一种复合光敏剂及光驱动杀菌的方法

技术领域

本发明涉及食品安全领域，具体为杀灭致病菌(沙门氏菌、单增李斯特菌等)和腐败菌(希瓦氏菌)的方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，人们在饮食上更加注重食品安全，食品安全已成为全球性的公共安全卫生热点话题。在众多食品安全事故中，食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，其对人类安全健康造成极大威胁，是食品安全问题的重大隐患。沙门氏菌是全球范围内危害公众健康的主要食源性致病菌，

据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，其裂解后可释放耐热力很强的内毒素。沙门氏菌主要存在与肉类，奶类，果蔬等食物中。在肉及其制品的沙门氏菌检出率美国为20％—25％、日本检查进口家禽的污染率为10.3％，国内肉类沙门氏菌检出率在1.1％—39.5％。因此，沙门氏菌给食源性疾病的控制和预防带来了新的挑战。

目前食品行业的杀菌手段主要分为两类，即传统的热杀菌技术和新型的非热杀菌技术(如超高压、脉冲电场、脉冲强光、辐照和微波等技术)。传统的热杀菌技术在食品行业中应用早、技术成熟且杀菌较彻底，能保证食品在微生物方面的安全，但会破坏食品的营养成分、组织结构、色泽和食品产品的风味。虽然现有的一些非热杀菌技术满足了消费者对食品安全与品质的双重要求，但它们往往存在着设备投入和运行成本高、能源消耗过大以及对冷链运输条件要求较高等缺点。因此，研发具有经济环保、绿色安全、广谱高效，并且能最大限度保持食品营养成分、组织结构和产品色泽等特性的光驱动杀菌技术正逐渐成为食品工业研究热点。

有研究认为现有的技术缺点为光驱动技术对革兰氏阴性菌的杀灭效果不理想。例如Zehao Li等人以煅烧三聚氰胺海绵(AMS)为光敏剂，使用300w的氙灯作为光源，在使用60mw/cm

因此，开发普通可见波长光源照射下绿色安全、低碳环保的新型光动力技术，大幅度提高光驱动杀菌效果，符合新时代条件下我国经济社会发展需求。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种基于绿色的复合光敏剂，高效杀灭的致病菌(例如沙门氏菌、单增李斯特菌等)和腐败菌(例如希瓦氏菌)的光驱动杀菌方法，尤其是用于食品杀菌。LED灯由于其性能稳定，结构简单，操作方便，安全可靠，成本低廉，且不受外界光照干扰，光照均匀，光热效应小，光照时间可精确控制的优良特性，已被广泛应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种复合光敏剂，其成分包括煅烧三聚氰胺海绵和可溶性二价铁盐。

所述煅烧三聚氰胺海绵的制备方法为，三聚氰胺海绵在300-450℃下煅烧，优选的，煅烧温度为350-375℃，本发明的一个优选实施方式中，煅烧温度为350℃。

煅烧时间1-5h，优选为2h；升温速率为5-15℃/min，优选为10℃/min。

所述煅烧三聚氰胺海绵和可溶性二价铁盐中铁离子的重量比为1：0.4-12.5，优选的，重量比为30：7-2：3；更优选为1：0.3-0.4。

上述复合光敏剂用于灭菌，尤其是杀灭致病菌(例如沙门氏菌、单增李斯特菌等)和腐败菌(例如希瓦氏菌)。经过对普通可见波长光源的优化，发现在波长为455-460nm的蓝光驱动下复合光敏剂光动力有效地杀灭了食源性致病菌(沙门氏菌等)和食品腐败菌等。

一种光驱动杀菌的方法，步骤包括：

(1)将二价铁离子(可溶性二价铁盐)、煅烧三聚氰胺海绵与待处理样品混合在黑暗中孵育；

(2)用蓝光照射，对沙门氏菌进行光驱动杀菌处理。

优选的，步骤(1)，在黑暗中孵育的时间为20-60分钟，更优选为35-45分钟；在本发明的一个优选实施方式中，在黑暗中孵育时间为40分钟。

步骤(2)所述光照时间为30-120分钟；优选为40-90分钟，更优选为40-60min。

优选的，步骤(2)所述蓝光波长范围为455-460nm。

优选的，步骤(2)蓝光的光能量密度为45-65mW/cm

优选的，步骤(2)中，以蓝色LED灯为光源。

待处理样品为固体时，将待处理样品与含有二价铁离子、煅烧三聚氰胺海绵的溶液混合。

待处理样品为液体时，将待处理样品与含有二价铁离子、煅烧三聚氰胺海绵的溶液混合，或者向待处理样品中加入二价铁离子和煅烧三聚氰胺海绵。

步骤(2)的混合体系中的二价铁离子浓度为0.4-2mg/mL，更优选为0.7-1.5mg/mL；在本发明的一个优选实施方式中，混合体系中的二价铁离子浓度为0.7mg/mL。

步骤(2)的混合体系中的煅烧三聚氰胺海绵浓度为1-5mg/mL，优选为1-3mg/mL；在本发明的一个优选实施方式中，混合体系中的煅烧三聚氰胺海绵浓度为2mg/mL。

所述煅烧三聚氰胺海绵和可溶性二价铁盐中铁离子的重量比为1：0.4-12.5，优选的，重量比为30：7-2：3；更优选为1：0.3-0.4。

所述煅烧三聚氰胺海绵的制备方法为，三聚氰胺海绵在300-450℃下煅烧，优选的，煅烧温度为350-375℃，本发明的一个优选实施方式中，煅烧温度为350℃。

煅烧时间1-5h，优选为2h；升温速率为5-15℃/min，优选为10℃/min。

杀菌处理后，光敏剂可以通过洗涤、过滤、抽滤或者压滤的方法去除。

本发明的复合光敏剂和方法能够提升光驱动杀菌效果，有效杀灭沙门氏菌，降低约6Log CFU/mL，去除率可达到99.9999％，对于单增李斯特菌和希瓦氏菌降低7Log CFU/mL以上，基本上可以完全杀灭。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的有益效果在于，以二价铁离子耦合煅烧海绵AMS为复合光敏剂，制备方法简单；以蓝色LED灯为光源，不需要特殊设备，就能够有效控制沙门氏菌等菌带来的风险，处理时间短，操作简便。经过上述方法处理后，可彻底杀灭沙门氏菌，并有一定的控制和预防效果。

本发明创新地将二价铁离子耦合煅烧海绵AMS与455-460nm的蓝色LED灯相结合，构建了一种新的用于杀灭致病菌和腐败菌的光驱动杀菌技术，以服务于食品工业，为降低沙门氏菌等致病菌或腐败菌的患病风险，维护公共卫生提供强有力的技术支持。

附图说明

图1为LED照明系统结构原理图

1—LED光源，2—24孔板，3—升降台，4—LED拍照摄影灯箱

图2为二价铁离子耦合光驱动煅烧海绵中，海绵煅烧温度对沙门氏菌存活的影响(P<0.05)。

图3为二价铁离子耦合光驱动煅烧海绵中，二价铁离子浓度对沙门氏菌存活的影响(P<0.05)。

图4为二价铁离子耦合光驱动煅烧海绵中，照射时间对沙门氏菌存活的影响(P<0.05)。

图5为二价铁离子耦合光驱动煅烧海绵杀灭油菜根茎中沙门氏菌存活的影响(P<0.05)。

图6为二价铁离子耦合光驱动煅烧海绵杀灭鸡蛋壳表面沙门氏菌存活的影响(P<0.05)。

图7为二价铁离子耦合光驱动煅烧海绵杀灭鲜榨黄瓜汁中沙门氏菌存活的影响(P<0.05)。

图8为二价铁离子耦合光驱动煅烧海绵，不同照射时间对沙门氏菌外膜的影响。照射时间分别为0、20、40、60min，对沙门氏菌外膜的影响。

图9为二价铁离子耦合光驱动煅烧海绵中，照射时间对单增李斯特菌存活的影响(P<0.05)。

图10为二价铁离子耦合光驱动煅烧海绵中，照射时间对希瓦氏菌存活的影响(P<0.05)。

图2-图7中的字母表示显著性。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明的实施并不限于以下各实施例。本发明的保护范围包括蓝光但不限于这一种光源照射，光驱动抑菌复合光敏剂杀灭致病菌和腐败菌顶范围包括沙门氏菌、单增李斯特菌、希瓦氏菌，但不限于这三种。

(一)菌种及培养：

鼠伤寒沙门氏菌CICC 21484购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(ChinaCenter of Industrial Culture Collection,CICC)；肠炎沙门氏菌CMCC 50041，购自中国医学微生物菌种保藏管理中心(China Medical Culture Collection，CMCC)。单增李斯特菌(ATCC19115、ATCC13932、ATCC7644、4bLM)从本实验室原猪肉中分离得到。希瓦氏菌(SP05、SP08)从本实验室腐败鱼头部样品中分离得到。

菌液培养条件：以革兰氏阳性单增李斯特菌、革兰氏阴性沙门氏菌代表食源性致病菌，希瓦氏菌代表食源性腐败菌。所有菌株保存在-80℃，25％的甘油中，单增李斯特菌和沙门氏菌分别在37℃条件下在BHI和TSB中活化培养12h，希瓦氏菌在TSB中活化培养12h。将获得的稳定初期的菌体培养液离心5min(4℃，4000g)，用0.85％无菌生理盐水溶液对菌体进行重悬，调整单增李斯特菌和希瓦氏菌菌体浓度为～8Log CFU/mL，沙门氏菌菌体浓度为～7Log CFU/mL。

(二)培养基、试剂与仪器：

脑心浸液琼脂(BHI)、PALCAM琼脂培养基、铁脂培养基、胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)、亚硫酸铋琼脂培养基(BSA)、胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)北京陆桥技术有限公司；白色三聚氰胺海绵(Melamine sponge，MS)购自郑州丰泰纳米材料有限公司；FeSO

Carbolite Gero-301马弗炉；PTR-60多功能垂直旋转混合器Grant-bio；9272隔水式恒温培养箱上海一恒科技有限公司。

LED组合灯箱即光驱动设备的组装：蓝色LED(455-460nm，18*14cm，20W)从中国广东中山吉达照明公司购买。如图1所示，LED光源1被一个LED拍照摄影灯箱4包围，以防止外部光线进入，LED光源1置于LED拍照摄影灯箱4顶部内侧，24孔板2置于升降台3上。

将LED光源1与24孔板(直径14mm)中细菌溶液之间的距离调整为5.0cm。蓝色LED的照明能量(光辐射强度)是56mW/cm

E＝Pt

其中E＝剂量(能量密度)，单位为J/cm

(三)实验方法

煅烧后的AMS和FeSO

吸取500μL混合液于24孔板中，用波长为455-460nm的蓝色LED灯照射一定时间。然后用0.85％无菌生理盐水进行稀释，选择合适稀释度，取100μL的稀释液进行涂布，将平板在37℃条件下培养36h，计算菌落数。每个处理均做3个平行样本，每个稀释度重复3次。

(四)数据分析

运用OriginPro 9.1、SPSS17.0软件包(SPSS Inc.,Chicago,USA)对实验数据进行处理和分析。采用最小显著极差法(LSD)对数据间的显著性进行比较(p＝0.05)。

实施例1光催化剂AMS制备

为了制备光催化剂AMS，将白色三聚氰胺海绵(MS)原料放入马弗炉中，加热至300～450℃，煅烧2h，升温速率为10℃/min，冷却至室温后，制得煅烧温度分别为300℃、350℃、375℃、400℃、450℃的AMS样品，以备进一步使用。

实施例2不同煅烧温度AMS的效果

将不同煅烧温度下获得的AMS和FeSO

吸取500μL混合菌液于24孔板中，用波长为455-460nm的蓝色LED灯照射40min(光辐射强度56mW/cm

体系中沙门氏菌的最初接种量为6.51Log CFU/mL。

图2中显示了不同煅烧温度的AMS和1mg/mL二价铁离子耦合处理后沙门氏菌的灭活情况。在孵育时间为40min，光照时间为40min时，在1mg/mL二价铁离子耦合不同煅烧温度MS、AMS-300、AMS-350、AMS-375、AMS-400、AMS-450下，最多分别能减少沙门氏菌的量为0.8、1.08、4.91、3.98、2.60、2.24Log CFU/mL。

随煅烧温度的增加，AMS和二价铁离子耦合处理后，光驱动对沙门氏菌的致死率提高，当煅烧温度达到350℃时，致死率最大。当继续提高煅烧温度时，对沙门氏菌的致死率明显下降。可能原因是过高的煅烧温度，改变了MS的化学结构和物理性质，从而减少了菌体与煅烧海绵AMS的接触面积，因此细菌的致死率降低。说明，合适煅烧温度的AMS和1mg/mL二价铁离子耦合处理后对沙门氏菌有较强的杀菌效果。

实施例3不同铁离子浓度对杀菌效果的影响

将AMS和不同浓度的FeSO

吸取500μL混合菌液于24孔板中，用波长为455-460nm的蓝色LED灯照射40min(光辐射强度56mW/cm

不同浓度二价铁离子与2mg/mL的AMS-350耦合光驱动处理后沙门氏菌的失活情况如图3所示。显然，随着二价铁离子浓度的增加，对沙门氏菌的杀灭效果也在增加。考虑到二价铁离子在食品中的添加量，选择浓度为0.7mg/mL的二价铁离子与2mg/mlAMS-350耦合用于后续的杀菌实验。

体系中沙门氏菌的最初接种量为6.37Log CFU/mL。

实施例4不同照射时间对杀菌效果的影响

AMS和FeSO

不同照射时间处理后沙门氏菌的失活情况如图4所示。随着照射时间的增加，对沙门氏菌的杀灭效果也显著增加。体系中沙门氏菌的最初接种量约为6.44Log CFU/mL。在孵育时间为40min，二价铁离子浓度为0.7mg/ml，AMS-350添加量为2mg/mL时，在不同照射时间20、40、60min下分别能减少沙门氏菌量为0.27、4.70和6.44Log CFU/mL。

实施例5光驱动方法处理油菜根茎中的沙门氏菌

将含有2mg/mL的AMS-350和0.7mg/mL的Fe

如图5所示，结果表明，起始油菜根茎中沙门氏菌菌落数为6.78Log CFU/g，光驱动杀菌处理后的菌落数为3.05Log CFU/g，对照组的菌落数为5.75Log CFU/g，通过多次实验发现，使用二价铁离子耦合煅烧海绵为光敏剂的光驱动杀灭沙门氏菌方法对油菜根茎的杀菌效果可以达到3.73Log CFU/g，其杀菌效果明显。

实施例6光驱动方法处理鸡蛋壳表面的沙门氏菌

将含有2mg/mL的AMS-350和0.7mg/mL的Fe

如图6所示，结果表明，起始蛋壳表面中沙门氏菌菌落数为6.41Log CFU/g，光驱动杀菌处理后的菌落数为3.34Log CFU/g，对照组的菌落数为5.17Log CFU/g，通过多次实验发现，使用二价铁离子耦合煅烧海绵为光敏剂的光驱动杀灭沙门氏菌方法对蛋壳表面的杀菌效果可以达到3.07Log CFU/g，其杀菌效果明显。

实施例7光驱动方法处理鲜榨黄瓜汁中的沙门氏菌

将AMS-350和FeSO

结果如图7所示，起始鲜榨黄瓜汁中沙门氏菌菌落数为6.86Log CFU/mL，光驱动杀菌处理后的菌落数为1.55Log CFU/mL，对照组的菌落数为5.13Log CFU/mL。通过多次实验发现，使用二价铁离子耦合煅烧海绵为光敏剂的光驱动杀灭沙门氏菌方法对鲜榨黄瓜汁的杀菌效果可以达到5.31Log CFU/ml，其杀菌效果明显。

实施例8光驱动杀菌方法对沙门氏菌外膜的影响

扫描电镜观察细菌形态的实验，是将12ml细菌悬浮液组成的样品以3，000rpm离心10分钟。弃去上清液，将沉淀物与1ml戊二醛(2.5％)吹打均匀，在4C下过夜固定。然后，在4℃下以8，000rpm离心5分钟，弃去上清，PBS洗涤三次。在连续稀释的乙醇溶液(30％、50％、70％、90％和100％)中脱水10min，离心(8000rpm，5min)用500ul无水乙醇重新悬浮，滴加10ul与载玻片上，风干。用热场发射扫描电镜(日立SU5000)对样品进行喷金观察。

结果如图8所示，无任何处理时，沙门氏菌细胞丰满，呈杆状，细胞膜光滑，细菌的鞭毛几乎没有损坏。AMS-350与Fe

实施例9不同照射时间对单增李斯特菌杀菌效果的影响

AMS和FeSO

不同照射时间处理后单增李斯特菌的失活情况如图9所示。随着照射时间的增加，对单增李斯特菌的杀灭效果也显著增加。体系中单增李斯特菌的最初接种量约为7.62LogCFU/mL。在孵育时间为40min，二价铁离子浓度为0.7mg/ml，AMS-350添加量为2mg/mL时，在不同照射时间20、40、60min下分别能减少沙门氏菌量为0.78、4.89和7.62Log CFU/mL。

实施例10不同照射时间对希瓦氏菌杀菌效果的影响

AMS和FeSO

不同照射时间处理后希瓦氏菌的失活情况如图10所示。随着照射时间的增加，对希瓦氏菌的杀灭效果也显著增加。体系中希瓦氏菌的最初接种量约为7.45Log CFU/mL。在孵育时间为40min，二价铁离子浓度为0.7mg/ml，AMS-350添加量为2mg/mL时，在不同照射时间20、30、40min下分别能减少沙门氏菌量为1.86、4.175和7.45Log CFU/mL。

通过以上分析可知，用二价铁离子耦合煅烧海绵为杀菌材料，455-460nm波长的蓝色LED灯为光驱动的光源，是一种可有效提升食品中杀灭致病菌和腐败菌效率的方法。

需要指出的是，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项目技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。