CT阴性轻度脑外伤的轴突损伤与进行性脑萎缩的血清标志物预测模型及其构建方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及CT阴性轻度脑外伤的轴突损伤与进行性脑萎缩的血清标志物预测模型及其构建方法。

背景技术

创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是导致死亡和发病的主要原因之一，超过80％的TBI被归类为轻度脑外伤(mild traumatic brain injury，mTBI)，而mTBI患者中95％以上呈现CT阴性。虽然CT扫描为检测TBI颅内损伤提供了有效的诊断方式，但CT阴性mTBI患者中存在27％患者发现临床MRI阳性损伤，因此仅基于CT的诊断方式可能导致误诊和不良的预后结局。然而，MRI也存在局限性，包括高成本和有限的可用性。因此，基于血液生物标记物来预测TBI后MRI阳性损伤受到越来越多的关注。

最近的一项研究发现亚急性期TBI的血清神经丝轻链蛋白(Neurofilamentlight，NfL)与功能结局、脑萎缩和白质轴突完整性相关。另外一项研究发现血浆NfL浓度与中重度TBI引起的轴突损伤有关，并能够预测神经退行性病变和功能预后结局。以上两项研究证明了TBI后血液标记物语神经影像和功能结局的关系，但其研究主要集中在中重度TBI患者，同时选定的标记物主要在于NfL，其他潜在的标记物以及CT阴性mTBI患者的研究尚不清楚。TBI的分子病理学研究表明轴突损伤、神经元胞体损伤、神经炎症以及血管健康在疾病进展中起到关键作用。因此，全面评估以上分子病理相关血清标志物与MRI影像学异常的联系对揭示不同血清标志物类型的分子通路起到重要作用。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供CT阴性轻度脑外伤的轴突损伤与进行性脑萎缩的血清标志物预测模型及其构建方法，为轻度脑外伤的早期检测提供有效的辅助检测手段。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了CT阴性轻度脑外伤的轴突损伤与进行性脑萎缩的血清标志物预测模型的构建方法，包括以下步骤：

S1：采集轻度脑外伤患者和健康对照者的血清标志物和影像学图像；

S2：对采集的轻度脑外伤患者和健康对照者的血清标志物进行组间统计对比，确定异常表达血清标志物；对采集的轻度脑外伤患者和健康对照者的影像学图像进行组间统计对比，确定影像学异常改变数据；

S3：对异常表达血清标志物与影像学异常改变数据作相关性分析，得到CT阴性轻度脑外伤的轴突损伤与进行性脑萎缩的血清标志物预测模型。

优选地，S1中，所述血清标志物包括NfL和IL-6。

进一步优选地，所述血清标志物还包括IL-1beta、UCH-L1和VEGF-A。

优选地，S1中，采集轻度脑外伤患者伤后7天内、伤后3个月以及伤后6～12个月的磁共振图像；采集与轻度脑外伤患者性别、年龄匹配的健康对照组的磁共振图像。

进一步优选地，S1中，所述磁共振图像包括弥散加权磁共振图像和高分辨率T1加权磁共振图像。

进一步优选地，对弥散加权磁共振图像进行预处理和统计分析，得到弥散指标，对得到的弥散指标进行组间统计对比，得到异常改变的弥散加权磁共振数据；对高分辨率T1加权磁共振图像分析雅可比脑萎缩率，并进行组间统计对比，得到异常改变的高分辨率T1加权磁共振数据。

优选地，S2中，采用曼-惠特尼U检验对轻度脑外伤患者和健康对照者的血清标志物进行组间统计对比，采用邦弗朗尼校正进行多重比较矫正，显著性水平设置为p<0.05，确定异常表达血清标志物。

优选地，对弥散加权磁共振图像进行预处理，所述预处理包括剥脑、涡流矫正和计算弥散张量指标；对预处理后的图像进行基于白质骨架的弥散参数统计分析，得到弥散指标；所述基于白质骨架的弥散参数统计分析包括非线性配准、创建平均FA图像和FA骨架、以及将个体FA值配准到平均FA骨架上。

优选地，对采集的高分辨率T1加权磁共振图像通过配准分析雅可比脑萎缩率，并进行组间统计对比，采用TFCE进行多重比较校正，显著性水平设置为p<0.05，得到异常改变的高分辨率T1加权磁共振数据。

进一步优选地，分析雅可比脑萎缩率的具体步骤为：采用基线和随访的T1图像进行交互配准计算，除以两次扫描的间隔时间得到雅可比萎缩率图像；再将雅可比萎缩率图像配准到标准空间并进行调制，最后采用8mm平滑核对调制后的图像进行平滑。

优选地，S3中，对异常表达的年龄相关的血清标志物与影像学异常改变数据的相关分析采用回归年龄的偏相关，其余血清标志物与影像学异常改变数据的相关分析采用斯皮尔曼相关。

本发明还公开了CT阴性轻度脑外伤的轴突损伤与进行性脑萎缩的血清标志物预测模型，包括：

采集模块，用于采集轻度脑外伤患者和健康对照者的血清标志物和影像学图像；

数据确定模块，用于对采集的轻度脑外伤患者和健康对照者的血清标志物进行组间统计对比，确定异常表达血清标志物；对采集的轻度脑外伤患者和健康对照者的影像学图像进行组间统计对比，确定影像学异常改变数据；

预测模型构建模块，对异常表达血清标志物与影像学异常改变数据作相关性分析，得到CT阴性轻度脑外伤的轴突损伤与进行性脑萎缩的血清标志物预测模型。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的CT阴性轻度脑外伤的轴突损伤与进行性脑萎缩的血清标志物预测模型的构建方法，将血清标志物与影像学特征结合，针对CT阴性mTBI患者，纳入TBI血清标志物，通过异常表达血清标志物结合脑影像异常改变数据的相关性分析，得到CT阴性轻度脑外伤的轴突损伤与进行性脑萎缩的血清标志物预测模型。在对该方法验证的过程中，考察不同血清标志物对预测CT阴性mTBI患者的MRI脑影像异常的预测效力，通过DTI和T1图像分析，发现轻度脑外伤患者急性期和亚急性期存在轴突损伤，同时在急性期到亚急性期以及亚急性期到慢性期都存在持续的灰白质脑萎缩。通过测定患者的血清标志物，发现轻度脑外伤患者在急性期的NfL、IL-6、IL-1beta、UCH-L1和VEGF-A表达水平显著增高。上述血清标志物与影像学异常改变相关分析，发现NfL与轻度脑外伤患者早期轴突损伤和慢性期灰白质脑萎缩相关，IL-6与早期轴突损伤有关，其余标记物与影像学异常没有显著相关，进一步说明患者异常表达血清标志物能够指示颅内病变。因而该模型及方法能够为轻度脑外伤的早期检测提供有效的辅助检测手段，有助于全面评估分子病理相关血清标志物与影像学异常数据的联系，进而寻求更好的治疗干预措施。

附图说明

图1为本发明的CT阴性轻度脑外伤的轴突损伤与进行性脑萎缩的血清标志物预测模型的构建方法的流程图；

图2为本发明的血清标志物在轻度脑外伤患者与健康对照组中的组间差异分析结果图；其中，A为NfL对比结果，B为VEGF-A对比结果，C为IL-6对比结果，D为IL-1beta对比结果，E为UCH-L1对比结果；

图3为本发明的急性期、伤后3个月、伤后6～12个月轻度脑外伤患者与健康对照的弥散参数组间差异图；其中，白色区域表示显著异常脑区，每三个胼胝体图像为一组，显示脑影像的不同切层；

图4为本发明的急性期到伤后3个月、伤后3个月到伤后6～12个月轻度脑外伤患者与健康对照的脑萎缩进展率的组间差异图；圈内区域表示显著加速脑萎缩区域，其中白色表示白质，灰色表示灰质；

图5为本发明的轻度脑外伤患者血清标志物与轴突损伤和脑萎缩之间的相关性图；其中，A为急性期IL-6浓度与胼胝体受损区平均RD相关性，B为急性期NfL水平与胼胝体受损区域的平均MD相关性，C为急性期NfL水平与胼胝体受损区域的平均RD相关性，D为急性期NfL与伤后3个月到伤后6～12个月向额叶区域投射的白质纤维束脑萎缩区的脑萎缩率的相关性，E为急性期NfL与伤后3个月到伤后6～12个月额叶灰质脑萎缩区的脑萎缩率的相关性。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。

还应当理解，在本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。

应当理解，尽管在本发明实施例中可能采用术语第一、第二、第三等来描述预设范围等，但这些预设范围不应限于这些术语。这些术语仅用来将预设范围彼此区分开。例如，在不脱离本发明实施例范围的情况下，第一预设范围也可以被称为第二预设范围，类似地，第二预设范围也可以被称为第一预设范围。

在附图中示出了根据本发明公开实施例的各种结构示意图。这些图并非是按比例绘制的，其中为了清楚表达的目的，放大了某些细节，并且可能省略了某些细节。图中所示出的各种区域、层的形状及它们之间的相对大小、位置关系仅是示例性的，实际中可能由于制造公差或技术限制而有所偏差，并且本领域技术人员根据实际所需可以另外设计具有不同形状、大小、相对位置的区域/层。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明提供的CT阴性轻度脑外伤的轴突损伤与进行性脑萎缩的血清标志物预测模型的构建方法，如图1所示，首先对轻度脑外伤患者和健康对照者的血清标志物进行组间统计对比，以确定异常表达血清标志物；然后对轻度脑外伤患者和健康对照者的弥散加权磁共振图像的弥散参数进行组间统计对比，得到异常改变的弥散加权磁共振数据，以确定轴突损伤脑区；再对轻度脑外伤患者和健康对照者的高分辨率T1加权磁共振图像分析脑萎缩率，并进行组间统计对比，得到异常改变的高分辨率T1加权磁共振数据，以确定灰白质加速萎缩脑区；最后分析异常表达血清标志物与轴突损伤以及脑萎缩的相关性。

具体步骤如下：

S1：采集健康对照组和轻度脑外伤患者急性期的NfL、IL-6、IL-1beta、UCH-L1和VEGF-A血清标志物浓度，并进行组间统计对比，确定异常表达血清标志物；

具体方法为：上午7点到8点之间采用静脉穿刺法采血，将采得的血液室温放置30～60min至自然冷却，之后对血液进行10min离心(3000r/min)，将上清液在-80℃冰箱保存。血清生物标记物：IL-6、IL-1beta、UCH-L1和VEGF-A分析采用Luminex液相芯片分析系统进行浮空检测，血清NfL分析采用超灵敏Simoa技术检测。样本内核样本间变异系数分别低于20％和25％。采用曼-惠特尼U检验对血清标志物进行组间统计对比，采用邦弗朗尼校正进行多重比较矫正，显著性水平设置为p<0.05。

S2：采集轻度脑外伤患者急性期(即伤后7天内)、伤后3个月以及伤后6～12个月的弥散加权磁共振图像，同时采集一次性别、年龄匹配的健康对照组的弥散加权磁共振图像，并对图像进行预处理；

图像预处理的具体方法为：采用FSL(https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl)对采集的弥散加权磁共振图像(即DTI图像)进行预处理。首先，为了去除头皮颅骨等脑外组织，使用BET进行剥脑。其次，为了去除涡流效应、头动偏移以及磁敏感性伪影，使用EDDY进行涡流校正。最后，使用DTIFIT计算被试的弥散张量指标，包括FA、L1、L2和L3图像，通过L1、L2和L3图像计算得到MD、AD和RD。

S3：对步骤2中预处理后的图像进行基于白质骨架的弥散参数统计分析，得到弥散指标；

具体方法为：首先，将所有被试的FA图像非线性配准到标准FMRIB58_FA模版上；其次，对被试的FA图像进行平均，进而生成平均FA骨架。随后，将所有被试的FA图像投影到平均FA骨架上，生成所有被试的FA的4D投影数据。最后，运行tbss_non_FA脚本，将原来的非线性配准分别应用到MD、RD、以及AD数据上，并将配准后的图像投影到上述的平均FA骨架上，从而分别得到MD、RD以及AD的4D投影数据。

S4：对步骤3中得到的弥散指标进行组间统计对比，确定轴突损伤脑区；

具体方法为：首先，采用design_ttest2创建设计矩阵，将年龄、性别和受教育程度作为协变量回归掉。其次，采用randomise统计对比mTBI患者组和健康对照组之间的FA、MD、AD以及RD的组间差异。最后，采用TFCE进行多重比较校正，多重比较置换次数为5000次，显著性水平设置为p<0.05，同时采用cluster校正保留cluster>50个体素的团块，采用TBSS_fill对经过校正的结果进行填充，便于后期差异图像展示。经过以上校正的轻度脑外伤患者弥散参数异常改变图像即为后续做相关分析的弥散参数异常脑影像。

S5：采集轻度脑外伤患者急性期、伤后3个月、以及伤后6～12个月的高分辨率T1加权磁共振图像，同时采集两次性别、年龄匹配的健康对照组的高分辨率T1加权磁共振图像；

S6：对步骤5中的高分辨率T1加权磁共振图像分析雅可比脑萎缩率，并进行组间统计对比，确定灰白质加速萎缩脑区(即患者异常脑萎缩脑区)；

具体方法为：采用SPM(https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm)对T1图像进行计算脑萎缩进展率。首先，采用Pairwise Longitudinal Registration工具将基线和随访的T1图像进行交互配准计算，除以两次扫描间隔时间得到雅可比萎缩率图像。其次，采用Normalise to MNI Space工具将雅可比萎缩率图像配准到MNI标准空间并进行调制，采用8mm平滑核对调制后的图像进行平滑。最后，采用5000次非参置换检验分别统计灰质和白质内的雅可比脑萎缩率组间差异，将年龄、性别、受教育程度作为协变量回归掉，采用TFCE进行多重比较校正，多重比较置换次数为5000次，显著性水平设置为p<0.05。经过以上校正的轻度脑外伤患者雅可比脑萎缩率异常改变图像即为后续做相关分析的加速脑萎缩异常脑影像。

S7：对步骤1中具有显著组间差异的血清标志物与步骤4和步骤6中确定的异常脑影像作相关性分析。

鉴于NfL及弥散参数、脑萎缩均与年龄存在显著相关性，因此，NfL与影像学异常的相关分析采用回归年龄的偏相关，其余血清标志物与影像学异常的相关分析采用斯皮尔曼相关。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中的描述和所示的本发明实施例的组件可以通过各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1.轻度脑外伤患者及健康对照血清标志物及磁共振数据的采集

研究采集了温州医科大学第二附属医院急诊科接受脑损伤治疗并确诊为轻度脑损伤的103例患者(年龄：19～67岁，受教育：0～16年，男性：54例，伤后时间：0～7天内，其中75％(77例)的患者(年龄：19～63岁，受教育：0～16年，男性：40例，伤后时间：0～7天)接受了MRI扫描。轻度脑外伤患者的入选和排除按照世界卫生组织神经创伤工作组制定的标准完成。同时，纳入了66例年龄、性别、受教育程度匹配的健康对照被试(年龄：20～60岁，受教育：0～22年，男性：34例)，其中82％(54例)的健康对照被试(年龄：20～60岁，受教育：0～22年，男性：25例)接受了MRI扫描。患者组在伤后3个月和伤后6～12个月进行随访采集MRI影像。为了消除正常老化过程带来的脑萎缩，健康对照组的T1图像做了2次采集。在实验程序开始之前，已经获得每个参与者的书面知情同意书。本研究程序已经过西安交通大学生命科学技术学院伦理委员会批准，符合赫尔辛基宣言。

对所有参与者，采用带有32通道头部线圈的MRI扫描仪GE 750在3.0T场强下进行MRI扫描。DTI的采集参数如下：重复时间＝8000ms；回波时间＝68ms；翻转角＝90°；体素大小＝2mm×2mm×2mm；矩阵大小＝128×128；75层；5个b＝0s/mm

采集血清标志物包括：

1)神经元轴突损伤标记物：NfL(神经丝蛋白轻链)；

2)炎症标记物：IL-6(白细胞介素-6)，IL-1beta(白细胞介素-1β)；

3)神经元胞体损伤标记物：UCH-L1(泛素羧基末端水解酶L1)；

4)血管再生标记物：VEGF-A(血管内皮生长因子A)

2.血清标志物统计分析方法及结果

按标记物分为神经元轴突损伤标记物(轻度脑外伤组52例，健康人44例)、炎症标记物(轻度脑外伤组83例，健康人40例)、神经元胞体损伤标记物(轻度脑外伤组83例，健康人40例)、血管再生标记物(轻度脑外伤组49例，健康人43例)四组进行检测。对每一项测得的标记物进行差异表达分析，差异分析采用曼-惠特尼U检验对两组人的血清标志物进行分析，具体的数据范围如表1所示：

表1血清标志物检测结果

注：表1展示了NfL、VEGF-A、IL-6、IL-1beta和UCH-L1血清标志物在轻度脑外伤组以及健康对照组的检测结果(中位数(四分位数))。

差异表达蛋白分析如图2所示，在神经元轴突损伤标记物中，NfL在轻度脑外伤患者较健康对照显著上升(p<0.001)；在血管再生标记物中，VEGF-A在轻度脑外伤患者较健康对照显著上升(p<0.0001)；在炎症标记物中，IL-6在轻度脑外伤患者较健康对照显著上升(p<0.0001)，IL-1beta在轻度脑外伤患者较健康对照显著上升(p<0.001)；在神经元胞体损伤标记物中，UCH-L1在轻度脑外伤患者较健康对照显著上升(p<0.0001)。

3.弥散参数统计分析方法及结果

为考察轻度脑外伤患者在急性期、伤后3个月、伤后6～12个月的轴突损伤情况，采用5000次非参置换检验统计对比FA、MD、AD以及RD的组间差异，将年龄、性别以及受教育程度作为协变量回归掉。采用TFCE进行多重比较校正，显著性水平设置为p<0.05，同时采用cluster校正保留cluster>50个体素的团块，采用TBSS_fill对经过校正的结果进行填充便于后期差异图像展示。

如图3所示，与健康对照组相比，急性期轻度脑外伤患者在胼胝体区域的MD和RD显著升高(p<0.05，TFCE校正)，而FA和AD无显著改变；在伤后3个月的随访期，轻度脑外伤患者胼胝体体部的MD仍然存在显著升高(p<0.05，TFCE校正)，而其余弥散参数无显著改变；在伤后6～12个月，所有的弥散参数均回归到正常水平。

4.雅可比脑萎缩率统计分析方法及结果

为考察轻度脑外伤后急性期到伤后3个月，以及伤后3个月到伤后6～12个月的脑萎缩进程，采用5000次非参置换检验分别统计灰质、白质内的雅可比脑萎缩率组间差异，将年龄、性别以及受教育程度作为协变量回归掉，显著性水平设置为p<0.05。

如图4所示，在灰质方面，与健康对照相比，轻度脑外伤患者急性期到伤后3个月的额颞叶雅可比萎缩率显著降低(p<0.05，TFCE校正)，而伤后3个月至伤后6～12个月额叶的雅可比萎缩率呈现持续降低(p<0.05，TFCE校正)。在白质方面，与健康对照相比，轻度脑外伤患者急性期到伤后3个月在小钳、扣带、下额枕束、前丘脑放射冠呈现显著降低的雅可比脑萎缩率(p<0.05，TFCE校正)，伤后3个月至伤后6～12个月在小钳、下额枕束、前丘脑放射冠呈现显著降低的雅可比脑萎缩率(p<0.05，TFCE校正)。

5.血清标志物与轴突损伤以及脑萎缩相关的方法及结果

采用异常表达血清标志物与影像学异常改变区域的均值作相关分析，鉴于NfL及弥散参数、脑萎缩均与年龄存在显著相关性，因此，NfL与影像学异常的相关分析采用回归年龄的偏相关，其余血清标志物与影像学异常的相关分析采用的斯皮尔曼相关。

如图5中A、B和C所示，轻度脑外伤患者急性期IL-6浓度与胼胝体受损区平均RD呈正相关(ρ＝0.253，p＝0.037)。轻度脑外伤患者急性期NfL水平与胼胝体受损区域的平均MD(r＝0.387，p＝0.012)和RD(r＝0.372，p＝0.017)呈现正相关。其他血清标志物与急性期和随访期的弥散参数异常无显著相关性。

如图5中D和E所示，轻度脑外伤患者急性期NfL与伤后3个月到伤后6～12个月向额叶区域投射的白质纤维束脑萎缩区的脑萎缩率呈负相关(r＝-0.548，p＝0.015)，同时轻度脑外伤患者与伤后3个月到伤后6～12个月额叶灰质脑萎缩区的脑萎缩率呈负相关(r＝-0.533，p＝0.019)。其他血清标志物与任何阶段的脑萎缩率都不存在相关性。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。