上皮性卵巢癌紫杉醇耐药分子标志物及其应用

技术领域

本发明涉及卵巢癌的诊断和治疗领域，特别涉及上皮性卵巢癌紫杉醇耐药分子标志物及其应用。

背景技术

上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Carcinoma，EOC)是妇科恶性肿瘤之一，其死亡率高居妇科恶性肿瘤第三位。因70％以上的上皮性卵巢癌患者在晚期被诊断，导致五年生存率较低，仅接近48％。目前常用治疗方式为手术和化疗。但由于卵巢位于女性盆腔深处，使得手术难度系数升高，为患者的手术安全带来较高风险。相较之下，使用药物进行治疗能极大提高患者的安全系数。紫杉醇作为上皮性卵巢癌患者常用的一线化疗药物，却因耐药性的出现限制了其临床疗效，同时紫杉醇耐药性通常可引发上皮性卵巢癌患者发生多药耐药(Multidrugresistance,MDR)，是导致患者化疗失败和生存率下降的主要原因。因此，改善上皮性卵巢癌患者的紫杉醇耐药性有利于在保证患者一定的安全系数下提高其生存率。

RNA测序是一种高通量二代测序技术，可同时对数亿条DNA/RNA链进行大规模并行测序，在较短时间内产生丰富的数据信息。随着技术的发展，各种生物信息相关的数据库内容增多，而RNA测序技术的成熟也使测序数据库中的数据不断增加。这些数据库提供的大量信息为高通量筛选基因带来了极大便利，可用于研究上皮性卵巢癌的紫杉醇耐药性及相关新靶点。

基因组转录调控区域中的超级增强子，能够大幅度激活基因的表达，且具有较高的组织特异性，在发育、肿瘤等过程中均扮演着重要的角色。基于基因控制原件超级增强子调控基因的原理，可研发控制基因表达的调节剂。通过调节基因表达来解决疾病问题，为患者创造了新的治疗机会。

现在关于上皮性卵巢的耐药性研究多聚焦在铂类药物而非紫杉醇，但铂类药物对人体的毒性远超过紫杉醇，综合各方面而言，紫杉醇为首选的一线化疗药物之一。少数关于上皮性卵巢的紫杉醇耐药性的研究则是选定单基因进行研究，或是选择已有适应症的药物，研究其与紫杉醇的联合使用来逆转其耐药性。单基因的研究不够整体，较为片面；而已有适应症的药物则缺乏特异性，会伴随一定的不良反应。也有极少数的研究通过高通量测序与生信分析筛选上皮性卵巢癌的化疗药物的耐药相关基因，但未有实验结果论证。

发明内容

本发明的研究过程：

(1)人上皮性卵巢癌细胞系A2780和紫杉醇耐药A2780-Taxol细胞系的培养传代。后收集处于对数生长期的A2780和A2780-Taxol细胞提取总RNA。

(2)制备文库，在illumina测序平台上进行转录组测序；

(3)原始测序数据过滤掉包含接头(adapter)序列、测序质量很低的碱基和未测出的碱基，使用HISAT2(v2.0.4)将干净读取(clean reads)映射到参考基因组。应用Bowtie2(v2.2.5)将clean reads与参考编码基因组对齐；

(4)使用软件RSEM(v1.2.8)计算A2780和A2780-Taxol细胞的基因表达水平，R语言包DESeq2计算GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中A2780紫杉醇耐药数据的基因表达倍数以及校正后P值，以|log2(Fold Change)|>＝1和FDR<＝0.001或Padj<0.01为条件筛选差异基因；

(5)使用R语言的软件包survminer和survival分析差异基因水平与TCGA(TheCancer Genome Atlas)数据库中紫杉醇用药的卵巢癌患者总生存期之间的关系；

(6)使用KEGG Pathway数据库获取基因相关通路(Pathway)，由R的函数phyper计算P值(P value)，软件包qvalue对Pvalue进行多重检验较正，得到包含在显著富集的通路中紫杉醇耐药相关基因；

(7)通过Western blotting、细胞免疫荧光实验和细胞免疫组化实验对上皮性卵巢癌的紫杉醇耐药相关基因进行验证。

在整个具体实施方案中，我们通过转录组测序和生物信息学分析，结合GEO数据库中测序数据，筛选到了488个在A2780细胞和A2780-Taxol细胞中差异表达的基因。通过Kaplan-Meier生存曲线分析，结合TCGA数据库中卵巢癌的紫杉醇用药患者的临床数据，发现其中26个差异基因与卵巢癌的紫杉醇用药患者的总生存期密切相关。经由KEGG和GO富集分析，筛选得到了3个紫杉醇耐药相关基因，其富集功能都与细胞粘附和迁移有关。3个紫杉醇耐药相关基因在A2780细胞和A2780-Taxol细胞呈现出了显著的差异表达情况。特别是UNC5C基因，在A2780细胞和A2780-Taxol细胞中具有显著性表达下降。这意味着UNC5C有望为临床卵巢癌的紫杉醇耐药诊断和治疗提供有意义的生物学指标，成为卵巢癌紫杉醇耐药患者的下调性分子治疗靶点，患者生存预后的标志物。我们对3个紫杉醇耐药相关基因UNC5C、MMP1和ZYX进行后续实验验证。

在我们的细胞Western blotting结果中，UNC5C在A2780-Taxol细胞中的表达情况显著低于A2780细胞。而且，在细胞免疫荧光实验和免疫组化实验中也出现了同样的结果。这些实验结果与我们先前的测序数据相互吻合。以UNC5C为紫杉醇耐药下调性分子靶点，研发逆转治疗上皮性卵巢癌多药耐药的靶向调节剂，不仅可以提高基因的表达和转录效率，迅速出现治疗效果，还具有组织特异性，能避免基因沉默疗法产生的不良反应。综上所述，UNC5C、MMP1、ZYX三个靶点在RNA测序、体外细胞的Western blotting、免疫荧光实验和免疫组化实验结果是良好相互印证的，说明我们的多重验证工作具备稳定性和准确性。本次UNC5C靶点的筛选、发现揭示了上皮性卵巢癌紫杉醇耐药性发生的新机制，提供了新的有意义的线索和依据。UNC5C可以为上皮性卵巢癌患者治疗紫杉醇诱导多药耐药、增强疗效和预后评估提供新的下调性耐药分子靶点和临床应用思路。

本发明具有以下优点：

(1)首次筛选、发现和验证了UNC5C基因作为上皮性卵巢癌紫杉醇耐药性的新的下调性分子标记物，具有广泛的应用前景。

(2)首次报道了UNC5C基因的显著表达下调可影响到上皮性卵巢癌患者获得性紫杉醇耐药以及影响生存预后。UNC5C可作为上皮性卵巢癌患者紫杉醇耐药性机制新的下调性分子靶点，可为研发调节剂来逆转治疗上皮性卵巢癌多药耐药提供新的作用靶点和思路。

(3)本研究结合了二代测序技术、生物信息学方法和国际公开数据库TCGA卵巢癌的紫杉醇用药患者临床样本数据，为临床揭示上皮性卵巢癌的紫杉醇耐药机制提供新的线索和依据。并且通过体外细胞Western blotting实验、免疫荧光实验、免疫组化实验对生物信息学分析结果得到了验证和吻合。

(4)在测序与GEO数据库的数据中针对共有的差异基因筛选出了UNC5C、MMP1和ZYX三个分子标记物。其中，测序结果显示UNC5C在A2780与A2780-Taxol中差异表达下调，同时体外细胞Western blotting实验、免疫荧光实验、免疫组化实验结果显著差异下调，可作为最优选分子标记物而用于设计肿瘤靶向调节剂。

(5)本发明创造可为今后治疗上皮性卵巢癌多药耐药、增强疗效、预后评估及提高人口健康方面提供紫杉醇耐药新靶标，对阐明未来的研发方向和实际临床应用产生指导意义。

附图说明

图1为DGEs1中差异基因的表达情况图；

图2为DGEs2中差异基因的表达热图；

图3为DGEs1中差异基因的KEGG显著富集通路图；

图4为DGEs1中差异基因的GO显著富集条目。其中，A：DEG1差异基因在CC分析中显著富集的前十五条条目。B：DEG1差异基因在MF分析中显著富集的前十五条条目。C：DEG1差异基因在BP分析中显著富集的前十五条条目；

图5为生存相关的差异基因与KEGG通路的关联图；

图6为Western blotting实验验证UNC5C、MMP1、ZYX在A2780细胞和A2780-Taxol细胞中的差异表达。A：UNC5C、MMP1、ZYX在A2780细胞和A2780-Taxol细胞中表达条带。B：UNC5C、MMP1、ZYX在A2780与A2780-Taxol细胞中的表达统计图；

图7为测序数据中UNC5C、MMP1、ZYX在A2780细胞和A2780-Taxol细胞中的差异表达水平(UNC5C在A2780-Taxol细胞中表达为0)；

图8为细胞免疫荧光实验验证UNC5C、MMP1、ZYX在A2780细胞和A2780-Taxol细胞中的差异表达。A：UNC5C在A2780与A2780-Taxol细胞中的免疫荧光杂交图像和荧光强度统计图。B：MMP1在A2780与A2780-Taxol细胞中的免疫荧光杂交图像和荧光强度统计图。C：ZYX在A2780与A2780-Taxol细胞中的免疫荧光杂交图像和荧光强度统计图；

图9为细胞免疫组化实验验证UNC5C、MMP1、ZYX在A2780细胞和A2780-Taxol细胞中的差异表达。A：UNC5C、MMP1、ZYX在A2780与A2780-Taxol细胞中的免疫组化染色图像。B：UNC5C、MMP1、ZYX在A2780与A2780-Taxol细胞中的免疫组化染色强度统计图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。另外，实施例中未注明具体技术操作步骤或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1.细胞培养

人上皮性卵巢癌A2780细胞系培养在含10％胎牛血清、1％双抗和2％ L-谷氨酰胺的1640培养基中；人上皮性卵巢癌紫杉醇耐药细胞系A2780-Taxol培养在含10％胎牛血清、1％双抗和60ng/ml紫杉醇的DMEM培养基中，置于5％ CO

2.RNA测序

1)提取总RNA

收集约1×10

2)RNA测序文库的制备

使用Agilent 2100Bioanalyzer检测total RNA的浓度、RIN值、28S/18S和片段大小。取一定量的total RNA使用oligo-dT beads进行纯化，最终调取的mRNA溶于10μlElution Buffer中。向上述产物中加入3μL First Strand Buffer，94℃孵育8min。配置反转录反应体系，在25℃for 10min；42℃for 50min；70℃for 15min后加入二链反应试剂，在16℃孵育1小时，然后进行磁珠纯化。配置末端修复反应，20℃孵育30min后进行磁珠纯化。配置加“A”反应体系，37℃孵育30min后加入接头(adapter)连接反应体系，20℃孵育15min，反应完成后进行磁珠纯化。配置PCR反应体系，按照PCR反应程序进行扩增，PCR产物用磁珠进行纯化。使用Agilent 2100Bioanalyzer检测文库的片段大小及浓度。将检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，按照预期上机数据量，稀释至一定的浓度。并将变性稀释后的文库加入FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，然后在簇生成平台cBot上完成桥式PCR扩增，并进行上机测序。

3)测序数据处理

测序数据由SOAPnuke(v1.5.2)过滤：(1)删除包含测序接头的读取；(2)删除低质量基比(基质量小于或等于5)大于20％的读取；(3)移除未知基('N'基)比率大于5％的读取，然后获取干净的读取并以FASTQ格式存储。使用HISAT2(v2.0.4)将干净读取映射到参考基因组。应用Bowtie2(v2.2.5)将clean reads与参考编码基因集(GCF_000001405.39_GRCh38.p13)对齐。

3.差异基因分析

使用软件RSEM(v1.2.8)计算A2780和A2780-Taxol细胞的基因表达水平，以|log2(Fold Change)|>＝1和FDR<＝0.001为条件筛选得到6226个差异基因(DGEs1)，如图1所示。GEO数据库下载紫杉醇耐药A2780-Taxol细胞的基因表达水平文件GSE159791，以A2780为对照，用R软件包DESeq2计算基因表达倍数以及校正后P值，以|log2(Fold Change)|>＝1和Padj<0.01为条件筛选得到的差异基因与DGEs1对比，选出488个共有基因(DGEs2)，如图2。使用R软件包pheatmap和ggplot2可视化结果。

4.Kaplan-Meier生存曲线分析

筛选出TCGA(https://xenabrowser.net/datapages/)中测序样本为卵巢癌，且使用紫杉醇作为主要治疗的患者临床信息，通过R语言的软件包survminer和survival分析DGEs2中同时上、下调的差异基因表达水平与患者总生存期之间的关系，并可视化。其中，只有26个差异基因与总生存期相关(P<0.05)，见表1。

表1与生存相关的差异基因

5.KEGG和GO富集分析

通过Gene Ontology数据库和KEGG Pathway数据库获取基因相关GO term和Pathway。由R的函数phyper计算Pvalue，并用软件包qvalue对Pvalue进行多重检验较正。以Qvalue(corrected Pvalue)<0.05为阈值筛选显著富集的GO term和Pathway，使用R语言包的软件包GOplot和ggplot2可视化结果。DGEs1的基因显著富集于黏着斑(Focaladhesion)、Hippo信号通路(Hippo signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signalingpathway)、轴突引导(Axon guidance)、PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)等通路(如图3所示)，同时显著富集于细胞粘附(Cell adhesion)和细胞迁移(Cell migration)的生物学过程(Biological Process,BP)，细胞定位(Cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)的显著富集结果也多是与细胞粘附和迁移相关(图4A-C)。其中，只有UNC5C、MMP1、ZYX三个生存相关基因分别包含在显著富集的PPAR signaling、Focaladhesion、和Axon guidance通路中(见图5)。因此，将UNC5C、MMP1、ZYX作为紫杉醇耐药相关基因。KEGG和GO富集结果显示，卵巢癌的紫杉醇耐药性的产生与肿瘤细胞粘附和迁移有极大相关。

6.Western Blotting

使用RIPA缓冲液裂解A2780和A2780-Taxol细胞，提取总蛋白。按照产品使用说明使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定对总蛋白浓度进行定量。通过SDS-PAGE使蛋白质样品分离，转膜。将抗体ZYX、MMP1和UNC5C按照1:1000比例稀释，膜放入一抗中4℃孵育过夜。TBST洗涤3次后与二抗在室温下孵育2h。使用化学发光试剂盒显影。用软件Image J处理蛋白丰度结果。结果如图6A-B显示，UNC5C在耐药细胞株A2780-Taxol中表达下降(P<0.05)，MMP1和ZYX在耐药细胞株A2780-Taxol中表达升高(P<0.05，P<0.01)，与测序结果(图7)的表达情况一致。

7.细胞免疫荧光实验

将爬片放入12孔板，用0.1％ Gelatin在37℃培养箱中预铺板1小时。随后，每孔加入约3×10

8.细胞免疫组化实验

将爬片放入12孔板,每孔加入细胞密度为4×10

9.统计分析

采用IBM SPSS Statistics 26统计软件、R语言和GraphPad Prism 5进行统计分析，P<0.05具有统计学意义。

上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。