缀合去纤维化藻酸盐。内隔室包含中度缀合的去纤维化藻酸盐(对照) 或CBP-藻酸盐(RGD)，带有或不带有(RGD，空的)源自小鼠的Balb/3T3 细胞。

图13A和13B是条形图，显示了用具有不同聚合物身份和溶液粘度的 1G-RGD聚合物制备的胶囊的初始破裂(图13A)和血浆中的FIX水平(图 13B)。

图14是柱状图，其显示了植入含有经工程化以表达FIX蛋白的RPE细胞的两隔室水凝胶胶囊2周后，裸鼠中FIX的血浆水平。将RPE细胞包封在具有不同对照或1G-HAVDI聚合物的第一隔室中。

图15A和15B是柱状图，显示了对于植入到IP或SubQ部位的第一隔室中用对照或1G-RGD聚合物制备的胶囊，每个胶囊的FIX-帕多瓦(padua) 水平和活细胞数。

图16是柱状图，显示了未处理的裸鼠或具有在第一隔室中含有 ARPE19:FVII与1G-RGD:0.33的胶囊的小鼠的FVII-帕多瓦血浆水平。

图17是柱状图，其显示了植入含有经工程化以表达FIX蛋白的RPE细胞的两隔室水凝胶胶囊2周后，裸鼠中FIX的血浆水平。将RPE细胞包封在具有不同1G-RGD:0.33或1G-RGD:6.04与未修饰SLG20聚合物的1:55、 1:30或1:50混合物的第一隔室中。

图18是在第一或第二隔室上具有对照或RGD缀合的藻酸盐的两隔室胶囊的荧光图像的黑白复印件。对胶囊进行F4/80染色，以鉴定粘附在胶囊表面的小鼠巨噬细胞，该巨噬细胞通常显示为绿色荧光，但在这些复印件中显示为白色。

图19是柱状图，其显示了植入含有经工程化以表达FIX蛋白的RPE细胞的两隔室水凝胶胶囊2周后，裸鼠中FIX-帕多瓦的血浆水平。将RPE细胞包封在包含在混合在一起的不同聚合物上或都缀合到同一聚合物上的 1G-RGD和G-PHSRN肽两者的第一隔室中。

图20是柱状图，其显示了植入含有经工程化以表达FVIII蛋白(由SEQ ID NO:8编码的SEQ ID NO:1)的RPE细胞的两隔室水凝胶胶囊11天后，裸鼠(5只小鼠/组)中FVIII-BDD的血浆水平。

图21示出了用于产生工程化RPE细胞的PiggyBac转座子表达载体。

图22是柱状图，其描绘了植入含有经工程化以表达FIX蛋白的示例性 RPE细胞的两隔室水凝胶胶囊12天后，裸鼠(3只小鼠/组)中FIX蛋白的血浆水平。将工程化RPE细胞包封在经CBP-聚合物修饰的胶囊的第一隔室中，该聚合物包含各种接头长度和序列。图22将“RDGSP”披露为SEQ ID NO:59。

图23是柱状图，其描绘了植入含有经工程化以表达FIX蛋白的示例性 RPE细胞的两隔室水凝胶胶囊18天后，裸鼠(4只小鼠/组)中FIX蛋白的血浆水平。将工程化RPE细胞包封在用具有不同溶液粘度的、经CBP修饰的藻酸盐制备的胶囊的第一隔室中。

图24在表7-11中显示了治疗性多肽的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO: 1、3-7、29-36)和编码序列(SEQ ID NO:8-21)以及用于工程化RPE细胞的示例性表达载体内的核苷酸序列(SEQ ID NO:22-28)。

具体实施方式

本披露的特征在于装置，所述装置包含含有被聚合物组合物包封的多个细胞(例如，活细胞)的至少一个隔室。包封性聚合物组合物包含至少一个细胞结合物质(CBS)，例如，细胞结合肽(CBP)或细胞结合多肽(CBPP)。当将装置植入受试者(例如，人)中时，细胞能够表达治疗剂，并且装置还包括在将装置植入受试者中时用于减轻异物反应(FBR)的器件。在实施例中，用于减轻FBR的器件包含布置在所述装置的表面上的具有式(I)的化合物。本披露还提供了包含本文所述的多个装置的制品以及其制造和使用方法。在一些实施例中，本文所述的装置和制品或其组合物有用于预防或治疗可以通过治疗剂的体内表达进行预防或治疗的疾病、障碍或病症。在一些实施例中，装置和制品具有有利的性质，例如，经包封的细胞具有比植入除没有CBS外其他基本相同的装置(例如CBS无效的参比装置)中的基本相同的细胞更高的体内生产力和/或存活力。

缩写和定义

贯穿本披露的详细描述和实例，将使用以下缩写。

CBP 细胞结合肽

CBPP 细胞结合多肽

CBP-聚合物 经由接头经CBP共价修饰的聚合物

CBS 细胞结合物质

CM-Alg 化学修饰的藻酸盐

CM-LMW-Alg 化学修饰的低分子量藻酸盐

CM-LMW-Alg-101 用表4中所示的化合物101化学修饰的低分子量藻酸盐

CM-HMW-Alg 化学修饰的高分子量藻酸盐

CM-HMW-Alg-101 用表4中所示的化合物101化学修饰的高分子量藻酸盐

CM-MMW-Alg 化学修饰的中等分子量藻酸盐

CM-MMW-Alg-101 用表4中所示的化合物101化学修饰的中等分子量藻酸盐

HMW-Alg 高分子量藻酸盐

MMW-Alg 中等分子量藻酸盐

RGD-藻酸盐 经包含氨基酸序列RGD(SEQ ID NO:43)的肽共价修饰的藻酸盐

U-Alg 未修饰的藻酸盐

U-HMW-Alg 未经修饰的高分子量藻酸盐

U-LMW-Alg 未经修饰的低分子量藻酸盐

U-MMW-Alg 未经修饰的中等分子量藻酸盐

70:30 CM-Alg:U-Alg 化学修饰的藻酸盐和未修饰的藻酸盐的70:30混合物(V:V)，例如，如实例2中所述的

因此，可以更容易地理解本公开，本文使用的某些技术和科学术语在下面具体定义。除非在本文件的其他地方具体定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义。

如本文使用的，包括所附权利要求，诸如“一”，“一个”和“该”的单数形式包括它们相应的复数指代，除非上下文另有明确说明。

“约”或“近似”当在本文中用来修改数值定义的参数(例如，水凝胶胶囊的物理描述，例如直径、球度、包封在其中的细胞数量，制品中的胶囊数量)时是指所列举的数值在如本领域普通技术人员所确定的所定义的参数的可接受的功能范围内，这将部分取决于如何测量或确定该数值，例如，测量系统的局限性，包括该测量系统可接受的误差范围。例如，“约”可以表示在所列举的数值之上和之下的20％的范围。作为非限制性实例，定义为具有1.5毫米(mm)直径并包封约500万(M)个细胞的水凝胶胶囊可具有 1.2至1.8mm的直径，并可包封4M至6M个细胞。作为另一个非限制性实例，约100个装置(例如，水凝胶胶囊)包括具有80至120个装置的制品。在一些实施例中，术语“约”意味着修改的参数可以在该参数的所述数值之上或之下变化多达15％、10％或5％。可替代地，特别是关于本文所述的装置的某些特性，例如细胞生产力或CBP或去纤维化化合物的密度，术语“约”可以表示在所述值的上下数量级内，例如，5倍、4倍、3倍、2倍或1倍内。

如本文使用的，“获得”(“acquire”或“acquiring”)是指通过“直接获得”或“间接获得”值或物理实体来获得值(例如，数值)或图像或物理实体(例如，样品)。“直接获得”意指执行一个过程(例如，执行分析方法或方案)来获得值或物理实体。“间接获得”是指从另一方或来源(例如，直接获得物理实体或值的第三方实验室)接收值或物理实体。直接获取值或物理实体包括执行包括实物的物理变化的过程或使用机器或装置。直接获取值的实例包括从人受试者获得样品。直接获得值包括执行使用机器或装置的过程，例如使用荧光显微镜以获取荧光显微镜数据。

如在此使用的，术语“施用”(administer、administering或administration) 是指将本文所述的实体(例如，装置或装置的制品)植入、吸收、摄取、注射或以其他方式引入至受试者，或向所述受试者提供用于施用的这样一种实体。

如本文使用的，“去纤维化(Afibrotic)”是指减轻异物反应(FBR) 的化合物或材料。例如，通过植入包含去纤维化化合物(例如，包含经表4 中列出的化合物共价修饰的聚合物的水凝胶胶囊)的装置(例如，水凝胶胶囊)的组织诱导的生物组织中的FBR的量低于通过植入去纤维化无效参比装置(即，缺乏任何去纤维化化合物但具有基本相同的组成(例如，相同的 CBP-聚合物、相同的细胞类型)和结构(例如，尺寸、形状、隔室的数量) 的装置)诱导的FBR。在实施例中，通过含有植入装置(例如，水凝胶胶囊) 的组织中的免疫应答来评估FBR的程度，其可以包括例如蛋白质吸附、巨噬细胞、多核异物巨细胞、成纤维细胞和血管生成，该评估使用本领域已知的测定，例如，如WO 2017/075630中所述，或使用Vegas,A.,等人.,Nature Biotechnol[自然生物技术](同上)中描述的一种或多种测定/方法(例如，植入胶囊的皮下组织蛋白酶测量，Massons三色(MT)，组织切片苏木精或伊红染色，胶原密度定量，细胞染色和巨噬细胞共聚焦显微镜检查(CD68 或F4/80)，肌成纤维细胞(α-肌肉肌动蛋白，SMA)或一般细胞沉积，已知炎症因子和免疫细胞标志物的79个RNA序列的定量，或在合适的受试者(例如免疫活性小鼠)的腹膜内空间中14天后对回收的装置(例如胶囊)上的巨噬细胞和中性粒细胞进行FACS分析。在实施例中，通过测量含有一种或多种免疫应答生物标志物(例如组织蛋白酶、TNF-α、IL-13、IL-6、G-CSF、 GM-CSF、IL-4、CCL2、或CCL4)的植入物在组织中的水平来评估FBR。在一些实施例中，由本发明的装置(例如，包含置于外表面上的去纤维化化合物的水凝胶胶囊)诱导的FBR比由FBR无效参比装置(例如，与测试或要求保护的装置基本相同的装置(除了缺少用于减轻FBR的器件(例如，不含去纤维化化合物，但在其他方面基本上与要求保护的胶囊相同的水凝胶胶囊))诱导的FBR低至少约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施例中，FBR(例如，一种或多种生物标志物的水平) 是在约30分钟、约1小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3 天、约4天、约1周、约2周、约1个月、约2个月、约3个月、约6个月或更长时间后测量的。

如本文使用的，“细胞”是指工程化细胞或未经工程化的细胞。在实施例中，细胞是永生化细胞或源自永生化细胞的工程化细胞。在实施例中，细胞是活细胞，例如，如通过本文所述或本领域已知的任何技术测量的是活的。

如本文使用的，“细胞结合肽(CBP)”意指包含如下氨基酸序列的线性或环状肽，所述氨基酸序列衍生自用于细胞粘附分子(CAM)的配体(例如，介导细胞基质连接或细胞间连接)的细胞结合结构域。CBP的长度为少于50、40、30、25、20、15或10个氨基酸。在实施例中，CBP的长度在3 和12个氨基酸之间，长度为4和10个氨基酸之间，或长度为3、4、5、6、 7、8、9或10个氨基酸。CBP氨基酸序列可以与天然存在的结合结构域序列相同，或者可以是其保守取代的变体。在实施例中，CAM配体是哺乳动物蛋白。在实施例中，CAM配体是选自下文表1中所列蛋白的组的人蛋白。在实施例中，CBP包括下文表1中所列细胞结合序列或其保守取代的变体。在实施例中，CBP包括下文表1中所列细胞结合序列中的至少一个。在实施例中，CBP基本上由文表1中所列细胞结合序列组成。在实施例中，CBP 是RGD肽，这意味着该肽包含氨基酸序列RGD(SEQ ID NO:43)，并且任选地包含位于N端和C端之一或两者处的一个或多个另外的氨基酸。在实施例中，CBP是包含RGD(SEQ ID NO:43)的环状肽，例如，在Vilaca,H.等人,Tetrahedron[四面体]70(35):5420-5427(2014)中描述的环状RGD肽之一。在实施例中，CBP是包含RGD(SEQ ID NO:43)的线性肽并且长度少于6个氨基酸。在实施例中，CBP是基本上由RGD(SEQ ID NO:43)或 RGDSP(SEQ ID NO:59)组成的线性肽。

表1：示例性CAM配体蛋白和细胞结合序列

如本文使用的，“CBP-聚合物”意指包含至少一个细胞结合肽分子的聚合物，所述分子经由接头共价附接到聚合物。在实施例中，聚合物不是肽或多肽。在实施例中，CBP-聚合物中的聚合物不含任何氨基酸。在实施例中， CBP-聚合物中的聚合物是合成的或天然存在的多糖，例如藻酸盐，例如藻酸钠。在实施例中，接头是氨基酸接头(即，基本上由单个氨基酸或具有几个相同或不同氨基酸的肽组成)，其经由肽键连接至CBP的N端或C端。在实施例中，氨基酸接头的C端连接至CBP的N端，并且氨基酸接头的N端经由酰胺键连接至多糖中的至少一个侧羧基。在实施例中，接头-CBP的结构表示为G

在实施例中，CBP-聚合物中CBP修饰的密度通过氮百分比燃烧分析(例如，如下文实例中所述)来估计。在实施例中，CBP-聚合物是RGD聚合物 (例如，RGD-藻酸盐)，其是经接头-RGD分子(例如，基本上由GRGD(SEQ ID NO:62)或GRGDSP(SEQ ID NO:60)组成的肽)共价修饰的聚合物(例如，藻酸盐)并且如使用本文所述的测定测量的，接头-RGD分子修饰的密度(例如，缀合密度)是约0.05％氮(N)至1.00％N、约0.10％N至约0.75％ N、约0.20％N至约0.50％N、或约0.30％N至约0.40％N。在实施例中， RGD-藻酸盐(例如，经GRGDSP(SEQ IDNO:60)共价修饰的MMW藻酸盐)中的接头-RGD修饰的缀合密度为0.1至1.0、0.2至0.8、0.3至0.7、0.3 至0.6、0.4至0.6微摩尔的接头-RGD部分每克在粘度为80-120cP的溶液(如盐溶液)中的RGD聚合物，如通过能够定量与聚合物缀合的肽的测定，例如本文所述的定量肽缀合测定测量的。除非另有明确说明或从上下文中显而易见，否则CBP-聚合物中CBP的具体数字浓度、浓度范围、密度或密度范围是指缀合的CBP分子的浓度或密度，即，它不包括CBP-聚合物中可能存在的任何残留游离(例如未结合的)CBP。

如本文使用的，“细胞结合多肽(CBPP)”意指如下多肽，其长度为至少50、至少75、或至少100个氨基酸并且包含CAM配体的细胞结合结构域的氨基酸序列或其保守取代的变体。在实施例中，CAM配体是哺乳动物蛋白。在实施例中，CBPP氨基酸包含全长CAM配体的天然存在的氨基酸序列，例如表1中列出的蛋白质之一或其保守取代的变体。

如本文使用的，除非本文另外明确指出，否则“CBP密度”是指CBP- 聚合物，例如用G

如本文使用的，“细胞结合物质(CBS)”意指任何化学、生物学或其他类型的物质(例如，小的有机化合物、肽、多肽)，其能够模仿用于细胞粘附分子(CAM)的配体或介导细胞基质连接或细胞间连接或其他受体介导的信号传导的其他细胞表面分子的至少一种活性。在实施例中，当存在包封细胞的聚合物组合物时，CBS能够形成瞬时或永久性键或与一个或多个细胞接触。在实施例中，CBS促进包封在聚合物组合物中的两个或更多个活细胞之间的相互作用。在实施例中，当将经包封的细胞植入测试受试者(例如，小鼠)时，CBS在包封多个细胞(例如，活细胞)的聚合物组合物中的存在与增加的细胞生产力(例如，治疗剂的表达)和增加的细胞存活力之一或两者有关。在实施例中，CBS物理附接到聚合物组合物中的一个或多个聚合物分子上。在实施例中，如本文定义的，CBS是细胞结合肽或细胞结合多肽。

如本文使用的，“保守修饰的变体”或“保守取代”是指参考肽或与参考分子相同的多肽的变体，除了在其氨基酸序列中具有一个或多个保守氨基酸取代。在实施例中，保守地修饰的变体由与参考氨基酸序列至少70％、80％、 85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成。保守氨基酸取代是指用具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、骨架构象和刚性等)的氨基酸取代氨基酸，并且对得到的取代肽或多肽的生物活性的影响最小。功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的，并且通过功能特征分组的示例性取代列于下表2中。

表2.示例性保守氨基酸取代基团。

如在整个说明书和权利要求书中所使用的，“基本上由...组成(Consistsessentially of)”，并且诸如“基本上由...组成(consist essentially of)”或“基本上由...组成(consisting essentially of)”的变体表示包括任何列举的要素或要素组，以及可任选地包括与所述元素具有相似或不同的性质的其他要素(其不会实质上改变特定分子、组合物、装置或方法的基本或新颖性质)。作为非限制性实例，基本上由所述氨基酸序列组成的细胞结合肽或治疗性蛋白还可以包括一个或多个氨基酸，该一个或多个氨基酸包括所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的取代，其各自不会实质上影响细胞结合肽或治疗性蛋白的相关生物活性。作为另一个非限制性实例，基本上由所述氨基酸序列组成的细胞结合肽可含有一个或多个共价附接的部分(例如放射性或荧光标记)，其不会实质上改变所述细胞结合肽的相关生物学活性(例如，其增加本文所述的经包封的细胞的存活力和/或生产力)。

如本文关于细胞使用的，“衍生自”是指从组织、细胞系或细胞获得的细胞，其任选随后被培养、传代、分化、诱导等以产生一个或多个衍生的细胞。例如，间充质干细胞可源自间充质组织，然后分化为多种细胞类型。

如本文使用的，“装置”是指任何可植入物体(例如，颗粒、水凝胶胶囊、植入物、医疗装置)，其包含能够在该装置植入后表达治疗剂的细胞(例如，活细胞)，并具有通过允许细胞营养进入装置来支持细胞存活力的配置。在一些实施例中，该装置允许从装置释放代谢副产物和/或由活细胞产生的治疗剂。

如本文使用的，“微分体积”是指本文所述装置内的一个隔室的体积，其排除由另一个或多个隔室占据的空间。例如，具有内、外隔室的两隔室装置中的第二(例如，外)隔室的微分体积是指第二隔室内的排除第一(内) 隔室占据的空间的体积。

如本文使用的，“有效量”是指装置、装置组合物或装置或装置组合物的组分，例如，包含细胞(例如工程化细胞)或由细胞(例如工程化RPE 细胞)产生的试剂(例如治疗剂)的多个水凝胶胶囊足以引发生物应答(例如治疗疾病、障碍或病症)的量。在一些实施例中，术语“有效量”是指装置的组分的量，例如，装置中的细胞数、布置在装置表面和/或屏障隔室中的去纤维化化合物的密度、细胞容纳隔室中CBS的密度。如本领域普通技术人员所理解的，有效量可以根据诸如所需的生物学终点、治疗剂的药代动力学、组合物或装置(例如，胶囊、颗粒)、所治疗的病症、施用方式和受试者的年龄和健康状况等因素而变化。有效量涵盖治疗性和预防性处理。例如，为了减轻FBR，有效量的具有式(I)化合物可以减少纤维化或阻止纤维化组织在植入装置处或附近的生长或扩散。作为另一个实例，有效量的CBS可以增强装置中细胞的存活力(例如，活细胞的数量)和/或增加细胞表达和/ 或分泌的治疗剂的水平。可以通过本领域已知的或本文描述的任何技术测定装置、组合物或其组分(例如，去纤维化化合物或CBS)的去纤维化有效量。

如本文使用的“内源核酸”是天然存在于受试细胞中的核酸。

如本文使用的，“内源多肽”是天然存在于受试细胞中的多肽。

如本文使用的，“工程化细胞”是具有非天然存在的改变的细胞(例如， RPE细胞)，并且通常包含与在相似条件下未工程化(外源核酸序列)的在其他方面类似地细胞相比不存在(或以不同水平存在)的核酸序列(例如DNA或RNA)或多肽。在实施例中，工程化细胞包含外源核酸(例如载体或改变的染色体序列)。在实施例中，工程化细胞包含外源多肽。在实施例中，工程化细胞包含外源核酸序列，例如不存在于未工程化的类似细胞中的序列，例如DNA或RNA。在实施例中，外源核酸序列是染色体的，例如，外源核酸序列是置于内源染色体序列中的外源序列。在实施例中，外源核酸序列是染色体或染色体外的，例如非整合的载体。在实施例中，外源核酸序列包含RNA序列，例如mRNA。在实施例中，外源核酸序列包含染色体或染色体外外源核酸序列，其包含表达为RNA例如mRNA或调节性RNA的序列。在实施例中，外源核酸序列包含染色体或染色体外核酸序列，其包含编码多肽的序列，或表达为多肽的序列。在实施例中，外源核酸序列包含第一染色体或染色体外外源核酸序列，其调节第二核酸序列的构象或表达，其中第二氨基酸序列可以是外源的或内源的。例如，工程化细胞可包含控制内源序列表达的外源核酸。在实施例中，工程化细胞包含以一定水平或分布存在的多肽，其不同于未经工程化的类似细胞中发现的水平。在实施例中，工程化细胞包含工程化为产生RNA或多肽的RPE。例如工程化细胞可以包含外源核酸序列，该外源核酸序列包含染色体或染色体外外源核酸序列，其包含表达为RNA例如mRNA或调节性RNA的序列。在实施例中，工程化细胞(例如，RPE细胞)包含外源核酸序列，该外源核酸序列包含染色体或染色体外核酸序列，其包含编码多肽或表达为多肽的序列。在实施例中，多肽由密码子优化的序列编码，以实现该多肽比天然存在的编码序列更高的表达。密码子优化的序列可以使用可商购的算法生成，例如，GeneOptimizer (赛默飞世尔公司(ThermoFisher Scientific))、OptimumGene

如本文使用的，“外源核酸”是不天然存在于受试细胞中的核酸。

如本文使用的，“外源多肽”是不天然存在于受试细胞，例如工程化细胞中的多肽。提及特定序列的氨基酸位置是指所述氨基酸在参比氨基酸序列，例如全长成熟(在信号肽切割后)野生型蛋白的序列(除非另有说明) 中的位置，且不排除在参比氨基酸序列中其他位置上存在变异，例如缺失、插入和/或取代。

如本文使用的，“因子VII蛋白”或“FVII蛋白”是指包含天然存在的因子VII蛋白或其具有如通过本领域内公认的测定而确定的FVII生物活性例如促进血液凝固的变体的氨基酸序列的多肽(除非另有说明)。天然存在的FVII作为单链酶原、酶原样双链多肽和完全活化的双链形式(FVIIa)存在。一些实施例中，对FVII的提及包括其单链和双链形式，包括酶原样和 FVIIa。可由本文所述的装置(例如，含有工程化RPE细胞的装置)产生的 FVII蛋白包括野生型灵长类动物(例如人)、猪、犬和鼠蛋白以及这种野生型蛋白质的变体，包括片段、突变体、具有一个或多个氨基酸取代和/或缺失的变体。在一些实施例中，变体FVII蛋白能够被激活成完全激活的双链形式(因子VIIa)，其具有野生型因子VIIa的至少50％、75％、90％或更多(包括>100％)的活性。FVII和FVIIa的变体是已知的，例如，marzeptacog alfa(激活的)(MarzAA)和欧洲专利号1373493、美国专利号7771996、美国专利号9476037和美国公开申请号US 20080058255中描述的变体。

除非另有说明，因子VII生物活性可通过本领域公认的测定法定量。例如，生物流体(例如血浆)样品中的FVII生物活性可以通过以下定量(i)测量在包含嵌入脂质膜中的组织因子(TF)的系统中产生的因子Xa、和因子 X的量(Persson等人,J.Biol.Chem[生物化学杂志].272:19919-19924,1997)； (ii)测量含水体系中的因子X水解；(iii)使用基于表面等离子体共振的仪器测量其与TF的物理结合(Persson,FEBS Letts.[FEBS通讯]413:359-363, 1997)；或(iv)测量合成基质的水解；和/或(v)在TF非依赖性体外系统中测量凝血酶的产生。在实施例中，通过市售的显色测定法(BIOPHEN FVII, HYPHEN BioMed Neuvillesur Oise,法国)评估FVII活性，其中含有FVII 的生物样品与促凝血酶原激酶钙、因子X和SXa-11(因子Xa特异性的生色底物)混合。

如本文使用的，“因子VIII蛋白”或“FVIII蛋白”是指包含天然存在的因子VIII多肽或其具有如通过本领域内公认的测定而确定的FVIII生物活性例如凝血活性的变体的氨基酸序列的多肽(除非另有说明)。可由本文所述装置(例如含有工程化RPE细胞的装置)表达的FVIII蛋白包括野生型灵长类动物(例如人)、猪、犬和鼠蛋白，以及这类野生型蛋白变体，包括片段、突变体、具有一个或多个氨基酸取代和/或缺失的变体、B结构域缺失 (BDD)变体、单链变体和任何前述野生型或变体与延长半衰期的多肽的融合体。在实施例中，将细胞工程化以编码具有B结构域的完全或部分缺失的前体因子VIII多肽(例如，具有信号序列)。在实施例中，将细胞工程化以编码包含变体FVIII蛋白的单链因子VIII多肽，其优选具有相对应的野生型因子VIII的凝血活性的至少50％、75％、90％或更多(包括>100％)。用于测量FVIII蛋白的凝结活性的测定包括一阶段或两阶段凝结测定(Rizza等人,1982,Bloom编辑的FVIII：C和FIXa的凝结测定(Coagulation assay of FVIII:C and FIXa in Bloomed.)The Hemophelias[血友病].NY Churchill Livingston公司1992)或发色底物FVIII：C测定(the chromogenic substrate FVIII:C assay)(Rosen,S.1984.Scand J Haematol[扫描血液学杂志] 33:139-145,增刊)。

许多FVIII-BDD变体是已知的，并且包括例如具有以下任何美国专利号中公开的全部或部分B结构域缺失的变体：4,868,112(例如，第2栏第2行至第19栏第21行和表2)；5,112,950(例如，第2栏第55-68行，图2和实例1)；5,171,844(例如，第4栏第22行至第5栏第36行)；5,543,502(例如，第2栏第17-46行)；5,595,886；5,610,278；5,789,203(例如，第2栏第26-51行和实施5-8)；5,972,885(例如，第1栏第25行至第2栏第40行)； 6,048,720(例如，第6栏第1-22行和实例1)；6,060,447；6,228,620；6,316,226 (例如，第4栏第4行至第5栏第28行和实例1-5)；6,346,513；6,458,563 (例如，第4栏第25-53行)和7,041,635(例如，第2栏第1行至第3栏第 19行，第3栏第40行至第4栏第67行，第7栏第43行至第8栏第26行和第11栏第5行至第13栏第39行)。

在一些实施例中，由本文所述的装置产生的FVIII-BDD蛋白(例如，由包含在装置中的工程化细胞表达)在B结构域中具有一个或多个以下氨基酸缺失：(i)大多数B结构域，除了将初级翻译产物细胞内加工成两条多肽链所必需的氨基末端B结构域序列之外的(WO91/09122)；(ii)缺失氨基酸 747-1638(Hoeben R.C.,等人J.Biol.Chem.[生物化学杂志]265(13): 7318-7323(1990))；氨基酸771-1666或氨基酸868-1562(Meulien P.,等人.Protein Eng.[蛋白质工程]2(4):301-6(1988)；氨基酸982-1562或760-1639 (Toole等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家图书馆院刊] 83:5939-5942(1986))；氨基酸797-1562(Eaton等人.,Biochemistry[生物化学]25:8343-8347(1986))；741-1646(Kaufman,WO 87/04187))，747-1560 (Sarver等人.,DNA 6:553-564(1987))；氨基酸741-1648(Pasek，WO 88/00831))，氨基酸816-1598或741-1689(Lagner(Behring Inst.Mitt.(1988) No 82:16-25,EP 295597)；包含弗林蛋白酶识别序列中的一个或多个残基的缺失，例如氨基酸1643-1648处的LKRHQR(SEQ ID NO:65)，包括美国专利号9,956,269第10栏第65行到第11栏第36行中所述的任何特定缺失。

在其他实施例中，FVIII-BDD蛋白保留以下任何B结构域氨基酸或氨基酸序列：(i)B结构域中的一个或多个N-连接的糖基化位点，例如残基757、 784、828、900、963或任选的943，前226个氨基酸或前163个氨基酸(Miao, H.Z.,等人.,Blood[血液]103(a):3412-3419(2004),Kasuda,A.,等人.,J. Thromb.Haemost[血栓形成和止血杂志].6:1352-1359(2008)，和Pipe,S.W., 等人.,J.Thromb.Haemost[血栓形成和止血杂志].9:2235-2242(2011)。

在一些实施例中，FVIII-BDD蛋白是通过取代弗林蛋白酶识别序列中的一个或多个氨基酸(氨基酸1643-1648处的LKRHQR(SEQ ID NO:65))产生的单链变体，其阻止该位点处的蛋白水解切割，该取代包括美国专利号10,023,628、9,394,353和9,670,267中描述的R1645和/或R1648位置的任何取代。

在一些实施例中，任何上述FVIII-BDD蛋白可进一步包含一种或多种以下变体：F309S取代，以改善FVIII-BDD蛋白的表达(Miao,H.Z.,等人., Blood[血液]103(a):3412-3419(2004)；白蛋白融合物(WO 2011/020866)；和Fc融合物(WO 04/101740)。

除非另有说明，否则本文提及的所有FVIII-BDD氨基酸位置均指全长人 FVIII中的位置。

如本文使用的，“因子IX蛋白”或“FIX蛋白”是指包含天然存在的因子IX蛋白或其变体的氨基酸序列的多肽，其具有如本领域认可的测定所确定的FIX生物活性，例如凝血活性，除非另有说明。FIX作为无活性酶原产生，该酶原通过因子XIa切除活化肽产生通过一个或多个二硫键保持在一起的重链和轻链而转化为活性形式。可以由本文描述的装置(例如，包含工程化RPE细胞的装置)产生的FIX蛋白包括野生型灵长类动物(例如人)、猪、犬和鼠蛋白，以及这种野生型蛋白的变体，包括片段，突变体，具有一个或多个氨基酸取代和/或缺失的变体，以及任何前述野生型或变体蛋白质与延长半衰期的多肽的融合体。在实施例中，将细胞工程化以编码全长野生型人因子IX多肽(例如，具有信号序列)或其功能变体。变体FIX蛋白优选具有野生型因子VIX的凝血活性的至少50％、75％、90％或更多(包括> 100％)。用于测量FIX蛋白的凝结活性的测定包括Biophen因子IX测定 (Hyphen BioMed)和一阶段凝血测定(活化部分促凝血酶原激酶时间 (aPTT)(例如，如EP 2 032 607中所述)，凝血酶产生时间测定(TGA)和旋转血栓弹力测定法(例如，如WO 2012/006624中所述)。

许多功能性FIX变体是已知的并且可以由包封在本文所述的装置中的工程化细胞表达，包括以下国际专利公开中描述的任何功能性FIX变体： WO 02/040544，第4页第9-30行和第15页第6-31行；WO 03/020764，表 2和3中，第14-24页和第12页第1-27行；WO 2007/149406，第4页第1 行至第19页第11行；WO 2007/149406 A2，第19页第12行至第20页第9行；WO 08/118507，第5页第14行至第6页第5行；WO 09/051717，第9 页第11行至第20页第2行；WO 09/137254，第2页第[006]段至第5页第[011] 段和第16页第[044]段至第24页第[057]段；WO 09/130198 A2，第4页第26 行至第12页第6行；WO 09/140015，第11页第[0043]段至第13页第[0053] 段；WO 2012/006624；WO 2015/086406。

在某些实施例中，FIX多肽包含与延长FIX蛋白的半衰期的异源多肽或非多肽部分融合的野生型或变体序列。示例性的延长半衰期的部分包括Fc、白蛋白、PAS序列、转铁蛋白、CTP(人绒毛膜促性腺激素(hCG)的28 氨基酸C-末端肽(CTP)及其4O-聚糖)、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合多肽、结合白蛋白的小分子、或其任何组合。示例性FIX多肽是 WO 2012/006624中描述的rFIXFc蛋白，其是通过Fc铰链区中的两个二硫键结合在一起的FIXFc单链(FIXFc-sc)和Fc单链(Fc-sc)。

FIX变体还包括功能获得性和功能缺失性变体。功能获得性变体的实例是人FIX的“帕多瓦”变体，其在成熟蛋白质的338位具有L(亮氨酸)而不是R(精氨酸)(对应于SEQ IDNO:2的氨基酸位置384)，并且与野生型人FIX相比具有更高的催化和凝结活性(Chang等人.,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],273:12089-94(1998))。功能缺失性变体的实例是在成熟蛋白质的起始的第五个氨基酸位置上丙氨酸取代赖氨酸，其导致与胶原蛋白IV的结合降低(例如功能缺失)的蛋白。

本文使用的“白细胞介素-2蛋白”或“IL-2蛋白”是指包含天然存在的IL-2蛋白或其具有通过本领域公认的测定确定的IL-2生物活性(例如，激活Treg细胞中的IL-2受体信号传导)的变体的氨基酸序列的多肽，除非另有说明。可以通过本文描述的装置(例如含有工程化RPE细胞的装置) 产生的IL-2蛋白包括野生型灵长类动物(例如人)、猪、犬和鼠蛋白，以及这种野生型蛋白的变体。变体IL-2蛋白优选具有相应野生型IL-2的至少 50％、75％、90％或更多(包括>100％)的生物活性。IL-2蛋白的生物活性测定描述于美国专利号10,035,836中，并且包括例如测量与CD4+CD25-/低 T细胞或NK细胞相比Treg细胞中磷酸化的STAT5蛋白的水平。可以通过本披露的装置(例如，含有工程化RPE细胞的装置)产生的变体IL-2蛋白包含具有一个或多个以下氨基酸取代的蛋白：N88R、N88I、N88G、D20H、 Q126L、Q126F和C125S或C125A。

本文使用的“胰岛细胞”是指包含任何天然存在的或任何合成产生的或修饰的细胞的细胞，所述细胞旨在部分或全部地重现、模拟或以其他方式表达朗格汉斯胰岛的细胞的部分或全部功能。术语“胰岛细胞”包括葡萄糖响应性胰岛素生成细胞，其衍生自干细胞，例如来自诱导的多能干细胞系。

除非另有明确说明，否则本文使用的“甘露醇”是指D-甘露醇。

如本文使用的，“中等分子量藻酸盐”或“MMW-Alg”是指具有75 kDa至150kDa的近似分子量的藻酸盐。

如本文所用的术语“间充质干细胞功能细胞”或“MSFC”是指衍生自中胚层谱系细胞或具有中胚层谱系细胞的至少一种特异性特征的细胞，并且其中MSFC是i)不在终末分化状态和ii)可以终末分化成一种或多种细胞类型。MSFC不包含内胚层来源的细胞例如肠细胞，或外胚层来源的细胞例如源自皮肤、CNS或神经细胞的细胞。在实施例中，MSFC是多能的。在实施例中，MSFC不是全能的。在实施例中，MSFC包括以下特征中的一个或多个：

a)它包括间充质干细胞(MSC)或由其衍生的细胞，包括衍生自MSC 的原代细胞培养物的细胞，直接(没有长期培养，自分离后例如少于5或10 次传代或细胞分裂轮次)从天然存在的MSC(例如从人或其他哺乳动物) 分离的细胞，衍生自转化的、多能的、永生化的或长期的(例如，超过5或 10次传代或细胞分裂轮次)MSC培养物的细胞。

b)它包含从较低分化细胞获得的细胞，例如，发育、编程或重编程(例如，体外)为MSC的细胞或基本上类似于(除了任何基因工程之外)一种或多种天然存在的MSC的细胞或来自MSC的原代或长期培养物的细胞、或上述a)中描述的细胞。可以衍生MSFC的分化程度较低的细胞的实例包括 IPS细胞、胚胎干细胞或其他全能或多能细胞；参见例如Chen,Y.S.等人 (2012)Stem Cells Transl Med[干细胞转化医学]1(83-95)；Frobel,J等人(2014)Stem Cell Reports[干细胞报道]3(3):414-422；Zou,L等人(2013)Sci Rep[科学报道]3:2243；

c)它是多能的，例如，通过能够提供关于细胞多能性的信息的任何测定法测量，例如显微镜检查；

d)它呈现出特征性的单核卵球形、星状或纺锤形，具有圆形到椭圆形的核。椭圆形细长核可具有突出的核仁和异染色质与常染色质的混合物。 MSFC(例如，MSC)可能具有很少的细胞质，但许多细长突起似乎从细胞核延伸；

e)它能够进行细胞分裂，例如，如能够提供关于细胞分裂的信息的任何测定例如显微镜检查所测量的。在实施例中，MSFC能够在培养中进行细胞分裂(例如，在被包封或掺入装置之前)。在实施例中，其在被包封(例如，如本文所述进行包封)或引入装置(例如，本文所述的装置)中后能够进行细胞分裂。在实施例中，它在达到汇合后不能进行细胞分裂；

f)它能够分化成间充质细胞谱系，例如成骨细胞、成核细胞、脂肪细胞或成纤维细胞；

g)它表达间充质细胞标志物，例如，CD105、CD106、CD73、CD90、 Stro-1、CD49a、CD29、CD44、CD146、CD166、TNAP+、THY-1+、Stro-2、 Stro-4和碱性磷酸酶中的一种、两种、三种、四种、五种或全部；

h)它不表达显著水平的CD34、CD31、VE-钙黏蛋白、CD45、HLA-DR、 CD11b和血型糖蛋白或白细胞分化抗原例如、CD14、CD33、CD3和CD19 中的一种、二种、三种、或任何一种；

i)它表达CD75、CD90和CD105中的一种、两种或全部，并且不表达CD45、CD34和CD14中的一种、两种或任何一种；

j)它是抗炎或免疫抑制剂，例如，通过能够提供关于炎症的信息的任何方法测量的，例如，体内抑制T细胞增殖；

k)它能够粘附，例如塑料粘附，例如通过例如目视检查确定的；或

l)可以三维生长，例如通过例如目视检查确定的。

本文使用的“甲状旁腺激素”或“PTH”是指天然存在的甲状旁腺激素多肽或肽或通过本领域公认的测定法测定的具有PTH生物活性的其变体的氨基酸序列。可由本文所述的包封细胞表达的PTH多肽和肽包括野生型灵长类动物(例如人)、猪、犬和鼠蛋白，以及此类野生型蛋白的变体。此类PTH多肽和肽可以基本上由pre-pro-PTH多肽(115个氨基酸)、pro-PTH 多肽(90个氨基酸)、成熟的84-氨基酸肽(PTH(1-84))及其生物活性变体(例如截短型变体肽PTH(1-34))的野生型人序列组成。在人野生型序列中具有一个或多个氨基酸取代的PTH肽变体已经描述于例如美国专利号 7410948和8563513以及美国公开专利申请US20130217630中。PTH变体优选具有相应野生型PTH的至少50％、75％、90％或更多(包括>100％)的生物活性。在美国专利号8383417中描述了通过串联质谱法检测某些PTH 变体的测定法。美国专利号7410948中描述了PTH肽变体的生物活性测定- 通过测量cAMP水平测定的腺苷酸环化酶的刺激。

如本文使用的，“泊洛沙姆”是指一类非离子三嵌段线性共聚物(其由侧面为两个聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))部分的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链组成)的标准通用术语。

如本文使用的，“泊洛沙姆188”或“P 188”是指泊洛沙姆，其聚氧丙烯核的分子量约为1800g/摩尔，氧乙烯含量约为80重量％，例如79.0-83.7％。在实施例中，泊洛沙姆188的平均分子量为8350g/摩尔。在实施例中，泊洛沙姆188的平均分子量为例如通过尺寸排阻色谱法测定的7680g/摩尔至 9510g/摩尔，并且氧乙烯含量为81.8±1.9重量％。在实施例中，泊洛沙姆 188中的每个聚氧乙烯链具有75-85(例如80)个环氧乙烷单体，并且聚氧丙烯核具有25-30(例如27个)环氧丙烷单体。在实施例中，本文所述方法中使用的泊洛沙姆188基本上满足由美国药典-国家处方集(USP-NF)或欧洲药典(Ph.Eur.)公布的泊洛沙姆专论中所述的在进行该过程时正式的规范。

如本文使用的，“聚合物组合物”是包含一种或多种聚合物的组合物 (例如溶液、混合物)。作为一类，“聚合物”包括均聚物、杂聚物、共聚物、嵌段聚合物、嵌段共聚物，可以是天然的也可以是合成的。均聚物包含一种类型的结构单元或单体，而共聚物包含一种以上类型的单体。

如本文使用的，“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸残基并具有至少两个并且在一些实施例中至少10、50、75、100、150或200个氨基酸残基的聚合物。

如本文使用的，“预防(Prevention、prevent、、preventing)”是指包括施用或应用疗法(在疾病、障碍或病症发作之前施用包封细胞的装置组合物 (例如，如本文所述)以排除所述疾病、障碍或病症的身体表现)的治疗。在一些实施例中，“预防”需要疾病、障碍或病症的体征或症状尚未发展或尚未观察到。在一些实施例中，治疗包括预防，而在其他实施例中，治疗不包括预防。

“替代疗法”或“替代蛋白”是治疗性蛋白或其功能片段，其在患有与蛋白的减少、改变或缺乏相关的疾病或病症的受试者中替代或增加减少的、以不足的量存在的、改变的(例如突变的)或缺乏的蛋白的有益功能。实例是某些凝血障碍中的某些凝血因子或某些溶酶体贮积病中的某些溶酶体酶。在实施例中，替代疗法或替代蛋白提供内源蛋白的功能。在实施例中，替代疗法或替代蛋白具有与被替换蛋白质的天然存在的变体(例如野生型等位基因或与病症无关的等位基因)相同的氨基酸序列。在实施例中，替代疗法或替代蛋白的氨基酸序列与天然存在的变体(例如野生型等位基因或与病症无关的等位基因，例如受试者携带的等位基因)具有不超过约1％、2％、3％、 4％、5％、10％、15％或20％的氨基酸残基不同。

如本文中关于所要求保护的装置(例如，水凝胶胶囊)所使用的，“参比装置”是指以下装置(例如，水凝胶胶囊)：(i)缺乏特定特征，例如减轻 FBR的工具(例如，包含去纤维化化合物(如本文所定义)或CBS(如本文所定义)(例如RGD聚合物)的屏障隔室)，(ii)在细胞容纳隔室包封约相同数量的与所要求保护的装置中相同的细胞类型的细胞，以及(iii)除缺少特定特征(例如，去纤维化化合物或CBS)外具有与所要求保护的装置中的那些基本上相似的聚合物组成和结构。在实施例中，参比装置的细胞容纳隔室中的活细胞数为所要求保护的装置的细胞容纳隔室中的活细胞数的80％至 120％以内，或在90％至110％以内。在实施例中，参比装置和所要求保护的装置中的细胞获得自相同的细胞培养物。在实施例中，基本上相似的聚合物组成是指参比装置和所要求保护的装置中的所有聚合物，包括任何CBP-聚合物和去纤维化聚合物的聚合物组分(如果适用)具有相同的化学和分子量类别(例如，具有高G含量和相同分子量范围的藻酸盐)。例如，在实施例中，CBP无效参比装置中细胞容纳隔室由用于形成所要求保护的装置的细胞容纳隔室的CBP-聚合物中的聚合物(例如，藻酸盐)的未修饰形式形成。在其中要求保护的两隔室水凝胶毫微胶囊具有(i)由包封多个细胞的CBP- 聚合物形成的内隔室和(ii)由化学修饰的聚合物(例如，如本文所述的CM-LMW-藻酸盐)和未修饰的聚合物(例如本文所述的U-HMW-藻酸盐) 的混合物形成的外隔室的一些实施例中，则参比胶囊和要求保护的胶囊的外隔室由相同的聚合物混合物形成，而参比胶囊的内隔室由细胞在用于外隔室的相同聚合物混合物中的悬浮液形成。在实施例中，基本上相似的结构意味着参比装置器件和要求保护的装置具有相同数量的隔室(例如，一个、两个、三个等)并且具有大约相同的尺寸和形状。

如本文使用的“RPE细胞”是指具有一种或多种以下特征的细胞：a)它包含视网膜色素上皮细胞(RPE)(例如，使用ARPE-19细胞系(

除非另有说明，否则本文使用的“盐溶液”是指生理盐水，即含有 0.9％NaCl的水。

“序列同一性”或“相同百分比”，当在本文中用于指代两个核苷酸序列或两个氨基酸序列时，意指当比较两个序列并对齐以在比较窗口或特定区域上进行最大对应时，两个序列在特定区域内相同，或在特定区域内在特定百分比的核苷酸或氨基酸位置具有相同核苷酸或氨基酸。序列同一性可以使用本领域已知的标准技术确定，包括但不限于美国专利申请公开号 2017/02334455描述的任何算法。在实施例中，相同核苷酸或氨基酸位置的特定百分比为至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或更高。

如本文使用的，“球形”是指具有形成球形(例如，完全圆形球)或球形形状的弯曲表面(例如，在表面上可以具有波和起伏)的装置(例如，水凝胶胶囊或其他颗粒)。球体和球状物体可以通过围绕三个垂直轴a、b和c 中的每一个的圆形、椭圆形或组合的旋转来数学地定义。对于球体，三个轴的长度相同。通常，球状形状是具有彼此在10％、或5％或2.5％之内的半主轴的椭圆体(对于其平均表面)。球形或球状形状的直径是平均直径，例如半主轴的平均值。

如本文中使用的，术语“球状体”是指装置(例如，水凝胶胶囊或其他颗粒)，是指该装置具有(i)完美或经典的扁球形或长球形，或(ii)具有粗略地形成一个球体的表面，例如可能具有波浪和起伏，和/或可能是半主轴彼此在100％之内的椭圆形(对于其平均表面)。

如本文使用的，“受试者”是指人或非人动物。在实施例中，受试者是人(即，男性或女性，例如，任何年龄组，儿科受试者(例如，婴儿、儿童、青少年)或成年受试者(例如，年轻成人、中年成人、或老年成人))。在实施例中，受试者是非人动物，例如哺乳动物(例如小鼠、狗、灵长类动物(例如食蟹猴或恒河猴))。在实施例中，受试者是商业上相关的哺乳动物(例如，牛、猪、马、绵羊、山羊、猫或狗)或禽(例如，商业相关的禽，例如鸡、鸭、鹅或火鸡)。在某些实施例中，该动物是哺乳动物。该动物可以是雄性的或雌性的并且处于任何发育阶段。非人的动物可以是转基因动物。

如本文使用的，“总体积”是指多隔室装置的一个隔室内的体积，其包括被另一个隔室占据的空间。例如，两隔室装置的第二(例如，外)隔室的总体积是指第二隔室内的体积，其包括被第一隔室占据的空间。

本文使用的，“治疗”(“Treatment”、“treat”、和“treating”)是指减轻、逆转、缓解、延迟疾病、障碍或病症的一种或多种症状、表现或潜在病因的发作或抑制其进展中的一种或多种。在实施例中，治疗包括减轻、逆转、缓解、延迟疾病、障碍或病症的症状的发作或抑制其进展。在实施例中，治疗包括减轻、逆转、缓解、延迟疾病、障碍或病症的表现的发作或抑制其进展。在实施例中，治疗包括减轻、逆转、缓解、减轻或延迟疾病、障碍或病症的潜在原因的发作。在一些实施例中，“治疗”需要已经发展或已经观察到疾病、障碍或病症的体征或症状。在其他实施例中，在没有疾病或病症的体征或症状时施用治疗，例如在预防性治疗中。例如，先于症状的发作(例如，考虑症状历史和/或根据遗传的或其他易感因素)施用治疗至易感个体。症状已经解决后也可以继续治疗，例如，以延迟或防止复发。在一些实施例中，治疗包括预防，而在其他实施例中，治疗不包括预防。

如本文使用的，“冯维勒布兰德因子蛋白”或“VWF蛋白”是指包含天然存在的VWF蛋白或其变体(其具有如本领域认可的测定所确定的VWF 生物活性，例如FVIII结合活性，除非另有说明)的氨基酸序列的多肽。可以通过本文描述的装置产生的VWF蛋白(例如由装置中含有的工程化细胞表达)包括野生型灵长类动物(例如人)、猪、犬和鼠蛋白，以及此类野生型蛋白的变体。可以将包封的细胞工程化以编码以下任何VWF多肽：2813 个氨基酸的前体VWF，缺少22个氨基酸的信号肽和任选地741个氨基酸的前肽原的VWF，2050个氨基酸的成熟VWF蛋白及其截短型变体，例如足以稳定VWF缺陷型小鼠中的内源FVIII水平的VWF片段，例如含有D'D3 区(氨基酸764-1247)或D1D2D′D3区的截短型变体；以及例如在美国专利号9458223中描述的D'区具有一个或多个氨基酸取代的VWF变体。变体 VWF蛋白优选具有相应野生型VWF蛋白的至少50％、75％、90％或更多(包括>100％)的生物活性。用于确定VWF的生物活性的本领域公认的测定法包括瑞斯托菌素辅因子活性(Federici AB等人.2004.Haematologica[血液病学]89:77-85)，VWF与血小板糖蛋白复合物Ib-V-IX的GP Ibα的结合(Sucker 等人.2006.Clin Appl Thromb Hemost[血栓形成/止血临床和应用].12:305-310)，和胶原蛋白结合(Kallas&Talpsep.2001.Annals of Hematology[血液学年鉴]80:466-471)。

在一些实施例中，由本披露的装置产生的VWF蛋白包含与延长VWF 蛋白半衰期的异源多肽或非多肽部分融合的天然存在的或变体VWF氨基酸序列。示例性的延长半衰期的部分包括Fc、白蛋白、PAS序列、转铁蛋白、 CTP(人绒毛膜促性腺激素(hCG)的28氨基酸C-末端肽(CTP)及其4O- 聚糖)、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合多肽、结合白蛋白的小分子、或其任何组合。

选定的化学定义

下面更详细地描述了特定官能团和化学术语的定义。化学元素根据the PeriodicTable of the Elements[化学元素周期表],CAS版,Handbook of Chemistry and Physics[化学和物理手册],第75版,封二来鉴定，并且特定官能团总体上如其中所述来定义。另外，有机化学的通用原理以及特定的官能部分和反应性描述于Thomas Sorrell,OrganicChemistry[有机化学], University Science Books[大学科学书籍],索萨利托(Sausalito),1999；Smith 和March，March’s Advanced Organic Chemistry,[March高级有机化学],第5 版,约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.),纽约,2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations[综合有机转化],VCH出版社(VCH Publishers,Inc.),纽约,1989；和Carruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis,[一些现代有机合成方法],第3版,剑桥大学出版社(Cambridge University Press),剑桥,1987。

本文所用的缩写具有它们在化学和生物学领域中的常规含义。本文所阐述的化学结构和式是根据化学领域中已知的化学价的标准规则构建的。

当列举数值范围时，意图涵盖该范围内的每个数值和子范围。例如，“C

如本文使用的，“烷基”是指具有1至24个碳原子(“C

如本文使用的，“烯基”是指具有2至24个碳原子、一个或多个碳碳双键并且没有碳碳三键的直链或支链的烃基团(“C

如本文使用的，术语“炔基”是指具有2至24个碳原子、一个或多个碳碳三键的直链或支链的烃基团(“C

如在此使用的，术语“杂烷基”是指包括至少一个碳原子和至少一个选自由O、N、P、Si和S组成的组的杂原子的非环状稳定的直链或支链或其组合，并且其中氮和硫原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。一个或多个杂原子O、N、P、S和Si可被置于杂烷基的任意位置处。示例性杂烷基包括但不限于：-CH

除非另有说明，术语“亚烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”或“亚杂烷基”单独或作为另一取代基的一部分分别表示衍生自烷基、烯基、炔基或杂烷基的二价基团。亚烷基、亚烯基、亚炔基或亚杂烷基可描述为例如C

如在本文使用的，“芳基”是指具有6-14个环原子以及提供在芳香族环系统中的零个杂原子单环的或多环的(例如，二环的或三环的)4n+2芳香族环系统(例如，在环阵列中具有6、10、或14个π电子)的基团(“C

如在本文使用的，“杂芳基”是指具有环碳原子以及提供在该芳香族环系统中的1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧以及硫)的5-10 元单环的或二环的4n+2芳香族环系统(例如，在环阵列中具有6或10个π电子)的基团(“5-10元杂芳基”)。在包含一个或多个氮原子的杂芳基基团中，连接点可以是碳或氮原子，只要化合价允许。杂芳基二环环系统可以在一个或两个环中包括一个或多个杂原子。“杂芳基”也包括环系统，其中该杂芳基环，如以上定义的，是与一个或多个芳基基团融合的(其中连接处或者在芳基上或者在杂芳基环上)，并且在此类情况下，环成员的数目继续称作在该融合(芳基/杂芳基)环系统中的环成员的数目。在其中一个环不包括杂原子的二环杂芳基基团(例如，吲哚基、喹啉基、咔唑基等)中连接点可以是在其中一环上，即，或者该环承载杂原子(例如，2-吲哚基)或该环不包含杂原子(例如，5-吲哚基)。杂芳基基团可以描述为例如6-10元杂芳基，其中术语“元”是指该部分内的非氢环原子。

在一些实施例中，一个杂芳基基团是具有环碳原子以及提供在该芳香族环系统中的1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧以及硫)的 5-10元芳香族环系统(“5-10元杂芳基”)。在一些实施例中，一个杂芳基基团是具有环碳原子以及提供在该芳香族环系统中的1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧以及硫)的5-8元芳香族环系统(“5-8元杂芳基”)。在一些实施例中，一个杂芳基基团是具有环碳原子以及提供在该芳香族环系统中的1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧以及硫)的5-6元芳香族环系统(“5-6元杂芳基”)。在一些实施例中，该5-6 元杂芳基具有1-3个选自氮、氧以及硫的环杂原子。在一些实施例中，该5-6 元杂芳基具有1-2个选自氮、氧以及硫的环杂原子。在一些实施例中，该5-6 元杂芳基具有1个选自氮、氧以及硫的环杂原子。每个杂芳基基团的每个实例可以是独立地任选经取代地，即，未被取代的(“未被取代的杂芳基”) 或被一个或两个取代基取代的(“被取代的杂芳基”)。

含有1个杂原子的示例性5元杂芳基基团包括，但不限于吡咯基、呋喃基和苯硫基。包含两个杂原子的示例性5-元杂芳基基团包括但不限于，咪唑基、吡唑基、噁唑啉基、异噁唑啉基、噻唑基以及异噻唑基。包含三个杂原子的示例性5-元杂芳基基团包括但不限于，噻唑基、噁二唑基以及噻二唑基。包含四个杂原子的示例性5-元杂芳基基团包括但不限于，四唑基。包含一个杂原子的示例性6-元杂芳基基团包括但不限于，吡啶基。包含两个杂原子的示例性6-元杂芳基基团包括但不限于，哒嗪基、嘧啶基以及吡嗪基。包含三或四个杂原子的示例性6-元杂芳基基团包括但不限于，独自地三嗪基以及四嗪基。包含一个杂原子的示例性7-元杂芳基基团包括但不限于，氮杂卓基、氧杂卓基以及硫杂卓基。示例性5,6-二环杂芳基基团包括但不限于，吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并三唑基、苯并苯硫基、异苯并苯硫基、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噻二唑基、吲嗪基以及嘌呤基。示例性6,6- 二环杂芳基基团包括但不限于，萘啶基、蝶啶基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基、酞嗪基以及喹唑啉基。其他示例性杂芳基基团包括血红素和血红素衍生物。

如本文使用的，术语“亚芳基”和“亚杂芳基”(单独或作为另一取代基的一部分)分别表示衍生自芳基和杂芳基的二价基团。

如本文使用的，“环烷基”是指具有从3到10个环碳原子的非芳香族环状烃基(“C

在此使用的，“杂环基”是指具有环碳原子以及1至4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷以及硅)的3-至10-元非芳香族环系统的基团(“3-10元杂环基”)。在包含一个或多个氮原子的杂环基基团中，连接点可以是碳或氮原子，只要化合价许可。杂环基基团或者可以是单环的(“单环的杂环基”)或者是融合的、桥联的或螺的环系统(例如二环系统(“二环的杂环基”))并且可以是饱和的或可以是部分不饱和的。杂环基二环的环系统可以在一个或两个环中包括一个或多个杂原子。“杂环基”还包括其中如上所定义的该杂环基环被一个或多个杂环基基团稠合的环系统，其中附接点是在该杂环基或杂环基环或者其中如上所定义的该杂环基环被一个或多个芳基或杂芳基基团稠合的环系统上，其中附接点是在该杂环基环上，并且在此类情况下，环成员的数目继续指示该杂环基环系统中的环成员的数目。杂环基可以描述为例如3-7元杂环基，其中术语“元”是指在该部分内的非氢环原子，即碳、氮、氧、硫、硼、磷和硅。每个杂环基基团的每个实例可以是独立地任选经取代地，即，未被取代的(“未被取代的杂环基”)或被一个或两个取代基取代的(“被取代的杂环基”)。在某些实施例中，该杂环基基团是未取代的3-10元杂环基。在某些实施例中，该杂环基基团是取代的3-10元杂环基。

在一些实施例中，杂环基基团是具有环碳原子以及1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷以及硅)的5-10元非芳香族环系统(“5-10元杂环基”)。在一些实施例中，杂环基基团是具有环碳原子以及1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮，氧，以及硫)的5-8 元非芳香族环系统(“5-8元杂环基”)。在一些实施例中，杂环基基团是具有环碳原子以及1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮，氧，以及硫)的5-6元非芳香族环系统(“5-6元杂环基”)。在一些实施例中，该5-6 元杂环基具有1-3个选自氮、氧以及硫的环杂原子。在一些实施例中，该5-6 元杂环基具有1-2个选自氮、氧以及硫的环杂原子。在一些实施例中，该5-6 元杂环基具有一个选自氮、氧以及硫的环杂原子。

含有1个杂原子的示例性3元杂环基基团包括，但不限于氮丙啶基、环氧乙烷基(oxiranyl)、环硫乙烷基(thiorenyl)。包含一个杂原子的示例性4- 元杂环基基团包括但不限于，氮杂环丙基、环氧乙烷基以及硫杂环丙烷基。含有1个杂原子的示例性5元杂环基基团包括，但不限于四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢苯硫基、二氢苯硫基、吡咯烷基、二氢吡咯基以及吡咯基-2,5- 二酮。含有2个杂原子的示例性5元杂环基基团包括，但不限于二氧戊环基、氧杂硫杂环戊烷基、二硫杂环戊烷基以及噁唑烷-2-酮。包含三个杂原子的示例性5-元杂环基基团包括但不限于，三唑啉基、噁二唑啉基以及噻二唑啉基。含有1个杂原子的示例性6元杂环基基团包括，但不限于哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、二氢吡啶基以及硫杂环己烷基(thianyl)。含有2个杂原子的示例性6元杂环基基团包括，但不限于哌嗪基、吗啉基、二硫杂环己烷基、二氧杂环己烷基。含有两个杂原子的示例性6元杂环基包括但不限于三嗪基或硫代吗啉基-1,1-二氧化物。包含一个杂原子的示例性7-元杂环基基团包括但不限于，氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基以及硫杂环庚烷基。含有1个杂原子的示例性8元杂环基基团包括，但不限于氮杂环辛烷基、氧杂环辛烷基和硫杂环辛烷基。融合至C

如本文使用的，“氨基”是指基团-NR

如本文使用的，“氰基”是指基团-CN。

除非另有说明，本文使用的“卤基”或“卤素”独立地或作为另一取代基的一部分，是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)原子。

如本文使用的，“羟基”是指基团-OH。

如本文所定义的烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、和杂芳基基团是任选地被取代的(例如，“被取代的”或“未被取代的”烷基、“被取代的”或“未被取代的”烯基、“被取代的”或“未被取代的”炔基、“被取代的”或“未被取代的”杂烷基、“被取代的”或“未被取代的”环烷基、“被取代的”或“未被取代的”杂环基、“取被代的”或“未被取代的”芳基或“被取代的”或“未被取代的”杂芳基基团)。通常，术语“取代的”，无论是否在术语“任选地”之前，意味着存在于基团(例如，碳或氮原子)上的至少一个氢是被允许的取代基替换的，例如，取代后的取代基产生稳定的化合物，例如，不能自发地通过重排、环化、消除或其他反应进行转化的化合物。除非另作说明，“取代的”基团在该基团的一个或多个可取代的位置具有取代基，并且当在任何给出的结构中的多于一个位置被取代时，在每个位置的取代基或是相同的或是不同的。术语“被取代的”预期包括被有机化合物的所有允许的取代基的取代，例如在此描述的导致稳定化合物的形成的取代基的任何一个。本披露涵盖任何和所有此类组合以便实现稳定化合物。出于本披露的目的，杂原子(例如氮)可以具有氢取代基和 /或如在此描述的满足杂原子的化合价并且导致稳定部分的形成的任何合适的取代基。

两个或更多个取代基可任选地连接以形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环基。这种所谓的成环取代基通常但不一定与环状基础结构相连。在一个实施例中，成环取代基连接到基础结构的相邻成员上。例如，连接到环状基础结构的相邻成员上的两个成环取代基产生稠合的环结构。在另一个实施例中，成环取代基连接到基础结构的单一成员上。例如，连接到环状基础结构的单一成员上的两个成环取代基产生螺环结构。在又另一个实施例中，成环取代基连接到基础结构的非相邻成员上。

在此描述的具有式(I)的化合物可以包含一个或多个不对称中心，并且因此可以呈不同异构体形式存在，例如对映异构体和/或非对映异构体。例如，本文所述的化合物可以呈单独的对映异构体、非对映异构体或几何异构体的形式，或可以呈立体异构体混合物的形式，这些立体异构体混合物包括外消旋混合物以及富含一种或多种立体异构体的混合物。可以通过本领域技术人员已知的方法(包括手性高压液相色谱(HPLC)和手性盐的形成和结晶) 从混合物中分离异构体；或者优选的异构体可以通过不对称合成来制备。参见，例如，Jacques等人,Enantiomers,Racemates and Resolutions[对映异构体、外消旋体和拆分](威利国际科学出版社(Wiley Interscience),纽约,1981)； Wilen等人,Tetrahedron[四面体]33:2725(1977)；Eliel,Stereochemistry of Carbon Compounds[碳化合物的立体化学](McGraw-Hill,纽约,1962)；和 Wilen,Tables of Resolving Agents andOptical Resolutions[拆分剂表和光学拆分]第268页(E.L.Eliel编辑,巴黎圣母院大学出版社(Univ.of Notre Dame Press),Notre Dame,IN 1972)。另外，本发明涵盖如在此描述的呈单一的异构体(基本上不含其他异构体)的化合物，并且可替代地，呈多种异构体的混合物。

如本文使用的，纯对映体化合物基本上不含化合物的其他对映体或立体异构体(即，对映体过量)。换句话说，化合物的“S”形式基本上不含该化合物的“R”形式，因此是“R”形式对映异构体过量的。术语“对映体纯的”或“纯的对映体”表示该化合物包含大于75重量％、大于80重量％、大于 85重量％、大于90重量％、大于91重量％、大于92重量％、大于93重量％、大于94重量％、大于95重量％、大于96重量％、大于97重量％、大于 98重量％、大于99重量％、大于99.5重量％、大于99.9重量％的对映体。在某些实施例中，重量基于化合物的所有对映异构体或立体异构体的总重量。

本文所述的具有式(I)化合物还可包含一个或多个同位素取代。例如， H可以是任何同位素形式，包括

术语“药学上可接受的盐”意指包括活性化合物的盐，这些活性化合物取决于在此描述的化合物上发现的特定取代基用相对无毒的酸或碱制备。当本披露中使用的用于制备装置的具有式(I)的化合物含有相对酸性的官能团时，碱加成盐可以通过使这些化合物的中性形式与足量的所需碱(纯净的或在合适的惰性溶剂中)接触而获得。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐，或类似的盐。当本披露中使用的化合物含有相对碱性的官能团时，酸加成盐可以通过使这些化合物的中性形式与足量的所需酸(纯净的或在合适的惰性溶剂中)接触而获得。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸(如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等)的那些，以及衍生自有机酸(如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等)的盐。还包括氨基酸盐如精氨酸盐等，以及有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science[药物科学杂志]66:1-19(1977))。本披露的装置(例如，颗粒、水凝胶胶囊)中使用的某些特定化合物含有碱性和酸性官能团，其允许化合物转化成碱或酸加成盐。可以通过本领域技术人员已知的方法制备这些盐。本领域技术人员已知的其他药学上可接受的载体适用于本披露。

本披露的装置可以包含前药形式的具有式(I)的化合物。前药是那些在生理条件下容易发生化学变化以提供可用于制备本披露的装置的化合物。另外，前药可以通过化学或生物化学方法在离体环境中转化为有用的具有式(I) 的化合物。

本文所述的某些具有式(I)的化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在，包括水合形式。一般来说，溶剂化形式等效于非溶剂化形式并且包括在本披露的范围中。本文所述的某些具有式(I)的化合物可以以多种结晶或无定形形式存在。通常，所有物理形式对于本披露所考虑的用途是等同的，并且旨在落入本披露的范围内。

术语“溶剂化物”是指通常通过溶剂分解反应与溶剂相缔合的化合物的形式。这种物理缔合可以包括氢键结合。常规的溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、乙醚等。本文所述的化合物可以制备为例如结晶的形式，并且可以是被溶剂化的。适合的溶剂化物包括药学上可接受的溶剂化物并且进一步包括化学计量的溶剂化物和非化学计量的溶剂化物。

术语“水合物”是指与水相缔合的化合物。典型地，在化合物的水合物中所含的水分子的数目与水合物中的化合物分子的数目呈一定的比率。因此，化合物的水合物可以例如由通式R·x H

如本文使用的术语“互变异构体”是指以下化合物，其具有可互换形态的化合物结构并且在氢原子和电子移位方面变化。因此，两种结构可以通过π电子和原子(通常是H)的运动处于平衡。例如，烯醇和酮是互变异构体，因为通过用酸或碱的处理它们快速地相互转化。互变异构形式可以与获得目的化合物的最优化学反应性和生物活性相关。

本文使用的，符号

装置的特征

本披露的特征在于可植入装置，所述装置包含多个细胞(例如，活细胞)，所述细胞被聚合物组合物包封在第一细胞容纳隔室中，所述聚合物组合物包含至少一种细胞结合物质(CBS)(如本文定义的)。当将装置植入受试者(例如，人或其他哺乳动物受试者)中时，细胞能够表达治疗剂。此外，装置包含至少一种用于减轻FBR(如本文定义的)的器件。

在实施例中，细胞容纳隔室中CBS以在将装置植入免疫受损或免疫活性动物后的某个时间点，与如上文中定义的CBS无效的参比装置相比，有效增加细胞的存活力和/或增加细胞的生产力的量存在，所述免疫活性动物是例如免疫活性小鼠(例如，可从美国缅因州巴港的杰克逊实验室(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME USA)获得的C57BL/6J小鼠品系)。在实施例中，在植入后的期望时间点，例如在1天、3天、5天、1周、2周、4周、8周、 12周、24周、36周和48周中的一个或多个处，可检测到细胞存活力和/或生产力的增加。在实施例中，CBS的有效量导致(i)当在植入后1周、2周、 4周或12周测量时，细胞存活力增加至少10％、25％、50％或100％和(ii)当在植入后1周、2周、4周或12周测量时，细胞生产力增加至少1.25倍、1.5 倍、2倍、5倍、8倍或10倍。在实施例中，所述细胞容纳隔室中的CBS的有效量落在最小有效量和较高量之间的范围内，在该范围，与CBS无效参比装置相比或与细胞容纳隔室中包含最大有效量(例如最佳量)的CBS的装置相比细胞的存活力和/或生产力降低。在实施例中，细胞容纳隔室中的 CBS的量高于或低于最佳量不超过50％、25％、10％或5％，例如，导致与 CBS无效参考装置相比细胞存活力和/或生产力最大增加的量。在实施例中，针对所需的细胞、CBS、由细胞表达的治疗性蛋白质(例如工程化ARPE-19 细胞)、特定多肽(例如因子VIII、因子IX、因子VII)，并且任选地包括治疗性蛋白质的特定编码序列组合测量植入后实现增加的生产力的CBP的有效量。

可以使用本领域已知的任何技术来估计本文描述的装置中的存活(和任选地死亡)细胞的数量，包括用两种荧光染料差异标记活细胞和死细胞，然后使用荧光显微镜检查来检测和任选定量标记的细胞的测定法。细胞存活力也可以通过评估其他细胞活力指标来评估，包括测量酯酶活性或定量细胞中 ATP的量。

在实施例中，通过测定体内或离体细胞表达的治疗剂水平来检测植入后细胞生产力的增加(例如，已从动物中取出装置后的细胞表达)。取决于治疗剂的性质，可以在细胞内、细胞外但在装置内部和/或内部外部，例如在从经本文所述的装置或装置制品治疗的动物(例如，非人类动物)中取出的组织样品中测量其表达。在实施例中，细胞生产力表示为治疗剂或试剂活性的测量量除以所施用装置的数目(例如，放置在动物中的胶囊的数目)和/或所施用细胞的数目(例如，所施用的胶囊制品中每个胶囊的大约细胞数，例如，如以下实例中所述确定的)。在实施例中，通过将确定的量(例如，治疗剂或活性的量)除以两个目的时间点之间的时间，例如在施用和测量之间，例如小时数、天数或周数，来进一步标准化细胞生产力的增加。在实施例中，治疗剂是蛋白质，并且生产力的增加通过测量从动物中取出的组织样品(例如，从动物收集的血液样品中分离的血浆)中蛋白质的量和/或活性)，将测得的量和/或活性除以所施用装置的数量(例如植入的两隔室胶囊的数量)，并任选地将结果除以施用与组织样品取出之间的天数来确定。

CBS可以包含位于包封性聚合物组合物内的多肽聚合物(例如，CBPP，像纤连蛋白或层粘连蛋白)或其可以是CBP，所述CBP共价附接到不相关氨基酸聚合物(例如，丝聚合物)或共价附接到的天然存在的聚合物(例如，藻酸盐、几丁质、棉)或共价附接到合成聚合物(例如，以下类别中任一种中的聚合物：丙烯酸、聚酯、聚乙烯、聚丙烯聚乙腈、聚对苯二甲酸乙二酯、尼龙、聚酰胺、聚氨酯、聚丁酯)。除CBS以外，细胞容纳隔室中的聚合物组合物可包含上述任何聚合物类别的一种或多种未修饰的天然存在或合成聚合物，以帮助提供隔室的结构完整性和/或帮助提供用于支撑细胞的支架。

在一些实施例中，CBS包括经一个或多个CBP(例如RGD(SEQ ID NO: 43)、RGDSP(SEQ ID NO:59)、DGEA(SEQ ID NO:39)、FYFDLR(SEQ ID NO:40)、PHSRN(SEQ ID NO:46)、YIGSR(SEQ ID NO:50))、包含或基本由本文表1中所列的任何细胞结合序列组成的肽、或这些CBP(例如， RGD+DGEA(分别为SEQ ID NO:43和39)、RGD+PHSRN(分别为SEQ ID NO：43和46)、RGD+DGEA+PHSRN(分别为SEQ ID NO:43、39和 46))的2、3或更多个的混合物)共价修饰的藻酸盐。藻酸盐是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)组成的多糖。在一些实施例中，藻酸盐是高古洛糖醛酸(G)藻酸盐，并且包含大于约50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％或更多古洛糖醛酸(G)。在一些实施例中， G:M比是至少1.3、1.5或大于1.5。在一些实施例中，藻酸盐是高甘露糖醛酸(M)藻酸盐，并且包含大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％或更多甘露糖醛酸(M)。在一些实施例中，M:G的比例为约1。在一些实施例中，M:G的比例为小于1。

在实施例中，每个CBP经由氨基酸接头(例如，基本上由一个、两个或三个甘氨酸残基组成)附接到藻酸盐上。在实施例中，接头是附接到CBP 的N端的单个甘氨酸残基。在实施例中，第一CBS是经RGD肽共价修饰的聚合物。在实施例中，第一CBS是分子量为75-150kDa并且G:M比为大于或等于1.5的藻酸盐，并经基本上由GRGD(SEQ ID NO:62)或GRGDSP (SEQ IDNO:60)组成的接头-CBP共价修饰。

在实施例中，每个CBP可以在CBP的自由末端，例如CBP的非接头末端上进一步包含末端封端基团或保护基。末端封端基团或保护基可以防止末端氨基酸残基发生不想要的或不必要的反应和/或减少或防止CBP的降解或修饰。示例性的封端基团包括烷基、醚、酰胺等。在实施例中，接头-CBP 包括GRGD或GRGDSP以及末端封端基团。在实施例中，接头-CBP包括 GRGD或GRGDSP且不含末端封端基团。

在实施例中，细胞容纳隔室中的包封性聚合物组合物可包含一种或多种另外的细胞结合物质，所述细胞结合物质可以是CBPP或经CBP共价修饰的聚合物。在实施例中，聚合物组合物还包含第二CBP-藻酸盐，例如，经选自由以下组成的组的接头-CBP共价修饰的藻酸盐：G

如下文实例中所述，令人惊奇地发现，当将RGD-修饰的藻酸盐用于将工程化RPE细胞包封在两隔室水凝胶胶囊的内隔室中时，包封的细胞的生产力会受到修饰的藻酸盐中RGD肽的密度的显著影响。因此，在一些实施例中，用于形成细胞容纳隔室的CBP-聚合物中的细胞结合肽(例如RGD (SEQ ID NO：43)或RGDSP(SEQ ID NO：59))的密度为(a)0.10％氮(N)至1.00％N、约0.20％N至约0.80％N、约0.30％N至约0.60％N、约0.30％至约0.50％或0.33％N至0.46％N，或(b)溶液中每克CBP-聚合物(例如，经 RGD(SEQ ID NO：43)或RGDSP(SEQ ID NO：59)共价修饰的MMW- 藻酸盐)约0.1至约1.0微摩尔CBP，如通过定量肽缀合测定，例如本文所述的测定法所确定的。在实施例中，包封的细胞是工程化ARPE-19细胞。在实施例中，工程化ARPE-19细胞是稳定转染的细胞或源自ATCC (CRL-2302)的单克隆细胞系。在实施例中，工程化ARPE-19细胞表达因子VIII或因子IX蛋白。在其中装置在细胞容纳隔室中包含不同CBP-聚合物的混合物的一些实施例中，细胞容纳隔室中细胞结合肽的总密度是溶液中每克CBP-聚合物0.1％氮(N)至1.00％N、约0.20％N至约0.80％N、约0.30％ N至约0.60％N或约0.30％N至约0.50％N或约0.1至约1.0微摩尔CBP，如通过定量肽缀合测定，例如本文所述的测定法所确定的。

在实施例中，定量肽缀合测定包括使CPB聚合物的样品经受酸水解以从缀合肽(和CBP-聚合物中的任何残留的未缀合肽)产生单个氨基酸，定量所述单个氨基酸，取每种氨基酸的摩尔浓度的平均值，并计算样品中的总肽浓度。在实施例中，基本上与本文实例25中描述的过程相似地进行定量肽缀合测定。在实施例中，定量肽缀合测定还包括从总肽浓度中减去样品中任何残留的未缀合肽的浓度。可以使用本领域已知的任何合适的测定法，例如通过如本文实例26中所述的LC-MS，来确定CBP-聚合物组合物中的未缀合肽的浓度。通常，定量肽缀合测定是在用于制备装置的CBP-聚合物的盐溶液的样品上进行的，但是也可以在CBP-聚合物的冻干样品上进行。

可以使用本领域已知的多种方法中的任一种，用CBP对聚合物进行共价修饰，参见例如Jeon O等人,Biodegradable,photocrosslinked alginate hydrogels withindependently tailorable physical properties and cell adhesivity.[具有可独立调整的物理性质和细胞粘附性的可生物降解的、光交联的藻酸盐水凝胶]Tissue Eng.PartA[组织工程部分A]16:2915-2925 (2010)；Rowley,J.A.等人,Biomaterials[生物材料]20:45-53(1999)。例如，当待修饰的聚合物是藻酸盐时，使用类似于下文实例1B中描述的方法可以将基本上由氨基酸接头序列(具有一个至几个氨基酸)和细胞结合氨基酸序列组成的肽的N端共价附接到藻酸盐。

除了细胞容纳隔室中的聚合物组合物外，装置(例如，宏装置、颗粒、水凝胶胶囊)可以包括或由诸如金属、金属合金、陶瓷、聚合物、纤维、惰性材料及其组合的材料形成。装置可以完全由一种类型的材料制成，或者可以在细胞容纳隔室和任何其他隔室内包含其他材料。

在本披露的装置中用于减轻FBR的器件可以包括本领域已知的多种方法中的一种或多种。

例如，本披露的装置中用于减轻FBR的器件可以包括在细胞周围包裹半透性生物相容性膜，该膜的孔径经选择可允许氧气和其他对细胞存活并起重要作用的分子穿过该半透性膜，同时防止免疫细胞穿过孔。在实施例中，半透性膜具有小于1000kD或在50-700kD、70-300kD之间或在70-150kD 之间、或在70-130kD之间的分子量截留值。

另一种减轻FBR的器件包括用由无细胞生物相容性材料形成的屏障隔室围绕细胞容纳隔室，例如Ma,M等人,Adv.Healthc Mater.[医疗保健材料], 2(5):667-672(2012)中描述的核-壳微胶囊。这种屏障隔室可以与半透性构件器件一起使用或不与之一起使用。减轻FBR的器件可包括在装置上或装置内放置从植入装置释放的抗炎药以抑制FBR，例如，如美国专利号9,867,781 中所述。如WO 2017/176792和WO 2017/176804中所述，其他减轻FBR的器件采用CSF-1R抑制剂，其被布置在装置表面上或包封在装置内。如在 Veiseh,O.等人,Nature Materials[自然材料]14:643-652(2015)中所述，其他 FBR减轻器件采用将装置为直径大于1mm的球形的配置。在一些实施例中，用于减轻FBR的器件包括将去纤维化化合物设置在装置的外表面上和/或设置在环绕细胞容纳隔室的屏障隔室内。下文描述了示例性去纤维化化合物。在一些实施例中，该装置可以包括上述FBR减轻器件中的两个或更多个的组合。

所述装置(例如，颗粒)可以具有适合于在植入到预期的目标位置之后支持包封的细胞的生存力和生产力的任何构造和形状。作为非限制性实例，装置形状可以是圆柱体、矩形、盘形、卵形、星状或球形。装置可以包括网状或嵌套结构。在一些实施例中，装置能够防止超过一定尺寸的材料通过孔或开口。在一些实施例中，装置(例如，颗粒)能够防止大于50kD、75kD、 100kD、125kD、150kD、175kD、200kD、250kD、300kD、400kD、500 kD、750kD、或1,000kD的材料通过。

在实施例中，装置是宏包封装置。宏包封装置的非限制性实例描述于：美国专利号9,526,880、9724430和8278106；欧洲专利号EP742818B1，以及Sang,S.和Roy,S.,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程] 113(7):1381-1402(2016)。

在一些实施例中，装置(例如，颗粒)具有最大线性尺寸(LLD)，例如平均直径或大小是至少约0.5毫米(mm)，优选约1.0mm、约1.5mm或更大。在一些实施例中，装置的直径或尺寸可以大至10mm。例如，本文所述的装置或颗粒的尺寸范围是0.5mm至10mm、1mm至10mm、1mm至 8mm、1mm至6mm、1mm至5mm、1mm至4mm、1mm至3mm、1mm 至2mm、1mm至1.5mm、1.5mm至8mm、1.5mm至6mm、1.5mm至5 mm、1.5mm至4mm、1.5mm至3mm、1.5mm至2mm、2mm至8mm、 2mm至7mm、2mm至6mm、2mm至5mm、2mm至4mm、2mm至3mm、 2.5mm至8mm、2.5mm至7mm、2.5mm至6mm、2.5mm至5mm、2.5mm 至4mm、2.5mm至3mm、3mm至8mm、3mm至7mm、3mm至6mm、 3mm至5mm、3mm至4mm、3.5mm至8mm、3.5mm至7mm、3.5mm 至6mm、3.5mm至5mm、3.5mm至4mm、4mm至8mm、4mm至7mm、4mm至6mm、4mm至5mm、4.5mm至8mm、4.5mm至7mm、4.5mm 至6mm、4.5mm至5mm、5mm至8mm、5mm至7mm、5mm至6mm、 5.5mm至8mm、5.5mm至7mm、5.5mm至6mm、6mm至8mm、6mm 至7mm、6.5mm至8mm、6.5mm至7mm、7mm至8mm、或7.5mm至 8mm。

所述装置可以形成制品(例如，组合物)中的多个基本上相同的装置的一部分。在一些实施例中，制品中的装置(例如，颗粒、水凝胶胶囊)的平均直径或尺寸在约0.5mm至约8mm之间。在一些实施例中，制品中的装置的平均直径或尺寸在约0.5mm至约4mm之间、或在约0.5mm至约2mm 之间。在一些实施例中，制品中的装置是两隔室水凝胶胶囊且平均直径或尺寸为约0.7mm至约1.3mm或约1.2mm至约1.8mm。

在一些实施例中，装置具有两个水凝胶隔室，其中内、细胞容纳隔室完全被第二、外(例如，屏障)隔室环绕。在实施例中，第二隔室的内边界与第一隔室的外边界形成界面，例如，如图1所示。在这样的实施例中，第二 (外)隔室的厚度是指第二隔室的外边界与两个隔室之间的界面之间的平均距离，例如，在外隔室中在视觉上观察到的最薄和最厚点处各自测得的距离的平均值。在一些实施例中(例如，该装置的直径为约1.5mm)，外隔室的最薄和最厚距离分别在25至110微米(μm)之间和在270至480μm之间。在一些实施例中，外隔室的厚度大于约10纳米(nm)，优选100nm或更大并且可以大至1毫米(mm)。例如，本文所述的水凝胶胶囊装置中的外隔室的厚度(例如，平均距离)可以是10nm至1mm、100nm至1mm、500nm 至1毫米、1微米(μm)至1mm、1μm至1mm、1μm至500μm、1μm 至250μm、1μm至1mm、5μm至500μm、5μm至250μm、10μm至1mm、 10μm至500μm、或10μm至250μm。在一些实施例中，外隔室的厚度(例如，平均距离)为100nm至1mm、1μm至1mm之间、1μm至500μm之间或5μm至1mm之间。在一些实施例中，外隔室的厚度(例如，平均距离)在约50μm和约100μm之间。在实施例中(例如，该装置的直径为约 1.5mm)，外隔室的厚度(例如，平均距离)在约180μm和260μm之间或在约310μm和440μm之间。

在一些实施例中，本披露的装置(例如，颗粒、胶囊)包含至少一个孔或开口，例如以允许材料的自由流动。在一些实施例中，装置的平均孔径在约0.1μm至约10μm之间。例如，平均孔径可以是0.1μm至10μm,0.1μm 至5μm、0.1μm至2μm、0.15μm至10μm、0.15μm至5μm、0.15μm至 2μm、0.2μm至10μm、0.2μm至5μm、0.25μm至10μm、0.25μm至5μm、 0.5μm至10μm、0.75μm至10μm、1μm至10μm、1μm至5μm、1μm 至2μm、2μm至10μm、2μm至5μm、或5μm至10μm。在一些实施例中，装置的平均孔径在约0.1μm至10μm之间。在一些实施例中，装置的平均孔径在约0.1μm至5μm之间。在一些实施例中，装置的平均孔径在约 0.1μm至1μm之间。在两隔室水凝胶胶囊装置的一些实施例中，细胞容纳内隔室和外隔室的平均孔径基本相同。在一些实施例中，内隔室和第二隔室的平均孔径相差约1.5％、2％、5％、7.5％、10％、15％、20％、25％、30％、 35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或更多。在一些实施例中，装置的平均孔径(例如，第一隔室的平均孔径和/或第二隔室的平均孔径)取决于许多因素，例如每个隔室内的材料和具有式(I)的化合物的存在和密度。

在一些实施例中，装置包含金属或金属合金。在实施例中，装置中的一个或多个隔室(例如，第一隔室、第二隔室或所有隔室)包含金属或金属合金。示例性金属或金属合金包括钛和钛族合金(例如，镍钛诺、镍钛合金、热记忆合金材料)、铂、铂族合金、不锈钢、钽、钯、锆、铌、钼、镍铬合金、铬钼合金或某些钴合金(例如钴-铬和钴-铬-镍合金，例如

在一些实施例中，该装置包含陶瓷。在实施例中，装置中的一个或多个隔室(例如，第一隔室、第二隔室或所有隔室)包含陶瓷。示例性陶瓷材料包括过渡元素的氧化物、碳化物或氮化物，例如氧化钛、氧化铪、氧化铱、氧化铬、氧化铝和氧化锆。也可以使用硅基材料，例如二氧化硅。在含陶瓷的装置中，陶瓷的量(例如，以％重量，实际重量计)可以是至少5％，例如，至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多，例如w/w；少于20％，例如少于20％、15％、10％、5％、1％、 0.5％、0.1％或更少。

在一些实施例中，装置中的一个或多个隔室包含去纤维化聚合物，例如共价附接到与CBP-聚合物中的聚合物相同或不同的聚合物的具有式(I)的去纤维化化合物。在实施例中，去纤维化聚合物中的一些或所有单体用相同的具有式(I)的化合物修饰。在一些实施例中，去纤维化聚合物中的一些或所有单体用不同的具有式(I)的化合物修饰。在其中装置是两隔室水凝胶胶囊的一些实施例中，去纤维化聚合物仅存在于外屏障隔室中。

装置中的一个或多个隔室可以包含未修饰的聚合物，该聚合物与CBP- 聚合物中以及该装置中存在的任何去纤维化聚合物中的聚合物相同或不同。在实施例中，装置中的第一隔室、第二隔室或所有隔室都包含未修饰的聚合物。

装置中的每种修饰和未修饰的聚合物可以是线性、支链或交联聚合物，或具有选择的分子量范围、聚合度、粘度或熔体流动速率的聚合物。支链聚合物可包括以下一种或多种类型：星形聚合物、梳形聚合物、刷状聚合物、树枝化聚合物、梯状和树枝状聚合物。聚合物可以是热响应性聚合物，例如凝胶(例如，在暴露于热或某一温度后变成固体或液体)或可光交联的聚合物。示例性聚合物包括聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙炔、聚(氯乙烯)(PVC)、聚烯烃共聚物、聚(氨酯)、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚酯、聚硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚醚、聚(原酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(羟基链烷酸酯)、聚氟烃、

在一些实施例中，装置中的一种或多种修饰和未修饰的聚合物包含聚乙烯。示例性的聚乙烯包括超低密度聚乙烯(ULDPE)(例如，具有密度为0.890 至0.905g/cm

在一些实施例中，装置中的一种或多种修饰和未修饰的聚合物包含聚丙烯。示例性的聚丙烯包括均聚物、无规共聚物(同相共聚物)和抗冲共聚物(多相共聚物)，例如McKeen,Handbook of Polymer Applications in Medicine and Medical Devices[医药和医疗器械中的聚合物应用手册],3-Plastics Used in Medical Devices[3-医疗器械中使用的塑料](2014):21-53中所述，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施例中，装置中的一种或多种修饰和未修饰的聚合物包含聚丙烯。示例性的聚苯乙烯包括通用目的或晶体(PS或GPPS)、高抗冲击性 (HIPS)和间同立构(SPS)聚苯乙烯。

在一些实施例中，设备中的一种或多种修饰和未修饰的聚合物包含热塑性弹性体(TPE)。示例性TPE包括(i)TPA-聚酰胺TPE，其包含交替的硬和软区段的具有硬嵌段中的酰胺化学键和软嵌段中的醚和/或酯键的嵌段共聚物；(ii)TPC-共聚酯TPE，由交替的硬区段和软区段的嵌段共聚物组成，主链中的化学键为酯和/或醚；(iii)TPO-烯烃TPE，由聚烯烃和常规橡胶的共混物组成，该共混物中的橡胶相具有很少或没有交联；(iv)TPS-苯乙烯类TPE，至少由苯乙烯和特定二烯的三嵌段共聚物组成，其中两个末端嵌段(硬嵌段)是聚苯乙烯且内部嵌段(一个或多个软嵌段)是聚二烯或氢化聚二烯； (v)TPU-聚氨酯TPE，由交替的硬和软区段的嵌段共聚物组成，在硬嵌段中具有聚氨酯化学键，在软嵌段中具有醚、酯或碳酸酯键或它们的混合；(vi) TPV-热塑性硫化橡胶，由热塑性材料和常规橡胶的混合物组成，其中橡胶在共混和混合步骤中通过动态硫化过程交联；和(vii)TPZ-未分类的TPE，其包含除TPA、TPC、TPO、TPS、TPU和TPV分组的那些之外的任何组合物或结构。

在一些实施例中，未修饰的聚合物是未修饰的藻酸盐。在一些实施例中，藻酸盐是高古洛糖醛酸(G)藻酸盐，并且包含大于约50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多古洛糖醛酸(G)。在一些实施例中，藻酸盐是高甘露糖醛酸(M)藻酸盐，并且包含大于约50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多甘露糖醛酸(M)。在一些实施例中，M:G的比例为约1。在一些实施例中，M:G的比例为小于1。在一些实施例中，M:G的比例为大于1。在实施例中，未修饰的藻酸盐分子量为150 kDa至250kDa，并且G:M比≥1.5。

在一些实施例中，去纤维化聚合物包含经具有式(I)的化合物化学修饰的藻酸盐。去纤维化聚合物中的藻酸盐可以与本装置中存在的任何未修饰的藻酸盐相同或不同。在实施例中，去纤维化藻酸盐中具有式(I)的化合物的密度(例如，缀合量)在约4.0％和约8.0％之间、在约5.0％和约7.0％之间、或在约6.0％和约7.0％氮之间(例如，如通过氮百分比燃烧分析测量的)。在实施例中，化合物101产生约0.5％至2％2％至4％N、约4％至6％N、约6％至8％或约8％至10％N的％N增加(与未修饰的藻酸盐相比)，其中％N通过燃烧分析确定并且对应于经修饰的藻酸盐中的化合物101的量。

在其他实施例中，去纤维化藻酸盐中具有式(I)的化合物(例如，化合物101)的密度(例如，浓度)定义为％w/w，例如胺的重量/溶液中去纤维化藻酸盐的重量的％，如通过合适的定量胺缀合测定(例如通过本文所述的测定)所确定的，并且在某些实施例中，具有式(I)的化合物(例如，化合物101)的密度在约1.0％w/w和约3.0％w/w之间、在约1.3％w/w和约2.5％ w/w之间或在约1.5％w/w和2.2％％w/w之间。在实施例中，定量胺缀合测定包括使化学修饰的聚合物(例如，具有式(I)的化合物，例如 CM-LMW-Alg-101修饰的藻酸盐)的样品进行酸水解以生成游离胺并定量样品中的总游离胺。在实施例中，定量胺缀合测定还包括从总胺浓度中减去未水解样品中未缀合胺(例如，具有式(I)的化合物)的浓度。通常，定量胺缀合测定是在用于制备装置的化学修饰的藻酸盐的盐溶液的样品上进行的，但是也可以在化学修饰的藻酸盐的冻干样品上进行。在实施例中，基本上与本文实例27中描述的过程相似地进行定量胺缀合测定。在实施例中，具有式(I)的化合物是表4中所示的化合物101。

在含藻酸盐的装置中，经修饰和未修饰的藻酸盐的量(例如，以％装置的重量，藻酸盐的实际重量计)可以是至少5％，例如，至少5％、10％、20％、 30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多，例如，w/w；少于20％，例如少于20％、15％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％或更少。

可以使用本领域已知的任何合适的方法用具有式(I)的化合物对去纤维化聚合物中的藻酸盐进行化学修饰。例如，可以活化藻酸盐羧酸部分以与一个或多个胺官能化化合物偶联，以获得用具有式(I)的化合物修饰的藻酸盐。可以将藻酸盐聚合物溶解在水(30mL/g聚合物)中并用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(0.5当量)和N-甲基吗啉(1当量)处理。向此混合物中添加具有式(I)的化合物于乙腈(0.3M)中的溶液。将反应温热至55℃保持 16h，然后冷却至室温并且经由旋转蒸发轻轻浓缩，然后可将残余物溶于例如水中。然后可以将混合物过滤，例如通过氰基修饰的硅胶床(Silicycle) 过滤，并且将滤饼用水洗涤。然后可将所得溶液用水进行透析(10,000MWCO 膜)24小时，例如，水被更换两次。可以例如经由冷冻干燥浓缩所得溶液，得到所需的化学修饰的藻酸盐。

本文描述的每个装置包含至少一个细胞容纳隔室。在实施例中，装置包含两个、三个、四个或更多个细胞容纳隔室。每个细胞容纳隔室包含多个细胞(例如，活细胞)并且当将装置植入到受试者中时，在这些隔室的至少一个中的细胞能够表达治疗剂。在一些实施例中，治疗剂是蛋白质或多肽，例如抗体、蛋白质、酶或生长因子。

在实施例中，细胞容纳隔室中的所有细胞衍生自单个亲本细胞类型或至少两种不同亲本细胞类型的混合物。在实施例中，细胞容纳隔室中的所有细胞均衍生自相同的亲本细胞类型，但第一多个衍生细胞经工程化以表达第一治疗剂，而第二多个衍生细胞经工程化以表达第二治疗剂。在具有两个或更多个细胞容纳隔室的装置中，每个细胞容纳隔室中的细胞和由此产生的治疗剂可以相同或不同。在一些实施例中，全部细胞容纳隔室被单个屏障隔室环绕。在一些实施例中，屏障隔室是基本上无细胞的。

除了被包封的细胞表达的治疗剂外，装置(例如，胶囊、颗粒)还可以包括细胞不表达的一种或多种外源剂，并且可以包括例如核酸(例如，RNA 或DNA分子)、蛋白质(例如激素、酶(例如，葡萄糖氧化酶、激酶、磷酸酶、加氧酶、氢化酶、还原酶)抗体、抗体片段、抗原或表位)、小分子、脂质、药物、疫苗或其任何衍生物，蛋白质或多肽的小分子、有活性或无活性片段。在实施例中，该装置被配置成释放这种外源剂。

可以作为用于植入或施用于受试者的制品或组合物提供本文所述的装置(即，装置制品或装置组合物)。在一些实施例中，装置制品或装置组合物包含至少2、4、8、16、32、64或更多个装置，并且制品或组合物中的至少20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％、95％或100％的装置具有如本文所述的特征，例如平均直径或平均孔径或细胞密度。

在一些实施例中，装置、装置制品或装置组合物靶标是或设计针对身体某个系统，例如神经系统(例如，外周神经系统(PNS)或中枢神经系统 (CNS))、血管系统、骨骼系统、呼吸系统、内分泌系统、淋巴系统、生殖系统或胃肠道。在一些实施例中，装置、制品或组合物靶标是CNS。在一些实施例中，装置、装置制品或装置组合物靶标是或设计针对身体的一部分，例如血液、眼睛、脑、皮肤、肺、胃、口、耳、腿、足、手、肝、心脏、肾、骨、胰腺、脾脏、大肠、小肠、脊髓、肌肉、卵巢、子宫、阴道或阴茎。

装置、装置制品或装置组合物可以被配置用于植入，或植入或设置在身体的任何部位中或之上。在一些实施例中，装置、装置制品或装置组合物被配置用于植入，植入或设置于受试者的网膜中，受试者的皮下脂肪中，或受试者的肌肉组织中。装置、装置组合物或装置制品可以配置用于植入，或植入或设置在皮肤上或皮肤中；粘膜表面、体腔、腹膜腔(例如小网膜囊)；中枢神经系统，例如脑或脊髓；器官，例如心脏、肝、肾、脾、肺、淋巴系统、脉管系统、口腔、鼻腔、牙齿、牙龈、胃肠道；骨；臀部；脂肪组织；肌肉组织；循环血液；眼睛(例如，眼内)；乳房、阴道；子宫、关节，例如膝关节或髋关节，或脊柱。

在一些实施例中，装置、装置制品或装置组合物被配置用于植入或植入或设置于腹膜腔(例如，网膜)中。在一些实施例中，装置被配置用于植入或植入或设置于小网膜囊(也称为网膜囊(omental bursa)或法氏囊网膜(bursalis omentum))中或小网膜囊上。小网膜囊指的是由网膜形成的位于腹部的腔，并且紧邻例如大网膜、小网膜、胃、小肠、大肠、肝、脾、胃脾韧带、肾上腺、和胰腺。通常，小网膜囊经由网膜孔(即，温斯洛孔(Foramen ofWinslow))连接到较大膜囊。在一些实施例中，小网膜囊包含高浓度的脂肪组织。可以经由注射或导管将装置、装置制品或装置组合物植入腹膜腔(例如，网膜，例如小网膜囊)中或者设置于腹膜腔内的表面(例如，网膜，例如小网膜囊)。M.Pellicciaro等人(2017)CellR4 5(3):e2410(其通过引用整体并入本文)提供了将装置、装置制品或装置组合物植入或设置于网膜(例如小网膜囊)中的其他考虑因素。

在一些实施例中，装置、装置制品或装置组合物被配置用于植入或植入或设置于中枢神经系统(CNS)中，例如脑或脊髓及其相应的组织和腔。在脊椎动物中，CNS包含在背部体腔内，包括颅腔和椎管。在一些实施里中，装置、装置组合物或装置制品被配置用于植入或植入或设置于脑内空间，例如实质内空间、心室内空间或硬膜下空间。装置、装置组合物或装置制品可以植入CNS中或经由颅骨中形成的孔并经由注射或导管递送设置在CNS内的表面上。

在一些实施例中，装置、装置组合物或装置制品被配置用于植入或植入或置于眼睛中。适于植入或设置装置的示例性区域包括眼内的任何表面或腔，例如视网膜、角膜、上皮、房水或玻璃体空间。在一些实施例中，装置、装置组合物或装置制品被配置用于植入或植入或置于玻璃体空间中。装置、装置制品或装置组合物可以植入眼睛中或通过切口和/或注射设置在眼睛内的表面上。

在一些实施例中，装置或装置制品易于从受试者回收，例如，不会对受试者造成伤害或不会引起周围组织的显著破坏。在实施例中，可以在装置或装置制品与周围组织的手术分离最小或没有的情况下回收装置，例如，经由最小微创手术方法、提取或切除。

装置、装置组合物或装置制品可以配置用于植入哺乳动物受体后多种暴露，包括：有限的暴露(例如，少于2天，例如，少于2天、1天、24小时、 20小时、16小时、12小时、10小时、8小时、6小时、5小时、4小时、3 小时、2小时、1小时或更短时间)；长时间暴露(例如，至少2天、3天、4 天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、1个月、2个月、3 个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、 12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、 20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、1年、1.5年、2年、2.5年、 3年、3.5年、4年或更长时间)和永久暴露(例如，至少6个月、7个月、8 个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16 个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、 24个月、1年、1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年或更长时间)。

在一些实施例中，装置不是WO 2012/112982、WO 2012/167223、WO 2014/153126、WO 2016/019391、WO 2016/187225、US 2012-0213708、US 2016-0030359、和US 2016-0030360中任一项中披露的任何胶囊、装置、植入物或其他物体。

小分子化合物

在一些实施例中，本文所述的装置包含至少一种具有式(I)的化合物：

或者其药学上可接受的盐，其中：

A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-O-、 -C(O)O-、-C(O)-、-OC(O)-、-N(R

L

L

M是不存在、烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自任选地被一个或多个R

P是不存在、环烷基、杂环基、或杂芳基，其各自任选地被一个或多个 R

Z是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、-OR

每个R

或R

每个R

每个R

每个R

x是1或2；并且

y是2、3或4。

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-a)的化合物：

或者其药学上可接受的盐，其中：

A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-O-、 -C(O)O-、-C(O)-、-OC(O)-、-N(R

L

L

M是不存在、烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自任选地被一个或多个R

P是任选被一个或多个R

Z是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基、其各自任选地被一个或多个R

每个R

或R

每个R

每个R

每个R

x是1或2；并且

y是2、3或4。

在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-O-、-C(O)O-、-C(O)-、-OC(O)-、-N(R

在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，L

在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，L

在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，M是不存在、烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基。在一些实施例中，M是杂烷基、芳基、或杂芳基。在一些实施例中，M是不存在。在一些实施例中，M是烷基(例如C

在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，P是不存在、杂环基、或杂芳基。在一些实施例中，P是不存在。在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，P是三环的、二环的或单环的杂芳基。在一些实施例中，P是单环的杂芳基。在一些实施例中，P是含氮杂芳基。在一些实施例中，P是单环的含氮杂芳基。在一些实施例中，P是5元杂芳基。在一些实施例中，P是5元含氮杂芳基。在一些实施例中，P是四唑基、咪唑基、吡唑基或三唑基、吡咯基、噁唑基或噻唑基。在一些实施例中，P是四唑基、咪唑基、吡唑基或三唑基，或吡咯基。在一些实施例中，P是咪唑基。在一些实施例中，P是

在一些实施例中，P是杂环基。在一些实施例中，P是5元杂环基或6 元杂环基。在一些实施例中，P是咪唑啉酮。在一些实施例中，P是

在一些实施例中，P是

在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，Z是烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基。在一些实施例中，Z是杂环基。在一些实施例中， Z为单环或双环杂环基。在一些实施例中，Z是含氧杂环基。在一些实施例中，Z是4元杂环基，5元杂环基或6元杂环基。在一些实施例中，Z是6 元杂环基。在一些实施例中，Z是6元含氧杂环基。在一些实施例中，Z是四氢吡喃基。在一些实施例中，Z是

在一些实施例中，Z是二环含氧杂环基。在一些实施例中，Z是邻苯二甲酸酐。在一些实施例中，Z是含硫杂环基。在一些实施例中，Z是6元含硫杂环基。在一些实施例中，Z是含有氮原子和硫原子的6元杂环基。在一些实施例中，Z是硫代吗啉基-1,1-二氧化物。在一些实施例中，Z是

在一些实施例中，Z是二环杂环基。在一些实施例中，Z是任选地被一个或多个R

在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，Z是芳基。在一些实施例中，Z 是单环芳基。在一些实施例中，Z是苯基。在一些实施例中，Z是单取代的苯基(例如，被1个R

在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，Z是烷基。在一些实施例中，Z 是C

在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，Z是杂烷基。在一些实施例中， Z是C

在一些实施例中，Z是-OR

在一些实施例中，Z是氢。

在一些实施例中，L

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-b)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环M

在一些实施例中，具有式(I-b)的化合物是具有式(I-b-i)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环M

在一些实施例中，具有式(I-b-i)的化合物是具有式(I-b-ii)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-c)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-d)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-e)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(I-f)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中M是任选地被一个或多个R

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(II)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中M是键、烷基或芳基，其中烷基和芳基任选地被一个或多个R

在一些实施例中，具有式(II)的化合物是具有式(II-a)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中L

在一些实施例中，具有式(I)的化合物是具有式(III)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中Z

在一些实施例中，具有式(III)的化合物是具有式(III-a)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(III-a)的化合物是具有式(III-b)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中环Z

在一些实施例中，具有式(III-a)的化合物是具有式(III-c)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中X是C(R’)(R”)、N(R’)或S(O)

在一些实施例中，具有式(III-c)的化合物是具有式(III-d)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中X是C(R’)(R”)、N(R’)或S(O)

在一些实施例中，该化合物是具有式(I)的化合物。在一些实施例中， L

在一些实施例中，该化合物是具有式(I-a)的化合物。在式(II-a)的一些实施例中，L

在一些实施例中，该化合物是具有式(I-b)的化合物。在一些实施例中， P不存在，L

在式(I-b)的一些实施例中，P不存在，L

在一些实施例中，该化合物是具有式(I-b-i)的化合物。在式(I-b-i)的一些实施例中，R

在一些实施例中，该化合物是具有式(I-b-ii)的化合物。在式(I-b-ii)的一些实施例中，R

在一些实施例中，该化合物是具有式(I-c)的化合物。在式(I-c)的一些实施例中，R

在一些实施例中，该化合物是具有式(I-d)的化合物。在式(I-d)的一些实施例中，R

在一些实施例中，该化合物是具有式(I-f)的化合物。在式(I-f)的一些实施例中，R

在一些实施例中，该化合物是具有式(II-a)的化合物。在式(II-a)的一些实施例中，R

在式(II-a)的一些实施例中，R

在一些实施例中，该化合物是具有式(III)的化合物。在式(III)的一些实施例中，R

在一些实施例中，该化合物是具有式(III-b)的化合物。在式(III-b)的一些实施例中，R

在一些实施例中，该化合物是具有式(III-b)的化合物。在式(III-b)的一些实施例中，R

在一些实施例中，该化合物是具有式(III-d)的化合物。在式(III-d)的一些实施例中，R

在一些实施例中，该化合物是具有式(I-b)、(I-d)、或(I-e)的化合物。在一些实施例中，该化合物是具有式(I-b)、(I-d)、或(II)的化合物。在一些实施例中，该化合物是具有式(I-b)、(I-d)、或(I-f)的化合物。在一些实施例中，该化合物是具有式(I-b)、(I-d)、或(III)的化合物。

在一些实施例中，具有式(I)化合物不是WO 2012/112982、WO 2012/167223、WO2014/153126、WO 2016/019391、WO 2017/075630、US 2012-0213708、US 2016-0030359或US2016-0030360中公开的化合物。

在一些实施例中，具有式(I)化合物包含表4中所示的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，本文所述的装置的外表面和/或其内的一个或多个隔室包含表4中所示的小分子化合物或其药学上可接受的盐。

表4：示例性小分子化合物

在一些实施例中，该化合物是具有式(I)的化合物(例如，式(I-a)、(I-b)、 (I-c)、(I-d)、(I-e)、(I-f)、(II)、(II-a)、(III)、(III-a)、(III-b)、(III-c)或(III-d)) 或其药学上可接受的盐，并且选自：

在一些实施例中，本文所述的装置包含

在一些实施例中，具有式(I)的化合物(例如，表4中的化合物101) 共价附接到藻酸盐(例如，具有近似MW<75kDa、G:M比≥1.5的藻酸盐)，通过如下文实例中所述的氮百分比燃烧分析测定的，缀合密度是至少2.0％并且小于9.0％、或3.0％至8.0％、4.0-7.0、5.0至7.0、或6.0至7.0或约6.8。

细胞

本披露的装置包含含有多个细胞(例如，活细胞)的至少一个细胞容纳隔室。所述细胞可以是多种不同的细胞类型(例如，人细胞)，包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、间充质干细胞、角质形成细胞和胰岛细胞。示例性细胞类型包括WO 2017/075631中记载的细胞类型。在一些实施例中，细胞衍生自下表5中所示的细胞系。

表5：示例性细胞系

在一些实施例中，装置不包含如本文所定义的任何胰岛细胞。在实施例中，包含在本披露的装置中的细胞(例如RPE细胞，MSFC，包括工程化 RPE细胞和MSFC)具有以下特征中的一种或多种：(i)不能以有效治疗用胰岛素可以治疗的糖尿病或其他疾病或病症的量产生胰岛素(例如，胰岛素A链、胰岛素B链或胰岛素原)；(ii)不能以葡萄糖应答性方式产生胰岛素；或(iii)不是来源于被工程化或分化为产胰岛素的胰腺β细胞的诱导性多能细胞。

在实施例中，多个细胞在被包封在本文所述的装置(例如，水凝胶胶囊) 内之前呈细胞悬浮液的形式。悬浮液中的细胞可以采取单细胞的形式(例如，来自单层细胞培养物)，或以另一种形式提供，例如，设置在微载体(例如，珠或基质)上或作为细胞的三维聚集体(例如，细胞簇或球状体)。细胞悬浮液可包含多个细胞簇(例如，作为球状体)或微载体。

在一些实施例中，多个细胞已被工程化以产生治疗剂。在实施例中，治疗剂用于预防或治疗例如WO 2017/075631中描述的疾病、障碍或病症。治疗剂可以是任何生物物质，例如核酸(例如，核苷酸、DNA或RNA)、多肽、脂质、糖(例如，单糖、二糖、寡糖或多糖)、或小分子。示例性治疗剂包括WO 2017/075631中列出的药剂。

在一些实施例中，治疗剂是肽或多肽(例如，蛋白质)，例如激素，酶，细胞因子(例如，促炎细胞因子或抗炎细胞因子)，生长因子，凝血因子，或脂蛋白。由工程化细胞产生的肽或多肽(例如，蛋白质，例如激素，生长因子，凝血因子或凝结因子，抗体分子，酶，细胞因子，细胞因子受体或包括细胞因子或细胞因子受体的嵌合蛋白)可以具有天然存在的氨基酸序列，或者可以含有天然存在的序列的变体。变体可以是相对于参比序列，例如，天然存在的序列的天然存在的或非天然存在的氨基酸取代、突变、缺失或添加。天然存在的氨基酸序列可以是多态变体。天然存在的氨基酸序列可以是人或非人氨基酸序列。在一些实施例中，天然存在的氨基酸序列或其天然存在的变体是人序列。另外，可以以某种方式修饰用于本公开的肽或多肽(例如蛋白质)，例如经由化学或酶促修饰(例如，糖基化，磷酸化)。在一些实施例中，所述肽具有约2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、 25、30、35、40、45、或小于50个氨基酸。在一些实施例中，蛋白质的平均分子量是5kD、10kD、25kD、50kD、100kD、150kD、200kD、250kD、 500kD或更大。

在一些实施例中，蛋白质是激素。示例性激素包括抗利尿激素(ADH)、催产素、生长激素(GH)、催乳素、生长激素释放激素(GHRH)、促甲状腺激素(TSH)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促黄体激素释放激素(LHRH)、甲状腺素、降钙素、甲状旁腺激素(PTH)、醛固酮、皮质醇、肾上腺素、胰高血糖素、胰岛素、雌激素、黄体酮和睾酮。在一些实施例中，蛋白质是胰岛素(例如，胰岛素A链，胰岛素B链或胰岛素原)。在一些实施例中，蛋白质是生长激素，例如人生长激素(hGH)，重组人生长激素(rhGH)，牛生长激素，甲硫氨酸-人生长激素，去苯丙氨酸人生长激素和猪生长激素。

在一些实施例中，蛋白质是生长因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)，神经生长因子(NGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGF)和胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)。

在一些实施例中，蛋白质是凝血因子或凝结因子，例如凝血因子或凝结因子。在一些实施例中，蛋白质是参与凝结(即血液从液体转化为固体或凝胶的过程)的蛋白质。示例性凝血因子和凝结因子包括因子I(例如，纤维蛋白原)，因子II(例如，凝血酶原)，因子III(例如，组织因子)，因子V (例如，前加速因子，不稳定因子)，因子VI，因子VII(例如，稳定因子，转变素原)，因子VIII(例如，抗血友病因子A)，因子VIIIC，因子IX(例如，抗血友病因子B)，因子X(例如，斯图亚特因子(Stuart-Prower)因子)，因子XI(例如，血浆促凝血酶原激酶前体)，因子XII(例如，哈格曼 (Hagerman)因子)，因子XIII(例如，纤维蛋白稳定因子)，冯维勒布兰德因子(vWF)，前激肽释放酶，肝素辅因子II，高分子量激肽原(例如，菲茨杰拉德(Fitzgerald)因子)，抗凝血酶III和纤连蛋白。在一些实施例中，蛋白质是抗凝血因子，例如蛋白质C。

在一些实施例中，蛋白质是抗体分子。如本文使用的，术语“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“抗体分子”包括，例如，单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)。在一个实施例中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链。在一个实施例中，抗体分子包括全长抗体、或全长免疫球蛋白链的抗原结合或功能片段。在一个实施例中，抗体分子是单特异性抗体分子并结合单表位，例如具有多个免疫球蛋白可变结构域序列的单特异性抗体分子，每个免疫球蛋白可变结构域序列结合相同的表位。在一个实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个的第一免疫球蛋白可变结构域序列具有对第一表位的结合特异性，并且所述多个的第二免疫球蛋白可变结构域序列具有对第二表位的结合特异性。在一个实施例中，第一和第二表位在相同抗原(例如，相同的蛋白质(或多聚体蛋白的亚基))上。在一个实施例中，多特异性抗体分子包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子、或四特异性抗体分子。

通过包封的工程细胞可以产生各种类型的抗体分子，包括任何类别的完整免疫球蛋白，其片段和至少含有抗体的抗原结合可变结构域的合成蛋白质。抗体分子可以是抗体，例如IgG抗体，例如IgG

在一些实施例中，蛋白质是细胞因子或细胞因子受体，或包括细胞因子或其受体的嵌合蛋白，包括例如肿瘤坏死因子α和β，它们的受体及其衍生物，肾素；脂蛋白；秋水仙碱；促肾上腺皮质激素；加压素；生长抑素；赖氨酸加压素；促胰酶素；亮丙瑞林；α-1-抗胰蛋白酶；心房利钠因子；肺表面活性剂；除组织型纤溶酶原激活子(t-PA)之外的纤溶酶原激活子，例如尿激酶；蛙皮素；凝血酶；脑啡肽酶；RANTES(通常T细胞表达和分泌的在活化时受调节的)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；苗勒抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；绒毛膜促性腺激素；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA 酶；抑制素；激活素；激素或生长因子的受体；整合素；蛋白质A或D；类风湿因子；血小板衍生生长因子(PDGF)；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4 或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑 IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD-3、CD-4、CD-8和 CD-19；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；干扰素如干扰素-α(例如，干扰素α2A)、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ和共有序列干扰素；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1、 IL-2至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；运输蛋白；归巢受体；地址素；生育抑制剂，如前列腺素；生育促进剂；调节蛋白；抗体(包括其片段)和嵌合蛋白，如免疫粘附素；这些化合物的前体、衍生物、前药和类似物，以及这些化合物的药学上可接受的盐，或它们的前体、衍生物，前药和类似物。合适的蛋白质或肽可以是天然的或重组的，包括例如融合蛋白。

由本文描述的装置产生的多肽(例如，蛋白质)的实例还包括CCL1、 CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)、CCL5(RANTES)、 CCL6、CCL7、CCL8、CCL9(CCL10)、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、 CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1(KC)、CXCL2(SDF1a)、 CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8(IL8)、CXCL9、CXCL10、 CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、 CX3CL1、XCL1、XCL2、TNFA、TNFB(LTA)、TNFC(LTB)、TNFSF4、 TNFSF5(CD40LG)、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TNFSF10、 TNFSF11、TNFSF13B、EDA、IL2、IL15、IL4、IL13、IL7、IL9、IL21、IL3、 IL5、IL6、IL11、IL27、IL30、IL31、OSM、LIF、CNTF、CTF1、IL12a、 IL12b、IL23、IL27、IL35、IL14、IL16、IL32、IL34、IL10、IL22、IL19、 IL20、IL24、IL26、IL29、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IL28、IFNA1、IFNA2、 IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21、IFNB1、IFNK、IFNW1、IFNG、IL1A(IL1F1)、IL1B (IL1F2)、IL1Ra(IL1F3)、IL1F5(IL36RN)、IL1F6(IL36A)、IL1F7(IL37)、 IL1F8(IL36B)、IL1F9(IL36G)、IL1F10(IL38)、IL33(IL1F11)、IL18 (IL1G)、IL17、KITLG、IL25(IL17E)、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、 CSF3(G-CSF)、SPP1、TGFB1、TGFB2、TGFB3、CCL3L1、CCL3L2、CCL3L3、 CCL4L1、CCL4L2、IL17B、IL17C、IL17D、IL17F、AIMP1(SCYE1)、 MIF、Areg、BC096441、Bmp1、Bmp10、Bmp15、Bmp2、Bmp3、Bmp4、 Bmp5、Bmp6、Bmp7、Bmp8a、Bmp8b、C1qtnf4、Ccl21a、Ccl27a、Cd70、 Cer1、Cklf、Clcf1、Cmtm2a、Cmtm2b、Cmtm3、Cmtm4、Cmtm5、Cmtm6、Cmtm7、Cmtm8、Crlf1、Ctf2、Ebi3、Edn1、Fam3b、Fasl、Fgf2、Flt3l、 Gdf10、Gdf11、Gdf15、Gdf2、Gdf3、Gdf5、Gdf6、Gdf7、Gdf9、Gm12597、 Gm13271、Gm13275、Gm13276、Gm13280、Gm13283、Gm2564、Gpi1、 Grem1、Grem2、Grn、Hmgb1、Ifna11、Ifna12、Ifna9、Ifnab、Ifne、Il17a、 Il23a、Il25、Il31、Iltifb,Inhba、Lefty1、Lefty2、Mstn、Nampt、Ndp、Nodal、 Pf4、Pglyrp1、Prl7d1、Scg2、Scgb3a1、Slurp1、Spp1、Thpo、Tnfsf10、Tnfsf11、 Tnfsf12、Tnfsf13、Tnfsf13b、Tnfsf14、Tnfsf15、Tnfsf18、Tnfsf4、Tnfsf8、 Tnfsf9、Tslp、Vegfa、Wnt1、Wnt2、Wnt5a、Wnt7a、Xcl1、肾上腺素、褪黑素、三碘甲状腺原氨酸、前列腺素、白三烯、前列环素、血栓素、胰岛淀粉样多肽、苗勒抑制因子或激素、脂联素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素、血管加压素、精氨酸加压素、心钠素、脑利钠肽、降钙素、缩胆囊素、皮质抑素、脑啡肽、内皮素、促红细胞生成素、卵泡刺激素、甘丙肽、胃抑制多肽、胃泌素、食欲刺激素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1、促性腺激素释放激素、铁调素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、抑制素、生长调节素、瘦素、促脂解素、黑素细胞刺激素、胃动素、增食欲素、催产素、胰多肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽、松弛素、肾素、促胰液素、生长抑素、血小板生成素、促甲状腺激素、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、雄激素、α-葡萄糖苷酶(也称为酸性麦芽糖酶、糖原磷酸化酶、糖原脱支酶、磷酸果糖激酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、乳酸脱氢酶、肉毒碱棕榈酰基转移酶、肉毒碱和肌腺苷酸脱氨酶。

在一些实施例中，蛋白质是替代疗法或替代蛋白质。在一些实施例中，替代疗法或替代蛋白质是凝血因子或凝结因子，例如因子VIII(例如，包含天然存在的人因子VIII氨基酸序列或其变体)或因子IX(例如，包含天然发生的人因子IX氨基酸序列或其变体)。

在一些实施例中，将多个细胞工程化以表达人因子VIII蛋白，例如重组因子VIII。在一些实施例中，重组因子VIII是B结构域缺失的重组因子VIII (FVIII-BDD)。在一些实施例中，FVIII-BDD蛋白是图20中所示的 FVIII-BDD蛋白。在实施例中，FVIII-BDD蛋白包括SEQ ID NO:1、基本上由其组成或由其组成。

在一些实施例中，将细胞工程化以表达因子IX，例如人因子IX(FIX) 蛋白。在一些实施例中，FIX蛋白是FIX-帕多瓦蛋白，并且包含SEQ ID NO: 36、基本上由其组成或由其组成。

在一些实施例中，包封的细胞衍生自人RPE细胞系并且包含外源核酸序列，所述外源核酸序列包含可操作地连接到多肽编码序列的启动子序列 (例如，SEQ ID NO:26或SEQID NO:23的核苷酸337-2069)。在实施例中，编码序列是图24中所示的密码子优化的FVIII-BDD编码序列(SEQ ID NO: 9、10、11、12、13、14、15、16或17)或图24中所示的密码子优化的FIX- 帕多瓦编码序列(SEQ ID NO:19、20或21)。

在一些实施例中，替代疗法或替代蛋白质是酶，例如α-半乳糖苷酶A (GLA)、α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)、葡糖脑苷脂酶、N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)、N-乙酰基-α-d-葡糖胺酶、N-乙酰基葡糖胺4-硫酸酯酶、尿酸氧化酶、苯丙氨酸羟化酶、或苯丙氨酸氨裂解酶。在一些实施例中，替代疗法或替代蛋白质是细胞因子或抗体。

在一些实施例中，治疗剂是糖，例如单糖、二糖、寡糖或多糖。在一些实施例中，糖包含三糖、四糖、五糖、六糖或七糖部分。在一些实施例中，糖包含线性单糖或环化单糖。在一些实施例中，糖包含葡萄糖、半乳糖、果糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸、甘露糖胺、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸或古洛糖醛酸部分。在一些实施例中，糖与蛋白质连接(例如，N-连接的聚糖或O-连接的聚糖)。示例性的糖包括葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、核糖、木糖、唾液酸、麦芽糖、直链淀粉、菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、甘露聚糖、凝集素、果胶、淀粉、纤维素、肝素、透明质酸、几丁质、支链淀粉或糖原。在一些实施例中，治疗剂是糖醇。

在一些实施例中，治疗剂是脂质。脂质可以是疏水的或两亲的，并且可以形成三级结构，例如脂质体、囊泡或膜，或插入脂质体、囊泡或膜中。脂质可包含脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、甾醇脂质、异戊二烯脂质、鞘脂、糖脂、聚酮化合物或鞘脂。由包封的细胞产生的脂质的实例包括花生四烯乙醇胺、二十二碳六烯酸、前列腺素、白三烯、血栓素、类花生酸、甘油三酯、大麻素、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酸、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、神经节苷脂、雌激素、雄酮、睾酮、胆固醇、类胡萝卜素、醌、氢醌或泛醌。

在一些实施例中，治疗剂是小分子。小分子可包括由细胞产生的天然产物。在一些实施例中，小分子具有差的可用性或不符合利平斯基(Lipinski) 五规则(用于估计小分子是否可能是人体中的口服活性药物的一组指导；参见，例如，Lipinski,C.A.et al(2001)Adv Drug Deliv[药物递送进展]46:2-36)。示例性小分子天然产物包括抗细菌药物(例如，卡芦莫南，达托霉素、非达霉素、磷霉素、ispamicin、硫酸微霉素、米卡霉素、mupiocin、硫酸奈替米星、替考拉宁、噻烯霉素、利福霉素、红霉素、万古霉素)、抗寄生虫药物 (例如、青蒿素、伊维菌素)、一种抗癌药物(如多柔比星、阿克拉霉素、氨基乙酰丙酸、阿加来必、高三尖杉酯碱(omacetaxine mepesuccinate)、紫杉醇、喷司他丁、培洛霉素、罗米地辛、trabectdin、放线菌素D、博来霉素、色霉素A、柔红霉素、甲酰四氢叶酸、新抑癌蛋白、链脲佐菌素、trabectedin、长春碱、长春新碱)、抗糖尿病药物(如伏格列波糖)、中枢神经系统药物(如左旋多巴、加兰他敏、zicontide)、他汀类药物(例如、美伐他汀)、抗真菌药物(例如、烟曲霉素、环孢菌素)、1-脱氧野尻霉素和茶碱、甾醇(胆固醇、雌激素、睾酮)。另外的小分子天然产物描述于Newman,D.J.And和 Cragg,M.(2016)J Nat Prod[自然前药杂志]79:629-661和Butler,M.S.等人 (2014)Nat Prod Rep[自然前药报道]31:1612-1661，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施例中，将细胞工程化以合成非蛋白质或非肽小分子。例如，在一个实施例中，工程化细胞可以产生他汀类药物(例如，牛磺酸抑制素、普伐他汀、氟伐他汀或阿托伐他汀)。

在一些实施例中，治疗剂是抗原(例如，病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、植物抗原、环境抗原或肿瘤抗原)。本领域技术人员认为抗原是免疫刺激性的，即，能够刺激免疫应答或对生物或其衍生的分子提供有效免疫。抗原可以是核酸、肽、蛋白质、糖、脂质或其组合。

本文所述的装置中的细胞可以产生单一治疗剂或多个治疗剂。多个治疗剂可以相关或可以形成复合物。在一些实施例中，从装置分泌或释放的治疗剂是呈活性形式。在一些实施例中，从装置分泌或释放的治疗剂是呈非活性形式，例如作为前药。在后一种情况下，治疗剂可以并下游试剂(例如酶) 活化。

治疗方法

本文描述了通过施用或植入产生治疗剂的本文所述的装置或装置的制品来预防或治疗受试者中的疾病、障碍或病症的方法。所述方法包括施用或植入装置或包括多个装置的装置制品，其中所述装置包括(i)至少一个细胞容纳隔室，所述细胞容纳隔室包含聚合物组合物，所述聚合物组合物包含第一细胞结合物质(CBS)并包封多个细胞(例如，活细胞)，当将所述装置或装置制品植入到受试者中时，所述细胞能够表达治疗剂，和(ii)当将所述装置或装置制品植入到所述受试者中时，用于减轻FBR的器件。在实施例中，器件包括环绕细胞容纳隔室并且包含具有式(I)的化合物(例如，如本文所述的)的屏障隔室。在一些实施例中，本文所述的方法直接或间接地减少或减轻疾病、障碍或病症的至少一种症状。在一些实施例中，本文所述的方法预防或减缓疾病、障碍或病症的发作。在一些实施例中，该受试者是人。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症影响身体系统，例如神经系统(例如，外周神经系统(PNS)或中枢神经系统(CNS))、血管系统、骨骼系统、呼吸系统、内分泌系统、淋巴系统、生殖系统或胃肠道。在一些实施例中，该疾病、障碍或病症影响身体的一部分，例如血液、眼睛、脑、皮肤、肺、胃、口、耳、腿、足、手、肝、心脏、肾、骨、胰腺、脾脏、大肠、小肠、脊髓、肌肉、卵巢、子宫、阴道或阴茎。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是神经变性疾病、糖尿病、心脏病、自身免疫疾病、癌症、肝病、溶酶体贮积病、血液凝血障碍或凝结障碍、骨科病症、氨基酸代谢紊乱。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是神经变性疾病。示例性神经变性疾病包括阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化症 (ALS)、多发性硬化症(MS)和脑瘫(CP)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(dentatorubro-pallidoluysian atrophy，DRPLA)、神经元核内透明包涵体疾病(NIHID)、路易体痴呆、唐氏综合征、哈勒沃登-施帕茨病 (Hallervorden-Spatz disease)、朊病毒病、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性(cortocobasal degeneration)、拳击员痴呆、弥漫性神经原纤维缠结、 Gerstmann-Straussler-Scheinker病、库贾氏病(Jakob-Creutzfeldt disease)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)3型、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、脊髓小脑共济失调、皮克氏病(Pick's disease)和齿状核红核苍白球路易体萎缩症。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是自身免疫疾病，例如硬皮病、多发性硬化、狼疮或过敏。

在一些实施例中，该疾病是肝脏疾病，例如乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化、NASH。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是癌症。示例性癌症包括白血病，淋巴瘤、黑素瘤、肺癌、脑癌(例如、胶质母细胞瘤)、肉瘤、胰腺癌、肾癌、肝癌、睾丸癌、前列腺癌或子宫癌。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是骨科病症。示例性骨科病症包括骨质疏松症、骨坏死、佩吉特病或骨折。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是溶酶体贮积病。示例性溶酶体贮积病包括戈谢病(例如，I型、II型、III型)、泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)、法布里病(Fabrydisease)、法伯病(Farber disease)、贺勒氏综合征(Hurler syndrome)(也称为黏多糖贮积症I型(MPS I))、亨特氏综合征(Hunter syndrome)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、唾液酸贮积病(Salla disease)、沙费利波综合征(Sanfilippo syndrome)(也称为黏多糖贮积症IIIA型(MPS3A))、多种硫酸酯酶缺乏症、Maroteaux-Lamy 综合征、异染性脑白质营养不良、克拉伯病(Krabbe disease)、施艾氏综合征(Scheie syndrome)、贺勒氏-施艾氏综合征(Hurler-Scheie syndrome)、黏多糖贮积症Ⅶ型(Sly syndrome)、透明质酸酶缺乏症、蓬佩病(Pompe disease)、Danon病、神经节苷脂贮积病或莫奎欧氏综合征(Morquio syndrome)。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是血液凝血障碍或凝结障碍。示例性血液凝血障碍或凝结障碍包括血友病(例如，血友病A或血友病B)、冯维勒布兰德病(VonWillebrand disease)、血小板减少症、尿毒症、 Bernard-Soulier综合征、因子XII缺乏、维生素K缺乏或先天性无纤维蛋白原血症。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是氨基酸代谢障碍，例如苯丙酮尿症、酪氨酸血症(例如，1型或2型)、尿黑酸尿症、高胱氨酸尿症、高同型半胱氨酸血症、枫糖尿病。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是脂肪酸代谢障碍，例如高脂血症、高胆固醇血症、半乳糖血症。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是嘌呤或嘧啶代谢障碍，例如莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)。

在一些实施例中，该疾病、障碍或病症是糖尿病(例如，I型或II型糖尿病)。

本披露进一步包括用于鉴定患有或怀疑患有本文所述的疾病、障碍或病症的受试者的方法，并且基于这种鉴定，向受试者施用如下装置或包含多个此类装置的组合物，所述装置包括含有经细胞结合肽共价修饰的藻酸盐的内隔室以及含有具有式(I)的化合物(例如，如本文所述)的外隔室。在实施例中，该受试者是人。

药物组合物、试剂盒以及施用

本披露还包括含有本文所述装置的药物组合物，以及其试剂盒。

在一些实施例中，药物组合物包含装置或多个装置，其中所述装置包括包含聚合物组合物(包含细胞结合物质并包封多个细胞(例如，活细胞)) 的至少一个细胞容纳隔室、用于减轻异物反应(FBR)的器件、以及药学上可接受的赋形剂。当将组合物施用到(例如，植入)受试者时，这些活细胞表达治疗剂。在一些实施例中，药物组合物包含有效量的装置(例如，一定量的水凝胶胶囊，例如100、200、400、800、2,000或更多个胶囊。在一些实施例中，该有效量是治疗有效量。在一些实施例中，该有效量是预防有效量。

在此描述的药物组合物可以通过药理学领域中已知的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使装置作为“活性成分”(例如，水凝胶胶囊、颗粒)与载体和/或一种或多种其他辅助成分缔合，并且然后如果必要和/或希望，使产物成形和/或包装成所希望的单或多剂量单位。

药物组合物可以呈单一单位剂量和/或呈多个单一单位剂量进行制备、包装和/或批量出售。如在此使用的，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量(即，水凝胶胶囊、颗粒的数量)。预定量通常等于将要向受试者施用的活性成分的剂量和/或这样一种剂量的一个合宜部分，例如像这样一种剂量的一半或三分之一。

本披露的药物组合物中该活性成分、该药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量将取决于所治疗的受试者的身份、尺寸和/或情况并且进一步取决于施用该组合物的路径而变化。举例来说，该组合物可以包括在 0.1％和100％(w/w)之间的活性成分。

术语“药学上可接受赋形剂”是指不会破坏与其一起配制的装置的药理学活性的一种无毒的载体、佐剂、稀释剂或媒介物。可用于制备本披露的药物组合物的药学上可接受的赋形剂是药物配制领域中公知的任何赋形剂，包括惰性稀释剂、分散剂和/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲液、润滑剂和/或油。在制备本披露的药物组合物中有用的药学上可接受的赋形剂包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

本文所述的装置及其相关组合物可以口服、肠胃外(包括皮下、肌肉内和皮内)、局部、经直肠、经鼻腔、肿瘤内、鞘内、眼内、玻璃体内、经颊、阴道或经由植入的储库施用。在一些实施例中，提供的装置或组合物可皮下施用或通过植入施用。

在一些实施例中，本文所述的装置和相关组合物可以施用于或植入身体的某个区域中或其上，例如粘膜表面或体腔。示例性施用或植入部位包括腹膜腔(例如，小网膜囊)、脂肪组织、心脏、眼(例如，视网膜)、肌肉、脾、淋巴结、食道、鼻、鼻窦、牙齿、牙龈、舌、口、喉、小肠、大肠、甲状腺、骨(例如，髋或关节)、乳房、软骨、阴道、子宫、输卵管、卵巢、阴茎、睾丸、血管、肝、肾、中枢神经系统(例如，脑、脊髓、神经)、或耳(例如，耳蜗)。

在一些实施例中，将本文所述的装置和相关组合物施用于或植入除中枢神经系统(例如，脑、脊髓、神经)之外的部位。在一些实施例中，将本文所述的装置和相关组合物施用于或植入除眼以外的部位。

本披露的这些组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以按照本领域中已知的技术利用恰当的分散或湿润剂以及悬浮剂来配制。无菌可注射的制剂还可以是在非毒性的、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射的溶液或悬浮液，例如作为在1.3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的载体以及溶剂有水、林格氏溶液、以及等渗氯化钠溶液。此外，常规采用无菌的固定油作为溶剂或悬浮介质。

对于眼科用途，提供的药学上可接受的组合物可以配制成微粉化悬浮液或软膏如矿脂。

虽然对在此提供的药物组合物的描述主要涉及适合用于向人施用的药物组合物，但熟练技术人员将理解此类组合物通常是适合用于向所有分类的受试者施用。为了使上述组合物适合于对多种动物施用，将适合于对人类施用的药物组合物进行修饰是很好理解的，并且普通技术的兽医药理学家可以用普通实验设计或操作此类修饰。

本文所述的装置和相关组合物可以配制成剂量单位形式，例如单一单位剂型，以便于施用和剂量均匀。可是要理解的是，本披露的组合物的总剂量和使用方案将通过主治医生在正确医学判断的范围内进行决定。对于任何特定患者或生物体的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的疾病和病症的严重程度；使用的特定装置的生产力以及该装置产生的治疗剂的活性；所使用的特定组合物；受试者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；施用时间、施用途径以及一个或多个所施用装置分泌的特定治疗剂的半衰期；治疗的持续时间；与该装置所表达的特定治疗剂联合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的因素。

实现有效量所需要的治疗的精确量将例如取决于受试者的物种、年龄和一般情况；副作用或病症的严重性；一种或多种具体装置的身份；施用模式等在受试者与受试者之间变化。所需剂量可以递送一天三次，一天两次，一天一次，隔一天一次，每三天一次，一周一次，两周一次，三周一次、四周一次。在一些实施例中，每2、3、4、6、9或12个月一次或每1、2、3或更多年以上一次递送所需剂量。在某些实施例中，可以使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)来递送希望的剂量。在一些实施例中，装置或相关组合物的每次后续施用或植入在去除先前的施用或植入之后进行。

应理解，如本文所述的装置和相关组合物可与一种或多种另外的药学试剂组合施用。这样的药学试剂可以改善治疗剂的生物利用度、减少和/或改变治疗剂的代谢、抑制植入装置的FBR、和/或改变治疗剂在体内的分布。也应当认识到的是，所使用的疗法对于相同疾病可以达到希望的效果，和/或其可能达到不同的效果。

本披露还涵盖了试剂盒(例如，药物包)。本发明的试剂盒有用于预防和/或治疗本文所述的任何疾病、障碍或病症。提供的试剂盒可以包括如本文所述的药物组合物(例如，装置的组合物)或装置，以及容器(例如，小瓶、安瓿、瓶、注射器和/或分装包，或其他合适的容器)。在一些实施例中，提供的试剂盒可以进一步任选地包括第二个容器，其包括用于如本文所述的药物组合物或装置的稀释或悬浮的药用赋形剂。在一些实施例中，将提供在该容器和该第二个容器中的药物组合物或装置进行组合以形成一个单位剂型。

制造装置的方法

本披露还包括制备本文所述装置的方法，例如，包含包封在聚合物组合物(包含细胞结合物质)中的多个细胞的细胞容纳隔室，以及用于减轻FBR 的器件。

在其中装置包括单隔室水凝胶胶囊的制品的实施例中，该装置可以如下制造。简而言之，可以将一定体积的包含去纤维化聚合物(例如，用具有式(I)的化合物修饰的藻酸盐)的水凝胶形成聚合物溶液加载到注射器中，例如，然后用钝尖的针盖住的注射器。然后可以将注射器放入注射泵中，该注射泵在容器上方垂直地定向，该容器包含水性交联溶液，该水性交联溶液包括交联剂、缓冲液和渗透压调节剂。然后可以将高压发电机连接到针。然后，注射器泵和发电机可用于通过注射器(其设定被确定为实现聚合物溶液的所需液滴速率)挤出聚合物溶液进入交联溶液。在耗尽聚合物溶液的体积后，可以使液滴在交联溶液中交联几分钟，例如约5分钟。在实施例中，确定交联溶液表面上的非胶囊碎片的数量。然后可以收集已经落到交联容器底部的水凝胶胶囊，例如通过将含有水凝胶胶囊的交联溶液转移到单独的容器中，溶液表面上任何非胶囊碎片留在原始交联容器中。然后可以使除去的水凝胶胶囊沉降，可以除去交联溶液，并且然后用缓冲液(例如，HEPES缓冲液) 洗涤胶囊一次或多次。在实施例中，通过显微镜检查所得水凝胶胶囊组合物的一个或多个等分试样以评估组合物的质量，例如，胶囊缺陷和卫星胶囊的数量。

在装置包括具有两个水凝胶隔室的水凝胶胶囊或两室水凝胶胶囊的制品的一些实施例中，制造装置的方法包括使包含第一和第二聚合物溶液(例如，每种溶液包含水凝胶形成聚合物)的多个液滴与水性交联溶液接触。可以使用本领域已知的任何技术形成液滴。

简而言之，在执行制造两室水凝胶胶囊的组合物的方法中，将一定体积的第一聚合物溶液(例如，包括悬浮在用细胞结合肽修饰的聚合物中并任选地与未修饰的聚合物共混的多个细胞(例如，活细胞))加载到与同轴针的内腔连接的第一注射器中。然后可以将第一注射器连接到注射泵，该注射泵在容器上方垂直地定向，该容器包含交联剂、缓冲液和渗透压调节剂。将一定体积的第二聚合物溶液(例如，包含未修饰的聚合物，用具有式(I)的化合物修饰的聚合物，或其共混物)加载到与同轴针的外腔连接的第二注射器中。然后，第二注射器可以连接到相对于含有交联溶液的容器水平定向的注射泵。然后可以将高压发电机连接到针。然后，注射泵和发电机可用于通过注射器(其设定被确定为实现聚合物溶液的所需液滴速率)挤出第一和第二聚合物溶液进入交联溶液。在排出第一和第二体积的聚合物溶液后，可以使液滴在交联溶液中交联一段时间，例如约5分钟。在实施例中，确定交联溶液表面上的非胶囊碎片的数量。然后可以收集已经落到交联容器底部的胶囊，例如通过将含有胶囊的交联溶液转移到单独的容器中，溶液表面上任何非胶囊碎片留在原始交联容器中。然后可以使除去的胶囊沉降，可以除去交联溶液，并且然后用缓冲液(例如，HEPES缓冲液)洗涤胶囊一次或多次。在实施例中，通过显微镜检查所得装置组合物的一个或多个等分试样以评估组合物的质量，例如，胶囊缺陷和胶囊的数量。

在一些实施例中，在制造单室或两室胶囊的工艺中，交联溶液还包含工艺添加剂(例如，亲水的非离子表面活性剂)。工艺添加剂可降低交联溶液的表面张力。可用作本披露中的工艺添加剂的试剂包括聚山梨醇酯型表面活性剂、聚环氧乙烷(PEO)和聚环氧丙烷(PPO)的共聚物、聚(环氧乙烷)- 聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)(PEO-PPO-PEO)三嵌段共聚物和非离子表面活性剂、例如

在一些实施例中，工艺添加剂(例如表面活性剂)以至少0.0001％或更高的浓度存在于交联溶液中。在一些实施例中，交联溶液包含至少0.001％、 0.01％或0.1％的工艺添加剂。在一些实施例中，工艺添加剂以选自约0.001％至约0.1％、约0.005％至约0.05％、约0.005％至约0.01％、和约0.01％至约 0.5％的浓度存在。在实施例中，工艺添加剂是表面活性剂并且以低于表面活性剂的临界胶束浓度的浓度存在。

在一些实施例中，交联剂包含单一类型的二价阳离子或不同类型的混合物，例如Ba

选择水性交联溶液中缓冲液的类型和浓度以与细胞相容并使溶液pH保持在大约中性，例如从约6.5至约7.5、约7.0至约7.5、或约7.0。在一些实施例中，水性交联溶液中的缓冲液包含HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)。

选择水性交联溶液中的渗透压调节剂以将溶液渗透压保持在与包含细胞(例如，活细胞)的悬浮液的第一聚合物溶液的渗透压类似的值，例如具有高达20％、10％或5％的更高或更低方差的渗透压。在一些实施例中，渗透压剂是浓度为0.1M至0.3M的甘露醇。

在实施例中，工艺添加剂是泊洛沙姆188。在实施例中，泊洛沙姆188 在洗涤步骤后以可检测的量存在于胶囊组合物中。泊洛沙姆188可以通过本领域已知的任何技术来检测，例如，通过除去胶囊的等分试样，添加硫酸钠溶液以将胶囊部分或完全溶解在等分试样中，以及通过LC/MS分析所得溶液。

交联溶液的表面张力的降低可以经由本领域已知的任何方法评估，例如，经由使用接触角测角仪或张力计，例如经由挂环法(du Nouy ring method) (参见，例如，Davarci等人(2017)Food Hydrocolloids[食品亲水胶体] 62:119-127)。

列举的示例性实施例

1.一种装置，所述装置包括：

(a)至少一个细胞容纳隔室，所述细胞容纳隔室包含聚合物组合物，所述聚合物组合物包含第一细胞结合物质(CBS)并包封多个细胞，当将所述装置植入到受试者中时，所述细胞能够表达治疗剂；以及

(b)当将所述装置植入到所述受试者中时，用于减轻异物反应(FBR) 的器件。

2.一种装置，所述装置包括：

(a)聚合物组合物，例如，聚合物基质，例如，水凝胶基质，所述聚合物组合物包含：

(i)第一细胞结合物质(CBS)；以及

(ii)多个细胞，所述细胞能够提供，例如产生、表达或释放治疗剂，

其中所述装置包括以下特性中的一个：

(b)它包含球形和线性尺寸的组合，例如，直径为至少1.0mm、1.3 mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、或3.0mm；

(c)所述聚合物组合物被布置在隔室中，例如，在包含环绕所述聚合物组合物的生物相容性聚合物的隔室或基质中；

(d)它包含实体，例如，减轻FBR的化合物，例如在一些实施例中被布置在所述装置的外表面的、本文定义的去纤维化化合物；或

(e)所述装置包含去纤维化化合物，例如本文定义的去纤维化化合物，例如被布置在所述装置的外部的去纤维化化合物。

3.如实施例2所述的装置，所述装置包括特性(b)。

4.如实施例2或3中任一项所述的装置，所述装置包括特性(c)。

5.如实施例2至4中任一项所述的装置，所述装置包括特性(d)。

6.如实施例2-5中任一项所述的装置，所述装置包括特性(e)。

7.如实施例2所述的装置，所述装置包括特性(b)至(e)中的两个。

8.如实施例2所述的装置，所述装置包括特性(b)至(e)中的三个。

9.如实施例2所述的装置，所述装置包括特性(b)至(e)全部。

10.如实施例2至9中任一项所述的装置，所述装置包括减轻与所述装置的另一种元件，例如与聚合物共价偶联的FBR的化合物。

11.如实施例2至9中任一项所述的装置，所述装置包括与所述装置的另一种元件，例如与聚合物共价偶联的去纤维化化合物，例如，本文所述的去纤维化化合物。

12.如实施例1至11中任一项所述的装置，其中所述第一CBS包括细胞结合肽(CBP)或细胞结合多肽(CBPP)。

13.如实施例1至12中任一项所述的装置，其中所述聚合物组合物包含不同于第一CBS的第二CBS。

14.如实施例13所述的装置，其中所述第一CBS和第二CBS包括细胞结合肽(CBP)或细胞结合多肽(CBPP)。

15.如实施例1至14中任一项所述的装置，其中所述第一CBS包括经由第一接头共价附接到第一聚合物上的第一CBP(“第一CBP-聚合物”)。

16.如实施例12至15中任一项所述的装置，其中所述第二CBS包括经由第二接头共价附接到第二聚合物上的第二CBP(“第二CBP-聚合物”)，其中所述第二CBP、第二接头和第二聚合物中至少一个的化学组成不同于第一CBP-聚合物中的相应组分。

17.如实施例12至16中任一项所述的装置，其中所述聚合物组合物还包含第三CBS。

18.如实施例17所述的装置，其中所述第三CBS包括经由第三接头共价附接到第三聚合物上的第三CBP(“第三CBP-聚合物)，其中所述第三 CBP、第三接头和第三聚合物中至少一个的化学组成不同于第一和第二CBP- 聚合物中的相应组分。

19.如实施例1至18中任一项所述的装置，其中所述第一CBS是包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的第一CBP-聚合物：DGEA(SEQ ID NO:39)、FYFDLR(SEQ ID NO:40)、HAVDI(SEQ ID NO:38)、PHSRN (SEQ ID NO:46)、REDV(SEQ ID NO:47)、RGD(SEQ ID NO:43)、RGDSP (SEQ ID NO:59)、和YIGSR(SEQ ID NO:50)，或所述序列中任一个的保守取代的变体。

20.如实施例12至19中任一项所述的装置，其中所述第一CBP是长度为少于10个氨基酸的线性或环状肽。

21.如实施例14至20中任一项所述的装置，其中所述第二CBP是长度为少于10个氨基酸的线性或环状肽。

22.如实施例12至21中任一项所述的装置，其中所述聚合物组合物包含第一CBP-聚合物、第二CBP-聚合物以及任选地第三CBP-聚合物，其中所述第一CBP-聚合物是RGD聚合物并且如果存在的话，第二CBP-聚合物和第三CBP-聚合物中的至少一个包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：DGEA(SEQ ID NO:39)、FYFDLR(SEQ ID NO:40)、HAVDI(SEQ ID NO:38)、PHSRN(SEQ ID NO:46)、PHSRNGGGGGGRGDS(SEQ ID NO:55)、 REDV(SEQ ID NO:47)、GFOGER(SEQ ID NO:41)、P(GPP)

23.如实施例1至22中任一项所述的装置，其中所述第一CBS是长度为少于10个氨基酸的线性CBP，包括RGD(SEQ ID NO:43)或RGDSP (SEQ ID NO:59)。

24.如实施例1至22中任一项所述的装置，其中所述第一CBS是基本上由RGD(SEQID NO:43)或RGDSP(SEQ ID NO:59)组成的线性CBP。

25.如实施例1至24中任一项所述的装置，其中所述聚合物组合物包含含有CBP-聚合物的第二CBS，其中第一CBP-聚合物中的CBP不同于第二CBP-聚合物中的CBP并且第一CBP-聚合物中的聚合物与第二CBP-聚合物中的聚合物相同或不同。

26.如实施例1至25中任一项所述的装置，其中所述聚合物组合物包含第一CBP-聚合物和任选地第二CBP-聚合物和任选地第三CBP-聚合物，其中所述聚合物组合物中每种CBP-聚合物中的接头选自由以下组成的组：

(a)线性氨基酸接头，其基本上由甘氨酸和/或β-丙氨酸的一至十、一至六或一至四个残基组成；

(b)线性氨基酸接头，其基本上由一个、两个或三个甘氨酸残基组成；

(c)环氧乙烷或二到四个环氧乙烷单体的低聚物；以及

(d)氨基羧酸盐。

27.如实施例26所述的装置，其中所述第一CBP基本上由RGD(SEQ ID NO:43)或RGDSP(SEQ ID NO:59)组成并且所述接头基本上由单个甘氨酸残基组成。

28.如实施例1至27中任一项所述的装置，其中所述聚合物组合物包含第一CBP-聚合物和任选地第二CBP-聚合物和任选地第三CBP-聚合物，其中所述聚合物组合物中每种CBP-聚合物中的聚合物是藻酸盐、壳聚糖、透明质酸盐、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺、明胶、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乳酸乙醇酸)(PLGA)、羧甲基纤维素或羧甲基壳聚糖。

29.如实施例28所述的装置，其中所述第一CBP-聚合物中的聚合物是藻酸盐。

30.如实施例28或29中任一项所述的装置，其中藻酸盐是所述第二 CBP-聚合物和第三CBP-聚合物中任一者或两者中的聚合物。

31.如实施例28至30中任一项所述的装置，其中所述藻酸盐的分子量为75-150kDa并且G:M比为大于或等于1.5。

32.如实施例1或12-31中任一项所述的装置，其中所述细胞容纳隔室还包含与第一聚合物相同或不同的未修饰的聚合物。

33.如实施例32所述的装置，其中所述细胞容纳隔室中的未修饰的聚合物是藻酸盐、壳聚糖、透明质酸盐、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺、明胶、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乳酸乙醇酸)(PLGA)、羧甲基纤维素或羧甲基壳聚糖。

34.如前述实施例中任一项所述的装置，其中所述用于减轻FBR的器件包括环绕所述细胞容纳隔室的屏障隔室。

35.如实施例1至34中任一项所述的装置，其中所述用于减轻FBR 的器件包含布置在所述装置的外表面上的第一去纤维化化合物。

36.如实施例1至35中任一项所述的装置，其中所述用于减轻FBR 的器件包括环绕细胞容纳隔室的屏障隔室，并且所述屏障隔室包含共价附接到聚合物上的去纤维化化合物(去纤维化-聚合物)，其中所述去纤维化聚合物中的聚合物与细胞容纳隔室中存在的每一种聚合物相同或不同。

37.如实施例35所述的装置，其中所述用于减轻FBR的器件还包括环绕细胞容纳隔室的屏障隔室，并且所述屏障隔室包含共价附接到聚合物上的第二去纤维化化合物(去纤维化-聚合物)，其中所述去纤维化聚合物中的聚合物与细胞容纳隔室中存在的每一种聚合物相同或不同，并且所述第二去纤维化化合物与第一去纤维化化合物相同或不同。

38.如实施例36或37所述的装置，其中所述屏障隔室还包括与所述屏障隔室中的去纤维化聚合物中的聚合物相同或不同的、未修饰的聚合物并且每种聚合物都存在于细胞容纳隔室中。

39.如实施例38所述的装置，其中所述屏障隔室使用未修饰的聚合物和去纤维化聚合物的混合物形成，并且任选地其中所述去纤维化聚合物中的去纤维化化合物的缀合密度通过氮百分比燃烧分析(例如，如下文实例1A 中所述)测定的，其中所测定的氮百分比是至少2.0％且小于9.0％、或是3.0％至8.0％、4.0％至7.0％、5.0％至7.0％、或6.0％至7.0％或约6.8％。

40.如实施例36至39中任一项所述的装置，其中所述第一和第二去纤维化化合物中任一者或两者是具有式(I-a)的化合物：

或者其药学上可接受的盐，其中：

A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-O-、 -C(O)O-、-C(O)-、-OC(O)-、-N(R

L

L

M是不存在、烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其各自任选地被一个或多个R

P是任选被一个或多个R

Z是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基、其各自任选地被一个或多个R

每个R

或R

每个R

每个R

每个R

x是1或2；并且

y是2、3或4。

41.如实施例1-39中任一项所述的装置，其中所述具有式(I)的化合物是具有以下式中任一种的化合物：式(I-b)、(I-c)、(I-d)、(I-e)、(I-f)、(II)、 (II-a)、(III)、(III-a)、(III-b)、(III-c)、或(III-d)，或其药学上可接受的盐。

42.如实施例35至41中任一项所述的装置，其中所述第一去纤维化化合物是表4中所示的化合物100、化合物101、化合物110、化合物112、化合物113或化合物114，并且任选地其中所述去纤维化聚合物中的第一去纤维化化合物的缀合密度是通过以下测定

(a)氮百分比燃烧分析，例如，如下文实例1A中所述的，其中所测定的氮百分比是至少2.0％且小于9.0％、或是3.0％至8.0％、4.0％至7.0％、 5.0％至7.0％、或6.0％至7.0％或约6.8％；或

(b)游离胺定量分析，例如，如下文实例26中所述的，其中所测定的缀合密度是1.0％w/w至3.0％w/w、1.3％w/w至2.8％ww、1.3％w/w至 2.6％w/w、1.5％w/w至2.4％w/w、1.5％w/w至2.2％w/w、或1.7％w/w至 2.2％w/w。

43.如实施例37至42中任一项所述的装置，其中所述第二去纤维化化合物是表4中所示的化合物100、化合物101、化合物110、化合物112、化合物113或化合物114。

44.如实施例35至43中任一项所述的装置，其中所述第一去纤维化化合物是表4中所示的化合物100。

45.如实施例35至43中任一项所述的装置，其中所述第一去纤维化化合物不是表4中所示的化合物100。

46.如实施例37至43中任一项所述的装置，其中所述第一和第二去纤维化化合物每一者都是表4中所示的化合物101。

47.如实施例37至46中任一项所述的装置，其中存在于所述屏障隔室中的每种聚合物是藻酸盐、壳聚糖、透明质酸盐、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺、明胶、聚(L-乳酸)(PLLA)、或聚(乳酸乙醇酸)(PLGA)、羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖。

48.如实施例36至47中任一项所述的装置，其中所述屏障隔室中的每种去纤维化聚合物中的聚合物是藻酸盐，所述藻酸盐的分子量为<75kDa 并且G:M比为大于或等于1.5。

49.如实施例38至48中任一项所述的装置，其中所述屏障隔室中的未修饰的聚合物是藻酸盐，所述藻酸盐的分子量为150kDa至250kDa并且 G:M比为大于或等于1.5。

50.如实施例1或11至49中任一项所述的装置，其中所述细胞容纳隔室由共价附接到藻酸盐的CBP-聚合物形成，所述CBP-聚合物基本上由 G

(a)足以增加细胞的存活力的量，例如，通过本文描述的测定确定的，任选地该量是最佳量；

(b)足以增加细胞的生产力的量，例如，通过本文描述的测定确定的，任选地该量是最佳量；

(c)0.10％氮(N)至1.00％N、约0.20％N至约0.80％N、约0.30％N 至约0.60％N、约0.30％至约0.50％、或0.33％N至0.46％N，如通过冻干至恒重的CBP-聚合物的燃烧分析所确定的，例如，如下文实例1B中所述的；

(d)0.1至1.0、0.2至0.8、0.3至0.7或0.3至0.6微摩尔的G

G

(e)(a)、(b)、(c)和(d)中两种或更多种的任意组合。

51.如实施例34至49中任一项所述的装置，其中所述细胞容纳隔室和屏障隔室形成两隔室水凝胶胶囊。

52.如实施例50或51所述的装置，其中所述细胞容纳隔室和屏障隔室体积大致相等。

53.如实施例34至51中任一项所述的装置，其中所述屏障隔室的厚度在选自由以下组成的组的范围内：

(a)1纳米和1毫米；

(b)100纳米和1毫米；以及

(c)500纳米和500微米。

54.如实施例1至53中任一项所述的装置，其中所述装置具有在500 纳米至5毫米之间的最大线性尺寸(LLD)，例如直径。

55.如实施例1至54中任一项所述的装置，其中所述装置具有球形且具有在0.5毫米至5毫米、例如在0.75毫米至4毫米之间、1毫米至3毫米、1毫米至2毫米、约1.5毫米至2毫米、或约1.5毫米的最大线性尺寸 (LLD)，例如直径。

56.如实施例35至55中任一项所述的装置，所述装置包括选自以下的一种或多种特性：

a)细胞容纳隔室中的多个细胞(例如，活细胞)是至少100；250； 500；750；1,000；2,500；5,000；10,000；25,000；或50,000个细胞；

b)所述屏障隔室基本上不含CBS和所述细胞；以及

c)所述细胞容纳隔室基本上不含任何去纤维化化合物。

57.如实施例36至56中任一项所述的装置，其中

(a)所述细胞容纳隔室和所述屏障隔室形成两隔室水凝胶胶囊；

(b)所述细胞容纳隔室中的第一CBP聚合物基本上由以下组成：分子量为150至250kDa并且G:M比为大于或等于1.5的藻酸盐，作为第一聚合物；单个甘氨酸残基，作为接头；以及由RGDSP(SEQ ID NO:59)组成的线性肽，作为第一CBP；

(c)所述屏障隔室中的去纤维化聚合物中的聚合物是具有小于75 kDa的分子量和大于或等于1.5的G:M比的藻酸盐，并且所述去纤维化化合物是表4中所示的化合物101；以及

(d)所述屏障隔室还包含未修饰的藻酸盐，所述未修饰的藻酸盐的分子量为150kDa至250kDa，并且G:M比为大于或等于1.5。

58.如实施例56所述的装置，其中所述屏障隔室由藻酸盐溶液形成，所述藻酸盐溶液基本上由以下组成：70:30比的(i)以5％重量体积比溶解于 0.9％盐水中的去纤维化藻酸盐和(ii)以3％重量体积比溶解于0.9％盐水中的未修饰的藻酸盐。

59.如实施例1至58中任一项所述的装置，其中从细胞系工程化所述多个细胞以表达治疗剂，其中所述细胞系是内皮、上皮、成纤维细胞、角质形成细胞或间充质细胞系。

60.如实施例46所述的装置，其中所述细胞系选自表5中所列的细胞系。

61.如实施例1至58中任一项所述的装置，其中所述多个细胞是工程化RPE细胞。

62.如实施例1至58中任一项所述的装置，其中所述多个细胞是工程化ARPE-19细胞。

63.如实施例1至62中任一项所述的装置，其中所述治疗剂是因子 VIII蛋白或其变体或因子IX蛋白或其变体。

64.如实施例1至63中任一项所述的装置，其中所述装置包括两个或更多个细胞容纳隔室。

65.如实施例1至64中任一项所述的装置，其中在植入后第一个时间点(例如，至少7天、两周、四周、八周或16周)由所述细胞表达的治疗剂的量比在所述时间点由能够表达相同治疗剂的无CBC参比装置表达的量高至少1.25倍、1.5倍、2倍(4倍、6倍、8倍或10倍)。

66.一种水凝胶胶囊，其包括：

(a)包含多个细胞(例如，活细胞)的细胞容纳隔室，所述多个细胞包封在包含第一RGD聚合物的第一聚合物组合物中，其中所包封的细胞表达外源多肽并且任选地其中所述多个细胞的浓度是4000万个细胞每毫升所述第一聚合物组合物；以及

(b)屏障隔室，所述屏障隔室环绕所述细胞结合隔室并包含第二聚合物组合物，所述第二聚合物组合物包含未修饰的藻酸盐和经至少一种化合物共价修饰的藻酸盐的混合物，所述至少一种化合物选自由以下组成的组：表 4中所示的化合物100、化合物101、化合物110、化合物112、化合物113 和化合物114，

其中所述水凝胶胶囊为球形且直径为0.5毫米至5毫米，并且任选地，所述屏障隔室的平均厚度为约10至约300微米、约20至约150微米、或约 40至约75微米。

67.如实施例66所述的水凝胶胶囊，其包含有效量的增加外源多肽的表达的第一RGD聚合物并且其中所述第一RGD聚合物基本上由经由接头用RGD肽共价修饰的藻酸盐组成，所述细胞容纳隔室基本上不含任何去纤维化化合物，并且所述屏障隔室基本上不含任何细胞和所述RGD肽，并且任选地其中所述RGD聚合物的有效量是最佳量。

68.如实施例66或67所述的水凝胶胶囊，其中所述RGD肽基本上由RGD(SEQ ID NO:43)或RGDSP(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列组成并且所述接头基本上由附接到所述RGD肽的N端的单个甘氨酸残基或单个β-丙氨酸残基组成。

69.如实施例67至68中任一项所述的水凝胶胶囊，其中：

(a)所述第一RGD聚合物中的聚合物为藻酸盐并且分子量为150至 250kDa且G：M比大于或等于1.5，并且任选地由藻酸盐溶液形成所述细胞容纳隔室，所述藻酸盐溶液的粘度在约90cP和约230cP至约300、350或 400cP之间，或在约80cP至约120cP之间；

(b)所述屏障隔室中的共价修饰的藻酸盐中的藻酸盐的分子量为<75 kDa，并且G:M比大于或等于1.5；

(c)所述屏障隔室中的未修饰的藻酸盐的分子量为150kDa至250 kDa，并且G:M比大于或等于1.5；以及

(d)任选地所述屏障隔室由藻酸盐溶液形成，所述藻酸盐溶液包含共价修饰的藻酸盐和未修饰的藻酸盐的混合物并且粘度为250-350cP。

70.如实施例69所述的水凝胶胶囊，其中：

(a)所述胶囊的直径在1.0毫米和2.0毫米之间；

(b)藻酸盐上的RGD肽的缀合密度是通过冻干至恒重的RGD聚合物的燃烧分析所确定的氮百分比(例如，如下文实例1B中所述的)，其中所确定的氮百分比是约0.10％氮(N)至1.00％N、约0.20％N至约0.80％N、约 0.30％N至约0.60％N、约0.30％至约0.50％、或0.33％N至0.46％N；以及

(c)所述屏障隔室中的共价修饰的藻酸盐仅用化合物101修饰，并且共价修饰的藻酸盐中化合物101的密度是通过例如，如本文实例1A中所述的，对已冻干至恒重的共价修饰的藻酸盐的燃烧分析所确定的氮百分比，其中所确定的氮百分比在约氮之间，为至少2.0％且小于9.0％、或是3.0％至 8.0％、4.0％至7.0％、5.0％至7.0％、或6.0％至7.0％或约6.8％。

71.如实施例70所述的水凝胶胶囊，其中：

(a)所述多个细胞是工程化RPE细胞，例如工程化ARPE-19细胞；

(b)所述胶囊的直径为约1.5毫米；

(c)所述RGD肽基本上由RGDSP(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列组成并且所述接头是单个甘氨酸残基；

(d)所述藻酸盐上的RGD肽的缀合密度选自由以下组成的组：

(i)有效增加细胞的存活力的量，例如，如通过本文描述的测定确定的，

(ii)有效增加细胞的生产力的量，例如，如通过本文描述的测定确定的，

(iii)冻干至恒重的RGD聚合物的燃烧分析所确定的氮百分比 (例如，如下文实例1B中所述的)，其中所确定的氮百分比是约0.10％氮(N) 至1.00％N、约0.20％N至约0.80％N、约0.30％N至约0.60％N、约0.30％至约0.50％、或0.33％N至0.46％N；

(iv)0.1至1.0、0.2至0.8、0.3至0.7或0.3至0.6微摩尔的 GRGDSP每克在溶液中的RGD聚合物，例如，如本文实例25中所述的；以及

(v)d(i)、d(ii)、d(iii)和d(iv)中两个或更多个的任何组合；

(e)所述屏障隔室中的共价修饰的藻酸盐仅用化合物101修饰，并且共价修饰的藻酸盐中化合物101的密度是：

(i)通过例如，如本文实例1A中所述的，对已冻干至恒重的共价修饰的藻酸盐的燃烧分析所确定的氮百分比，其中所确定的氮百分比在约氮之间，为至少2.0％且小于9.0％、或是3.0％至8.0％、4.0％至7.0％、5.0％至 7.0％、或6.0％至7.0％或约6.8％；或

(ii)通过例如，如本文实例27中所述的游离胺定量分析所确定的基于重量/重量的％胺，其中所测定的密度是1.0％w/w至3.0％w/w、1.3％w/w 至2.8％ww、1.3％w/w至2.6％w/w、1.5％w/w至2.4％w/w、1.5％w/w至 2.2％w/w、或1.7％w/w至2.2％w/w。

72.如实施例71所述的水凝胶胶囊，其中所述多个细胞是经工程化以表达FVIII-BDD蛋白，例如，SEQ ID NO:1的ARPE-19细胞。

73.如实施例72所述的水凝胶胶囊，其中所述ARPE-19细胞包含 SEQ ID NO:15，其任选地可操作地连接至CAG启动子核苷酸序列，例如， SEQ ID NO:26的核苷酸337-2069。

74.如72或73的水凝胶胶囊，其中所述RGD聚合物中藻酸盐上的 RGD肽的缀合密度是0.3至0.6微摩尔的GRGDSP每克在溶液中的RGD聚合物。

75.如实施例66至74中任一项所述的水凝胶胶囊，其中所述多个细胞是至少1,000、2,500、5,000、10,000、25,000、或50,000个RPE细胞。

76.一种装置的制品，其中所述制品中的每个装置是如实施例1至65 中任一项所述的装置或是如实施例66至75中任一项所述的水凝胶胶囊。

77.如实施例76所述的制品，其中所述制品中的每个装置是具有选自由以下组成的组的直径的球形水凝胶胶囊：0.5毫米至2毫米；0.7毫米至 1.8毫米、1.0毫米至1.8毫米；1.2毫米至1.7毫米；1.3毫米至1.7毫米；和 1.4至1.6毫米。

78.如实施例76或77所述的制品，其中所述制品是药学上可接受的组合物。

79.一种在受试者中植入装置的方法，所述方法包括：

提供本文所述的装置或装置的制品，例如实施例1至65中任一项的装置、实施例66至75中任一项的水凝胶胶囊或实施例76至78中任一项的制品；并且

将所述装置或制品放置于所述受试者的体内。

80.一种将治疗剂提供给受试者的方法，所述方法包括：

提供本文所述的装置或装置的制品，例如实施例1至65中任一项的装置、实施例66至75中任一项的水凝胶胶囊、或实施例76至78中任一项的制品；并且

将所述装置或制品放置于所述受试者的体内。

81.一种评估，例如，受试者中的装置的方法，所述方法包括：

提供本文所述的装置，例如实施例1至65中任一项的装置、或实施例 66至75中任一项的水凝胶胶囊；并且

将所述装置或制品放置于所述受试者的体内。

82.一种对需要治疗剂的受试者进行治疗的方法，所述方法包括：

提供本文所述的装置或装置的制品，例如实施例1至65中任一项的装置、实施例66至75中任一项的水凝胶胶囊、或实施例76至78中任一项的制品；并且

将所述装置或制品放置于所述受试者的体内。

83.一种制造本文披露的装置或水凝胶胶囊的方法，所述方法包括：

将所述装置或水凝胶胶囊的第一元件与所述装置或水凝胶胶囊的第二元件组合，

由此制造本文披露的装置或水凝胶胶囊。

84.一种制造本文披露的装置的制品或水凝胶胶囊的方法，所述方法包括：

将装置或水凝胶胶囊与第二组分，例如，缓冲液、载体或赋形剂组合，

由此制造本文披露的装置或水凝胶胶囊。

85.一种制造本文披露的装置或水凝胶胶囊或其制品的方法，所述方法包括：

提供本文披露的装置或水凝胶胶囊或其制品；

例如，通过测量获取与所述装置或水凝胶胶囊或其制品的元件或特性相关的参数的值，例如大小、组分的存在或量、生物学特性、组分的存活力，

由此制造本文披露的装置或水凝胶胶囊。

86.一种评估本文披露的装置或水凝胶胶囊或其制品的方法，所述方法包括：

提供本文披露的装置或水凝胶胶囊，或其制品；

例如，通过测量获取与所述装置或水凝胶胶囊的元件或特性相关的参数的值，例如大小、组分的存在或量、生物学特性、组分的存活力，

由此评估本文披露的装置或水凝胶胶囊或其制品。

实例

为了使在此所述的本披露可以得到更完全的理解，列出了以下实例。提供了在本申请中描述的实例来说明所述装置(例如，胶囊、颗粒、化学修饰、组合物以及在此提供的方法，并且这些实例不应以任何方式解释为限制它们的范围。

实例1：制备示例性、修饰的聚合物

例如，在藻酸盐的情况下，藻酸盐羧酸被活化以与一个或多个胺官能化化合物偶联，以获得用去纤维化化合物(例如具有式(I)的化合物)修饰的藻酸盐。将藻酸盐聚合物溶于水(30mL/g聚合物)中，并用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(0.5当量)和N-甲基吗啉(1当量)处理。向该混合物中添加目的化合物(例如，表4中所示的化合物101)在乙腈(0.3M)中的溶液。目的化合物可以使用本领域已知的方法制备，例如，如WO 2018/067615(将其通过引用以其全部内容结合在此)中所述。

添加的化合物和偶联剂的量取决于与藻酸盐结合的化合物的所需浓度，例如缀合密度。为了制备CM-LMW-Alg-101-中等聚合物溶液，溶解的未经修饰的低分子量藻酸盐(近似MW<75kDa，G:M比≥1.5)用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(5.1mmol/g藻酸盐)和N-甲基吗啉(10.2mmol/g藻酸盐) 和化合物101(5.4mmol/g藻酸盐)处理。为制备CM-LMW-Alg-101-高聚合物溶液，溶解的未经修饰的低分子量藻酸盐(近似MW<75kDa，G:M比≥1.5) 用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(5.1mmol/g藻酸盐)和N-甲基吗啉(10.2 mmol/g藻酸盐)和化合物101(5.4mmol/g藻酸盐)处理。

将反应温热至55℃，保持16小时，然后冷却至室温，并且经由旋转蒸发轻轻浓缩，然后将残余物溶于水中。将混合物通过氰基修饰的硅胶床 (Silicycle)过滤，并且将滤饼用水洗涤。然后将所得溶液彻底透析(10,000 MWCO膜)并经由冷冻干燥浓缩藻酸盐溶液以提供所希望的作为固体的化学修饰的藻酸盐或使用适于产生粘度为25cP至35cP的化学修饰的藻酸盐溶液的任何技术浓缩。

在实施例中，化学修饰的藻酸盐的缀合密度通过氮百分比燃烧分析测量。通过将化学修饰的藻酸盐溶液对水(10,000MWCO膜)透析24小时，将水置换两次，然后冻干至恒重来制备样品。

在另一个实施例中，化学修饰的藻酸盐的缀合密度是通过使用下文实例 27中描述的定量胺测定进行测量。

为了用于产生下文实例中所述的水凝胶胶囊，制备了化学修饰的藻酸盐聚合物，其中如通过氮百分比燃烧分析测量的，化合物101(表4中所示) 与低分子量藻酸盐(近似MW<75kDa，G:M比≥1.5)以中(2％至5％N) 或高(5.1％至8％N)密度缀合，且在本文中称为CM-LMW-Alg-101-中和 CM-LMW-Alg-101-高。除非另有说明，否则下文实例中制备的胶囊中的化学修饰的藻酸盐为CM-LMW-Alg-101-中。

例如，在藻酸盐的情况下，用50mM的含0.5M NaCl的2-(N-吗啉代)- 乙磺酸水合物缓冲溶液在pH 6.5下制备藻酸盐溶液(1％，w/v)，并依次与 N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亚胺(EDC)混合。 N-羟基琥珀酰亚胺与EDC的摩尔比是0.5:1.0。将目的肽添加到藻酸盐溶液中。添加的肽和偶联剂的量取决于与藻酸盐结合的肽的所需浓度，例如肽缀合密度。通过增加肽和偶联剂的量，可以获得更高的缀合密度。反应24h后，将反应物通过超纯去离子水(diH2O)(MWCO 3500)透析3天进行纯化，用活性炭处理30min，过滤(0.22mm过滤器)，并浓缩至所需粘度。

在实施例中，肽修饰的藻酸盐的缀合密度通过氮百分比燃烧分析测量。通过将肽修饰的藻酸盐溶液对水(10,000MWCO膜)透析24小时，将水置换两次，然后冻干至恒重来制备样品。

在另一个实施例中，肽修饰的藻酸盐的缀合密度是使用如实例25以及任选地26中描述的定量肽缀合测定测量的。

实例2：制备用于制造水凝胶胶囊的示例性藻酸盐溶液

除非另有说明，否则所有未修饰的和肽修饰的藻酸盐均购自挪威山特维卡的

实例3：制备用于包封在一室或两室水凝胶毫胶囊中的示例性细胞

3A.用于作为单细胞包封的工程化ARPE-19细胞

可以根据本领域已知的任何方法，例如根据以下方案，培养经工程化以表达治疗剂例如凝血因子(例如，FVIII或FIX蛋白)的ARPE-19细胞。

吸出75cm

3B.用于作为簇包封的ARPE-19细胞

使用AggreWell

在第2天，将平板从孵育中移除。使用大口径移液管头，轻轻吸打细胞以移除球状体簇。通过40μm或80μm细胞过滤器过滤这些簇以除去外来分离的单细胞，然后在离心机中旋转2x1分钟。使用大口径移液管头轻轻地重新悬浮这些簇，并轻轻搅拌以将它们分布遍及整个介质或另一种材料(例如藻酸盐)。

可替代地，使用以下方案制备ARPE-19球状体。在第1天，在无菌组织培养罩中从包装中取出AggreWell

可替代地，使用PBS MINI生物反应器(PBS Biotec公司,美国加州卡马里洛(Camarillo CA,USA))按照以下方案制备ARPE19球体。将细胞培养基和2.2亿ARPE19细胞添加到PBS 0.1L或PBS 0.5L的容器中，然后将其插入放置在培养箱中的基本单元中。在如上所述收集球状体之前，将PBS MINI速度调节刻度盘设置为40rpm，并且将容器在37℃下孵育至少48小时。

实例4：在下文实例中使用的水凝胶胶囊的制备

包封为单细胞的RPE细胞的胶囊在包封之前，将工程化为表达治疗性蛋白的单ARPE-19细胞在1,400r.p.m离心1分钟并用无钙Krebs-Henseleit (KH)缓冲液(4.7mM KCl，25mM HEPES，1.2mM KH

在制备一室和两室水凝胶胶囊之前，通过使用无菌工艺通过0.2-μm过滤器过滤来对缓冲液和藻酸盐溶液进行灭菌。

为了制造包封细胞的、直径约1.5mm的一隔室水凝胶胶囊，将所需数量的细胞悬浮于所需藻酸盐溶液中(例如，对照胶囊中使用的70:30 CM-LMW-Alg:U-HMW-Alg溶液或实例2和表6中所述的实验藻酸盐溶液中的一种)，将所得细胞悬浮液加载到注射器中并用18号钝头针(SAI融合技术公司(SAI Infusion Technologies))盖上。将注射器放入注射泵中，注射泵在含有交联溶液的培养皿上方垂直定向。高压发电机连接到针头并接地到生物安全柜。打开注射泵和发电机以通过针头挤出藻酸盐溶液，流速为0.16 mL/min或10mL/hr，并将电压调节在5-9kV范围内，直至出现液滴速率12 滴/10秒。

为了制备配置为直径约1.5mm的两隔室水凝胶毫胶囊的装置，如下设置静电液滴发生器：ES系列0-100kV，20瓦高压发电机(EQ系列，松山 (Matsusada)，北卡罗莱纳州，美国)连接到同轴针头的顶部和底部(内腔 22G，外腔18G，Ramé-Hart仪器公司(Ramé-HartInstrument Co.)，Succasunna，新泽西州，美国)。将内腔连接到带有Luer-Lok

为了制备两隔室和一隔室的毫胶囊，在挤出所需体积的藻酸盐溶液后，将藻酸盐液滴在含有25mM HEPES、20mM BaCl

实例5：将细胞结合位点掺入包封细胞的单隔室藻酸盐胶囊内对体外细胞生产力和存活力的影响

基本上如实例4中所述，使用实例2中所述的藻酸盐溶液来制备含有单隔室水凝胶毫微囊(直径约1.5mm)的组合物，所述藻酸盐溶液缺乏或含有细胞结合位点。

将经工程化以表达FVIII-BDD蛋白(SEQ ID NO:1)的ARPE-19细胞 (ARPE-19:FVIII-BDD细胞)以330万个细胞/ml藻酸盐悬浮在对照藻酸盐溶液中(70:30 CM-LMW-Alg-101:U-HMW-Alg)或实例2和表6中所述的实验藻酸盐溶液中的一种中。制备后，将每种胶囊组合物以每孔一个胶囊放入 96孔板中。24h后收集上清液，并通过ELISA测量每种上清液中FVIII的浓度。同样，此时，通过CellTiter

如图2所示，与对照(例如，缺乏CBP的藻酸盐)相比，包封在经细胞结合肽(例如，CBP-藻酸盐)共价修饰的藻酸盐溶液中的细胞没有显示出增加的生产力。另外，藻酸盐与胶原蛋白I和HA的混合物也不能提高包封细胞的生产力。这些结果表明，包封性藻酸盐聚合物中细胞结合位点的存在不影响包封细胞的体外生产力。

实例6：在胶囊植入后，将ARPE19:FVIII-BDD细胞包封在胶囊内隔室中经 RGD修饰的藻酸盐中增加FVIII-BDD血浆水平

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备对照组合物和包封ARPE19:FVIII-BDD细胞的经RGD修饰的两隔室水凝胶毫胶囊。第二(外)隔室的溶液是无细胞的70:30 CM-LMW-Alg-101:U-HMW-Alg溶液，且第一(内)隔室的溶液是ARPE19:FVIII-BDD细胞在70:30 CM-LMW-Alg-101:U-HMW-Alg溶液(对照)或实例2中描述的RGD修饰藻酸盐溶液(VLVG-4GRGD和1G-RGD:0.41)之一中的悬浮液。将ARPE19:FVIII-BDD细胞以1亿个细胞/ml的浓度悬浮在第一藻酸盐溶液(内隔室溶液)中。

将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入裸鼠的腹膜内(IP)空间(每种组合物4只小鼠)。植入后2周，经由临时抽血从每只小鼠收集血样。通过ELISA测量这些样品中的FVIII-BDD血浆水平，结果如图3所示。

与对照相比，两种RGD-修饰的藻酸盐胶囊的血浆FVIII-BDD水平均较高，表明在第一隔室内存在RGD-藻酸盐可增加体内FVIII-BDD血浆水平。

实例7：将细胞包封在内胶囊隔室中的包含细胞结合位点的聚合物中不会影响体内细胞增殖或离体胶囊机械性能

如实例6中所述制备两隔室对照和包含CBP并在第一(内)隔室中包封ARPE19:FVIII-BDD细胞的胶囊的组合物。还制备了类似的两隔室胶囊，其中外隔室相同，但是内隔室由上文实例2和表6中所述的胶原蛋白I或 HA藻酸盐溶液形成。对于所有对照和测试胶囊，用于形成内隔室的溶液中悬浮细胞的浓度为1亿个细胞/ml。

将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入裸鼠的IP空间(每种组合物 4只小鼠)。植入后4周，从小鼠中取出了大多数胶囊，并使用CellTiter

在对照和CBP胶囊中，观察到在一个月的植入期间一定的细胞生长，但是对于对照和CBP-藻酸盐组，取回的胶囊中的细胞数量相似。在植入一个月的时间内，胶原蛋白和HA胶囊中的细胞数量没有明显变化。如图4A 所示，尽管增殖的程度在各组之间变化，但是其他数据(未显示)表明，无论起始细胞浓度如何，细胞数目在约50,000个细胞/胶囊附近平稳。因此，图4A中的数据表明GRGDSP(SEQ ID NO:60)肽没有刺激体内的显著增殖(超过在对照胶囊中观察到的)。

植入前测量的初始破裂因胶囊组成而异：与对照和VLVG-4GRGD胶囊相比，由SLG20(即1G-RGD，HA，胶原蛋白I)组成的第一(内)隔室产生了更坚固的胶囊。但是，对于对照和所有测试胶囊组合物中的胶囊，植入一个月后取回时确定的初始破裂强度相似。这些数据表明胶囊内细胞结合结构域的存在不影响胶囊的机械完整性。

实例8：在胶囊植入后，将ARPE19-FVIII-BDD细胞包封在内胶囊隔室中 G-RGD-藻酸盐中增加FVIII-BDD血浆水平

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封 ARPE19:FVIII-BDD细胞的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。使用70:30 CM-LMW-Alg-101:U-LMW-Alg溶液制备第二(外)隔室，并且内隔室包含 70:30 CM-LMW-Alg-101:U-LMW-Alg溶液(对照)或实例2和表6中描述的以下CBP修饰藻酸盐溶液之一：MVG-GRGDSP、1G-RGD:0.41、 4G-RGD:0.53。对于所有对照和测试胶囊，用于形成内隔室的藻酸盐溶液中细胞的浓度为1亿个细胞/ml。

将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入裸鼠的IP空间(每种组合物 4只小鼠)。植入后14天，处死动物并从每只小鼠收集血样。通过ELISA测量这些样品中的FVIII-BDD血浆水平，结果如图5所示。

在植入了含有经由单个G接头经RGD肽共价修饰的藻酸盐的胶囊的小鼠中，血浆FVIII-BDD水平高于植入有对照胶囊或经由4G接头经相同RGD 肽共价修饰的藻酸盐的胶囊的小鼠。具有相同RGD肽但不同MW藻酸盐的两个RGD藻酸盐之间(MVG-GRGDSP和1G-RGD:0.41)或MVG-GRGDSP 藻酸盐和M REDV藻酸盐的混合物之间没有显著差异。令人惊讶的是，用与1G-RGD:0.41藻酸盐相同的RGD肽(RGDSP(SEQ ID NO:59))修饰但使用4G接头而不是单个G接头的4G-RGD:0.53藻酸盐似乎对细胞生产力产生负面影响：在植入4G-RGD:0.53胶囊的小鼠中无法检测到血浆 FVIII-BDD。这些数据表明，经由经装置(例如，水凝胶毫胶囊)植入细胞可以提高动物模型中植入的工程化RPE细胞表达的治疗蛋白的血浆水平，所述装置将工程化RPE细胞包封在经由单个G接头缀合至RGD细胞结合肽的聚合物(例如，藻酸盐)中。

实例9：内胶囊隔室中存在RGD-藻酸盐不影响植入胶囊的纤维化

该实验检查了在将胶囊植入动物模型后，内隔室中细胞结合肽的存在以及外隔室中去纤维化化合物的中等或高密度是否会影响纤维化水平。在该实验中使用的胶囊组合物具有下述的两隔室胶囊构造。

(1)对照：内隔室由溶液形成，所述溶液包含ARPE19-FVIII-BDD细胞在70:30 CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg混合物中的悬浮液；外隔室由 70:30 CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg混合物形成；

(2)RGD内/中等外：内隔室由溶液形成，所述溶液包含 ARPE19-FVIII-BDD细胞在1G-RGD:0.41(表6)中的悬浮液；外隔室由70:30 CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg混合物形成；

(3)RGD内/高外：内隔室由溶液形成，所述溶液包含 ARPE19-FVIII-BDD细胞在1G-RGD:0.41(表6)中的悬浮液；外隔室由70:30 CM-LMW-Alg-101-高:U-HMW-Alg混合物形成；

(4)RGD内/高(60:40)外：内隔室由溶液形成，所述溶液包含 ARPE19-FVIII-BDD细胞在1G-RGD:0.41(表6)中的悬浮液；外隔室由60:40 CM-LMW-Alg-101-高:U-HMW-Alg混合物形成；以及

(5)RGD，空：内/中等外：内隔室由1G-RGD:0.41(表6)形成；外隔室由70:30 CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg混合物形成，但未包封细胞。

将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入C57/BL6小鼠的IP空间(每种组合物4只小鼠)，并且11天后取回。取回的胶囊通过明视野显微镜成像，结果示于图6。

对于在第二(外)隔室中具有中等密度去纤维化化合物并且第一隔室将细胞包封在去纤维化藻酸盐:未修饰的藻酸盐混合物(对照)或RGD-藻酸盐中的胶囊，纤维化没有差异。正如预期的，植入的没有细胞的胶囊(RGD(空)) 在小鼠中的纤维化程度比含有异种RPE细胞的胶囊要小。通过使用高密度 CM-LMW藻酸盐来改变第二(外)隔室中去纤维化化合物的密度减少了纤维化，而将CM-LMW:U-HMW混合比从70:30更改为60:40增加了纤维化。因此，第一(内)隔室中细胞结合肽的存在不影响胶囊的去纤维化特性。

实例10：将ARPE19:FIX-帕多瓦细胞包封在内胶囊隔室中的G-RGD-藻酸盐中，增加植入后血浆FIX帕多瓦水平

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封 ARPE19:FIX-帕多瓦细胞的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。第二(外)隔室由70:30 CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg溶液形成，且内隔室由以下藻酸盐溶液之一形成，这些藻酸盐溶液中每一者包含1亿个ARPE19:FIX-帕多瓦细胞/ml：

(1)对照：70:30 CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg混合物；

(2)1G-RGD:0.41

(3)4G-RGD:0.53

(4)4G-RGD:0.96

(5)4G-RGD:1.77

(6)RGD-4G:2.95

将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入裸鼠的IP空间(每种组合物 4只小鼠)。植入后12天，处死动物并从每只小鼠收集血样。通过ELISA测量这些样品中FIX的血浆水平。

如图7所示，与对照和内隔室中具有较高密度4G-RGD藻酸盐的胶囊相比，内隔室中含有1G-RGD:0.41藻酸盐或4G-RGD:0.53藻酸盐的胶囊的植入后血浆FIX水平显著更高。出人意料的是，植入1G-RGD:0.41胶囊所产生的血浆FIX水平显著高于植入4G-RGD:0.53胶囊所产生的，这表明RGD 接头的组成相对于从胶囊分泌的治疗性蛋白质的量可影响细胞生产力。最后，使用具有更高浓度的4G接头肽(SEQ ID NO：61)的藻酸盐聚合物制备的胶囊均具有与对照相似的FIX水平。总之，这些数据表明，植入包含 RPE细胞的两隔室水凝胶胶囊(该RPE细胞经工程化以表达FIX蛋白并包封在第一(内)隔室的RGD-藻酸盐中)可以显著增加动物模型中的血浆FIX 水平，并标明RGD密度和接头大小的一些组合可能无法与经1G-RGDSP在约0.41％N下修饰的藻酸盐一样好地工作。

实例11.使用RGD-藻酸盐和第二CBP-藻酸盐的混合物将ARPE19:FIX-帕多瓦细胞包封在内胶囊隔室中时，植入后血浆FIX水平更高

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封 ARPE19:FIX-帕多瓦细胞的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。第二(外)隔室由70:30 CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg溶液形成，且内隔室由以下藻酸盐溶液之一形成，这些藻酸盐溶液中每一者包含1亿个ARPE19:FIX-帕多瓦细胞/ml。

(1)对照：70:30 CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg混合物；

(2)1G-RGD:0.41(表6)

(3)4G-DGEA(表6)

(4)1G-RGD/4G-DGEA：1G-RGD:0.41溶液与4G-DGEA溶液的1:1 混合物

(5)1G-RGD/4G-PHSRN：1G-RGD:0.41溶液与4G-PHSRN溶液的 1:1混合物

(6)1G-RGD/4G-DGEA/4G-PHSRN：1G-RGD:0.41、4G-DGEA与 PHSRN溶液的1:1:1混合物。

将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入裸鼠的IP空间(每种组合物 4只小鼠)。植入后2周，处死动物并从每只小鼠收集血样。通过ELISA测量这些样品中FIX的血浆水平。

如图8所示，与对照相比，含有1G-RGD-藻酸盐或DGEA-藻酸盐的胶囊的FIX血浆水平更高，其中RGD胶囊中的较高水平具有单因素ANOVA 的统计学意义。尽管没有达到统计学显著性，但1G-RGD藻酸盐仍显著高于 4G-DGEA胶囊。对于三组胶囊(含有RGD藻酸盐和另一种CBP藻酸盐的混合物)，FIX血浆水平最高。这些数据表明，与使用单个CBP-藻酸盐 (RGDSP(SEQ ID NO:59)或DGEA(SEQ ID NO:39))制成的胶囊相比，包含ARPE19-FIX-帕多瓦细胞以及多种CBP-藻酸盐的组合的胶囊可以提高 FIX水平。

实例12.包封ARPE19:FIX-帕多瓦细胞的内隔室中RGD肽的密度影响植入的水凝胶胶囊产生的FIX血浆水平

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封 ARPE19:FIX-帕多瓦细胞的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。第二(外)隔室由70:30 CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg溶液形成，且内隔室由以下表 6中所述的藻酸盐溶液之一形成，这些藻酸盐溶液中每一者包含1亿个 ARPE19:FIX-帕多瓦细胞/ml：

(1)对照：70:30 CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg混合物；

(2)1G-RGD:0.22

(3)1G-RGD:0.33

(4)1G-RGD:0.72

(5)1G-RGD:1.47

将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入裸鼠的IP空间。植入后2周，处死动物并从每只小鼠收集血样。通过ELISA测量这些样品中FIX的血浆水平。

如图9所示，与第一(内)隔室聚合物缀合的RGD的量影响血浆中检测到的FIX的水平。FIX水平随着RGD密度从0增加到1G-RGD:53而增加，但是令人惊讶的是，在植入1G-RGD:0.72和1G-RGD:1.47胶囊后，FIX水平依次降低。总之，这些数据表明，RGD肽的缀合密度可对水凝胶胶囊产生的FIX水平产生显著影响，此外，对于如本实例所述构造的胶囊，在内隔室用1G-RGD:0.33制备的胶囊对于实现最高血浆FIX-帕多瓦水平可能是最佳的。

实例13.将ARPE19:PTH细胞包封在内胶囊隔室中的1G-RGD-藻酸盐中，增加植入后血浆PTH水平

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备对照组合物和包封ARPE19:PTH细胞的经RGD修饰的两隔室水凝胶毫胶囊。第二 (外)隔室的藻酸盐溶液是无细胞的70:30 CM-LMW-Alg-101:U-HMW-Alg 溶液，且用于第一(内)隔室的藻酸盐溶液是ARPE19:FVIII-PTH细胞以1 亿个细胞/ml在70:30 CM-LMW-Alg-101:U-HMW-Alg溶液(对照)或表6 中描述的RGD修饰藻酸盐溶液(1G-RGD:0.72％)中的悬浮液。

将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入裸鼠的腹膜内(IP)空间(每种组合物4只小鼠)。植入后1周，处死动物并从每只小鼠收集血样。通过 ELISA测量这些样品中的PTH血浆水平，结果如图10所示。

与对照相比，RGD-修饰的藻酸盐胶囊的血浆PTH水平高近似两倍，表明在第一隔室内存在RGD-藻酸盐可增加体内PTH血浆水平。

实例14：内胶囊隔室中的G-RGD-藻酸盐内含有ARPE19:FVIII细胞的胶囊的稳定性与无RGD对照相当

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封 ARPE19:FVIII细胞的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。用以下第一和第二隔室溶液的组合制备胶囊组合物：(1)第一和第二：CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg溶液(对照条件)，(2)第一：1G-RGD:0.41，第二： CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg溶液，(3)第一：1G-RGD:0.41，第二：CM-LMW-Alg-101-高:U-HMW-Alg溶液，(4)第一：1G-RGD:0.41，第二：CM-LMW-Alg-101-高:U-HMW-Alg溶液，以60:40体积比的of CM-LMW-ALG-101比高:U-HMW制备，以及(5)第一：1G-RGD:0.41，第二：CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg溶液。对于上述条件(1-4)，以1 亿个细胞/ml，将ARPE19:FIX细胞包封在第一(内)隔室中。将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入裸鼠的IP空间。植入后2个月，处死动物并从每只小鼠收集胶囊。对胶囊成像并进行活/死染色。数据示于图11中。

完整取回所有胶囊并检测到活细胞。与含有GRGDSP(SEQ ID NO：60) 的胶囊相比，用于对照的第一隔室内的细胞密度存在可见差异，但是活细胞的总数相似(数据未显示)。总之，这些数据表明在第一隔室内掺入RGD不会对胶囊的完整性产生负面影响。

实例15：内胶囊隔室中的G-RGD-藻酸盐内含有Balb/3T3细胞的胶囊植入 C57/BL6中直到2个月，具有与无RGD对照相等的去纤维化

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封 ARPE19:FVIII细胞的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。用以下如实例14中所述的第一和第二隔室溶液的组合制备胶囊组合物。对于上述条件(1-4)，以 2000万个细胞/ml，将Balb/3T3细胞包封在第一(内)隔室中。将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入C57/BL6小鼠的IP空间。植入后2个月，取回胶囊并通过明视野显微镜对纤维化的存在进行成像。

如图12所示，所有胶囊均被完整取出并且基本上没有纤维化，其中空的、透明的外层没有被不透明的纤维化沉积物覆盖。如预期的，与70:30混合物相比，在以60:40的CM-LMW-Alg-101-高:U-HMW-Alg混合物制备的胶囊中观察到更多的纤维化。总之，这些数据表明，在第一隔室内RGD掺入确实影响了同种异体情况下胶囊的去纤维化特性。

实例16：包封ARPE19:FIX-帕多瓦细胞的内隔室中G-RGD-修饰的多肽的身份影响植入的水凝胶胶囊产生的FIX血浆水平

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封 ARPE19:FIX-帕多瓦细胞的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。第二(外)隔室由70:30 CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg溶液形成，且内隔室由以下藻酸盐溶液之一使用如表6中所述的不同初始聚合物形成，这些藻酸盐溶液中每一者包含1亿个ARPE19:FIX-帕多瓦细胞/ml：

(1)1G-RGD:0.72

(2)1G-MVG:0.71,79cP

(3)1G-MVG:0.71,97cP

(4)1G-MVG:0.71,143cP

(5)1G-MVG:0.71,202cP

(6)1G-SLG100:0.65

将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入裸鼠的IP空间。植入后4周，处死动物并从每只小鼠收集胶囊和血样。通过ELISA测量这些样品中FIX 的血浆水平。使用质地分析仪测量在植入前和离体取回时胶囊的初始破裂。

植入前，胶囊的初始破裂随聚合物的身份和溶液粘度的变化而变化。如图13A所示，以相似的离体机械强度完整地取出所有胶囊。如图13B所示，与G-SLG100:0.65或G-MVG:0.71相比，在四种粘度(79、97、143、202cP) 的任何一个处，含有G-RGD:0.72的胶囊的FIX-帕多瓦血浆水平最高。总之，这些数据表明，与RGD肽缀合的聚合物的身份可对水凝胶胶囊产生的FIX 水平产生显著影响，此外，对于如本实例所述构造的胶囊，SLG20聚合物对于实现最高血浆FIX水平可能是最佳的。

实例17：将ARPE19:FIX细胞包封在内胶囊隔室中的1G-HAVDI-藻酸盐中，增加植入后血浆FIX水平

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备对照和包封ARPE19:FIX细胞的经HAVDI修饰的(SEQ ID NO:38)两隔室水凝胶毫胶囊。第二(外)隔室的藻酸盐溶液是无细胞的70:30 CM-LMW-Alg-101:U-HMW-Alg溶液，且用于第一(内)隔室的藻酸盐溶液是ARPE19:FIX细胞以1亿个细胞/ml在70:30 CM-LMW-Alg-101:U-HMW-Alg溶液(对照)或表6中描述的HAVDI修饰藻酸盐溶液(G-HAVDI:0.38％)中的悬浮液。

将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入裸鼠的腹膜内(IP)空间(每种组合物4只小鼠)。植入后2周，通过临时抽血从每只小鼠收集样品。通过ELISA测量这些样品中的FIX血浆水平，结果如图14所示。

与对照相比，HAVDI修饰的藻酸盐胶囊的血浆FIX水平高近似两倍，这表明在第一隔室内存在源自钙黏蛋白的CBP修饰的藻酸盐(例如， G-HAVDI)可以增加体内FIX血浆水平。

实例18：内隔室中包封ARPE19:FIX-帕多瓦细胞的G-RGD修饰的聚合物增加了来自IP和SubQ部位的血浆中的FIX水平

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封 ARPE19:FIX-帕多瓦细胞的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。第二(外)隔室由70:30 CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg溶液形成，且内隔室由以下表 6中所述的G-RGD:0.33形成，这些中每一者包含1亿个ARPE19:FIX-帕多瓦细胞/ml。

以0.2mL胶囊/动物将胶囊植入裸鼠的IP和SubQ部位。10天后，收集血浆样品和胶囊时处死动物。通过ELISA确定血浆中的FIX水平，并通过 Cell Titer Glo确定每个胶囊的活细胞数。

如图15A所示，在所有条件下在血浆中都检测到FIX，但是对于植入了 IP而不是SubQ的胶囊的动物，其水平更高。与IP和SubQ部位的对照相比，含G-RGD的胶囊的FIX水平更高。如图15B所示，相比于SubQ，对于从 IP取回的胶囊，每个胶囊的活细胞数略高。总之，这表明含CBP的胶囊可通过多种施用途径增加治疗性蛋白质的血清水平。

实例19：内隔室中包封ARPE19:FVII细胞的G-RGD修饰的聚合物导致IP 和SubQ部位检测到FVII

用1G-RGD:0.33制备包封ARPE19:FVII细胞的胶囊，并如实例18所述植入。图16显示在血浆中从IP和SubQ部位都检测到FVII，表明含有1G-RGD: 0.33的胶囊可用于递送FVII，并且该胶囊可植入IP或SubQ。

实例20：用高缀合的G-RGD藻酸盐与未修饰的藻酸盐的混合物制备的胶囊实现与1G-RGD:0.33藻酸盐相似的FIX水平.

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封 ARPE19:FIX-帕多瓦细胞的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。第二(外)隔室由70:30 CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg溶液形成，且内隔室由以下藻酸盐溶液之一使用如表6中所述的不同初始聚合物形成，这些藻酸盐溶液中每一者包含1亿个ARPE19:FIX-帕多瓦细胞/ml：

(1)1G-RGD:0.33

(2)1G-RGD:6.04,1:55

(3)1G-RGD:6.04,1:30

(4)1G-RGD:6.04,1:15

将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入裸鼠的IP空间。植入后2周，处死动物并从每只小鼠收集胶囊和血样。通过ELISA测量这些样品中FIX 的血浆水平。

如图17所示，与G-RGD:6.04,1:55和G-RGD:6.04:1:15相比，含有 1G-RGD:0.33和G-RGD:6.04,1:30(0.20％N)的胶囊的FIX-帕多瓦的血浆水平最高。总之，这些数据表明，可以通过将高缀合的聚合物与未缀合的聚合物混合到大约相同的水平来模拟最佳的RGD缀合水平。另外，在本实例中所述的混合溶液中，在中间缀合水平上存在与实例12中所述的相似的最大FIX水平。

实例21：必须在第一隔室内包含1G-RGD以防止纤维化

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封 ARPE19:FIX-帕多瓦的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。用以下第一和第二隔室溶液的组合制备胶囊组合物并在第一隔室中包封2000万个ARPE19:FIX 细胞/ml：(1)第一：未修饰的1.4w/v％SLG20，第二：CM-LMW-Alg-101- 高:U-HMW-Alg，(2)：第一：1G-RGD:0.33，第二：CM-LMW-Alg-101- 高:U-HMW-Alg，和(3)：第一：与未缀合的G-RGD肽混合的未修饰的 1.4w/v％SLG20，以实现溶液中0.33％N，和(4)：第一：未修饰的1.4w/v％ SLG20，第二：1G-RGD:0.33。

将胶囊以0.5mL/动物植入C57/BL6小鼠的IP空间中2周。处死时，收集胶囊。取回的胶囊用抗F4/80染色小鼠巨噬细胞，并通过荧光显微镜检查纤维化的存在。

如图18所示，对于胶囊和对照(第一隔室中的缀合的1G-RGD:0.33或未缀合的0.33％N G-RGD肽)，观察到相似的巨噬细胞粘附。值得注意的是，与对照相比，在第一隔室中包含未缀合的0.33％N G-RGD的胶囊不具有增加的巨噬细胞粘附，表明未缀合的G-RGD不驱动纤维化反应。重要的是，在第二(外)隔室使用G-RGD:0.33藻酸盐的胶囊中，巨噬细胞粘附增加了，这表明CBP-藻酸盐必须包含在胶囊的第一(内)隔室中以防止纤维化。

实例22：将ARPE19:FIX细胞与G-RGD和G-PHSRN包封在掺混在一起或缀合至同一种聚合物上的两种聚合物上导致在植入后产生相似的血浆 FIX水平

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封 ARPE19:FIX-帕多瓦细胞的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。第二(外)隔室由70:30 CM-LMW-Alg-101-中等:U-HMW-Alg溶液形成，且内隔室由以下藻酸盐溶液之一使用如表6中所述的不同初始聚合物形成，这些藻酸盐溶液中每一者包含1亿个ARPE19:FIX-帕多瓦细胞/ml：

(1)1G-RGD:0.72与G-PHSRN:0.83的1:1混合物；以及

(2)PHSRN/RGD，相同聚合物(总计0.87％N)

将每种胶囊组合物的0.5mL等分试样植入裸鼠的IP空间。植入后2周，处死动物并从每只小鼠收集胶囊和血样。通过ELISA测量这些样品中FIX 的血浆水平。

如图19所示，对于包含G-RGD和G-PHSRN两者的胶囊的组合物两者， FIX的血浆水平相似。

实例23：接头组成对RGDSP-缀合藻酸盐中包封的ARPE19-FIX细胞的生产力的评估

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封 ARPE19:FIX细胞的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。第二(外)隔室由70:30 CM-LMW-Alg-101-高:U-HMW-Alg溶液形成，且内隔室由RGD-藻酸盐溶液与用或不使用接头(由1、2、3、4或6个甘氨酸残基(1G、2G、3G、4G (SEQ ID NO:61)、6G(SEQ ID NO:69))组成)或由一个β-丙氨酸组成的接头与藻酸盐缀合的RGDSP肽(SEQ ID NO:59)形成。冻干后，针对氮含量百分比通过元素分析确定肽缀合水平，以提供：对于无接头0.19％N，对于1G接头0.30％N，对于2G接头0.32％N，对于3G接头0.29％N，对于 4G接头(SEQ ID NO:61)0.48％N，对于6G接头0.43％N，和对于1β-丙氨酸连接的RGDSP肽(SEQ ID NO:59)0.28％N。以1亿个细胞/mL，将 ARPE19:FIX细胞包封在第一(内)隔室中。将每种胶囊组合物的0.25mL 等分试样植入裸鼠的IP空间(n＝3只/组)。植入后12天，处死动物并从每只小鼠收集血浆。通过ELISA测量这些样品中FIX的血浆水平。

如图22所示，用于将RGDSP肽(SEQ ID NO:59)与第一(内)隔室聚合物缀合的接头的选择影响血浆中检测到的FIX的水平。当肽修饰的藻酸盐中甘氨酸接头残基的数量从3增加到4，以及从4增加到6时，胶囊产生的血浆FIX水平显著下降。相反，具有藻酸盐的胶囊产生了相似水平的血浆FIX水平，其中经由无接头或经由1G、2G、3G或1-β-丙氨酸接头中任一者附接肽RGDSP(SEQ ID NO：59)。

实例24：GRDGSP缀合的藻酸盐的低至中粘度可最大化FIX水平

如实例4中所述，通过同轴针挤出第一和第二藻酸盐溶液来制备包封 ARPE19:FIX细胞的两隔室水凝胶毫胶囊的组合物。第二(外)隔室由70:30 CM-LMW-Alg-101-高:U-HMW-Alg溶液形成，且内隔室由RGD-藻酸盐溶液和与藻酸盐缀合的GRGDSP肽(SEQ ID NO:60)形成。将RGD-藻酸盐溶液配制成不同的溶液粘度：91、112、142、228、366、453cP。冻干后，针对氮含量百分比通过元素分析确定肽缀合水平，以提供：分别地，对于91cP、 142cP、228cP样品0.38％N，以及对于112cP、366cP、和453cP样品0.32％ N。这些RGD-藻酸盐溶液用于将ARPE19:FIX细胞以1亿个细胞/mL包封在第一(内)隔室中。将每种胶囊组合物的0.25mL等分试样植入裸鼠的IP 空间(n＝4只/组)。植入后18天，处死动物并从每只小鼠收集血浆。通过ELISA测量这些样品中FIX的血浆水平。

如图23所示，第一(内)隔室聚合物溶液的粘度影响血浆中检测到的 FIX的水平。当包封在低至中等粘度溶液(91cP至228cP)中时，与包封在较高粘度溶液(366cP和453cP)中相比，ARPE19:FX细胞产生更高的血浆FIX水平。

实例25：示例性的定量肽缀合测定。

该测定通过使CBP-聚合物样品经受酸水解来确定CBP-聚合物中肽的量，所述酸水解将CBP切割为单个氨基酸。通过预柱在线衍生化和反相液相色谱-紫外-荧光(LC-UV-FLR)(改编自Agilent Biocolumns氨基酸分析“How-To”指南，安捷伦科技公司(AgilentTechnologies,Inc.)， 5991-7694EN，2018年3月1日发布)，使用氨基酸参比品对水解样品中的各个氨基酸进行分离和定量)。伯氨基酸(例如除脯氨酸外的全部20个标准 L-α氨基酸)用邻苯二醛(OPA)衍生，且仲氨基酸(例如脯氨酸)用9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)衍生。然后平均每种氨基酸的摩尔浓度，以计算样品中总肽的浓度。可以通过使用任何合适的分析技术(例如，如实例26中所述)确定CBP-聚合物的未水解样品中的肽的量，并将该量从总肽量中减去，来针对CBP-聚合物中任何残留未缀合的CBP的存在校正浓度。

该测定在下文进一步描述，该测定用于确定GRGDSP-藻酸盐中的肽缀合密度；然而，本领域技术人员可以容易地修改该测定以确定GRGDSP-藻酸盐或其他肽修饰的聚合物中的肽浓度，条件是未修饰的聚合物不包含任何氨基酸。同样，技术人员可以容易地用可以在测定中执行或提供基本上相同的功能或作用的不同的装备、材料或化学物质代替以下指定的任何装备、材料或化学物质。

定义

装备、材料和化学物质

装备

·安捷伦(Agilent)1260LC系统

·安捷伦二极管阵列检测器(G1315D)：13μL/10mm流通池

·安捷伦荧光检测器(G1321B)

·化学工作站(ChemStation)软件

·带加热块的热/搅拌板，IKA RCT BS001

·梅特勒-托利多(Mettler Toledo)XPE105分析天平

·pH计，梅特勒-托利多S220 SevenCompact

·离心机，贝克曼库尔特爱兰歌娜(Beckman Coulter Allegra)25R

·涡旋混合器，VWR 97043-562

·带有加热装置(耐酸)的氮蒸发器，Organomation 1156Y80

材料

·AdvanceBio AA LC柱，2.7μm，4.6x100 mm，安捷伦655950-80

·AdvanceBio AAA保护柱，2.7μm，4.6x5 mm，安捷伦820750-931

·带有PTFE衬里盖的微波反应瓶，化学玻璃(Chemglass)CG-4920-02

·50mL离心管，VWR 10160-140

·压接器，化学玻璃CG-4930-20

·开瓶器(Decapper)，VWR 10806-372

·量筒，A级

·容积转移移液器(移交)A级

·容量瓶，A级

·移液管(200μL可变体积)，艾本德3123000055

·移液管(1000μL可变体积)，艾本德3123000063

·移液管(10mL可变体积)，艾本德3123000080

·一次性移液器，VWR 16001-180

·搅拌子，VWR 58948-078

·LC小瓶(2mL)，安捷伦5182-0716

·LC瓶帽(未预密封)，安捷伦5182-0721

·LC瓶插入件(250μL)，安捷伦5183-2085

·各种实验室玻璃器皿

化学物质

程序

试剂制备

注意：可以按比例缩放体积以形成较小或较大的批次

10mM Na

·使用1L量筒计量1L的LCMS级水并将其转移到流动相瓶中。

·称量2.64±0.10g的Na

·称量2.00±0.10g的Na

·将两种盐添加到含有1L水的同一瓶中

·吸取2.4mL的6N HCl到同一瓶中

·在环境温度下搅拌板，直到固体完全溶解

·用6N HCl调节最终pH至8.20±0.05

失效日期/储存条件(环境温度1周；2℃-8℃温度1个月)

45/45/10ACN/MeOH/水(有机流动相)

·使用500mL量筒计量450mL的LCMS级ACN并将其转移到流动相瓶中。

·使用500mL量筒计量450mL的LCMS级MeOH并将其转移到相同瓶中。

·使用100mL量筒计量100mL的LCMS级水并将其转移到相同瓶中。

·手动翻转并摇匀以混合均匀。

·失效日期/储存条件(环境温度1个月)

进样稀释物

·使用100mL量筒计量100mL的水性流动相并将其转移到流动相瓶中

·吸取0.4mL的浓磷酸到同一瓶中

·手动翻转并摇匀以混合均匀。

·失效日期/储存条件(2℃-8℃1个月)

·将1.5mL进样稀释物转移到LC小瓶中，并将该小瓶放在安捷伦 LC系统中的“4”位置以进行仪器分析

衍生化试剂：硼酸盐缓冲剂

·将1.5mL转移到LC小瓶中，并放在安捷伦LC系统中的“1”位置以进行仪器分析

衍生化试剂：OPA和FMOC

·破开OPA试剂和FMOC试剂各自的安瓿

·将100μL OPA试剂或FMOC试剂的等分试样(NLT)放入带有LC 瓶插入件的LC小瓶中，并安捷伦LC系统中将包含OPA试剂的LC小瓶置于位置“2”，并将包含FMOC试剂的LC小瓶置于位置“3”(FMOC)以进行仪器分析

冻干的肽-藻酸盐缀合物的样品的酸水解

称量12-16mg冻干的缀合物到微波反应瓶中，确保样品留在底部

根据下面的步骤3.3.2-3.3.19水解

冻干的肽-藻酸盐缀合物的样品在盐溶液中的酸水解

称量1000±50mg盐水中的缀合物溶液至微波反应瓶中

使用10mL移液管或容量吸管向样品中添加10.0mL的6N HCl

添加一个搅拌子

用压接机密封衬PTFE的盖

将每个样品瓶放在热/搅拌板上的匹配加热块中

在120℃加热，以400rpm搅拌，持续6小时

去除加热并冷却至环境温度

取下盖子并用一次性移液管将整个溶液从反应瓶中移至20mL容量瓶中

用移液管吸取2mL的LCMS级水到空的反应瓶中，用相同的一次性移液管彻底冲洗内壁，然后将冲洗液完全移入同一20mL容量瓶中

重复上述步骤两次

用LCMS级水标记容量瓶

盖上盖子并颠倒烧瓶多次以混合均匀

完全移入50mL离心管中

以5000rpm离心10分钟

准确吸取1mL上清液到LC小瓶中，并保存在2℃-8℃直到干燥(例如，第二天)(如果需要，将剩余的上清液保存在2℃-8℃以进行任何重复测试)

在60℃的氮气下完全干燥1mL上清液，确保针不接触样品，但足够低以快速干燥样品

吸取0.25mL的0.1μmol/mL内标混合物到装有干燥样品的小瓶中

彻底涡旋

用移液器转移到带有LC瓶插入件的LC小瓶中

储存在2℃-8℃，直到HPLC分析(步骤3.6)

标准品制备

AA标准品储备溶液：10μmol/mL

·对于每种AA，基于MW计算制备10μmol/mL储备溶液所需的重量

·参见如下实例：

·将计算出的重量称入50mL容量瓶中

·溶解并用0.1N HCl标记

·通过加盖，倒置或涡旋以混合均匀

·储存在2℃-8℃，直到HPLC分析(步骤3.6)

内标混合物：1μmol/mL

·在相同的10mL容量瓶中，精确吸取1.0mL正缬氨酸储备溶液(10 μmol/mL)和1.0mL肌氨酸储备溶液(10μmol/mL)

·用0.1N HCl标记

·通过加盖，倒置或涡旋以混合均匀

·储存在2℃-8℃，直到HPLC分析(步骤3.6)

内标混合物：0.1μmol/mL

注意：该溶液用于干燥后重构样品

·精确吸取1.0mL内标混合物(1μmol/mL)到10mL容量瓶中

·用0.1N HCl标记

·通过加盖，倒置或涡旋以混合均匀

·储存在2℃-8℃，直到HPLC分析(步骤3.6)

5AA混合物(+iSTD 0.1):0.025/0.1/0.25μmol/mL

·精确吸取xxμL(见下表)的D、S、G、R、N-iSTD、S-iSTD、和 P(10μmol/mL)溶液到同一10mL容量瓶中

·用0.1N HCl标记

·通过加盖，倒置或涡旋以混合均匀

·储存在2℃-8℃，直到HPLC分析(步骤3.6)

17AA标准品(+iSTD 0.1)混合物：0.1μmol/mL

·破开0.1μmol/mL 17AA标准品溶液的安瓿

·精确吸取0.9mL的AA标准品混合物到LC小瓶中

·Into the same LC vial，精确吸取100μL的iSTD混合物(1μmol/mL) 到同一LC小瓶中

·涡旋混合均匀

·将NLT 100μL等分到带有LC瓶插入件的LC小瓶中

·储存在2℃-8℃，直到HPLC分析(步骤3.6)

HPLC条件

HPLC分析

(样品分析的示例顺序)

*仅供参考，仅运行一次进样作为初始标准品和最终标准品。

系统适用性标准

在标准进样中分析定量中使用的每种目的氨基酸(D/S/G/R)和内标(诺华林和肌氨酸)的保留时间和峰面积(UV和FLR两者)。

数据分析-仅在系统适用性合格时才分析样品

整合指南

·仅整合目的氨基酸

·从“自动集成”开始

·根据需要手动调整积分

目的氨基酸的鉴定

·17AA(+iSTD)标准品混合物中目的AA和内标的RT应当与5AA (+iSTD)标准品混合物中的RT匹配

·每个样品中AA的RT应与标准品的RT相匹配(UV/FLR)

相对面积(D,S,G,R)＝面积(D,S,G,R)/面积(正缬氨酸)

相对面积(P)＝面积(P)/面积(肌氨酸)

标准校正曲线

·使用分析证书上的报告值或在标准品制备过程中通过稀释因子调整的实际重量计算标准品溶液的浓度。

·绘制标准进样中每种目标氨基酸的平均面积或平均相对面积与浓度的关系图：0.025、0.1、和0.25μmol/mL。执行线性回归。

浓度＝m*面积或相对面积+b

其中，m是线性拟合曲线的斜率，且b是线性拟合曲线的Y轴截距。

·RSQ不应小于0.99。

·如果线性度失败，请准备新鲜的衍生化试剂/标准品溶液，并对系统故障进行故障排除并重复测试。

样品分析

·可以通过UV和FLR进行定量

·使用相对面积(相对于内标的面积比)进行定量

·使用线性拟合标准曲线计算每个样品中AA的浓度：G、R、D、S：

浓度,AA(μmol/mL)＝(m*面积或相对面积+b)

·通过平均每种AA的浓度，计算总GRGDSP(SEQ ID NO:60)的浓度：

浓度,总GRGDSP(SEQ ID NO:60)(μmol/mL)＝(浓度,G/2+浓度,R +浓度,D+浓度,S+浓度,P)/5

μmol(总GRGDSP)(SEQ ID NO:60)/g(缀合物)＝浓度,总GRGDSP (SEQ ID NO:60)(μmol/mL)x0.25mL/1.0mL x 20mL/重量(g)

μmol(缀合的GRGDSP(SEQ ID NO:60))/g(缀合物)＝μmol(总 GRGDSP(SEQ ID NO:60))/g(缀合物)-μmol(残留游离GRGDSP(SEQ ID NO:60))/g(缀合物)

实例26：确定CBP-聚合物组合物中残留游离肽的示例性测定

这项分析使用液相色谱-质谱(LC-MS)来确定包含肽-聚合物缀合物的组合物中残留的未缀合肽的数量，例如通常在执行一个或多个纯化步骤以去除大部分后，例如，大于95％、98％、99％或更多的未缀合的肽进行。简而言之，将盐溶液中的缀合物样品添加到分子量截断(MWCO)管中，MWCO 高于肽的分子量，将管离心以从缀合物中分离出残留的肽，并且使用包含已知浓度的相同肽的参比组合物作为标准品，通过LC-MS对肽的量进行定量。

实例27：示例性定量胺测定以测量经具有式(I)的化合物修饰的去纤维化聚合物中的胺-缀合密度。

该测定确定了用胺化合物化学修饰的聚合物中含胺化合物(例如，具有式I的化合物，例如表4中的化合物101)的量。将化学修饰的聚合物的样品进行裂解缀合胺的酸水解，并且使用非缀合胺化合物作为标准品通过反相液相色谱和紫外检测(LC-UV)定量分析水解的样品中总胺的重量％。LC 峰的身份可以通过质谱进一步确认。总胺的重量％可以用作化学修饰的聚合物中胺化合物的％缀合。通过使用任何合适的方法(例如，如下所述)测定化学修饰的聚合物的未水解样品中任何残留的未缀合的胺化合物的量并从总肽量中减去该量，可以获得更精确的结果。

该测定在下面进一步描述，用于测定用化合物101(即， CM-LMW-Alg-101)化学修饰的藻酸盐中的％缀合密度；然而，本领域技术人员可以容易地修改测定，以确定用于化学修饰多糖(例如，藻酸盐)或不包含胺的另一种聚合物的任何具有式I的化合物的缀合密度。同样，技术人员可以容易地用可以在测定中执行或提供基本上相同的功能或作用的不同的装备、材料或化学物质代替以下指定的任何装备、材料或化学物质。

定义

装备和材料

装备

·安捷伦1260LC系统(DAD:13μL/10mm流通池)

·安捷伦SQ MS检测器(G1956B)

·化学工作站(ChemStation)软件

·带加热块的热/搅拌板，IKA RCT BS001

·梅特勒-托利多(Mettler Toledo)XPE105分析天平

·离心机，贝克曼库尔特爱兰歌娜(Beckman Coulter Allegra)25R

·涡旋混合器，VWR 97043-562

材料

·XBridge C18，2.5μm，4.6x50mm，沃特世(Waters)186006037

·SG-SM0001参比材料(>98.0％纯度)

·2N HCl(ACS级)，BDH 7203-1

·氨水28％-30％(ACS级)，密理博西格马(MilliPore Sigma) 1.05423.1000

·乙腈(LCMS级)，费希尔化学A955-4

·水(LCMS级)，费希尔化学W6-4

·0.9％盐水，ROBio SAL-090

·带有PTFE衬里盖的微波反应瓶，化学玻璃(Chemglass)CG-4920-02

·Vivaspin 20 3kDa MWCO浓缩器，通用医疗(GE Healthcare) 28-9323-58

·50mL离心管，VWR 10160-140

·压接器，化学玻璃CG-4930-20

·开瓶器(Decapper)，VWR 10806-372

·量筒，A级

·容积转移移液器(移交)A级

·容量瓶，A级

·气密性注射器1mL，汉密尔顿(Hamilton)81316

·移液管(200μL可变体积)，艾本德3123000055

·移液管(1000μL可变体积)，艾本德3123000063

·移液管(10mL可变体积)，艾本德3123000080

·一次性移液器，VWR 16001-180

·搅拌子，VWR 58948-078

·LC小瓶和帽，VWR 46610-724

·各种各样的实验室玻璃器皿

程序

试剂制备

注意：可以按比例缩放体积以形成较小或较大的批次

水中0.1％的氨(水性流动相)

·使用1L量筒计量1L的LCMS级水并将其转移到流动相瓶中。

·使用1mL容积转移移液器或汉密尔顿注射器，估量1.0mL浓氨水，并将其转移到同一流动相瓶中。

·手动翻转并摇匀以混合均匀。

·失效日期/储存条件-环境温度1个月

ACN中0.1％的氨(有机流动相)

·使用1L量筒计量1L的LCMS级ACN并将其转移到流动相瓶中。

·使用1mL容积转移移液器或汉密尔顿注射器，估量1.0mL浓氨水，并将其转移到同一流动相瓶中。

·手动翻转并摇匀以混合均匀。

·失效日期/储存条件-环境温度1个月

固体缀合样品的酸水解

称量50±5mg冻干的缀合物固体到微波反应瓶中，确保缀合物留在瓶底

使用10mL移液管或容量吸管添加10.0mL的2N HCl

添加一个搅拌子

用压接机密封衬PTFE的盖

将每个样品瓶放在热/搅拌板上的匹配加热块中

在120℃加热，以400rpm搅拌，持续120分钟

去除加热并冷却至环境温度

用一次性移液管将整个溶液从反应瓶中移至25mL容量瓶中

用移液管吸取5mL的LCMS级水到空的反应瓶中，用相同的一次性移液管彻底冲洗内壁，然后将冲洗液完全移入同一25mL容量瓶中

重复上述步骤两次

用LCMS级水标记容量瓶

完全移入50mL离心管中

以3000rpm离心10分钟

取上清液进行HPLC分析

储存在2℃-8℃

盐样品中缀合物的酸水解

称量1000±50mg盐水中的缀合物溶液至微波反应瓶中

使用10mL移液管或容量吸管添加10.0mL的2N HCl

添加一个搅拌子

用压接机密封衬PTFE的盖

将每个样品瓶放在热/搅拌板上的匹配加热块中

在120℃加热，以400rpm搅拌，持续120分钟

去除加热并冷却至环境温度

用一次性移液管将整个溶液从反应瓶中移至25mL容量瓶中

用移液管吸取5mL的LCMS级水到空的反应瓶中，用相同的一次性移液管彻底冲洗内壁，然后将冲洗液完全移入同一25mL容量瓶中

重复上述步骤两次

用LCMS级水标记容量瓶

完全移入50mL离心管中

以3000rpm离心10分钟

取上清液进行HPLC分析

储存在2℃-8℃

固体缀合物中残留的游离胺的样品制备

称量50±5mg冻干的缀合物固体到闪烁管中

吸取5.0mL的盐水到该闪烁管中

摇动并涡旋10分钟以完全溶解

完全移入MWCO管中

以5000rpm离心60分钟(将膜的平坦侧平行于转子臂放置)

去除MWCO管的顶部并丢弃

将底部的样品完全转移到5mL容量瓶中

用水或盐水标记并倒置以混合均匀

转移至闪烁瓶中，储存在2℃-8℃

转移等分试样用于HPLC分析

盐水中缀合物中残留的游离胺的样品制备

称量1000±50mg盐水中的缀合物(或与未修饰的藻酸盐混合)到 MWCO管中

吸取4.0mL的盐水到该MWCO管中

将试管翻转并涡旋5次，或直到溶液充分混合以充分提取游离胺

以5000rpm离心90分钟

去除MWCO管的顶部并丢弃

将底部的样品完全转移到5mL容量瓶中

用水标记并倒置以混合均匀

转移至闪烁瓶中，储存在2℃-8℃

转移等分试样用于HPLC分析

标准品制备

标准品溶液：1mg/mL

·称量50.00±5.00mg的SG-SM0001标准品溶液到闪烁管中

·添加约10mL LCMS级水，通过摇动和涡旋将固体完全溶解

·通过使用一次性移液管用LCMS级水冲洗闪烁瓶两次，将溶液完全转移至50mL容量瓶中

·用LCMS级水稀释至刻度，充分混合

·储存在2℃-8℃

标准品溶液：0.01mg/mL

·吸取100μL的1mg/mL溶液至10mL容量瓶中

·用LCMS级水稀释至刻度

·翻转混匀

·储存在2℃-8℃

HPLC条件

HPLC分析

样品分析的示例顺序

*仅供参考，仅运行一次进样作为初始标准品和最终标准品。

系统适用性标准

数据分析-仅在系统适用性合格时才分析样品

整合指南

·仅整合胺峰

·从“自动集成”开始

·根据需要手动调整积分

胺鉴定

·(任选的)每个样品中胺峰的m/z应在392.1±0.5以内。

·每个样品中UV中胺峰的RT与标准品的RT相匹配

浓度,标准品(mg/mL)＝

重量(mg)/50mL/稀释因子,

其中稀释因子＝1，对于1.0mg/mL标准品；

其中稀释因子＝100，对于0.01mg/mL标准品；

浓度,游离胺(mg/mL)＝

面积,未水解样品/面积,0.01标准品x浓度,0.01标准品

％残留游离胺＝

浓度,游离胺(mg/mL)x5mL/

重量,未水解缀合物(mg)x100

浓度,总胺(mg/mL)＝

面积,水解样品/面积,1.0标准品x浓度,1.0标准品

％总胺＝

浓度,总胺(mg/mL)x25mL/重量,水解缀合物(mg)x100

等效物和范围

本申请引用了不同发布的专利、出版的专利申请、杂志文章和其他出版物，将其全部通过引用以其整体并入本文。如果在任一个并入的参考文献和本说明书之间有冲突，以本说明书为准。另外，在现有技术之内的本披露的任何具体的实施例可以从任何一个或多个权利要求中明确排除。因为此类实施例被视为对于本领域的技术人员是已知的，因此它们可以被排除，即使该排除在本文没有被明确陈述。本披露的任何具体的实施例可以因为任何原因从任一权利要求中排除，不管是否与存在的现有技术相关。

本领域的普通技术人员只使用常规实验就将认识到或能够确定本文描述的具体实施例的许多等效形式。本文描述的实施例的范围不旨在限制以上说明书、附图或实例，而是如在所附权利要求中所陈述的。本领域的普通技术人员要认识到的是，在不脱离如在以下权利要求中所定义的本披露的精神或范围下，可以对本说明书进行各种改变和修改。

序列表

<110> 西吉隆医疗股份有限公司（SIGILON THERAPEUTICS, INC.）

<120> 用于细胞治疗的可植入装置及相关方法

<130> S2225-7026WO

<140>

<141>

<150> 62/824,768

<151> 2019-03-27

<150> 62/737,835

<151> 2018-09-27

<160> 70

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1457

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多肽"

<400> 1

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

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Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln

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Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu

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Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln

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Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr

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Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu

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Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met

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<211> 1474

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多肽"

<400> 7

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Tyr

<210> 8

<211> 4374

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

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<221> 来源

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<400> 9

atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60

accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120

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<210> 10

<211> 4374

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 10

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<210> 11

<211> 4362

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 11

atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60

accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 13

atgcagatcg agctgtctac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgcggttctg cttcagcgcc 60

accagaagat attacctggg cgccgtggaa ctgagctggg actacatgca gtctgacctg 120

ggagagctgc ccgtggacgc tagatttcct ccaagagtgc ccaagagctt ccccttcaac 180

acctccgtgg tgtacaagaa aaccctgttc gtggaattca ccgaccacct gttcaatatc 240

gccaagcctc ggcctccttg gatgggactg ctgggaccta caattcaggc cgaggtgtac 300

gacaccgtgg tcatcaccct gaagaacatg gccagccatc ctgtgtctct gcacgccgtg 360

ggagtgtctt actggaaggc ttctgagggc gccgagtacg acgatcagac aagccagaga 420

gagaaagagg acgacaaggt tttccctggc ggcagccaca cctatgtctg gcaggtcctg 480

aaagaaaacg gccctatggc ctccgatcct ctgtgcctga catacagcta cctgagccac 540

gtggacctgg tcaaggacct gaattctggc ctgatcggag ccctgctcgt gtgtagagaa 600

ggcagcctgg ccaaagagaa aacccagaca ctgcacaagt tcatcctgct gttcgccgtg 660

ttcgacgagg gcaagagctg gcacagcgag acaaagaaca gcctgatgca ggacagggat 720

gccgcctctg ctagagcttg gcctaagatg cacaccgtga acggctacgt gaacagaagc 780

ctgcctggac tgatcggctg ccacagaaag tccgtgtact ggcacgtgat cggcatgggc 840

acaacacctg aggtgcacag catctttctg gaaggacaca ccttcctcgt gcggaaccat 900

agacaggcca gcctggaaat cagccctatc accttcctga ccgctcagac cctgctgatg 960

gatctgggcc agtttctgct gttctgccac atcagctccc accagcacga tggcatggaa 1020

gcctacgtga aggtggacag ctgccccgaa gaaccccagc tgcggatgaa gaacaacgag 1080

gaagccgagg actacgacga cgacctgacc gactctgaga tggacgtcgt cagattcgac 1140

gacgataaca gccccagctt catccagatc agaagcgtgg ccaagaagca ccccaagacc 1200

tgggtgcact atatcgccgc cgaggaagag gactgggatt acgctcctct ggtgctggcc 1260

cctgacgaca gaagctacaa gagccagtac ctgaacaacg gccctcagcg gatcggccgg 1320

aagtataaga aagtgcggtt catggcctac accgacgaga cattcaagac cagagaggcc 1380

atccagcacg agagcggaat tctgggccct ctgctgtatg gcgaagtggg cgatacactg 1440

ctgatcatct tcaagaacca ggccagcaga ccctacaaca tctaccctca cggcatcacc 1500

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aaccggtcct ggtatctgac cgagaacatc cagcggtttc tgcccaatcc tgctggcgtg 1860

cagctggaag atcctgagtt ccaggcctcc aacatcatgc actccatcaa tggctatgtg 1920

ttcgacagcc tgcagctgag cgtgtgcctg cacgaagtgg cctactggta catcctgagc 1980

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atggtgtacg aggataccct gacactgttc ccattcagcg gcgagacagt gttcatgagc 2100

atggaaaacc ccggcctgtg gatcctgggc tgtcacaaca gcgacttccg gaacagaggc 2160

atgacagccc tgctgaaggt gtccagctgc gacaagaaca ccggcgacta ctacgaggac 2220

agctatgagg acatcagcgc ctacctgctg agcaagaaca atgccatcga gcctcggagc 2280

ttcagccaga atcctcctgt gctgaagcgg caccagcgcg agatcaccag aacaaccctg 2340

cagagcgacc aagaggaaat cgattacgac gacaccatca gcgtcgagat gaagaaagaa 2400

gatttcgaca tctacgacga ggacgagaat cagagcccca gaagctttca gaaaaagacc 2460

cggcactact tcattgccgc cgtcgagaga ctgtgggact acggcatgtc tagcagccct 2520

cacgtgctga gaaatagagc ccagagcggc agcgtgcccc agttcaagaa agtggtgttc 2580

caagagttca ccgacggcag cttcacccag ccactgtata gaggcgagct gaacgagcat 2640

ctgggcctgc tgggccctta tatcagagcc gaagtggaag ataacatcat ggtcaccttc 2700

cggaatcagg cctctcggcc ctacagcttc tacagctccc tgatcagcta cgaagaggac 2760

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tggagagtgg aatgtctgat tggagagcac ctccacgccg gaatgagcac cctgtttctg 3420

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cagatcgctc tgcggatgga agtgctgggc tgtgaagctc aggacctcta ctga 4374

<210> 14

<211> 4374

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 14

atgcagatcg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgcgcttctg cttcagcgcc 60

acccgccgct actacctggg cgccgtggag ctgagctggg actacatgca gagcgacctg 120

ggcgagctgc ccgtggacgc ccgcttcccc ccccgcgtgc ccaagagctt ccccttcaac 180

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gagaaggagg acgacaaggt gttccccggc ggcagccaca cctacgtgtg gcaggtgctg 480

aaggagaacg gccccatggc cagcgacccc ctgtgcctga cctacagcta cctgagccac 540

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accacccccg aggtgcacag catcttcctg gagggccaca ccttcctggt gcgcaaccac 900

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gcctacgtga aggtggacag ctgccccgag gagccccagc tgcgcatgaa gaacaacgag 1080

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gacctggcca gcggcctgat cggccccctg ctgatctgct acaaggagag cgtggaccag 1740

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cagagcgacc aggaggagat cgactacgac gacaccatca gcgtggagat gaagaaggag 2400

gacttcgaca tctacgacga ggacgagaac cagagccccc gcagcttcca gaagaagacc 2460

cgccactact tcatcgccgc cgtggagcgc ctgtgggact acggcatgag cagcagcccc 2520

cacgtgctgc gcaaccgcgc ccagagcggc agcgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc 2580

caggagttca ccgacggcag cttcacccag cccctgtacc gcggcgagct gaacgagcac 2640

ctgggcctgc tgggccccta catccgcgcc gaggtggagg acaacatcat ggtgaccttc 2700

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ctggccccca tgatcatcca cggcatcaag acccagggcg cccgccagaa gttcagcagc 3660

ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggacg gcaagaagtg gcagacctac 3720

cgcggcaaca gcaccggcac cctgatggtg ttcttcggca acgtggacag cagcggcatc 3780

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<210> 15

<211> 4374

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 15

atgcagattg agctgagcac ctgtttcttc ctgtgcctgc tgagattttg cttctcagct 60

acccgcaggt actacctggg agccgttgag ctgtcctggg attacatgca gtcagatctg 120

ggggagctgc ctgtggacgc tcggtttccc cccagagtgc caaagtcctt tcccttcaac 180

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gcctacgtta aggtcgatag ttgccctgaa gaacctcagc tgaggatgaa gaacaacgag 1080

gaagccgagg actacgatga cgatttgacc gattccgaaa tggacgtggt gcgctttgat 1140

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gacctcgcat ctggcttgat cggccctctg ctgatatgtt acaaggaaag cgtcgatcag 1740

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atggagaacc ctggactgtg gattctcgga tgccacaaca gtgactttcg taatagaggg 2160

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ttctcacaga atccccctgt cctcaagagg caccagcgag agatcacaag gaccacactc 2340

cagtccgacc aggaggagat tgactacgat gacacgattt ctgtggagat gaaaaaagag 2400

gactttgaca tctacgatga ggatgaaaac cagagcccta ggtcgttcca gaagaaaaca 2460

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cacgtgttgc ggaacagagc ccagagtggg tccgtcccac agttcaagaa ggttgttttc 2580

caggagttca cagatggctc cttcactcag ccactgtatc gcggcgagct gaatgagcac 2640

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ttttggaagg tgcagcacca tatggcgccg acgaaagacg aatttgactg caaagcctgg 2880

gcctacttca gcgacgtcga cttggagaag gacgtccaca gcggcctgat tggccctttg 2940

ttggtctgcc ataccaatac actcaaccct gcccacggga ggcaggtgac cgtgcaggag 3000

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gagaggaact gcagagcacc ctgtaacatc cagatggagg accctacttt caaggaaaat 3120

tacaggttcc atgccattaa tggctacatc atggataccc tccccgggct tgtgatggct 3180

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cttgccccca tgattattca cggcattaag acacaggggg ccaggcagaa attctcctcc 3660

ctgtacatct cccagttcat catcatgtac agtctggacg gcaaaaagtg gcagacctac 3720

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aaacacaaca ttttcaaccc ccccatcatt gctaggtata tcaggctcca tcccacccac 3840

tatagcatca ggtccactct gcggatggag ctgatgggct gcgaccttaa ttcatgcagc 3900

atgccgctgg gcatggagtc aaaggccatc tccgacgccc aaatcaccgc ctccagctac 3960

ttcaccaata tgttcgccac ctggagcccc agcaaggccc ggctgcacct gcagggccgc 4020

agcaacgcct ggcggcctca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag 4080

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tatgtgaagg agttcttgat cagctcgtca caggatggcc accagtggac tttgttcttt 4200

cagaacggta aggtgaaagt gttccaggga aaccaagatt cctttacacc agtggtcaac 4260

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 16

atgcagattg agctgagcac ctgtttcttc ctgtgcctgc tgagattttg cttctcagct 60

acccgcaggt actacctggg agccgttgag ctgtcctggg attacatgca gtcagatctg 120

ggggagctgc ctgtggacgc tcggtttccc cccagagtgc caaagtcctt tcccttcaac 180

accagcgtgg tgtacaaaaa gacacttttt gttgaattta ctgaccactt gttcaacatc 240

gccaagccac gacccccatg gatgggcctg ctggggccaa ccattcaggc agaggtttac 300

gacacagtcg tgatcacact gaagaacatg gcctcccatc cagtgtctct gcacgccgtc 360

ggtgtgtcct actggaaagc atccgagggc gccgagtatg acgaccagac cagccagaga 420

gagaaagagg acgacaaagt gttccctgga ggcagccaca cctacgtgtg gcaggtgttg 480

aaggaaaatg ggcccatggc cagtgaccct ttgtgtctga cttactcata cctgtctcat 540

gtggatctag tcaaggacct gaattctgga ctgattgggg cactgcttgt gtgccgcgaa 600

ggcagcctgg ccaaagaaaa gacacagacc cttcacaagt tcatcctgct gttcgccgtg 660

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<210> 17

<211> 4425

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 17

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ggcatggagt caaaggccat ctccgacgcc caaatcaccg cctccagcta cttcaccaat 4020

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 18

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<213> 人工序列

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tatggcatct acaccaaggt gtcccgctac gtgaactgga ttaaggagaa aaccaagctg 1380

acctga 1386

<210> 22

<211> 313

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 22

ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc 60

tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt gcatttagga catctcagtc gccgcttgga 120

gctcccgtga ggcgtgcttg tcaatgcggt aagtgtcact gattttgaac tataacgacc 180

gcgtgagtca aaatgacgca tgattatctt ttacgtgact tttaagattt aactcatacg 240

ataattatat tgttatttca tgttctactt acgtgataac ttattatata tatattttct 300

tgttatagat atc 313

<210> 23

<211> 1733

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 23

ctcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360

tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420

tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480

cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 540

ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 600

ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 660

cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc 720

cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc 780

ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg 840

aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt 900

gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc 960

gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg 1020

ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg 1080

tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc 1140

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cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 1320

gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 1380

cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 1440

ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 1500

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cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 1620

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tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttg 1733

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<211> 522

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 24

tcctcaggtg caggctgcct atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca 60

caaataccac tgagatcttt ttccctctgc caaaaattat ggggacatca tgaagcccct 120

tgagcatctg acttctggct aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa 180

ttttttgtgt ctctcactcg gaaggacata tgggagggca aatcatttaa aacatcagaa 240

tgagtatttg gtttagagtt tggcaacata tgcccatatg ctggctgcca tgaacaaagg 300

ttggctataa agaggtcatc agtatatgaa acagccccct gctgtccatt ccttattcca 360

tagaaaagcc ttgacttgag gttagatttt ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc 420

tttaacatcc ctaaaatttt ccttacatgt tttactagcc agatttttcc tcctctcctg 480

actactccca gtcatagctg tccctcttct cttatggaga tc 522

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

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ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg cgtaaaattg 60

acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa tagatattaa 120

gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt tatttatgtt 180

tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta acaaa 235

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<211> 6164

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 26

ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc 60

tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt gcatttagga catctcagtc gccgcttgga 120

gctcccgtga ggcgtgcttg tcaatgcggt aagtgtcact gattttgaac tataacgacc 180

gcgtgagtca aaatgacgca tgattatctt ttacgtgact tttaagattt aactcatacg 240

ataattatat tgttatttca tgttctactt acgtgataac ttattatata tatattttct 300

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attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta 420

cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt 480

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tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta 600

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ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg 720

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gtgtgggcgc gtcggtcggg ctgcaacccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc 1500

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ttcccgaaga gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 5460

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acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 5580

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ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 5760

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<210> 27

<211> 6721

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 27

ctcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360

tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420

tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480

cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 540

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ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 660

cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc 720

cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc 780

ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg 840

aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt 900

gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc 960

gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg 1020

ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg 1080

tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc 1140

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gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 1260

cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 1320

gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 1380

cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 1440

ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 1500

agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 1560

cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 1620

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aaatggacgt ggtgcgcttt gatgatgaca attctccatc cttcattcag attagatccg 2940

tcgccaagaa gcaccccaag acctgggtgc actacattgc agccgaggag gaggattggg 3000

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atggtccaca acggatcggc aggaagtaca agaaagtgcg gttcatggcc tatacagacg 3120

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acggcgaagt gggcgacacc ttgttaatta tcttcaagaa ccaggctagt agaccttata 3240

acatttatcc ccacggcatt accgatgtgc ggcctctcta ctctaggcgg cttccaaagg 3300

gggtgaaaca cctgaaggac tttcccatcc tccctggcga aatctttaag tataagtgga 3360

cagtgaccgt ggaggatgga ccaaccaaga gcgaccccag gtgcctgaca cgctattatt 3420

caagcttcgt gaatatggaa agggacctcg catctggctt gatcggccct ctgctgatat 3480

gttacaagga aagcgtcgat cagagaggaa atcagatcat gtcagacaaa aggaatgtga 3540

tcctgttctc cgtcttcgat gaaaacagga gctggtatct gacagagaac atccagagat 3600

tcctgccaaa tcccgccggc gtccagctgg aggacccgga gtttcaggca tctaacatca 3660

tgcattccat taatggttac gtgttcgact ccctgcagct gagcgtgtgc ctccacgagg 3720

tggcctactg gtacatcttg agcatcggcg cccagaccga ctttctgagc gtctttttct 3780

ccgggtatac tttcaaacat aagatggtgt acgaagatac tctgacgctg ttccctttct 3840

ctggggagac tgtgtttatg tctatggaga accctggact gtggattctc ggatgccaca 3900

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ataacgccat cgagccccga agcttctcac agaatccccc tgtcctcaag gcccaccagg 4080

cggagatcac aaggaccaca ctccagtccg accaggagga gattgactac gatgacacga 4140

tttctgtgga gatgaaaaaa gaggactttg acatctacga tgaggatgaa aaccagagcc 4200

ctaggtcgtt ccagaagaaa acaaggcact acttcattgc cgccgtggag agactgtggg 4260

actacggaat gagtagttcc ccacacgtgt tgcggaacag agcccagagt gggtccgtcc 4320

cacagttcaa gaaggttgtt ttccaggagt tcacagatgg ctccttcact cagccactgt 4380

atcgcggcga gctgaatgag cacttgggct tattgggccc ctacattcgc gcagaagtcg 4440

aagataatat tatggtgacc ttccgcaacc aggccagccg gccttactca ttctactcct 4500

ctctcatctc ttatgaggag gatcagcgcc agggcgccga accccggaag aactttgtga 4560

agcccaatga aaccaaaact tacttttgga aggtgcagca ccatatggcg ccgacgaaag 4620

acgaatttga ctgcaaagcc tgggcctact tcagcgacgt cgacttggag aaggacgtcc 4680

acagcggcct gattggccct ttgttggtct gccataccaa tacactcaac cctgcccacg 4740

ggaggcaggt gaccgtgcag gagtttgcct tgttcttcac catcttcgac gaaaccaaga 4800

gctggtactt cacagagaac atggagagga actgcagagc accctgtaac atccagatgg 4860

aggaccctac tttcaaggaa aattacaggt tccatgccat taatggctac atcatggata 4920

ccctccccgg gcttgtgatg gctcaggacc agcgcatccg ctggtacctg ctctcaatgg 4980

gctccaacga gaacattcat agcatccact ttagtggcca cgtgtttacc gtgcgcaaga 5040

aggaggagta caagatggca ctgtacaacc tgtaccctgg cgtgtttgag acagtggaga 5100

tgctgccatc caaggccggc atctggcgcg tggagtgcct cattggggag cacctccatg 5160

ctggcatgtc tacactgttc ctggtgtaca gcaacaagtg tcagactcca ctcggaatgg 5220

cctccgggca tatccgcgat tttcagatca cggcctctgg ccagtatggc caatgggctc 5280

ccaagctggc caggctgcac tacagtggga gtatcaacgc ttggagcacc aaggagcctt 5340

tctcctggat caaggtggac ctgcttgccc ccatgattat tcacggcatt aagacacagg 5400

gggccaggca gaaattctcc tccctgtaca tctcccagtt catcatcatg tacagtctgg 5460

acggcaaaaa gtggcagacc taccgcggga acagtaccgg gacattgatg gtgttcttcg 5520

ggaacgtgga ctctagcggc attaaacaca acattttcaa cccccccatc attgctaggt 5580

atatcaggct ccatcccacc cactatagca tcaggtccac tctgcggatg gagctgatgg 5640

gctgcgacct taattcatgc agcatgccgc tgggcatgga gtcaaaggcc atctccgacg 5700

cccaaatcac cgcctccagc tacttcacca atatgttcgc cacctggagc cccagcaagg 5760

cccggctgca cctgcagggc cgcagcaacg cctggcggcc tcaggtgaac aaccccaagg 5820

agtggctgca ggtggacttc cagaaaacca tgaaggtgac tggggtcacc acccagggag 5880

tcaagagcct gctgaccagc atgtatgtga aggagttctt gatcagctcg tcacaggatg 5940

gccaccagtg gactttgttc tttcagaacg gtaaggtgaa agtgttccag ggaaaccaag 6000

attcctttac accagtggtc aactctctgg atcctcccct gctgacacgg tacctgcgga 6060

tccatcccca gtcatgggtg caccagattg ctctgcgcat ggaggtgctt ggctgcgagg 6120

cccaggacct gtactgaaat tcgcggccgc taaacccagc tttcttgtac aaagtggcaa 6180

ctttattata catagttgat cctcaggtgc aggctgccta tcagaaggtg gtggctggtg 6240

tggccaatgc cctggctcac aaataccact gagatctttt tccctctgcc aaaaattatg 6300

gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca 6360

ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa 6420

atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gcccatatgc 6480

tggctgccat gaacaaaggt tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg 6540

ctgtccattc cttattccat agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt tttatatttt 6600

gttttgtgtt atttttttct ttaacatccc taaaattttc cttacatgtt ttactagcca 6660

gatttttcct cctctcctga ctactcccag tcatagctgt ccctcttctc ttatggagat 6720

c 6721

<210> 28

<211> 3733

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多核苷酸"

<400> 28

ctcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360

tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420

tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480

cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 540

ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 600

ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 660

cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc 720

cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc 780

ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg 840

aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt 900

gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc 960

gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg 1020

ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg 1080

tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc 1140

acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc 1200

gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 1260

cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 1320

gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 1380

cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 1440

ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 1500

agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 1560

cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 1620

tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 1680

tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttgcaagttt 1740

gtacaaaaaa gcaggctgcc accatgcagc gcgtgaacat gattatggcc gagtctcccg 1800

gcctgatcac catctgtctg ctgggctatc tgctgagcgc cgagtgcacc gtgtttctgg 1860

atcacgagaa cgccaacaag atcctgaaca gacccaagcg gtacaacagc ggcaagctgg 1920

aagagttcgt gcagggcaac ctggaacgcg agtgcatgga agagaagtgc agcttcgaag 1980

aggccagaga ggtgttcgag aacaccgaga gaaccaccga gttctggaag cagtacgtgg 2040

acggcgatca gtgcgagagc aacccttgtc tgaatggcgg cagctgcaag gacgacatca 2100

acagctacga gtgctggtgc cccttcggct tcgagggcaa gaattgcgag ctggacgtga 2160

cctgcaacat caagaacggc agatgcgagc agttctgcaa gaacagcgcc gacaacaagg 2220

tcgtgtgctc ctgcacagag ggctacagac tggccgagaa ccagaagtct tgcgagcccg 2280

ctgtgccctt tccatgtggc agagtgtctg tgtcccagac cagcaagctg accagagccg 2340

agacagtgtt ccccgacgtg gactacgtga acagcaccga ggccgagaca atcctggaca 2400

acatcaccca gagcacccag tccttcaacg acttcaccag agtcgtcggc ggcgaggatg 2460

ctaagcctgg acagtttcct tggcaagtgg tgctgaacgg caaggtggac gctttttgtg 2520

gcggctccat cgtgaacgag aagtggatcg tgaccgccgc tcactgtgtg gaaaccggcg 2580

tgaagattac agtggtggcc ggcgagcaca acatcgagga aacagagcac accgagcaga 2640

aacggaacgt gatcagaatc atccctcacc acaactacaa cgccgccatc aacaagtaca 2700

accacgatat cgccctgctg gaactggacg agcccctggt cctgaactct tacgtgaccc 2760

ctatctgtat cgccgacaaa gagtacacca acatctttct gaagttcggc agcggctacg 2820

tgtccggctg gggaagagtt ttccacaagg gcagatcagc cctggtgctg cagtacctga 2880

gagtgcccct ggtggataga gccacatgcc tgctgagcac caagttcacc atctacaaca 2940

acatgttctg cgccggcttc cacgaaggcg gcagagattc ttgtcaaggc gattctggcg 3000

gccctcacgt gacagaggtt gagggcacaa gctttctgac cggcatcatc agctggggcg 3060

aagagtgtgc catgaagggg aagtacggca tctacaccaa ggtgtccaga tacgtgaact 3120

ggatcaaaga aaagaccaag ctcacctgaa attcgcggcc gctaaaccca gctttcttgt 3180

acaaagtggc aactttatta tacatagttg atcctcaggt gcaggctgcc tatcagaagg 3240

tggtggctgg tgtggccaat gccctggctc acaaatacca ctgagatctt tttccctctg 3300

ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga 3360

aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat 3420

atgggagggc aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat 3480

atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag gttggctata aagaggtcat cagtatatga 3540

aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc cttgacttga ggttagattt 3600

tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt tccttacatg 3660

ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc agtcatagct gtccctcttc 3720

tcttatggag atc 3733

<210> 29

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多肽"

<400> 29

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210> 30

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多肽"

<400> 30

Met Ile Pro Ala Lys Asp Met Ala Lys Val Met Ile Val Met Leu Ala

1 5 10 15

Ile Cys Phe Leu Thr Lys Ser Asp Gly Lys Ser Val Lys Lys Arg Ser

20 25 30

Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser

35 40 45

Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn

50 55 60

Phe

65

<210> 31

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多肽"

<400> 31

Met Ile Pro Ala Lys Asp Met Ala Lys Val Met Ile Val Met Leu Ala

1 5 10 15

Ile Cys Phe Leu Thr Lys Ser Asp Gly Lys Ser Val Lys Lys Arg Ser

20 25 30

Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser

35 40 45

Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn

50 55 60

Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser Gln

65 70 75 80

Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys

85 90 95

Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala

100 105 110

Lys Ser Gln

115

<210> 32

<211> 506

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多肽"

<400> 32

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys

20 25 30

Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr

35 40 45

Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val

50 55 60

Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys

65 70 75 80

Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala

85 90 95

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp

100 105 110

Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr

115 120 125

Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe

130 135 140

Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn

145 150 155 160

Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro

165 170 175

Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu

180 185 190

Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp

195 200 205

Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu

210 215 220

Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser

225 230 235 240

Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly

245 250 255

Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln

260 265 270

Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser

275 280 285

Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr

290 295 300

Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg

305 310 315 320

Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Leu Asp Val Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser

340 345 350

Ile Gly Asp Cys Ala Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His

355 360 365

Val Cys Ala Gln His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu

370 375 380

Cys Pro Gln Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu

385 390 395 400

Cys Glu Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys

405 410 415

Gln His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys

420 425 430

His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr

435 440 445

Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg

450 455 460

Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His

465 470 475 480

Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys

485 490 495

Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro

500 505

<210> 33

<211> 1247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多肽"

<400> 33

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr

20 25 30

Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly

35 40 45

Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly

50 55 60

Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys

65 70 75 80

Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu

85 90 95

Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro

100 105 110

Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys

115 120 125

Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly

130 135 140

Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly

145 150 155 160

Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln

165 170 175

Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala

180 185 190

Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser

195 200 205

Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln

210 215 220

Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu

225 230 235 240

Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu

245 250 255

Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala

260 265 270

Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His

275 280 285

Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys

290 295 300

Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met

305 310 315 320

Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu

325 330 335

Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His

340 345 350

Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn

355 360 365

Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys

370 375 380

Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp

385 390 395 400

Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg

405 410 415

Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys

420 425 430

Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu

435 440 445

Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val

450 455 460

Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu

465 470 475 480

Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu

485 490 495

Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu

500 505 510

Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn

515 520 525

Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro

530 535 540

Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln

545 550 555 560

Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met

565 570 575

Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe

580 585 590

Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys

595 600 605

Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly

610 615 620

Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val

625 630 635 640

Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln

645 650 655

Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu

660 665 670

Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe

675 680 685

Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys

690 695 700

Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp

705 710 715 720

Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met

725 730 735

His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val

740 745 750

Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg

755 760 765

Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu

770 775 780

Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met

785 790 795 800

Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg

805 810 815

His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln

820 825 830

Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr

835 840 845

Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp

850 855 860

Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly

865 870 875 880

Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp

885 890 895

Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys

900 905 910

Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu

915 920 925

Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys

930 935 940

Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg

945 950 955 960

Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg

965 970 975

His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val

980 985 990

Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr

995 1000 1005

Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn

1010 1015 1020

Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro

1025 1030 1035

Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln

1040 1045 1050

Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe

1055 1060 1065

Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

1070 1075 1080

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala

1085 1090 1095

Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln

1100 1105 1110

His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln

1115 1120 1125

Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu

1130 1135 1140

Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln

1145 1150 1155

His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys

1160 1165 1170

His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln

1175 1180 1185

Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly

1190 1195 1200

Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp

1205 1210 1215

Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr

1220 1225 1230

Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro

1235 1240 1245

<210> 34

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多肽"

<400> 34

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 35

<211> 585

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多肽"

<400> 35

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210> 36

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多肽"

<400> 36

Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr

1 5 10 15

Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu

20 25 30

Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn

35 40 45

Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys

50 55 60

Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn

65 70 75 80

Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln

85 90 95

Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile

100 105 110

Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys

115 120 125

Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe

130 135 140

Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe

165 170 175

Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala

180 185 190

Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu

195 200 205

Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe

210 215 220

Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp

225 230 235 240

Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile

245 250 255

Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly

260 265 270

Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu

275 280 285

His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn

290 295 300

Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu

305 310 315 320

Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile

325 330 335

Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr

340 345 350

Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val

355 360 365

Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu

370 375 380

Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His

385 390 395 400

Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val

405 410 415

Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly

420 425 430

Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser

435 440 445

Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

450 455 460

<210> 37

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 37

Ser Trp Glu Leu Tyr Tyr Pro Leu Arg Ala Asn Leu

1 5 10

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 38

His Ala Val Asp Ile

1 5

<210> 39

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 39

Asp Gly Glu Ala

1

<210> 40

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 40

Phe Tyr Phe Asp Leu Arg

1 5

<210> 41

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<220>

<221> 经修饰的残基

<222> (3)..(3)

<223> 4-羟脯氨酸

<400> 41

Gly Phe Xaa Gly Glu Arg

1 5

<210> 42

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 42

Val Ala Pro Gly

1

<210> 43

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 43

Arg Gly Asp

1

<210> 44

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 44

Gly Pro Arg

1

<210> 45

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 45

Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5

<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 46

Pro His Ser Arg Asn

1 5

<210> 47

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 47

Arg Glu Asp Val

1

<210> 48

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 48

Ile Lys Val Ala Val

1 5

<210> 49

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 49

Leu Arg Glu

1

<210> 50

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 50

Tyr Ile Gly Ser Arg

1 5

<210> 51

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 51

Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg

1 5

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 52

Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu

1 5

<210> 53

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 53

Val Thr Cys Gly

1

<210> 54

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成多肽"

<220>

<221> 经修饰的残基

<222> (19)..(19)

<223> 4-羟脯氨酸

<400> 54

Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro

1 5 10 15

Gly Phe Xaa Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

20 25 30

Pro Pro Gly Pro Pro

35

<210> 55

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 55

Pro His Ser Arg Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Gly Asp Ser

1 5 10 15

<210> 56

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 56

Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Ala Ser Ile Lys Val Ala Val Ala Asp

1 5 10 15

Arg

<210> 57

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 57

Lys Gln Leu Arg Glu Gln

1 5

<210> 58

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 58

Ser Val Thr Cys Gly

1 5

<210> 59

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 59

Arg Gly Asp Ser Pro

1 5

<210> 60

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 60

Gly Arg Gly Asp Ser Pro

1 5

<210> 61

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 61

Gly Gly Gly Gly

1

<210> 62

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 62

Gly Arg Gly Asp

1

<210> 63

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<220>

<221> 位点

<222> (1)..(3)

<223> /注释="该区域可以包含1-3个残基"

<400> 63

Gly Gly Gly Arg Gly Asp

1 5

<210> 64

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<220>

<221> 位点

<222> (1)..(3)

<223> /注释="该区域可以包含1-3个残基"

<400> 64

Gly Gly Gly Arg Gly Asp Ser Pro

1 5

<210> 65

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 65

Leu Lys Arg His Gln Arg

1 5

<210> 66

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<220>

<221> 位点

<222> (1)..(3)

<223> /注释="该区域可以包含1-3个残基"

<400> 66

Gly Gly Gly Asp Gly Glu Ala

1 5

<210> 67

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<220>

<221> 位点

<222> (1)..(3)

<223> /注释="该区域可以包含1-3个残基"

<400> 67

Gly Gly Gly Pro His Arg Ser Asn

1 5

<210> 68

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<220>

<221> 位点

<222> (1)..(3)

<223> /注释="该区域可以包含1-3个残基"

<400> 68

Gly Gly Gly Arg Glu Asp Val

1 5

<210> 69

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 69

Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 70

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<220>

<221> 位点

<222> (1)..(4)

<223> /注释="该序列可以包含1-4个残基"

<400> 70

Gly Gly Gly Gly

1