一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA-LFD快速检测试剂盒

技术领域

本发明属于试剂盒生产技术领域，尤其涉及一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA-LFD快速检测试剂盒。

背景技术

弯曲菌病原名孤菌病，是由弯曲菌引起的人和动物多种疾病的总称。弯曲菌是一种人畜共患的致病菌，是世界范围内普遍流行的食源性病原菌，各种动物(特别是猪、鸡、牛、羊)都能患病，除可引起腹泻外，还可造成牛、羊和犬的流产、不孕、乳房炎及禽类的传染性肝炎等疾病。感染人后主要引起以腹泻为主的急性胃肠炎症状，同时可伴发包括免疫损伤性疾病在内的严重并发症，也可造成流产、败血症、心内膜炎、关节炎、肺炎和脑膜炎等全身性感染。近年来，国内外从动物和人类分离到弯曲菌的报道日益增多。该病在世界各地的分布较广。目前该病已作为重要的人兽共患病而引起广泛重视。

研究表明弯曲菌能产生细胞膨胀致死毒素，其有三个亚型，即A型，B型和C型。细胞膨胀致死毒素与弯曲菌致病性、出血性腹泻、食物中毒、食品安全密切相关。动物感染弯曲菌后，可随粪便排菌，也可通过牛乳和其他分泌物排出，造成污染。猪、禽在宰杀和加工过程中肉品被污染，容易引起暴发。鸡和猪肠道中带菌率相当高，特别是鸡，可达50％～90％，已成为本病流行病学的一个重要问题。禽类感染本菌主要引起肝炎变化。

牛源常见的种属包括空肠弯曲菌、结肠弯曲菌及胎儿弯曲菌。空肠弯曲菌、结肠弯曲菌多引发牛冬痢等肠道疾病，而胎儿弯曲菌可能造成牛不孕不育及流产。近年来因追求牛肉嫩度，食用未全熟污染过弯曲菌的肉牛造成的病例呈逐年上升趋势，给公共卫生和食品安全带来了巨大威胁。

目前屠宰场牛源弯曲菌的检测报道较少，且牛源弯曲菌流行传播未得到重视，目前空肠弯曲菌检验主要传统培养法(GB4789.9-2014《食品微生物学检验空肠弯曲菌检验》)。通过增菌、分离和鉴定3个步骤，但该方法较为耗时，整个周期需要7～10d，弯曲菌为微需氧菌，对营养和培养条件要求比较苛刻，检测效率较低，不能实现对肉牛食品安全风险的及时预警。

专利申请CN201320068824.3，公开了弯曲菌多重PCR检测试剂盒，具体公开一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸥弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌、胎儿弯曲菌胚胎亚种多重PCR检测试剂盒，其包括：盒盖、盒体、能够嵌入所述盒体的装有酶反应混合物的容器、能够嵌入所述盒体的装有引物混合物的容器、能够嵌入所述盒体的装有阳性对照的容器、和能够嵌入所述盒体的装有水的容器。本实用新型所述的试剂盒优点在于：1、多重PCR方法操作简单快速，能同时检测5种常见致病弯曲菌；2、本试剂盒中的阳性对照包含待测五种菌的DNA模版，能监控多重体系中每对引物的工作情况；多重PCR体系中加入弯曲菌23S-rRNA通用引物，能直接反应每个PCR体系中是否加入了细菌DNA模版，防止出现由于模版加入量不够出现的假阴性。

专利申请CN201510572362.2，公开了一种用于检测空肠弯曲菌的酶联免疫试剂盒，所述的试剂盒含有两株能特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体，一株为专门作为捕捉抗体的单克隆抗体3G2D8H3G9，CGMCC-No.8766，另一株是作为检测抗体的单克隆抗体4C9E1G7H3，CGMCC-No.8457。大量测试证实，本发明的试剂盒可特异、高效地检测空肠弯曲菌，但和其它91种常见病原细菌无交叉反应，是一种性能极好的病原细菌检测产品。

专利申请CN201810939213.9，公开了一种弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型三重PCR检测引物及试剂盒，所述弯曲菌分为结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌，对应引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.18所示。本发明的三重PCR检测方法能快速、准确的检测出弯曲菌细胞膨胀致死毒素，可对弯曲菌细胞膨胀致死毒素A型，B型和C型的单个毒素进行检测，也可对A型，B型和C型毒素同时检测，省时省力，使原来需要做三次PCR和三次电泳的检测，现在一次就可以完成，传统的单一PCR方法检测时间一般2-3天，该三重PCR方法将检测时间缩短至4h，大大提高了工作效率，可用于弯曲菌毒素型普查、分子流行病学调查及疫苗筛选和检测。但是该PCR技术检测时间长，且需要大型设备。

发明内容

本发明为解决上述技术问题，提供了一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA-LFD快速检测试剂盒。本申请与现有的PCR技术进行比较，结果可通过肉眼判断检测结果，30分钟检测完成，且不需要大型设备，非常适合屠宰场肉牛现场检疫，具有广阔的应用前景。

为了能够达到上述所述目的，本发明采用以下技术方案：

一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA-LFD快速检测试剂盒，每个试剂盒可用于检测20个样品，每个试剂盒包括以下物质：

①RPA反应混合液600μL，即buffer缓冲液；

②RPA反应酶冻干粉0.05g×20次；

③特异引物混合液100μL，浓度为10μmol/L；

④超纯水阴性对照50μL；

⑤阳性对照：pMD-18T-16SrRNA阳性标准品50μL，浓度为200拷贝/μL；

⑥超纯水1000μL、醋酸镁280mM60μL。

进一步地，所述RPA反应在50μL反应体系中进行，所述RPA反应在50μL反应体系中进行，50μL反应体系为：上下游引物各2.4μL、浓度均为10μmol/L，TwistAmp

进一步地，所述RPA反应条件为：引物浓度10μmol/L，温度40℃，反应时间20min。

进一步地，所述特异引物是根据genbank中弯曲菌属16SrRNA序列设计的，上游引物5'端用6-FAM标记，下游引物5'端用生物素(Biotin)标记，特异引物具体为：

上游引物：5’-ATACAATGAGACGCAATACCGCGAGGTGG-3’；

下游引物：5’-GCATGGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCTGG-3’。

进一步地，所述pMD-18T-16SrRNA阳性标准品的制备方法为：根据genbank中弯曲菌属16SrRNA序列，设计1对引物：

上游引物：5’-CCCACGTATTTAGTTGCTAAC-3’；

下游引物：5’-CTCCCATGGTGTGACG-GGCGG-3’；

对弯曲菌属DNA进行PCR扩增，将扩增的308bpPCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段，与pMD-18T克隆载体连接，转化感受态细胞DH5α，重组体命名为pMD-18T-16SrRNA，对其进行测序，同时用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒pMD-18T-16SrRNA在D

进一步地，所述弯曲菌属DNA的提取方法为：肉样和屠宰场环境样品，采用棉签蘸取后，放入1mL的PBS缓冲液中，反复挤压后吸取0.5mL液体，参照快速DNA提取检测试剂盒给出的方法提取DNA，并保存于-20℃下，备用。

进一步地，所述PCR扩增反应体系以50μL计为：PCR混合酶25μL，模板2μL，上下游引物各2μL，水19μL。

进一步地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃、5min；94℃、30s，退火温度55℃、30s，72℃、30s，30个循环；最后72℃延伸10min。

本申请试剂盒部分筛选试验

1、试验材料

菌株：大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、弯曲菌属菌株由贵州省畜禽疫病研究实验室保存。

主要试剂及仪器：Goldview、Tris、EDTA、DL2000、TaqDNAPolymerase(5U/μL)及相应10×TaqBuffer、dNTP、DH5α、pMD-18T等购自生工生物工程(上海)股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，快速DNA提取检测试剂盒，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司。TwistAmp

2、特异引物设计

根据genbank中弯曲菌属16SrRNA序列，设计了上述所述的1对特异引物，特异引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。上游引物5'端用6-FAM标记，下游引物5'端用生物素(Biotin)标记。

3、pMD-18T-16SrRNA阳性标准品的制备

根据genbank中弯曲菌属16SrRNA序列，设计1对引物，上游引物：5’-CCCACGTATTTAGTTGCTAAC-3’；下游引物：5’-CTCCCATGGTGTGACG-GGCGG-3’，该引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，应用该设计引物对弯曲菌属DNA进行PCR扩增，能有效扩增出了目的片段，片段大小为308bp，无非特异性片段产生，如图1所示。测序是将pMD-18T-16SrRNA送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将生工生物工程(上海)股份有限公司测序结果与GenBank中的16SrRNA基因序列比对，核苷酸相似度为98.9％～100％。

4、RPA反应条件的优化

RPA反应在50μL反应体系中进行，对RPA反应条件，包括温度(38℃、40℃、42℃)，引物浓度(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)，反应时间(20min、30min、40min)进行优化以确定最佳反应条件。上下游引物(5、10、20μmol/L)各2.4μL，TwistAmp

RPA反应在50μL反应体系中最佳反应条件为：引物浓度10μmol/L，温度38℃、40℃、42℃条带亮度差异不明显，反应时间20min、30min、40min条带亮。因此，RPA反应在50μL反应体系中反应条件确定为：引物浓度10μmol/L，温度40℃，反应时间20min。

5、胶体金侧向流免疫层析试验

核酸扩增结束后，将扩增产物进行适当稀释，100μL点样进胶体金侧向流免疫层析试纸条中观察结果，结果判定如下：

①阳性：出现质控线和反应线两条红线，其中一条位于检测区(T)内，另一条位于质控区(C)内；

②阴性：仅出现一条红色质控线，在检测区(T)内无条带出现。

6、敏感性试验

将重组质粒pMD-18T-16SrRNA计算DNA拷贝数后，进行10倍比稀释后分别进行RPA反应，每个稀释倍数3个重复，以确定建立的RPA诊断的敏感性。

将标准样品10倍倍比稀释，取2.0×10

7、特异性试验

以弯曲菌属、大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌DNA进行RPA反应，每个样品3个重复，以确定建立的RPA诊断方法的特异性。结果弯曲菌属为阳性，而大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌为阴性，如图3所示。

8、重复性试验

应用建立的RPA方法重复检测弯曲菌属DNA样品3次，以检验结果的可靠性，结果均一致。

9、试剂盒的组装与保存期检测

将试剂盒各组份分别保存于室温、4℃和-20℃，设置1周、6个月、1年三个时间梯度，对阳性菌株进行检测，4℃保存1年阳性拷贝数降低100倍，-20℃保存1月、3月、6月、1年对阳性拷贝数无影响。因此，试剂盒保存期为1年。

由于本发明采用了以上技术方案，具有以下有益效果：

(1)本申请根据弯曲菌属16SrRNA序列，设计了1对引物，PCR扩增出16SrRNA基因片段，并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过RPA引物设计筛选和反应条件的优化，通过灵敏性、特异性、重复性试验，建立牛源弯曲菌属RPA-LFD检测技术，以此为基础研制出试剂盒。

(2)本申请与荧光定量PCR(qPCR)技术、PCR技术进行比较，具有很好的灵敏度，且可通过肉眼判断检测结果，且不需要大型设备，非常适合屠宰场肉牛现场检疫，具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实例或现有技术中的技术方案，下面将对实施实例或现有技术描述中所需要的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：

图1为本申请弯曲菌属PCR扩增结果图；

图2为本申请试剂盒RPA-LFD敏感性试验结果图；

图3为本申请试剂盒RPA-LFD特异性试验结果图。

附图中：1-DL2000；2-弯曲菌属16SrRNA基因PCR产物；3-阴性对照；4-重组质粒DNA2.0×10

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。

实施例1

一种现场可视化RPA-LFD快速检测肉牛屠宰场牛源弯曲菌属用的特异引物，其特征在于：所述特异引物是根据genbank中弯曲菌属16SrRNA序列设计的，上游引物5'端用6-FAM标记，下游引物5'端用生物素(Biotin)标记，特异引物具体为：

上游引物：5’-ATACAATGAGACGCAATACCGCGAGGTGG-3’；

下游引物：5’-GCATGGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCTGG-3’。

一种肉牛屠宰场牛源弯曲菌属现场可视化RPA-LFD快速检测试剂盒，每个试剂盒可用于检测20个样品，每个试剂盒包括以下物质：

①RPA反应混合液600μL，即buffer缓冲液；

②RPA反应酶冻干粉0.05g×20次；

③特异引物混合液100μL，浓度为10μmol/L；所述特异引物如上述1所述；

④超纯水阴性对照50μL；

⑤阳性对照：pMD-18T-16SrRNA阳性标准品50μL，浓度为200拷贝/μL；

⑥超纯水1000μL、醋酸镁280mM60μL。

所述RPA反应在50μL反应体系中进行，所述RPA反应在50μL反应体系中进行，50μL反应体系为：上下游引物各2.4μL、浓度均为10μmol/L，TwistAmp

所述RPA反应条件为：引物浓度10μmol/L，温度40℃，反应时间20min。

所述pMD-18T-16SrRNA阳性标准品的制备方法为：根据genbank中弯曲菌属16SrRNA序列，设计1对引物：

上游引物：5’-CCCACGTATTTAGTTGCTAAC-3’；

下游引物：5’-CTCCCATGGTGTGACG-GGCGG-3’；

对弯曲菌属DNA进行PCR扩增，将扩增的308bpPCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段，与pMD-18T克隆载体连接，转化感受态细胞DH5α，重组体命名为pMD-18T-16SrRNA，对其进行测序，同时用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒pMD-18T-16SrRNA在D

所述弯曲菌属DNA的提取方法为：肉样和屠宰场环境样品，采用棉签蘸取后，放入1mL的PBS缓冲液中，反复挤压后吸取0.5mL液体，参照快速DNA提取检测试剂盒给出的方法提取DNA，并保存于-20℃下，备用。所述PCR扩增反应体系以50μL计为：PCR混合酶25μL，模板2μL，上下游引物各2μL，水19μL。所述PCR扩增的反应条件为：94℃、5min；94℃、30s，退火温度55℃、30s，72℃、30s，30个循环；最后72℃延伸10min。

为了进一步说明本发明能够达到所述技术效果，做以下实验：

RPA试剂盒对临床样品的检测

2021年-2022年贵州省贵阳市、凤冈县、关岭县肉牛屠宰场采集的92份环境和肉品表面样品，应用研制的试剂盒进行检测，同时应用文献中的引物(朱冬梅,刘书亮,彭珍,赖海梅,韩新锋.肉鸡源弯曲菌的分离、多重PCR鉴定及其耐药性分析[J].中国人兽共患病学报,2014,30(04):390-396.)中的方法进行普通PCR检测。

上游引物：5-ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC-3；

下游引物：5-GGACGTACTATTTAGTATT-3。

结果92份样品中环境样品检测阳性率12/92(13.0％)，普通PCR检测阳性率8/92(8.67％)，肉样表面阳性率均为0。将12个阳性产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序结果与GenBank中的16SrRNA基因序列比对，核苷酸相似度为98.9％～100％。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同含义和范围内的所有变化囊括在本发明的保护范围之内。