靶向肠道稳态的糖代谢的食品筛选方法及其应用

技术领域

本发明涉及保健食品领域，具体涉及一种通过调节肠道稳态继而改善糖代谢的食品筛选方法及其在健康食物设计中的应用。

背景技术

随着我国经济社会的发展，以及我国人民的膳食结构和生活方式的明显变化，目前，糖尿病等慢性病已经成为制约健康预期寿命提高的首要因素。据统计，2018年我国12.4％的成年人罹患糖尿病，38.1％处于糖尿病前期。大量研究表明，积极的饮食和生活方式干预可以延缓糖耐量受损人群的糖尿病发病率，6年饮食和运动干预能预防或推迟糖尿病长达14年。说明开发血糖调控型健康食品，对于改善现有饮食结构、促进国民健康有重大意义。

为了提高健康食品开发的成功率，可以在开发早期设置评价模型，筛选适宜的原料或配方。此前血糖调控型健康食品的筛选和开发方式，主要有两种，一种是降低主食自身的血糖生成能力，其评价指标为血糖生成指数，通过宏量营养素比例计算预测或者体外仿生消化试验预测；一种是通过作用于与降糖药相似的靶点或通路，发挥潜在的健康作用。与肠道相关的靶点主要包括淀粉消化酶、葡萄糖吸收相关的转运蛋白等。但是，现有的评价方法往往基于单一机制，未能将肠道视为整体，充分考虑其作为稳定内环境对于糖代谢的重要性。

为此，本发明旨在建立一种基于肠道稳态的组合筛选模型，按照食物及食物组合类型优选组合方式，重点关注葡萄糖在小肠的消化释放过程以及结肠部位的微生态环境，提炼与糖代谢相关的评价指标以及重要安全指标。从而指导健康导向型食物的设计、开发、应用，制定健康导向型的质量控制要求，确定适用人群和使用方式。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种靶向肠道稳态的糖代谢的食品筛选方法及其应用，该食品筛选方法具有应用面广、操作简便快捷、肠道稳态性能好的优点。

本发明所涉及的食品筛选方法的筛选条件(也称为体外组合模型)，主要由靶向肠道不同部位、与糖代谢通路相关的评价模型组成，包括多种体外试验模型和计算模型。其主要评价目标为，筛选或定向设计对于糖代谢健康有益的健康食物或食物组合，尤其是调控型茶及茶制品。其促进代谢健康的机制在于，较为平稳的葡萄糖消化吸收、较低的肠道炎症水平、更有益糖代谢健康的菌群及代谢物组成、更高概率地作用于糖代谢相关代谢通路。

本发明重点关注如下稳态平衡关系：

(1)试验对象抑制淀粉酶活性和葡萄糖释放与过度产气导致不适的平衡；

(2)肠道主要有益菌和有害菌的正向比例平衡，以及在此基础上的pH值平衡；

(3)维持肠道上皮屏障完整性继而正向调控糖代谢的肠道微生态平衡，包括双歧杆菌和嗜黏蛋白阿克曼菌(以下也简称AKK菌)等有益菌的适度增殖，但不至于多度增殖破坏肠道黏膜；同时瘤胃球菌、真细菌等产丁酸菌增殖，通过丁酸发挥维持上皮屏障完整性的作用；在双歧杆菌(或AKK菌)与产丁酸菌之间存在动态平衡关系。

本发明的适宜对象包括糖代谢调控型健康食物、食品、膳食。根据评价对象成分属性差异，将评价模型进行不同的优选组合。1、对于每100g食用部位中，碳水化合物、蛋白质、脂肪等宏量营养素的总比例≥10％的侯选物，包括单一食物和整体膳食，其主要筛选目标为降低自身的血糖生成能力，以上消化道消化结合肠道微生物消化的组合模型进行评价，其主要评价指标为：葡萄糖释放动力学、双歧杆菌增殖率、脱硫弧菌/双歧杆菌/产丁酸菌平衡比例、短链脂肪酸含量变化率、菌群代谢通路等，以一种或多种指标的组合为评价依据。2、对于每100g食用部位中，碳水化合物、蛋白质、脂肪等宏量营养素的总比例<10％的侯选物，以非宏量营养素型植物化学物质为主要成分，其主要筛选目标为辅助降低第1类饮食血糖生成能力，主要以α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、脂肪酶多种消化酶活性联合肠道微生物消化的组合模型进行评价，其主要评价指标为消化酶抑制率、双歧杆菌增殖率、脱硫弧菌/双歧杆菌/产丁酸菌平衡比例、短链脂肪酸含量变化率、菌群代谢通路等。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种靶向肠道稳态的糖代谢的食品筛选方法，该方法包括筛选满足如下条件(1)～(3)的食品：

(1)在体外酶活性抑制试验中，针对α-葡萄糖苷酶和/或蔗糖酶活性的抑制率＞40％；和/或

在体外仿生消化试验中，2h内的葡萄糖释放曲线的斜率下降＞20％或曲线下面积减少＞20％；和/或

在动物OGTT试验中，血糖峰值下降＞20％和/或血糖曲线下面积减少＞20％；

(2)在体外结肠发酵试验中，72h或者24h后，相对于不添加食品样品的相同体系，0.8＜产气量变化倍数＜1.5，双歧杆菌丰度变化倍数＞1，总短链脂肪酸含量变化倍数＞1，乙酸含量、丙酸含量和丁酸含量中至少2种的变化倍数＞1；

(3)在体外结肠发酵试验中，未出现如下不良反应相关指标：pH值＞6.5。

优选地，条件(2)中，体外结肠发酵试验中培养24h后，脱硫弧菌丰度/双歧杆菌丰度＜0.1，真细菌丰度/双歧杆菌丰度＞0.002。

优选地，该方法包括筛选满足如下条件(1-1)～(3-1)的食品：

(1-1)在体外酶活性抑制试验中，针对α-葡萄糖苷酶和/或蔗糖酶活性的抑制率＞60％；且针对α-淀粉酶活性的抑制率＜50％；和/或

在体外仿生消化试验中，2h内的葡萄糖释放曲线的斜率下降＞30％或曲线下面积减少＞30％；和/或

在动物OGTT试验中，血糖峰值下降＞30％和/或血糖曲线下面积减少＞30％；

(2-1)在体外结肠发酵试验中，72h或者24h后，相对于不添加食品样品的相同体系，0.8＜产气量变化倍数＜1.5，双歧杆菌丰度变化倍数＞1.5，总短链脂肪酸含量变化倍数＞1，乙酸含量、丙酸含量和丁酸含量中至少2种的变化倍数＞1.2；且在体外结肠发酵试验中培养24h后，脱硫弧菌丰度/双歧杆菌丰度＜0.01；

(3-1)在体外结肠发酵试验中，未出现如下不良反应相关指标：

(i)pH值＞6.5；

(ii)绿脓杆菌、金黄葡萄球菌、克雷伯菌和/或艰难梭菌出现或者丰度升高；

(iii)肠杆菌和/或脱硫弧菌的丰度升高；且

(iv)变形杆菌、荚膜梭菌、克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、柠檬酸菌属和/或假丝酵母菌的丰度增加。

优选地，条件(2-1)中，丁酸含量的的变化倍数＞1.2，且乙酸含量和丙酸含量中至少1种的变化倍数＞1.2。

优选地，该方法还包括：筛选产丁酸菌的丰度高的食品。

更优选地，该方法还包括：进一步筛选产丁酸菌丰度/双歧杆菌丰度的比值高、和/或产丁酸菌丰度/嗜黏蛋白阿克曼菌丰度的比值高的食品。

优选地，在上述(2-1)的基础上，进一步满足：在体外结肠发酵试验中培养24h后，脱硫弧菌丰度/双歧杆菌丰度＜0.01，真细菌丰度/双歧杆菌丰度＞0.003。

优选地，该方法包括筛选针对α-葡萄糖苷酶和/或蔗糖酶活性抑制率的IC

优选地，对于每100g食用部位中，由碳水化合物、蛋白质和脂肪构成的总宏量营养素比例≥10％的食品，条件(2)中的测试时间为72h；对于每100g食用部位中，由碳水化合物、蛋白质和脂肪构成的总宏量营养素比例＜10％的食品，条件(2)中的测试时间为24h。

优选地，所述食品为茶、茶制品、主食、液体饮料、固体饮料和复配糖中的一种或者多种。

本发明第二方面提供上述筛选方法在健康食物设计中的应用。

通过上述技术方案，本发明具有如下有益效果。

一、以血糖调控为目的，设计针对食物的肠道组合筛选模型；并根据评价侯选物的特征，进行不同的模型组合设计。有别于以往药物筛选中利用单一靶点的评价方式、μL和mL级别的评价体系，组合模型设计更符合食物混合体系的实际评价需要。

二、在过往对主食等食物的升糖能力评价中，主要关注血糖生成指数(GI)，但是GI评价的缺陷在于，只要考虑2h内的曲线下面积变化，没有充分考虑血糖峰值、血糖吸收速度等动力学指标，而血糖动力学对于糖代谢及心血管健康都有重要意义。

三、过去食物功能研究沿用药物设计思路。在降糖药物设计中，和肠道相关的靶点主要是淀粉消化酶，例如阿卡波糖等药物即通过抑制α-葡萄糖苷酶活性，延缓淀粉消化和葡萄糖吸收，从而发挥降糖作用。但是，阿卡波糖也有较强的抑制α-淀粉酶的作用，导致未消化的多糖进入结肠，在微生物发酵作用下过度产气并导致炎症，导致腹胀、腹痛等不良反应。更有甚者，一些与肠道炎症或者便臭相关的微生物丰富增加，与肠黏膜发炎、溃疡、破损、渗漏、诱发腹泻、便秘、结肠炎、甚至肠癌相关。为此，本发明将小肠部位的消化吸收与结肠部位的微生物消化相结合，筛选靶向肠道健康从而调控血糖且应用安全的配方及剂量。

四、过去食物功能研究沿用药物设计思路。降糖药物设计所使用的体外评价模型和计算模型，主要适用于小分子化合物，并关注其最终靶点。近年来的研究认为，茶褐素等大分子成分以及二甲双胍等化合物极有可能通过调节肠道菌群继而改善肝脏脂肪沉积和胰岛素抵抗。可见，随着微生物组学技术的发展，基于关键菌株标记物评估侯选物对肠道微生态的调节作用，有望建立新的评价模型。以此类菌的平衡关系为主要评价指标，可以遴选出过往评价模型未能覆盖的、通过消化物调节肠道菌群继而改善糖代谢的食物或食物组合。基于现有研究报道以及我们的科研结果，认为在血糖调控中，肠道双歧杆菌与产丁酸菌的平衡对于维护肠道屏障完整性、降低系统炎症反应、调节糖代谢至关重要，这是本发明重点关注的肠道菌平衡关系。

五、利用本发明所描述的评价方法，应用于已有食物的筛选，从普通食品中遴选具有糖代谢健康益处的侯选物。

六、利用本发明所描述的评价方法，实施定向食物设计，包括食物结构设计、食物功能组分比例控制、配方设计、有效剂量设计等。

七、利用本发明所描述的评价方法，基于与控糖功效紧密相关的侯选物结构、组分、配比等信息，制定糖代谢健康导向的质量要求和/或分级要求，应用于健康食物及食物组合的原料筛选、加工工艺优化、储藏条件优化等环节。

八、利用本发明所描述的评价方法及评价结构，为所设计的健康食物及食物组合制定指向糖代谢异常细分人群的用途以及健康食用方式。在指定用法、用量的设计下，有助于维持健康体重和糖代谢健康。经动物实验和临床研究论证，本发明所涉及制品对于糖代谢异常的研究对象具有减肥、降低空腹血糖、改善肝脏脂肪沉积、改善胰岛素功能等一项或多项与改善糖代谢调控相关的作用。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明第一方面提供的靶向肠道稳态的糖代谢的食品筛选方法，该方法包括筛选满足如下条件(1)～(3)的食品：

(1)在体外酶活性抑制试验中，针对α-葡萄糖苷酶和/或蔗糖酶活性的抑制率＞40％；和/或

在体外仿生消化试验中，2h内的葡萄糖释放曲线的斜率下降＞20％或曲线下面积减少＞20％；和/或

在动物OGTT试验中，血糖峰值下降＞20％和/或血糖曲线下面积减少＞20％。

(2)在体外结肠发酵试验中，72h或者24h后，相对于不添加食品样品的相同体系，0.8＜产气量变化倍数＜1.5，双歧杆菌丰度变化倍数＞1，总短链脂肪酸含量变化倍数＞1，乙酸含量、丙酸含量和丁酸含量中至少2种的变化倍数＞1。

(3)在体外结肠发酵试验中，未出现如下不良反应相关指标：pH值＞6.5。

在本发明中，“葡萄糖释放曲线的斜率”是指葡萄糖释放曲线中释放量上升区段的斜率。在本发明中，“曲线下面积”是指曲线与横轴包围的面积。在本发明中，短链脂肪酸指的是碳原子数小于6的有机脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸。

在本发明中，“变化倍数”通过试验后测定值除以试验前测定值得到。变化倍数＞1，说明该参数增加；变化倍数＝1，说明该参数不变；变化倍数＜1，说明该参数减少。

在本发明中，条件(1)～(3)中的各参数按照后续“测试方法”部分的记载进行测定。产气量变化倍数可以通过气压变化倍数表征。

根据本发明，通过上述条件(1)～(3)进行筛选得到的食品，可以获得良好的肠道稳态性能。

根据本发明，在体外酶活性抑制试验中，针对α-葡萄糖苷酶和/或蔗糖酶活性的抑制率，例如可以为＞40％、＞45％、＞50％、＞55％、＞60％、＞65％等。在体外仿生消化试验中，2h内的葡萄糖释放曲线的斜率下降或曲线下面积减少，或者在动物OGTT试验中，血糖峰值下降和/或血糖曲线下面积减少，例如可以为＞20％、＞25％、＞30％、＞35％、＞40％、＞45％等。

根据本发明，在体外结肠发酵试验中，72h或者24h后，相对于不添加食品样品的相同体系，产气量变化倍数可以为＞0.8、＞0.9、＞1、＞1.1、＞1.2、＞1.3等，另外，可以为＜1.5、＜1.4、＜1.3、＜1.2、＜1.1、＜1或者1等；双歧杆菌丰度变化倍数可以为＞1、＞1.1、＞1.2、＞1.3、＞1.4、＞1.5、＞1.6、＞1.7、＞1.8等；总短链脂肪酸含量变化倍数可以为＞1、＞1.1、＞1.2、＞1.3、＞1.4、＞1.5、＞1.6、＞1.7、＞1.8等，乙酸含量、丙酸含量和丁酸含量中至少2种的变化倍数可以为＞1、＞1.1、＞1.2、＞1.3、＞1.4、＞1.5、＞1.6、＞1.7、＞1.8等。

根据本发明一些优选的实施方式，条件(2)中，体外结肠发酵试验中培养24h后，脱硫弧菌丰度/双歧杆菌丰度＜0.1。

根据本发明另一些优选的实施方式，条件(2)中，体外结肠发酵试验中培养24h后，脱硫弧菌丰度/双歧杆菌丰度＜0.1，体外结肠发酵试验中培养24h后，真细菌丰度/双歧杆菌丰度＞0.002。

根据本发明一些优选的实施方式，该方法包括筛选满足如下条件(1-1)～(3-1)的食品：

(1-1)在体外酶活性抑制试验中，针对α-葡萄糖苷酶和/或蔗糖酶活性的抑制率＞60％；且针对α-淀粉酶活性的抑制率＜50％；和/或

在体外仿生消化试验中，2h内的葡萄糖释放曲线的斜率下降＞30％或曲线下面积减少＞30％；和/或

在动物OGTT试验中，血糖峰值下降＞30％和/或血糖曲线下面积减少＞30％。

(2-1)在体外结肠发酵试验中，72h或者24h后，相对于不添加食品样品的相同体系，0.8＜产气量变化倍数＜1.5，双歧杆菌丰度变化倍数＞1.5，总短链脂肪酸含量变化倍数＞1，乙酸含量、丙酸含量和丁酸含量中至少2种的变化倍数＞1.2；；且

在体外结肠发酵试验中培养24h后，脱硫弧菌丰度/双歧杆菌丰度＜0.01。

(3-1)在体外结肠发酵试验中，未出现如下不良反应相关指标(i)～(iv)：

(i)pH值＞6.5；

(ii)绿脓杆菌、金黄葡萄球菌、克雷伯菌和/或艰难梭菌出现或者丰度升高；

(iii)肠杆菌和/或脱硫弧菌的丰度升高；

(iv)变形杆菌、荚膜梭菌、克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、柠檬酸菌属和/或假丝酵母菌的丰度增加。

根据本发明，优选的情况下，条件(2-1)中，丁酸含量的的变化倍数＞1.2，且乙酸含量和丙酸含量中至少1种的变化倍数＞1.2。

根据本发明，优选的情况下，该方法还包括筛选产丁酸菌的丰度高的食品。更优选的情况下，进一步筛选产丁酸菌丰度/双歧杆菌丰度的比值高、和/或产丁酸菌丰度/AKK菌丰度的比值高的食品。在满足其他条件的前提下，通过筛选产丁酸菌的丰度更高、产丁酸菌丰度/双歧杆菌丰度的比值更高和/或产丁酸菌丰度/AKK菌丰度的比值更高的食品，可以进一步提高得到的食品的肠道稳态效果。

上述“产丁酸菌丰度/双歧杆菌丰度的比值高”、“产丁酸菌丰度/AKK菌丰度的比值高”，说明食用相应的食物后瘤胃球菌、真细菌等产丁酸菌与双歧杆菌(或AKK菌)处于相对平衡状态。

具体地，产丁酸菌丰度可以通过测定在体外结肠发酵试验或在糖脂代谢异常动物模型中计算产丁酸菌的丰度而得到。在同时满足上述条件(1-1)～(3-1)的基础上，食品的产丁酸菌丰度、产丁酸菌丰度/双歧杆菌丰度的比值、产丁酸菌丰度/AKK菌丰度的比值越高，越有利于肠道稳态的维持。

作为产丁酸菌，包括瘤胃球菌、真细菌、罗氏菌等直接或间接促进肠道产丁酸的肠道微生物。本发明中的产丁酸菌丰度的测定方法可以为如下的任意一种：

方法1：利用荧光实时定量PCR方法，对样品中产丁酸菌(瘤胃球菌、真细菌、罗氏菌)及脱硫弧菌、双歧杆菌、AKK菌等本发明关注菌进行定量分析，并计算比例。

方法2：利用扩增子测序技术获得样品菌群序列信息，并计算菌群相对丰度，对样品中产丁酸菌(瘤胃球菌、真细菌、罗氏菌)及脱硫弧菌、双歧杆菌、AKK菌等本发明关注菌的丰度进行比例计算。

方法3：在体外发酵体系或者动物模型中，通过采集发酵体系样品后者直接采集动物肠道内容物、粪便样品，利用扩增子测序技术获得样品菌群序列信息，同时测定主要短链脂肪酸的含量，基于典型相关分析(CCA)获取特定菌与特定短链脂肪酸的相关性结果，评估试验体系中与丁酸形成关联最强的2-3个菌，为该试验中的产丁酸菌。对样品中产丁酸菌(瘤胃球菌、真细菌、罗氏菌)及脱硫弧菌、双歧杆菌、AKK菌等本发明关注菌的丰度进行比例计算。

本发明中的产丁酸菌，可以是瘤胃球菌、真细菌、罗氏菌或其他鉴定为主要产丁酸菌中的一种、两种或者三种。针对实验具体情况的不同，优选选择丰度较高、与产丁酸相关性最强的1-2种产丁酸菌进行筛选。根据本发明一种优选的实施方式，所述产丁酸菌优选为选自瘤胃球菌、真细菌和罗氏菌中的丰度最高的产丁酸菌。

根据本发明，通过上述条件(1-1)～(3-1)进行筛选得到的食品，可以进一步提高肠道稳态的性能。

根据本发明一些优选的实施方式，在其他条件相同或相近的情况下，该方法还包括筛选针对α-葡萄糖苷酶和/或蔗糖酶活性抑制率的IC

在本发明中，所述食品为靶向肠道稳态的糖代谢的候选食品，例如可以为茶、茶制品、主食(较低升糖指数的主食，优选GI值＜70，以＜55为宜)、液体饮料、固体饮料、复配糖等。

在本发明中，对于每100g食用部位中，由碳水化合物、蛋白质和脂肪构成的总宏量营养素比例≥10％的食品，条件(2)中的测试时间为72h；对于每100g食用部位中，由碳水化合物、蛋白质和脂肪构成的总宏量营养素比例＜10％的食品，条件(2)中的测试时间为24h。

另外，为了方便说明，本发明中将“由碳水化合物、蛋白质和脂肪构成的总宏量营养素比例≥10％的食品”称为第一类食品，将“由碳水化合物、蛋白质和脂肪构成的总宏量营养素比例＜10％的食品”称为第二类食品。

根据本发明，针对第二类食品，条件(1)中优选采用体外酶活性抑制试验进行筛选；针对第一类食品，条件(1)中优选采用体外仿生消化试验或者动物OGTT试验进行筛选。

经过上述标准筛选后，本发明中，将满足条件(1)～(3)的食品称为候选食品，将满足条件(1-1)～(3-1)食品称为优选食品。

本发明第二方面提供了上述第一方面的筛选方法在健康食物设计中的应用。

测试方法

(1)α-葡萄糖苷活性抑制试验：

在96孔酶标板中依次加入：60μL待测样品或缓冲液(溶液1)、50μL酶活性为0.2u/mL的酶溶液或者缓冲液(溶液2)，37℃温育20min；再加入50μL 5mM的对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(溶液3)。于37℃温育10min。利用酶标仪(Synergy2，美国Bio-Tek公司)于405nm读取吸光度值。按如下公式计算酶抑制率：

其中A：溶液1、2均为缓冲液；B：溶液1为缓冲液，溶液2为酶溶液；C：溶液1为待测样品，溶液2为缓冲液；D：溶液1为待测样品，溶液2为酶溶液。

(2)α-淀粉酶活性抑制试验：

在2mL深孔板中依次加入：50μL待测样品或TB缓冲液(溶液1)、50μL酶活性为24u/mL的酶溶液或者缓冲液(溶液2)，37℃温育10min；再加入100μL 1.7重量％的淀粉溶液(溶液3)。于37℃温育3min，100℃显色5min，冰上冷却5min。取50μL反应体系+100μL ddH

其中A：溶液1、2均为缓冲液；B：溶液1为缓冲液，溶液2为酶溶液；C：溶液1为待测样品，溶液2为缓冲液；D：溶液1为待测样品，溶液2为酶溶液。

(3)蔗糖酶活性抑制试验：

在96孔酶标板中依次加入：60μL待测样品或TB缓冲液(溶液1)、50μL酶活性为0.2u/mL的酶溶液或者缓冲液，37℃温育20min；再加入50μL5mM的蔗糖溶液(溶液3)。于37℃温育10min。利用酶标仪(Synergy2，美国Bio-Tek公司)于405nm读取吸光度值。按如下公式计算酶抑制率：

其中A：溶液1、2均为缓冲液；B：溶液1为缓冲液，溶液2为酶溶液；C：溶液1为待测样品，溶液2为缓冲液；D：溶液1为待测样品，溶液2为酶溶液。

(4)血糖动力学体外评价(体外仿生消化试验)：

在Minekus,M.等的方法(参见MINEKUS M,ALMINGER M,ALVITO P,et al.Astandardised static in vitro digestion method suitable for food-aninternational consensus[J].Food and Function,2014,5(6):1113-1124)基础上优化，利用容量为100mL的烧瓶，构建40mL的消化体系，通过调整添加酶系、调整反应溶液和pH值的方式，逐次模拟口腔、胃、肠三段式消化体系。具体地，称取样品5g，加入含75u/mLα-淀粉酶的仿生唾液5mL，37℃下消化2min。胃模拟阶段加入含2000u/mL胃蛋白酶的仿生胃液15mL，调节pH至3.0，37℃下消化120min。肠模拟阶段加入含100u/mL猪胰酶的仿生肠液20mL并加入胆盐，调节pH至7.0，37℃消化，分别于第0、5、10、20、30、45、60、90、120min时取样0.5mL于无水乙醇中灭酶终止反应，测定溶液中还原糖含量。以葡萄糖为标准参考物，利用曲线下面积计算样品eGI(估计血糖生成指数，Expected glycemic index)。以时间变量，葡萄糖释放量为应变量，针对葡萄糖释放到达平台期之前的曲线进行线性拟合，计算斜率，作为释放速率的量化指标。

(5)血糖动力学体内评价(动物OGTT试验)：

小鼠禁食4小时，禁食期间保证自由饮水，称量小鼠体重并通过剪尾法取小鼠尾尖血液检测空腹血糖，然后按照10mL/kg bw剂量给糖，并在给糖后的0min、15min、30min、60min、120min测量小鼠血糖值，绘制血糖曲线。计算C

(6)体外结肠发酵试验：

选择5名健康青年作为粪便样品来源，各称取5g，混合后在厌氧工作站中将每10g粪便溶解于80mL的PBS缓冲液，600r/min的离心1min，得到粪便细菌提取液。配制批式发酵培养基(1L培养基配方如下：组分A：蛋白胨2.00g，酵母提取物2.00g，氯化钠0.10g，磷酸氢二钾0.04g，磷酸二氢钾0.04g，七水硫酸镁0.01g，六水氯化钙0.01g，碳酸氢钠2.00g，吐温80 2.00mL；组分B：血红素0.02g，维生素K1 10.00mL，三号胆盐0.50g，半胱氨酸盐酸盐0.50g)，灭菌后分别分装30mL到总体积50mL批式发酵试管中，每管接种10％的粪便细菌提取液，通氮气5min，37℃，低速(75rpm)震荡培养。24小时后，测定0天指标；之后加入5mL测试样品，并以无菌水为对照。分别通入氮气后37℃，低速(75rpm)震荡培养2天，每隔24小时测定产气量并取样。利用PCR(例如下述(7)qPCR法)测定双歧杆菌等关键菌的丰度，或者利用基因测序技术(例如下述(8)16S rRNA测序)测定采集样品的微生物的丰度信息，至少精确至属水平。取2mL发酵液离心，利用HPLC测定上清中的总短链脂肪酸以及乙酸、丙酸、丁酸的含量。

(7)qPCR：

取发酵液，用氯仿抽提并离心，沉淀并洗涤RNA，并用DEPC水溶解。在RNase free的PCR管中，加入oligo dT、RNA、DEPC水，吹打均匀后，置70℃保温5min，使RNA变性。随后4℃，保持5min，以防止RNA复性。之后加入反转录酶、dNTP、MgCl

(8)16S rRNA测序：

使用细菌DNA提取试剂盒(DP302)提取细菌基因组，经NanoDrop2000测定选择DNA浓度为20ng/μL的样本进行下一步PCR扩增。基因组通过PCR进行扩增得到细菌16S rRNA基因的V4-V5区。扩增子经2％琼脂糖凝胶电泳后凝胶回收提取，使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒按照制造商的说明进行纯化，并使用QuantiFluor

(9)糖脂代谢异常动物模型

糖脂代谢异常动物模型包括代谢综合征动物模型、肥胖动物模型、高血糖动物模型、高脂血症动物模型等模拟人体糖脂代谢异常的动物模型，在食物相关研究中，通过采用高脂高糖饲料诱导，以肥胖、高血糖、高血脂为建模成功的判定标准，并与基础饲料饲喂的正常组进行比对，以确认建模成功。例如利用高脂饲料D12492饲喂雄性C57BL/6J小鼠12周，其体重显著增加至150％，糖耐量测试中的血糖曲线下面积显著增加至150％，总胆固醇和总甘油三酯增加至160％左右。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1：微生物发酵型乌龙茶降糖推荐摄入量设计及验证

本实施例旨在摸索茶叶靶向“肠道-糖代谢”调控的适宜用量。

本实施例所描述的茶叶以闽南乌龙茶为原料，经萎凋、做青、杀青、揉捻、干燥后，＞120℃高温焙火，并在40℃发花房自然发花，形成冠突散囊菌密集生长的状态。产品标准号：Q/XMCH008S。经饮用者描述，有改善代谢健康效应。

利用该茶叶开展体外酶生化试验和体外结肠发酵试验，制备茶汤的步骤如下：将干茶样品磨碎，称取2g磨碎样品于沸蒸馏水300mL，立即移入沸水浴中浸提45min(在预实验中，以提取物干燥后的质量除以投入茶叶质量，计算得提取率为35％)。水浴后过滤，用少量蒸馏水洗脱，定容茶汤至300mL。将茶汤分别按50％、20％、10％、5％、1％稀释，并按该梯度比例配置成培养基，用于体外结肠发酵试验。测定初始及发酵24h后的气压值，开瓶取发酵液测定发酵后短链脂肪酸，qPCR法测定发酵前后双歧杆菌的变化。

体外酶活性抑制试验结果如下表1。

表1

体外结肠发酵试验结果如下表2。

表2

实验中未观察到pH值异常升高等条件(3-1)中的不良反应相关指标。

表2中气压变化倍数的计算方式为：添加茶汤样品之后体系的气压值/不添加茶汤样品的体系中气压值。双歧杆菌丰度变化倍数的计算方式为：添加茶汤样品之后体系中双歧杆菌的丰度/不添加茶汤样品的体系中双歧杆菌的丰度。短链脂肪酸含量变化倍数的计算方式为：添加茶汤样品之后体系中单项或者总短链脂肪酸的含量/不添加茶汤样品的体系中该项短链脂肪酸的含量。

根据条件(1)～(3)中关于α-葡萄糖苷酶活性、产气量变化倍数、双歧杆菌丰度变化倍数、短链脂肪酸含量变化倍数综合判定，稀释比例5-20％范围内的茶汤剂量满足条件(1)～(3)，作为本发明中的候选食品。与之相对，稀释比例1％的茶汤因α-淀粉酶抑制率＞50％，产气量变化倍数＜1而不满足条件(1)和(2)。稀释比例50％的茶汤因短链脂肪酸变化倍数指标未达标而不满足条件(2)。上述结果提示低浓度作用强度不足，而过高浓度存在不良反应风险。

根据条件(1-1)～(3-1)综合判定，稀释比例10％的茶汤针对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率＞60％且针对α-淀粉酶活性的抑制率＜50％；0.8＜产气量变化倍数＜1.5，双歧杆菌丰度变化倍数＞1.5，总短链脂肪酸的含量变化倍数＞1，丙酸和丁酸的含量变化倍数＞1.2。进而，针对稀释比例10％的茶汤，进一步利用测序技术(16S rRNA测序)获得肠道关键菌丰度信息后，通过丰度值的比较计算肠道关键菌及代谢产物平衡关系指标，得：体外结肠发酵试验中培养24h后，脱硫弧菌丰度/双歧杆菌丰度＝0.002，真细菌丰度/双歧杆菌丰度＝0.003。未测得条件(3-1)中的不良反应相关指标，该稀释比例10％的茶汤满足条件(1-1)～(3-1)，为此确认稀释比例10％的茶汤为优选食品。

综上判断，体外结肠发酵试验在5-20％的稀释比例下，该茶有潜在有益作用；以10％为优选。考虑到成人结肠容积约为3L，10％浓度为300mL，需提取率为35％的茶2g。考虑日常200mL水冲泡1-2min的浸提效率为5％，相当于泡茶14g。为此换算为人体饮用推荐量，每日约为7-28g茶有效，14g最优。低于7g可能有益作用不足；高于28g可能影响肠道稳态导致肠道不适并削弱有益作用。

按前述推荐量进行动物实验论证，结合茶叶包装规格，设置相当于人饮用3.5、7、14、28g/d茶的用量。主要结果如下表3。

表3

结果表明，在设置剂量下，实验动物脏器指数未有显著变化，肠道病理切片未发现饮茶导致的炎症反应或上皮屏障损伤，呈现良好的安全性。相当于每日饮用14g茶的组，其空腹血糖、糖耐量测试血糖曲线下面积等指标，相较于高脂高糖饮食的对照组，改善最为显著。在3.5-14g/d的区间内，随着饮用量增加，改善效果增强。其中3.5g/d时整体改善效果不显著。28g/d组的作用反而弱于14g/d组，与7g/d组接近。进一步分析肠道菌群数据，可见以双歧杆菌为代表的有益菌的增殖，呈现出相同的趋势，表现为从3.5-14g/d的区间内，丰度随剂量增加而升高，而28g/d组反而明显低于14g/d组。基本符合体外筛选中对于排除、候选、优选饮用量的判断。

进一步利用临床研究进行人体利用验证。采用自身干预前后对照研究设计，观察饮用3个月茶对高脂血症(和/或合并脂肪肝)人群的糖脂代谢改善效果。在干预第0天、第90天分别测量志愿者体重、内脏脂肪等级、血脂、空腹血糖等指标。饮用方法为：每日饮用7g，每次200mL沸水冲泡90秒，可反复冲泡，第1-2泡全部饮用。结果如下表4，可见空腹血糖改善，与血糖相关的风险因素如体重、内脏脂肪等也得以改善。证实本发明的靶向肠道稳态的糖代谢的食品筛选方法中筛选得到的候选食品和优选食品是可靠的。

表4

实施例2：血糖调控型发酵陈皮黑茶的配方筛选及验证

发酵陈皮黑茶是以一定比例的陈皮和黑毛茶为原料，经渥堆发酵后，又经特殊窖藏工艺生产而成。为了开发具有糖脂代谢调控作用的发酵陈皮黑茶，为消费者提供一种具有良好感官特征的、质量稳定的健康茶饮，利用α-葡萄糖苷酶、脂肪消化酶的活性抑制率试验，结合体外微生物发酵试验，针对不同黑茶原料复配陈皮发酵后的产品进行评价。

配方的主要区别在于黑茶的产地和工艺差别，作为候选的黑茶类型包括黑毛茶、千两茶、贵州苗茶等。其中黑毛茶的制备方式参考DB61/T 1055-2016；千两茶的制备方式参考DB43/T389-2010、贵州苗茶采用贵州高原地区产的茶叶。将前述黑茶原料与广东新会陈皮拼配后经蒸汽渥堆，在25～30℃，湿度大于70℃条件下自然“发花”15天，后经干燥过程，制成成品。具体地，以重量％计，配方1：黑毛茶80％，贵州苗茶10％，陈皮10％；配方2：黑毛茶40％，千两茶40％，陈皮10％；配方3：千两茶90％，陈皮10％。将前述黑茶与陈皮后，按照茯砖茶制备工艺经冠突散囊菌发酵得成品，其产物中来自陈皮和茶转化形成的茶多酚、茶黄酮、茶多糖、茶色素、橙皮素等品质成分含量存在差异，是形成其不同功能特性的根本原因。

利用陈皮黑茶开展体外酶生化试验和体外结肠发酵试验，制备茶汤的步骤如下：将干茶样品磨碎，称取2g磨碎样品于沸蒸馏水300mL，立即移入沸水浴中浸提45min(提取率为35％)。水浴后过滤，用少量蒸馏水洗脱，定容茶汤至300mL。将茶汤按10％稀释，并按该比例配置成培养基，用于体外结肠发酵试验。

获得数据如下表5，并且未观察到与肠道炎症及便臭相关的有害菌指标(即满足条件(3-1))。

表5

根据条件(1)～(3)进行筛选，配方1满足条件(1)～(3)，作为本发明的候选配方；配方2因产气量变化倍数过高而被排除。配方3因α-葡萄糖苷酶抑制率低而被排除。根据条件(1-1)～(3-1)进行筛选，配方1满足，是优选配方。

进一步分析，配方1抑制α-葡萄糖苷酶活性最强，意味着延缓二糖消化吸收作用最强；对淀粉酶的活性抑制作用弱于配方2，意味着导致不良反应降低；与双歧杆菌相比，有着更高的真细菌丰度和更低的脱硫弧菌丰度，且丁酸含量最高，意味着肠道屏障损伤和炎症的概率最低，符合本发明的理论逻辑。

通过高脂饮食诱导C57BL/6J小鼠建立代谢综合征模型，按体外试验结果换算的推荐摄入量对优选配方的控糖效果进行论证。论证指标包括小鼠在第12周的体重增长、空腹血糖、糖耐量、胰岛素水平、血脂水平的影响。结果如下表6。

表6

表6续

表中，*表示有统计显著性。

结果表明，根据优选方案设计的发酵陈皮黑茶不影响小鼠脏器指数，肠道病理切片未发现饮茶导致的炎症反应或上皮屏障损伤，呈现良好的安全性；同时有助于缓解因高脂饮食导致的小鼠体重增加、糖耐量异常，并改善肝脏脂肪沉积，其中以糖耐量异常的改善最为显著。主要表现为口服糖耐量试验中，血糖浓度峰值下降40％，2h血糖曲线下面积下降34.6％。

进一步检测其肠道微生物的属水平信息，并进行PICRUSt和KEGG通路分析。结果表明，参与脂磷壁酸合成的酶脂磷壁酸合酶[EC:2.7.8.20]以及1,2-二酰基甘油3-α-葡糖基转移酶[EC:2.4.1.337]经发酵陈皮黑茶干预后表达显著下调(P<0.001)，而脂磷壁酸是革兰氏阳性菌细胞壁的重要成分，与革兰氏阳性菌的富集、黏附作用等密切相关。从而证实了饮用陈皮黑茶确有抑制高脂饮食导致的革兰氏阳性细菌毒素通路的作用。与本发明所述肠道稳态的调节理论相匹配。

实施例3：靶向肠道的血糖调控型红茶粉的最佳剂量设计

本实施例所描述的茶叶以滇红茶为原料，按如下工艺制备茶叶：

初制：鲜叶-萎凋(温度25℃，时长：10h)-揉捻(时长30min)-发酵(25℃，5h)-干燥(90℃)-毛茶。

精制：毛茶-筛分(孔径：12目)-风选-捡剔(剔除非茶类夹杂物)-拼堆成色(符合DB36/T 1028三级以上要求)。

然后，按如下茶叶提取物浸提及干燥工艺制备茶粉。

(1)除杂：进一步除去非茶叶杂质。

(2)粉碎：粉碎后茶叶粒径为0.5-2mm。

(3)浸提：用95℃水按10倍比例进行浸提40min。

(4)离心：按800r/min离心实施固液分离。

(5)陶瓷膜过滤：用Al

(6)冷冻或喷雾干燥。

利用该茶粉开展体外酶生化试验和体外结肠发酵试验，制备茶汤的步骤如下：将干茶样品磨碎，称取0.75g样品于沸蒸馏水300mL。将茶汤按10％稀释，用于体外结肠发酵试验。在发酵体系稳定后，先测定0天指标；之后加入测试样品，并以无菌水为对照。测定发酵24h后的气压值，开瓶取发酵液测定发酵后短链脂肪酸，16S rRNA测序法测定发酵前后双歧杆菌的变化。

利用体外酶生化及结肠发酵技术，对降糖潜力及最佳剂量进行预测，方法同实施例2。获得数据如下表7所示，并且试验中未观察到与肠道炎症及便臭相关的有害菌指标。

表7

通过上述表7的结果可以看出，该样品的相关指标符合条件(1)～(3)的标准。

用动物模型对剂量进行优化。构建60％高脂饲料诱导的糖脂代谢紊乱动物模型、用以模拟由于高脂饮食带来的肥胖、糖代谢紊乱等的异常状态，并以二甲双胍为阳性对照，分别以75mg/kg(低剂量组)、150mg/kg(中剂量组)、300mg/kg(高剂量组)的剂量对模型进行干预。

上述剂量的设置是以中剂量为人的每日推荐摄入量得到的。红茶每次冲泡量为2g，浸出物约为0.75g/60kg人。按体表面积换算，相当于小鼠150mg/kg。

结果显示：造模后，高脂饲料喂养的小鼠禁食血糖(FBG)出现显著升高(P<0.05)，同时糖耐量试验(GTT)也显示其糖耐量出现降低(P<0.05)，提示高脂饲料喂养后小鼠出现了一定程度的糖代谢紊乱。而相较于模型组，红茶粉给药组的非禁食血糖和禁食血糖均降低(P<0.05)。GTT和ITT结果显示，相较于模型组，红茶给药组糖耐量得到一定改善，胰岛素敏感性显著改善(P<0.05)。肠道菌群标记物显示中剂量组(相当于人每日摄入0.75g红茶粉)与模型组相比，乳杆菌、乳球菌丰度增加，脱硫弧菌被抑制，产丁酸菌/双歧杆菌、产丁酸菌/AKK菌的丰度比值增加，有利于肠道稳态；当剂量进一步增加至高剂量组(相当于人每日摄入1.5g红茶粉)后，产丁酸菌/双歧杆菌、产丁酸菌/AKK菌的丰度比值反而降低，不利于肠道稳态，具体数据如下表8所示。

表8

表中，“-”表示菌丰度过低无法测定。

故优选中剂量为日常推荐饮用剂量。按体表面积换算法，小鼠150mg/kg/天换算为60kg人饮用2g/天。

以该推荐饮用量招募43名超重、肥胖的糖代谢异常人群(BMI>24)进行RCT试验，分为健康教育对照组和红茶粉干预组，干预组每日佐餐饮用0.5g红茶粉，干预1个月。结果表明，饮用红茶粉后，餐后血糖曲线下面积显著减小，且体脂率随干预时间下降。

实施例4：靶向肠道健康的麦麸加工精度研究

参考行业标准NY/T 3218-2018制备小麦麸。在研磨过程中，设置不同的参数(9Hz、12Hz、14Hz)，从而获得粒径不同的麸皮原料。利用体外仿生消化获取eGI值，并利用体外结肠发酵试验法，获得72h时的肠道菌和短链脂肪酸信息，如下表9。

表9

基于上述信息，研磨参数为12Hz的麸皮纳入靶向“肠道-血糖”健康的侯选物加工参数，作为本发明的候选食品。研磨参数为9Hz的麸皮因双歧杆菌丰度变化倍数低而被排除，研磨参数为14Hz的麸皮因短链脂肪酸指标不符合而被排除。

进一步检测研磨参数为12Hz的麸皮，其慢消化淀粉和抗性淀粉含量比例＞35％，因此推测麦麸并非通过单次食用降低餐后血糖反应，而是通过长期食用后，调节肠道微生态继而发挥改善糖代谢的作用。

利用60％高脂饲料诱导的糖脂代谢紊乱动物模型对麸皮的作用进行评价，干预组在饲料中添加了15重量％麸皮。结果表明，饲养12周后，高脂饲料组动物的体重显著增加，出现空腹血糖升高、血脂紊乱等症状。干预组的体重增速低于模型组，且空腹血糖、血胆固醇均显著降低。取动物粪便进行16S rRNA测序，发现麸皮组的脱硫弧菌丰度较之模型组降低，瘤胃球菌、双歧杆菌的丰度较之模型组显著升高。取肠道内容物，测定短链脂肪酸含量。结果表明，干预组动物肠道中的乙酸、丁酸含量显著升高。取肠道上皮细胞制作病理切片，可见模型组的肠道上皮出现屏障受损相关的病理表现，而干预组肠道上皮细胞较为完整，提示肠道健康状况优于模型组。

实施例5

利用实施例4中研磨参数为12Hz的麸皮与实施例3筛选制备的茶粉、小麦粉以25％、10％、65％的重量比复配制备面条，经体外仿生消化预测eGI值为43，预测为低eGI面条；其2h内葡萄糖释放曲线的曲线下面积较之GI为82的普通面条(100％小麦粉)下降47.6％，符合条件(1-1)的判定要求。以普通面条为对照，在体外仿生消化试验中，测定标志性菌群及有机酸丰度如下表10。根据条件(2-1)判定，低eGI面条与普通面条的产气量菌符合判定要求，但仅有低GI面条的短链脂肪酸指标符合要求；进一步地，以瘤胃球菌和双歧杆菌的比例计算，低eGI面条高于普通面条，提示低eGI面条更有利于肠道稳态要求。试验中未观测到条件(3-1)所述不良反应相关指标。

表10

由此，判定本实施例所述低eGI面条为符合肠道稳态要求的健康主食产品，有助于维持血糖稳定。

以WS/T 652—2019《食物血糖生成指数测定方法》为测试依据，招募12人食用本实施例的普通面条和低eGI面条，以食品级一水葡萄糖55g(相当于可利用碳水化合物含量50g)为参考食物。期间，称取挂面68.7g，用300mL水煮4min，捞出晾凉。称取煮面面汤250g，随餐饮用。每次独立试食测定间隔≥72h。测定前三日受试者规律作息，正常饮食；测定前一日晚餐避免高膳食纤维及高糖食物，22:00前开始禁食；测定当日清晨避免剧烈运动，受试者静坐10min后开始试食测定。首先采集空腹血样。开始进食后，严格控制进食时间，在5～10min内进食完全部受试物及水，从第一口进食时间开始计时。分别于餐后15min、30min、45min、60min和120min采集血样。保证采血时间点的一致性和准确性。采用罗氏血糖仪测定各时间点血样血糖浓度。计算餐后血糖变化量和血糖应答曲线下面积增幅，并计算GI值。

结果表明，普通面条GI值为84；低eGI面条GI值为48，确认为低GI面条。进一步地，测试食用该面条对肠道的影响。连续食用该面条7天，在0天和7天分别采集粪便样本，进行16S rRNA测序。结果表明，食用该低GI面条后，肠道脱硫弧菌丰度降低，瘤胃球菌和双歧杆菌呈现同步增加的趋势，且瘤胃球菌的增值比例大于双歧杆菌；代谢通路分析显示，碳代谢功能增强，能量代谢和PPAR通路增强，2型糖尿病通路被抑制，同时毒素通路被抑制，提示使用面条后人体倾向于肠道稳定和代谢健康。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。