一种基于计算机分子模拟技术进行多抗原表位合并重组的方法

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种在计算机分子模拟技术指导下进行多抗原表位的免疫显性基合并重组、以抗体可变区或病毒受体蛋白为模板对多抗原表位肽进行筛选的方法。

背景技术

免疫是由抗原刺激机体开始的，抗原能刺激机体免疫系统产生免疫应答，并能与免疫应答产物(抗体或致敏淋巴细胞)结合[1-3]。目前认为，抗原分子在发挥免疫刺激作用时，并非以完整的分子发挥作用，而是以抗原分子的某些局部结构，发挥对免疫细胞的刺激作用或与抗体的结合作用，抗原分子上这样的局部结构，被称为抗原决定簇，或抗原表位[4,5]。目前一般认为，一个多肽表位含5-6个氨基酸残基；一个多糖表位含5-7个单糖；一个核酸抗原表位含6-8个核苷酸[6,7]。在多肽抗原中发现其中有一个基团在与抗体结合时比其它氨基酸残基发挥更大作用，这样的基团被称为关键氨基酸。人们用同样的方法对各种不同多肽抗原表位的关键氨基酸进行了大量研究，但在他们的报告中抗原表位的关键氨基酸都不是一个，而是一个组合[8]。随着现在各种测序技术，蛋白重组技术和结晶衍射技术的进展，大量有关抗原的数据库，模型和算法得以建立[7,9]。虽然我们对抗原抗体之间的作用已经了解很多，但是抗原表位的本质是什么？仍然没有定论。对什么样的抗原表位才能诱发人体产生针对自身抗原的免疫反应？针对经常发生变异的病毒如新冠病毒怎么样才能造出“通用”疫苗等的问题，都依赖于我们对抗原表位组成的进一步认识。

以计算机为工具的免疫信息学研究近年来在蛋白质抗原的研究中取得了一定的成果。随着测序技术、计算技术和蛋白质结构分析技术的研究进展，越来越多的生物学数据库得以构建。当大家考虑分析某种特定抗原的表位时，可以通过多肽叠加表达的方法，也可以先通过计算机进行预测，然后再通过生物学实验进一步证实这些表位的功能[11,12]。例如，Guevarra借助计算机分析工具预测了登革热病毒2型NS1抗原的特异性免疫原性表位，并合成模拟肽免疫兔子，发现兔体内产生了可以特异性结合所预测的、根据唯一的DENV2NS1免疫原性表位所合成的模拟表位肽的抗体[13]。Javadi利用计算机模型和免疫信息学工具，设计有效的微生物抗原多表位，特别是汇集多种抗原的免疫原性表位，从而制成高免疫原性的多表位重组抗原；这些研究成果对疾病预防和诊断试剂开发都具有重要意义[14]；目前人们在计算机模拟指导下从各个不同的角度，利用不同的研究手段，针对不同的需求，建立了多种对抗原表位进行改造和设计的方法或在线工具，如ABCpred(Artificianeural networkbased B-cell epitope prediction server)、LBtope(Linear B-cellEpitope Prediction server)、IEDB(The Immune Epitope Database)、BCpred(Prediction of Continuous B-Cell Epitopes)、SVMTriP(Support Vector Machine tointegrate Tri-Peptide)和PEPOP等[15-20]。借助这些工具，近年来，科学家们在2型登革热病毒、寨卡病毒、基孔肯雅病毒、汉坦病毒和弓形虫等微生物的相关表位研究中，将在线工具预测与动物模型验证结合起来取得了不少有意义的研究结果[13,14,21-23]。但由于对抗原表位组成及其特性没有一个统一的认识，迄今为止，并没有确立一个统一的软件编程思路，也没有建立一个大家都公认的多肽抗原表位预测模型。不同的软件只能侧重于从自己认为正确的角度对抗原表位进行分析，这不但提示抗原表位的复杂性，同时也表明对抗原表位本质进行深入研究的迫切性和必要性。而且以上文献的研究成果均是基于抗原本身的氨基酸序列来进行的，从未有利用计算机模拟技术合成与原始蛋白非同源性的多抗原表位多肽来进行抗原表位预测、合并重组或应用的研究报告。

1.Cyster JG,Allen CDC:B Cell Responses:Cell Interaction Dynamics andDecisions.Cell 2019,177(3):524-540.

2.Mix E,Goertsches R,Zett UK:Immunoglobulins--basic considerations.JNeurol 2006,253Suppl 5:V9-17.

3.Slifka MK,Amanna I:How advances in immunology provide insight intoimproving vaccine efficacy.Vaccine 2014,32(25):2948-2957.

4.Benjamin DC:B-cell epitopes:factand fiction.AdvExpMedBiol 1995,386:95-108.

5.

6.Matsuura E,Lopez LR,Shoenfeld Y,Ames PR:β2-glycoprotein I andoxidative inflammation in early atherogenesis:a progression from innate toadaptive immunity？Autoimmun Rev2012,12(2):241-249.

7.Van Blarcom T,Rossi A,Foletti D,Sundar P,Pitts S,Melton Z,Telman D,Zhao L,Cheung WL,Berka J et al:Epitope Mapping Using Yeast Display and NextGeneration Sequencing.Methods MolBiol2018,1785:89-118.

8.Lucchese G,Stufano A,Trost B,Kusalik A,Kanduc D:Peptidology:shortamino acid modules in cell biologyand immunology.AminoAcids 2007,33(4):703-707.

9.Stave JW,Lindpaintner K:Antibody and antigen contact residuesdefine epitope and paratopesizeand structure.JImmunol2013,191(3):1428-1435.

10.Guo C,Xie X,Li H,Zhao P,Zhao X,Sun J,Wang H,Liu Y,Li Y,Hu Qetal:Prediction ofcommon epitopes on hemagglutinin of the influenza A virus(H1subtype).Exp Mol Pathol 2015,98(1):79-84.

11.Kalita P,Padhi AK,Zhang KYJ,Tripathi T:Design of a peptide-basedsubunit vaccine against novel coronavirus SARS-CoV-2.Microb Pathog 2020,145:104236.

12.Sesterhenn F,Yang C,Bonet J,Cramer JT,Wen X,Wang Y,Chiang CI,Abriata LA,Kucharska I,Castoro G et al:De novo protein design enables theprecise induction of RSV-neutralizing antibodies.Science 2020,368(6492).

13.Guevarra LA,Jr.,Boado KJO,

14.Javadi Mamaghani A,Fathollahi A,Spotin A,Ranjbar MM,Barati M,Aghamolaie S,Karimi M,Taghipour N,Ashrafi M,Tabaei SJS:Candidate antigenicepitopes for vaccination and diagnosis strategies of Toxoplasma gondiiinfection:A review.Microb Pathog 2019,137:103788.

15.Demolombe V,de Brevern AG,Felicori L,C NG,Machado de Avila RA,Valera L,Jardin-Watelet B,Lavigne G,Lebreton A,Molina F et al:PEPOP 2.0:newapproaches to mimic non-continuousepitopes.BMCBioinformatics 2019,20(1):387.

16.El-Manzalawy Y,Dobbs D,Honavar V:Predicting linear B-cell epitopesusing string kernels.J MolRecognit 2008,21(4):243-255.

17.Saha S,Raghava GP:Prediction of continuous B-cell epitopes in anantigen using recurrent neural network.Proteins 2006,65(1):40-48.

18.Singh H,Ansari HR,Raghava GP:Improved method for linear B-cellepitope prediction using antigen's primary sequence.PLoS One 2013,8(5):e62216.

19.Vita R,Mahajan S,Overton JA,Dhanda SK,Martini S,Cantrell JR,Wheeler DK,Sette A,Peters B:The Immune Epitope Database(IEDB):2018update.Nucleic Acids Res 2019,47(D1):D339-d343.

20.Yao B,Zheng D,Liang S,Zhang C:SVMTriP:A Method to Predict B-CellLinear Antigenic Epitopes.Methods MolBiol 2020,2131:299-307.

21.Conte FP,Tinoco BC,Santos Chaves T,Oliveira RC,Figueira Mansur J,Mohana-Borges R,Lemos ERS,Neves P,Rodrigues-da-Silva RN:Identification andvalidation of specific B-cell epitopes of hantaviruses associated tohemorrhagic fever and renal syndrome.PLoS Negl Trop Dis 2019,13(12):e0007915.

22.Martini S,Nielsen M,Peters B,Sette A:The Immune Epitope Databaseand Analysis Resource Program 2003-2018:reflections andoutlook.Immunogenetics 2020,72(1-2):57-76.

23.Wang L,Gao J,Lan X,Zhao H,Shang X,Tian F,Wen H,Ding J,Luo L,Ma X:Identification of combined T-cell and B-cell reactive Echinococcus granulosus95antigens for the potential development ofa multi-epitopevaccine.Ann TranslMed2019,7(22):652.

发明内容

为了解决上述问题，本发明提出了一种基于计算机分子模拟进行免疫显性基组合的筛选及其在制备重组多抗原表位肽中的应用；本发明在对多肽抗原表位的研究、分析、认识的基础上，提出了多肽抗原表位是免疫显性基组合、其组合中的各免疫显性基均可以被性质相同的免疫显性基团所取代、多个抗原表位可以合并重组成一个多抗原表位肽的观点。

本发明采用的技术方案为：

一种基于计算机分子模拟技术及抗原表位是关键氨基酸(免疫显性基)组合理论的多抗原表位合并重组方法，该方法实施要先对各单克隆抗体结合抗原表位的关键氨基酸组合进行分析，然后在计算机分子模拟技术的指导下对需要重组的各单克隆抗体结合的关键氨基酸进行合并重组成多抗原表位肽；然后分析各单克隆抗体的可变区氨基酸序列，并通过计算机分子模拟技术对各单抗的可变区构建三维结构模型，并用该模型对每条重组多抗原表位肽进行模拟结合，筛选出与每株单克隆抗体均结合良好的多抗原表位肽，进行生物学实验鉴定，最后用确定的目的多抗原表位肽进行疫苗制备、诊断产品生产或药物研发等后续工作。具体包括如下步骤：

S1、确定要合并重组的单克隆抗体结合表位数，分析每株单克隆抗体结合表位的关键氨基酸组合；

S2、在计算机分子模拟技术指导下，对计划合并的抗原表位的全部关键氨基酸进行合并重组，重组成含多个单抗结合表位的多抗原表位肽；

S3、调取单克隆抗体杂交瘤细胞株的mRNA，逆转录合成cDNA，分别扩增各单抗轻链可变区基因和重链可变区基因，得到单抗可变区氨基酸序列；通过计算机分子模拟技术构建单抗可变区三维结构模型；

S4、通过计算机分子模拟技术让每株单抗均与每条重组多抗原表位肽进行多肽-蛋白对接，模拟进行结合；将分子模拟结合得到的、重组多抗原表位肽与各单抗之间结合能量进行排名，筛选推荐可能与每株单抗均结合良好的重组多抗原表位肽序列；

S5、对筛选推荐的多抗原表位肽进行多肽合成和生物学鉴定，以确定是否符合设计要求。

所述S1中，分析每株单克隆抗体结合表位的关键氨基酸组合采用丙氨酸逐个扫描替换多肽中的氨基酸，然后合成丙氨酸替换肽，ELISA阻断实验计算抑制指数，根据抑制指数确定被替换的是否为关键氨基酸。

用ELISA阻断方法检测多肽中替换掉的氨基酸对多肽与单抗结合的影响大小；替换的氨基酸对多肽与抗体的结合影响大，说明被替换了的氨基酸在多肽与抗体的结合中发挥较大作用，是发挥重要作用的氨基酸，为关键氨基酸；否者为非关键氨基酸。

所述S2中，通过计算机分子模拟技术对各抗体结合的关键氨基酸随机重组出多条多抗原表位肽(由于要合并的单抗结合表位数不同，而重组的多抗原表位肽数目多少也不同)，再基于多肽理化性质和几何片段相似性，进行排名；如本专利一个实施例中所示，开始对各抗体结合的关键氨基酸随机重组出4608条多肽，最后排名得到具备同时与6株单抗潜在结合活性位点的人工重组多抗原表位肽61条；

所述S3中，在RCSB PDB蛋白质晶体数据库挑选出与各单抗氨基酸序列相似度最好的晶体蛋白，作为同源模建的模板，利用同源建模软件Modeller，构建各单抗可变区三维结构模型。

所述S4中，利用UCSF Chimera软件，构建各单抗靶抗原肽的三维结构。利用Rosetta软件，将各单抗分别与S2步骤中排名靠前的多抗原表位肽进行多肽-蛋白对接，筛选出与每株单抗均具有较好结合活性、排名靠前的多肽进行多肽合成和生物学验证；例如在本发明一个实施例中，通过模拟6株抗体可变区分别与61条多抗原表位肽结合后，得到与每株单抗结合的亲和力均大于-8.0Kcal/mol的重组多抗原表位肽6条。

所述S5中，筛选推荐的重组多抗原表位肽还需要对其与每株单抗的结合活性、对抗体与靶抗原结合的阻断作用、与抗体结合的交叉反应性及其它一些设计目的所需要的生物学指标等进行实验室评价，筛选出评价结果较好、符合设计目的的多抗原表位肽进行进一步研究或应用

进一步地，所述S2中，通过计算机分子模拟技术对单抗结合的关键氨基酸组合的氨基酸进行拆分、合并、重新组合的步骤包括：

StepA:利用Cd-hit软件对各单抗结合抗原表位肽的关键氨基酸进行序列相似性匹配；

Step B:根据氨基酸几何形状以及理化性质，将各单抗结合抗原表位肽进行全局性理化性质匹配；

Step C:几何构型相似性匹配；

Step D:相似性氨基酸匹配；

Step E:对随机重组的成千上万个多抗原表位肽，基于理化性质和几何片段相似性，进行打分排名，最后得到数十或数百条具备同时与多株单抗潜在结合活性位点的多抗原表位肽。

本发明中的“关键氨基酸”是指抗原上与抗体结合时发挥关键作用的氨基酸；“抗原表位”是把抗原上与抗体结合的部分看成一个整体、一个抗原上的局部结构；“关键氨基酸组合”则是把抗原上与抗体结合的部分看成是几个共同发挥作用的氨基酸、或其上一些基团的组合。

获得的具备诱导抗流感HA免疫反应的重组多抗原表位肽，其序列为ILLWVLSHL。

所述筛选方法在寻找虽结构或序列不同，但诱发的抗体功能相近的抗原表位中的应用。

所述筛选方法在制备多肽疫苗、多价疫苗或者多肽药物中的应用。

所述多抗原表位合并重组的方法，在把筛选抗体换为病毒的受体蛋白时，就可对多种病毒的中和表位进行重组制备多价疫苗；对像新冠病毒、HIV病毒等中和抗原表位免疫原性较弱的病毒的中和表位进行重组，根据抗体的交叉反应理论，从而可以研发出能很容易刺激出病毒相应中和抗体的多肽疫苗；同样也可以通过该方法筛选研发出免疫原性较弱的多肽药物。

一种人工重组多抗原表位肽的获得方法，将反应特性不同的目标病毒蛋白的单抗与其结合的多肽作为研究对象，在计算机分子模拟技术的指导下，对单抗分别在目标病毒抗原多肽上结合的关键氨基酸组合进行拆分、合并重组，并以单抗可变区为模板对重组多抗原表位肽进行筛选，获得人工重组多抗原表位肽。

重组多抗原表位肽筛选，通过计算机分子模拟技术对单抗结合的关键氨基酸组合的氨基酸进行拆分、合并、重新组合；并把重新组合的多抗原表位肽与单抗的可变区建模结构进行模拟结合，筛选出可能与单抗结合良好的重组多抗原表位肽；

以流感病毒为例，说明上述基于计算机分子模拟技术的多抗原表位合并重组的方法，包括如下步骤：

1)从流感病毒HA蛋白上截取的2条多肽，多肽1：191-LVLWGIHHP-199；多肽2：93-WSYIVE-98，确定关键氨基酸；

2)在计算机分子模拟技术指导下，对计划合并的抗原表位的全部关键氨基酸进行合并重组，重组成含多个单抗结合表位的多抗原表位肽；

3)以与目标病毒抗原结合的杂交瘤细胞的mRNA，逆转录合成cDNA，作为后续基因克隆的模板；分别扩增单抗轻链可变区基因和重链可变区基因，得到氨基酸序列；计算机分子模拟技术构建单抗可变区三维结构模型；在RCSB PDB蛋白质晶体数据库挑选出与各单抗氨基酸序列相似度最好的晶体蛋白，作为同源模建的模板，利用同源建模软件Modeller，构建各单抗可变区三维结构模型。

4)计算机分子模拟技术分析单抗与多肽片段进行蛋白蛋白对接；将筛选得到的重组多抗原表位肽利用Rosetta软件分别与单抗进行蛋白-多肽对接，并得到多肽与各单抗之间结合能量，排名，选取与单抗均具有较好结合活性排名靠前的多肽；利用Rosetta软件，将6株单抗分别与多肽WSYIVE和LVLWGIHHP进行蛋白蛋白对接，蛋白蛋白对接采用全局对接的方法，以受体蛋白为球状系统的中心，将多肽平均地分布在球面多肽结合口袋上；

5)、以表面可接近性、亲水性和亲和力为指标，筛选出与单抗结合良好的重组多抗原表位肽。

步骤2)中，通过计算机分子模拟技术对单抗结合的关键氨基酸组合的氨基酸进行拆分、合并、重新组合的步骤包括：

StepA:利用Cd-hit软件对二肽LVLWGIHHP和WSYIVE关键氨基酸进行序列相似性匹配；

Step B:根据氨基酸几何形状以及理化性质，将多肽LVLWGIHHP和WSYIVE进行全局性理化性质匹配；

Step C:几何构型相似性匹配；

Step D:相似性氨基酸匹配；

Step E:对4608个多肽，基于理化性质和几何片段相似性，进行打分排名，最后得到61条人工组合多肽，具备同时结合6株单抗活性位点的潜力。

经过上述步骤，筛选获得诱导抗流感HA免疫反应的重组多抗原表位肽，序列为ILLWVLSHL、LLIWVLSHL、ILIWVLSHI、ILIWVLSHV、ILIWVISHL、ILIWVLSHL。

一般认为，抗原表位是抗原发挥免疫功能的最小功能单位，它是一个整体。抗原表位与抗体的结合就像钥匙与锁，是一对一的关系，抗原表位由此决定了抗原的特异性。经典免疫学认为，B细胞通过其表面的B细胞受体识别来自天然抗原的线性表位或者空间表位，这些表位的组成是特异性的，而且在B细胞表位、尤其是线性表位确认过程中，一般是依据抗原本身的氨基酸序列，这也是目前疫苗设计的理论依据。本研究组研究发现，抗流感病毒HA蛋白的几株单抗定位在同一条肽段上，但这些单抗可变区的氨基酸序列并不相同，表明这些单抗不是一个杂交瘤细胞分泌的；而且结合同一肽段的3株单抗反应特性并不相同，提示3株单抗在同一条短肽上结合的可能不是同一个抗原表位；也就是说该肽段虽短，可能也组成了一个以上的抗原表位。通过丙氨酸扫描氨基酸替换方法对抗体结合表位的分析发现，各单抗结合的关键氨基酸组合之间都存在1-2个氨基酸的差异，提示结合同一条短肽的3株单克隆抗体反应特性不同的原因可能是其结合的关键氨基酸组合的差异性造成的，也就是说这些抗体可能是由不同的关键氨基酸组合刺激产生的。这一结果表明，多肽抗原的基本功能单位——抗原表位可能就是关键氨基酸的组合。

为验证一个小分子短肽是不是可以组成多个抗原表位，我们分别对来自流感病毒HA蛋白的2条肽段LVLWGIHHP、WSYIVE进行单克隆抗体制备；结果发现它们刺激产生的单克隆抗体有的可以与HA抗原反应，有的不与HA抗原结合，而且与HA抗原结合的那些单抗之间和不与HA抗原结合的那些单抗之间反应特性也不相同，提示一个6肽的小分子，可能也组成了多个不同的抗原表位。这些结果提示，抗原表位可能不是一个固定的结构，而是一个由多个氨基酸基团(这些发挥免疫刺激作用的基团被称为免疫显性基)组成的一个免疫显性基组合；如果是这样，那组成抗原表位的关键氨基酸组合中的基团可能就可以用性质相同或相似的基团替换；也就是说组成抗原表位的关键氨基酸组合也许可以被拆分和重新组合。

在如此短的肽段上都集中了至少3个以上的单抗结合表位，这表明抗原表位组成的复杂性。上述研究结果表明，小分子多肽与抗体的结合实际上就是多肽链上的氨基酸(基团)与抗体可变区氨基酸残基上基团的相互作用，它们能否结合取决于它们相互之间的表面可接近性和亲和力；如果满足这些条件，多肽中发挥免疫显性作用的基团可以以不同的组合与不同的抗体结合。也就是说，多肽中氨基酸的基团在免疫时均可以作为免疫显性基发挥作用，这些免疫显性基可以以不同的组合作为不同的抗原表位发挥免疫刺激作用，至于这些组合中哪个或哪几个组合发挥免疫刺激作用则取决于免疫细胞的选择。

本研究组在对多肽抗原表位的前期研究、分析、认识的基础上，提出了多肽抗原表位是免疫显性基组合、其组合中的各免疫显性基均可以被性质相同的免疫显性基团所取代、多个抗原表位可以合并重组成一个多抗原表位肽的观点。为验证该观点的正确性，本研究通过计算机分子模拟技术，对6株单抗各自结合的关键氨基酸组合进行拆分、合并重组成一条多抗原表位肽。对6株单抗的可变区进行蛋白质结构同源建模，并在计算机分子模拟技术的指导下对重组多抗原表位肽与6株单抗的结合活性进行分析；证明部分重组多抗原表位肽序列虽然与多肽LVLWGIHHP、WSYIVE的序列不同，但重组多抗原表位肽上的确携带有可以与6株单抗结合的抗原表位；用BSA标记重组多抗原表位肽ILLWVLSHL常规免疫小鼠后，诱导出了较强的抗多肽LVLWGIHHP、WSYIVE和H1N1流感病毒抗原的抗体。由此证明两条多肽和H1N1抗原HA蛋白上的抗原表位，都以6株单抗为模板，转移到了重组多抗原表位肽上，也就是说多抗原表位肽上存在与2条多肽和H1N1流感病毒抗原相似的抗原表位。重组多抗原表位肽免疫血清的抗流感病毒H1N1抗原的抗体效价比抗多肽LVLWGIHHP、WSYIVE的抗体效价都高的结果似乎提示，重组多抗原表位肽ILLWVLSHL上携带的与流感病毒H1N1抗原上的相同抗原表位比LVLWGIHHP、WSYIVE两条多肽各自单独携带的相同抗原表位多。由此我们建立了一个在计算机分子模拟技术指导下进行多抗原表位合并重组、以抗体可变区为模板对多抗原表位进行筛选的方法；而且证明携带多抗原表位的重组肽在免疫时还能很好地展示其免疫原性。

本研究提出了多肽抗原表位是免疫显性基组合的概念，该概念认为：抗原表位是免疫显性基的组合，组合中的免疫显性基可以来自相邻的氨基酸，也可以是来自不相邻的、在蛋白质的氨基酸序列中相距较远的氨基酸；这些免疫显性基聚集在一起可以以不同的组合与不同的免疫细胞结合，发挥不通的免疫刺激作用；至于哪一种免疫显性基组合发挥免疫刺激作用，完全取决于免疫细胞上抗原受体的选择。

另一方面，我们通过计算机分子模拟技术合成了能诱导产生抗流感病毒HA抗体的与流感病毒抗原氨基酸序列不通的多肽，这种新理念的建立及实践，为多肽疫苗、多价疫苗和多肽药物的研发提供了新的理论和应用研究思路。2019年底开始流行的新冠病毒在传播过程中病毒关键部位氨基酸的突变影响疫苗免疫效果，我们的单肽负载多表位的理念将有利于新型新冠疫苗的设计和应用。此外，本文的方法还可以被用于其他研究，如在研究自身免疫病方面，我们将抛弃以前在现存抗原表位库与人体自身抗原表位找对应关系的尝试，利用免疫显性基组合的概念来找虽结构或序列不同，但诱发的抗体功能相近的抗原表位。另外，我们的方法还可以在肿瘤相关(特异性)抗原发现与后续疫苗开发，多肽相关新型诊断表位确认以及多肽药物研发等方面加以利用。

本发明所述筛选方法在制备多肽疫苗、多价疫苗或者多肽药物中的应用，具体地，例如针对新冠病毒的易变异性，采用本发明的方法，把新冠病毒重要的Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron五种亚型病毒各自与ACE2结合所使用的关键氨基酸组合，在计算机分子模拟技术的指导下进行拆分、重新组合成很多条多抗原表位肽，然后用它们各自结合的ACE2受体蛋白晶体模型与每条多抗原表位肽进行模拟结合，筛选出能与ACE2受体结合的各种多肽，标记载体，免疫小鼠，通过生物学中和试验对免疫血清进行检测，确定能同时阻断五个主要亚型病毒与ACE2结合、效价较高的血清，用制备该血清的多抗原表位肽做新冠病毒疫苗，即可研发出针对五种新冠病毒亚型、抗原性较强的多价疫苗。

针对免疫原性较弱，接种后不易刺激接种者产生中和抗体，或产生的中和抗体维持时间较短的新冠病毒疫苗、HIV疫苗等，可以通过对天然疫苗进行重组改造。如对与ACE2受体蛋白结合的、新冠病毒S蛋白刺突上的16个氨基酸，在计算机分子模拟技术的指导下进行序列重组，然后用ACE2受体蛋白对重组多肽进行模拟结合，筛选出与受体蛋白结合良好的重组多肽，然后对重组多肽进行载体标记，常规免疫动物，检测免疫血清中对新冠病毒中和抗体效价的高低，选出能刺激高效价中和抗体的重组多肽制备疫苗，即可达到预防新冠病毒感染、阻止新冠病毒传播的目的。

有益效果：

本发明利用计算机模拟技术合成与原始蛋白非同源性的多抗原表位多肽来进行抗原表位预测、合并重组，首次提出抗原表位是免疫显性基的组合，其组合中的各免疫显性基均可以被性质相同的免疫显性基团所取代、多个抗原表位可以合并重组成一个多抗原表位肽。本发明建立了一个在计算机分子模拟技术指导下进行多抗原表位合并重组、以抗体可变区为模板对多抗原表位进行筛选的方法；而且证明携带多抗原表位的重组肽在免疫时还能很好地展示其免疫原性，这种新理念的建立及实践，为多肽疫苗、多价疫苗和多肽药物的研发提供了新的理论和应用研究思路。

附图说明

图1、计算机模拟重组多肽流程图；

图2、mAbs单抗与各多肽分子间结合模式图及分子间相互作用的能量(kcal/mol))；mAbs单抗：浅青色；多肽：蓝色；单抗与多肽间0.4nm范围内氨基酸为相互作用重点氨基酸；

图3、重组多抗原表位肽对单抗与流感病毒抗原结合的阻断作用；图注：图中各线条显示的是每条重组多抗原表位肽对每株单抗与流感病毒抗原结合的阻断效果。从图中的结果看，XH-001和XH-006对每株单抗均具有较好的阻断作用

具体实施方式

实施例1

1.材料:

1)流感病毒毒株：甲型H1N1流感病毒裂解疫苗(A/reassortant/NYMCX 179A(California/07/2009xNYMC X 157)(H1N1))(国药准字S20090015)，购自华兰生物疫苗有限公司；季节性H1N1(A/Brisbane/59/2007(H1N1))，H1N1的501毒株、Pr8毒株抗原由本实验室自制，H3N2型流感疫苗(A/Victoria/210/2009(H3N2))由大连雅立峰生物技术有限公司惠赠；H5N1(A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1))兽药生字(2009)；H7N2抗原由中国动物疫病预防控制中心惠赠；H7N2和H7N9抗原由中国疾病预防控制中心惠赠。

2)抗体：本文所用6株单抗，包括A1-10、H1-74、H1-84、H1-5、H1-16、H1-81等均为本实验室参考文献制备的抗甲型H1N1流感病毒HA蛋白单克隆抗体【Guo C,Xie X,Li H,ZhaoP,Zhao X,Sun J,Wang H,LiuY,LiY,Hu Q etal:Prediction of common epitopes onhemagglutinin ofthe influenzaAvirus(H1 subtype).Exp MolPathol 2015,98(1):79-84】；HRP标记的山羊抗小鼠二抗(cat.no.B141027)购自中杉金桥公司。

3)多肽：实验用所有多肽均由上海强耀生物公司合成，产品经HPLC、MS检测纯度>85％。从流感病毒HA蛋白上截取的2条多肽：多肽1，191-LVLWGIHHP-199；多肽2，93-WSYIVE-98。以这2条多肽为模板，用丙氨酸逐个替换多肽中的氨基酸，合成丙氨酸替换肽。

4)其他试剂：细胞培养用牛血清(cat.no.16000-044)购自杭州四季青生物工程材料有限公司，总RNA提取试剂盒(cat.no.DP433)，cDNA第一链合成试剂盒(cat.no.KR104)及DH5a感受态细胞(cat.no.CB101),>10

2.抗原表位关键氨基酸的确定

1)抗原抗体反应及间接ELISA实验

在4℃条件下分别包被2009年甲型H1N1流感病毒裂解疫苗、H1N1501株和Pr8株、季节性流感病毒H3N2疫苗、禽流感H5N1、H7N2病毒、H7N9病毒、交联多肽等多种抗原过夜；洗涤后分别加入杂交瘤细胞培养上清原液作为一抗，同时以尿囊液和SP2/0上清液作为阴性对照，37℃反应1h；洗涤后加入HRP标记的羊抗小鼠二抗(1:2500稀释)，37℃反应1h。洗涤后，加入TMB显色液显色，ELISA读数仪上测定A450nmOD值，以阳性/阴性(P/N)>2.5为阳性结果。

2)丙氨酸扫描肽设计与制备

对多肽LVLWGIHHP和WSYIVE的氨基酸分别用丙氨酸逐一扫描替换，然后合成丙氨酸替换扫描肽(由上海强耀生物公司合成两条抗原肽的丙氨酸替换扫描肽)，共17条(见表1)。

表1、HA蛋白的丙氨酸扫描替代肽序列

3)关键氨基酸的确定及ELISA阻断实验

在96孔ELISA板上包被H1N1流感病毒HA抗原，包被浓度为2-5ug/ml，4℃包被过夜，洗涤、封闭备用。将适当稀释度的单抗，先分别与各种多肽反应，37℃作用1h，然后将其加入到预先包被HA的ELISA板上，后面按常规间接ELISA操作步骤进行，最后加入TMB显色液显色，ELISA读数仪上测定A450nmOD值；根据各孔OD450nm值按公式计算抑制指数：抑制指数IR＝(未加多肽对照组OD值-加多肽实验组OD值)/未加多肽对照组OD值。抑制指数≤40％表明该抗原肽与抗体结合活性弱，抗原肽中被替换的氨基酸为关键氨基酸；抑制指数在40％-80％之间表明抗原肽与抗体有一定的结合活性，说明被替换的氨基酸对抗体与抗原的结合有一定的影响；抑制指数≥80％表明抗原肽与抗体结合活性强，被替换的氨基酸不影响抗原肽与抗体的结合，被替换的为非关键氨基酸。

3.单抗结构及其与多肽的相互作用分析

1)单抗的可变区基因测序

参照文献的方法

2)单抗可变区三维结构模型的构建及其与多肽的相互作用

在RCSB PDB蛋白质晶体数据库挑选出与各单抗氨基酸序列相似度最好的晶体蛋白，作为同源模建的模板，利用同源建模软件Modeller，构建各单抗可变区三维结构模型。

利用UCSF Chimera软件，构建多肽WSYIVE和LVLWGIHHP三维结构。利用Rosetta软件，将6株单抗分别与多肽WSYIVE和LVLWGIHHP进行蛋白蛋白对接。对接采用全局对接的方法，以受体蛋白为球状系统的中心，将多肽平均地分布在球面多肽结合口袋上。Rosetta中进行对接包含两个步骤：(1)用围绕受体活性位点的氨基酸残基形成一个范围更大的对接结合位点，然后用不同类型的原子作为探针进行扫描，计算格点能量；(2)对配体在Box范围内进行构象搜索，最后根据配体的不同构象、方向、位置及能量进行评分，并最终对结果进行排序。(3)对100个多肽体系，分别进行蛋白-多肽分子对接，得到100个对接位相，并进行能量排名。挑选WSYIVE和LVLWGIHHP与6株抗体蛋白结合能量最低的位相，作为各体系的最佳代表，用于后续分析。

3)载体蛋白BSA和KLH偶联小分子多肽以及单克隆抗体制备

采用EDC活化剂(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)活化多肽羧基端，然后与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)或钥孔戚血蓝素(KLH)偶联(交联方法由上海强耀生物公司提供)。

以羧基端交联BSA的多肽LVLWGIHHP和WSYIVE为免疫原，与弗氏完全佐剂乳化混匀，皮下免疫BALB/c小鼠，20～25μg/只。3周后，用与初次免疫相同剂量和弗氏非完全佐剂加强免疫2～3次；融合前3天，用不含佐剂的抗原腹腔追加免疫。分别进行细胞融合及阳性杂交瘤细胞克隆的筛选，细胞融合参见文献

4.多抗原表位肽的重组及筛选及功能测试

1)重组多抗原表位肽

通过计算机分子模拟技术对6株抗流感病毒单抗结合的6个关键氨基酸组合的氨基酸进行拆分、合并、重新组合；并把重新组合的多抗原表位肽分别与6株单抗的可变区建模结构进行模拟结合，以表面可接近性、亲水性和亲和力为指标，筛选出可能与6株单抗都结合良好的人工重组多抗原表位肽。详细流程如下：

通过计算机分子模拟技术对6株单抗分别与LVLWGIHHP、WSYIVE 2条多肽结合的关键氨基酸进行混合重组，形成合并抗原表位的人工重组多抗原表位肽

StepA:利用Cd-hit软件对二肽LVLWGIHHP和WSYIVE关键氨基酸进行序列相似性匹配，各抗体上多肽氨基酸序列及活性氨基酸位点如下：

(1)A1-10:LVLWGIHHP

(2)H1-84:LVLWGIHHP

(3)H1-74:LVLWGIHHP

(4)H1-16:WSYIVE

(5)H1-81:WSYIVE

其中，单抗A1-10、H1-84、H1-74在多肽上结合的共有关键氨基酸(占比>60％)区域为：LVLWGIHHP；单抗H1-5、H1-16、H1-81多肽上结合的共有关键氨基酸(占比>60％)为：WSYIVE。

Step B:根据氨基酸几何形状以及理化性质，将多肽LVLWGIHHP和WSYIVE进行全局性理化性质匹配，得到共计559832个LVLWGIHHP氨基酸组合，WSYIVE随机组合共计1728个。将1728个WSYIVE氨基酸片段与559832个LVLWGIHHP个氨基酸进行序列相似度排名，发现由于WSYIVE中SYE的问题，两者之间的序列相似度都不能达到50％，因此无法进行相似度匹配打分。

Step C:几何构型相似性匹配。WSYIVE肽段中E为negative charged氨基酸，其与LVLWGIHHP上的H(positive charged)氨基酸电负性完全相反，因此将其最终放在组合肽段的两侧，或者直接删除并在序列匹配中将其筛出不进行匹配。WSYIE中，由于SY两者与LVLVWGIHHP中任何一个氨基酸都不存在关联性，因此需要将该氨基酸进行重点刨析，在几何构型上与F、W极为类似，同时含有较好的疏水性侧链基团，因此可以将Y相似性列表中加入W。在氨基酸中S含有较好的侧链羟基基团，即-OH，该氨基酸只与LVLWGIHHP中的H氨基酸存在共性，即都可以作为电子受体产生极性氢键。

通过上述序列组合，可以得到共计2239488个LVLWGIHHP氨基酸组合，WSYIVE随机组合共计3888个。将3888个WSYIVE相似肽段与2239488个LVLWGIHHP氨基酸进行序列相似度排名。而通过序列比对取交集的方法，发现几乎所有的氨基酸都被囊括在PHHIGWLVL，因此还需要进一步缩小蛋白质氨基酸序列相似性范围。

Step D:相似性氨基酸匹配。将至少理化性质强于或相似性氨基酸替代多肽中氨基酸，提高组合片段亲和力，或者保持当前亲和力。通过理化性质、几何片段大小(氨基酸基团体积大小)对相似性氨基酸替代，进行更加细致的分化。经过层层筛选，WSYIVE多肽中的氨基酸随机组合与LVLWGIHHP随机组合片段均有重叠，共计4608枚预测氨基酸。

Step E:对4608个多肽，基于理化性质和几何片段相似性，进行打分排名，最后得到61条人工组合多肽，具备同时结合6株单抗活性位点的潜力。

2)与各单抗都结合的重组多抗原表位肽筛选及构建

首先通过计算机分子模拟技术对各抗体结合的关键氨基酸随机重组出4608条多肽，再基于理化性质和几何片段相似性，进行打分排名，最后得到同时与6株单抗均具有潜在结合活性位点的人工重组多抗原表位肽61条，将61条人工重组多肽，利用Rosetta软件分别与单抗进行蛋白-多肽对接，并得到61条多肽与各单抗之间结合能量。蛋白质与多肽平均相互作用能，包括静电能、范德华能、模糊的相互作用约束能三项能量值，得到蛋白质与多肽间结合能量并综合排名，最终得到6条与单抗均具有较好结合活性排名靠前的多肽，分别为ILLWVLSHL、LLIWVLSHL、ILIWVLSHI、ILIWVLSHV、ILIWVISHL和ILIWVLSHL。再通过生物学实验对它们与6株单抗的阻断作用、结合活性、与抗体结合的非特异性等进行评价，选出一条多抗原表位肽进行进一步鉴定。

3)免疫血清制备及鉴定

将标记BSA的重组多抗原表位肽ILLWVLSHL与弗氏完全佐剂乳化均匀，皮下免疫BALB/c小鼠，30～50μg/只；4周后，将标记BSA的重组多抗原表位肽与弗氏不完全佐剂乳化均匀，用与初次免疫相同剂量加强免疫2～3次；间隔两周，最后用不含佐剂的抗原腹腔追加免疫，尾静脉采血制备抗血清。采用间接ELISA方法，分别包被KLH标记的重组多抗原表位肽及H1N1流感病毒抗原，用5％的脱脂奶粉4℃封闭过夜后洗涤备用。以获得的免疫血清作为一抗，同时以正常鼠血清作为对照，二抗为HRP标记的羊抗小鼠二抗(1:2500稀释)，同上按常规间接ELISA方法进行操作。以P/N>2.5为阳性结果，从而确定免疫血清的效价。

结果

结合同一条短肽的单抗反应特性不相同

本研究中将这6株单抗分别与2009年甲型H1N1流感病毒裂解疫苗、流感病毒H1N1的501、PR8、H3N2、H5N1、H7N2、H7N9等病原体进行ELISA反应，同时以SP2/0细胞培养上清液作为阴性对照，具体结果见表2。

表2结合同一短肽的单抗与不同抗原反应特性的鉴定结果

注：表中数值是实验组ELISA检测OD值与SP2/0对照组OD值的比值(SP2/0OD值小于0.05时以0.05计)，P/N≥2.5结果判定为阳性；实验设置3个复孔。

从表2的结果可以看出，虽然A1-10、H1-74、H1-84识别同一个表位肽LVLWGIHHP，但是这3株单抗与抗原501，H5N1，H7N2的反应特性并不相同。另外识别表位肽WSYIVE的H1-5、H1-16、H1-81单抗与PR8，H7N2的反应也不相同，提示它们结合的抗原表位并不相同。

识别同一条短肽的单抗结合的关键氨基酸组合不相同

将2条多肽(LVLWGIHHP、WSYIVE)分别合成其丙氨酸扫描替换肽；然后将丙氨酸扫描替换肽分别与上述单抗反应，观察各肽段分别对已定位的单克隆抗体与HA抗原反应的阻断作用，通过测定OD值，计算阻断率，各单抗在多肽上结合的关键氨基酸组合见表3-A和B。

表3.单抗各自结合的关键氨基酸组合差异性比较

表注：表中展示了多肽与不同的单抗结合时，多肽上都有哪些氨基酸对与抗体结合发挥了关键作用。实验结果重复3次(N＝3)。

表3的结果显示，虽然A1-10、H1-74、H1-84同时识别多肽LVLWGIHHP，但它们识别的关键氨基酸并不相同，除V192,L193,W194,I196为3株单抗识别的共同骨架外，A1-10和H1-74还共同识别关键氨基酸L191，它们识别抗原表位的差异在于前者识别的关键氨基酸组合中还有H197、而后者则有P199；而H1-84识别的关键氨基酸组合比H1-74少了一个L191，其它均与H1-74相同(见表3-A)。H1-5、H1-16、H1-81同时与多肽WSYIVE结合，它们各自结合的都是4个关键氨基酸；H1-16与H1-81识别的4个关键氨基酸组合之间有一个氨基酸不同，一个用的是I96，另一个用的是V97，其它3个关键氨基酸都相同；而H1-5结合的4个关键氨基酸中只有W93与其它两个抗体结合的关键氨基酸组合共用，I96与H1-16共用，其它2个关键氨基酸与另外两个抗体结合的关键氨基酸均不相同(表3-B)。可见，这6株单抗各自识别的是6个不同的关键氨基酸组合，这可能就是6株单抗反应特性不同的原因。与此同时，表4中6株单克隆抗体的轻、重链可变区氨基酸组成表明，与同一条短肽结合的3株单抗并不是由同一株杂交瘤细胞所分泌，见表4。

表4 6株mAb重链和轻链氨基酸序列测序结果

/>

表注：表4中6株单克隆抗体的轻、重链可变区氨基酸组成表明，与同一条短肽结合的3株单抗并不是由同一株杂交瘤细胞所分泌。

6株单抗的计算机分子模拟同源建模及其与2条多肽的相互作用分析

我们进一步对6株单抗的重链和单链进行序列比对，发现在RCSB PDB晶体数据库中均不含有100％序列相似度蛋白结构，为此我们对各单抗体系蛋白结构进行了同源建模(建模模板如表5所示)。同源建模中，蛋白质氨基酸序列相似度阈值为30％，相似度越高，建模结构可靠性越高。其中，A1-10、H1-74、H1-84、H1-5、H1-16和H1-81单抗同源建模模板序列相似度均大于77％，建模模板高度可靠。

表5、各单抗体系蛋白结构同源建模

/>

表注：表内展示了6株单抗可变区建模各自使用的模板与单抗本身序列的相似性有多大，体现的是后续在与多肽模拟结合时其获得数据的可靠性

通过Rosetta软件，我们将6株单抗分别与两条多肽(LVLWGIHHP和WSYIVE)进行蛋白-蛋白对接，分别取各体系对接位相中结合能量最低的构象，相互作用能量与对应结合模式如表6和图2所示。多肽LVLWGIHHP与A1-10、H1-74和H1-84单抗上的多个氨基酸之间，能形成致密的结合界面网络，进而形成很好的极性相互作用与疏水性结合。这三者之间的结合能量相差不大，在-20.7、-21.9、-22.8kcal/mol区间小范围浮动，具备较好的结合能量。多肽WSYIVE相较于LVLWGIHHP序列较短，因此H1-5、H1-16和H1-81与单抗体之间形成结合界面的氨基酸相对较少，但多肽与各个抗体上结合口袋依然能够形成较好的极性与疏水性结合匹配，能量分别为-14.63、-15.98和-15.40kcal/mol。表6中小分子多肽与抗体相互作用的键能分析结果基本与表3-B各抗体与小分子多肽WSYIVE结合的关键氨基酸分析结果一致(其键能为抗体上多个氨基酸残基与多肽上的其中一个关键氨基酸相互作用的合力)；小分子多肽上的每个关键氨基酸都同时与单抗可变区上的多个氨基酸残基相互作用。

表6A、多肽WSYIVE上的每个氨基酸与三株单抗可变区氨基酸残基结合的键能

表注：表内结果显示，抗原表位肽上的每个氨基酸，都可与抗体可变区中的多个氨基酸残基相互作用；而且抗原表位肽上的同一个氨基酸在与不同的抗体结合时，其结合的是抗体可变区上不同的氨基酸残基组合。

表注：表内结果显示，抗原表位肽上的每个氨基酸，都可与抗体可变区中的多个氨基酸残基相互作用；而且抗原表位肽上的同一个氨基酸在与不同的抗体结合时，其结合的是抗体可变区上不同的氨基酸残基组合。

2条多肽LVLWGIHHP、WSYIVE存在流感病毒的抗原表位

通过传统杂交瘤融合和筛选技术对2条多肽LVLWGIHHP、WSYIVE分别制备单克隆抗体16株和10株，用两条多肽分别对新获得的单抗进行阻断实验后，得到结合活性能分别被上述短肽完全阻断的单克隆抗体均剩7株，分别对各自的7株单抗进行反应特性分析发现，新制备的抗这2条多肽的单克隆抗体中，分别有1株和7株单抗可与不同亚型的流感病毒抗原反应(见表7、表8)，表明这2条多肽上都存在流感病毒的抗原表位。抗LVLWGIHHP的单抗中只有LP-9-6与流感病毒H1N1和A3的抗原反应，表明该多肽至少组成了两个抗原表位，一个与流感病毒H1N1和A3抗原上的某个表位相同，另一个则与其不同。而在抗WSYIVE的单抗中，看起来虽然7株单抗均与某些亚型的流感病毒抗原反应，但除WE-6-11、WE-6-12、WE-6-16三株单抗的反应特性基本相同外，其它4株单抗的反应特性彼此均不相同，提示该多肽组成了多个抗原表位。

表7抗LVLWGIHHP的单抗与免疫原及流感病毒抗原的反应特性鉴定

注：表中数值是实验组ELISA检测OD值与SP2/0对照组OD值的比值(抗体和SP2/0阴性对照使用的均是细胞培养上清，阴性对照OD值小于0.05时以0.05计)，P/N≥2.5结果判定为阳性；实验设置3个复孔。

表8抗WSYIVE的单抗与免疫原及流感病毒抗原的反应特性鉴定

注：表中数值是实验组ELISA检测OD值与SP2/0对照组OD值的比值(抗体和SP2/0阴性对照使用的均是细胞培养上清，阴性对照OD值小于0.05时以0.05计)，P/N≥2.5结果判定为阳性；实验设置3个复孔。

通过计算机分子模拟技术获得的重组多肽ILLWVLSHL诱导抗流感病毒HA抗原免疫反应

我们对6株单抗结合的关键氨基酸进行重组，得到61条可能含有6株单抗结合表位的重组多抗原表位肽，通过分子对接方法获取61条人工重组多肽与6株单抗蛋白间结合能排序，从而得到与每株单抗结合的亲和力均大于-8.0Kcal/mol的重组多抗原表位肽6条。结果见表9。从表中可以看出，6株单抗与重组多肽ILLWVLSHL、LLIWVLSHL、ILIWVLSHI、ILIWVLSHV、ILIWVISHL、ILIWVLSHL的能量打分均明显降低，表明6条重组多肽均具备与6株单抗同时结合的潜在活性，说明这几条重组多抗原表位肽上携带有6株单抗的靶抗原表位，可以用于后续分析。

表9计算机推荐的6条重组多抗原表位肽序列及与抗体结合的亲和力

用6条重组多抗原表位肽分别对6株单抗与流感病毒抗原的结合进行阻断实验，结果见图3所示，多抗原表位肽XH-001：ILLWVLSHL和XH-006:ILIWVLSHL对6株单抗与抗原结合的抑制率均在0.8以上；其它多肽对6株单抗与抗原结合的抑制率均在0.4以下或0.4-0.8之间；多抗原表位肽ILLWVLSHL和ILIWVLSHL能同时阻断6株单抗与流感病毒抗原的结合，表明该多抗原表位肽上携带有能与6株抗体都结合良好的抗原表位。

为了排除实验中的非特异反应，我们对阻断实验筛选出的2条重组多抗原表位肽与6株单抗的特异性反应和无关单抗的交叉反应情况进行了分析，结果显示，标记载体蛋白后多抗原表位肽XH-001ILLWVLSHL上6株单抗结合的抗原表位保存较好(见表10)，而多抗原表位肽XH-006上单抗H1-74、H1-84、H1-5、H1-81结合的表位在实验的某些环节上丢失了，为此我们选择多抗原表位肽XH-001进行下一步的动物免疫实验。

表10重组多抗原表位肽与6株单抗的特异性反应和无关单抗的交叉反应情况

注：表中数值是实验组ELISA检测OD值与SP2/0对照组OD值的比值(SP2/0OD值小于0.05时以0.05计)，P/N≥2.5为阳性；实验设置3个复孔(N＝3)。

以标记载体BSA后的多抗原表位肽常规免疫Balb/c小鼠后，检测其抗2条小分子短肽LVLWGIHHP、WSYIVE和H1N1流感病毒抗体的产生情况；表11的结果表明，重组多抗原表位肽ILLWVLSHL虽然氨基酸序列与两条小分子多肽的序列不同，但从其免疫血清与两条小分子多肽和流感病毒抗原都反应的实验结果表明，以6株单克隆抗体为模板筛选出来的重组多抗原表位肽不但仍然携带有两条小分子多肽的抗原表位，而且流感病毒HA蛋白上的抗原表位也通过6株抗流感病毒单抗很好地复制到了重组多抗原表位肽上，而且这些表位在免疫动物时还能被很好地展示出来。

表11重组多抗原表位肽免疫小鼠血清抗目的抗原表位的抗体ELISA检测结果

注：表中数值展示的是重组多抗原表位肽载体结合物XH001-BSA免疫的4只B

WSYIVE和重组多抗原表位肽ILLWVLSHL及H1N1流感病毒抗原的抗体效价；以实验组ELISA检测OD值与正常鼠血清对照组OD值的比值(正常鼠血清OD值小于0.05时以0.05计)大于2.5为阳性；实验重复3次(N＝3)。

本发明在前期研究的基础上发现，抗流感病毒HA蛋白的几株单抗定位在同一条肽段上

为验证一个小分子短肽是不是可以组成多个抗原表位，我们分别对来自流感病毒HA蛋白的2条肽段LVLWGIHHP、WSYIVE进行单克隆抗体制备；结果发现它们刺激产生的单克隆抗体有的可以与HA抗原反应，有的不与HA抗原结合，而且与HA抗原结合的那些单抗之间和不与HA抗原结合的那些单抗之间反应特性也不相同，提示一个6肽的小分子，可能也组成了多个不同的抗原表位(表7，8)。这些结果提示，抗原表位可能不是一个固定的结构，而是一个由多个关键氨基酸(或其上的某些基团)组成的一个组合；如果是这样，那么组成抗原表位的关键氨基酸组合中的基团可能就可以用性质相同或相似的基团替换；也就是说组成抗原表位的关键氨基酸组合也许可以被拆分和重新组合。这一特性为设计具有不同反应特性的抗体提供了理论基础。

本课题中在如此短的肽段上都集中了至少3个以上的单抗结合表位，这表明抗原表位组成的复杂性。上述研究结果表明，小分子多肽与抗体的结合实际上就是多肽链上的氨基酸(基团)与抗体可变区氨基酸残基上基团的相互作用，它们能否结合取决于它们相互之间的表面可接近性和亲和力；如果满足这些条件，多肽中发挥免疫显性作用的基团可以以不同的组合与不同的抗体结合(表6，9)。也就是说，多肽中的多个关键氨基酸可以以不同的组合作为不同的抗原表位发挥免疫刺激作用，至于这些关键氨基酸中哪个或哪几个组合发挥免疫刺激作用则取决于免疫细胞的选择(表2，3，4)。

本研究在此基础上，提出了多肽抗原表位是关键氨基酸的组合，且这些关键氨基酸均可以被性质相同的关键氨基酸所取代、多个抗原表位可以合并重组成一个多抗原表位肽的观点。为验证该观点的正确性，本研究采用计算机模拟技术合成与原始蛋白非同源性的多抗原表位多肽来进行抗原表位预测、合并重组或应用。本研究通过计算机分子模拟技术，对6株单抗各自结合的关键氨基酸组合进行拆分、合并重组成一条多抗原表位肽(附图1)。对6株单抗的可变区进行蛋白质结构同源建模(表5)，并在计算机分子模拟技术的指导下对重组多抗原表位肽与6株单抗的结合活性进行分析(表6，图2)；证明部分重组多抗原表位肽序列虽然与多肽LVLWGIHHP、WSYIVE的序列不同，但重组多抗原表位肽上的确携带有可以与6株单抗结合的抗原表位(表7，8，9，10，图3)；用BSA标记重组多抗原表位肽ILLWVLSHL常规免疫小鼠后，诱导出了较强的抗多肽LVLWGIHHP、WSYIVE和H1N1流感病毒抗原的抗体(表11)。由此证明两条多肽和H1N1抗原HA蛋白上的抗原表位，都以6株单抗为模板，转移到了重组多抗原表位肽上，也就是说多抗原表位肽上存在与2条多肽和H1N1流感病毒抗原相似的抗原表位。重组多抗原表位肽免疫血清的抗流感病毒H1N1抗原的抗体效价比抗多肽LVLWGIHHP、WSYIVE的抗体效价稍高的结果似乎提示，重组多抗原表位肽ILLWVLSHL上携带的与流感病毒H1N1抗原上的相同抗原表位比LVLWGIHHP、WSYIVE两条多肽各自单独携带的相同抗原表位要多。由此我们建立了一个在计算机分子模拟技术指导下进行多抗原表位合并重组、以抗体可变区为模板对多抗原表位进行筛选的方法；而且证明携带多抗原表位的重组肽在免疫时还能很好地展示其免疫原性。

本研究提出了多肽抗原表位是关键氨基酸组合的概念，该概念认为：抗原表位是关键氨基酸的组合，组合中的基团可以来自相邻的氨基酸，也可以是来自不相邻的、在蛋白质的氨基酸序列中相距较远的氨基酸；这些关键氨基酸聚集在一起可以以不同的组合与不同的免疫细胞结合，发挥免疫刺激作用；至于哪一种免疫显性基组合发挥免疫刺激作用，完全取决于免疫细胞上抗原受体的选择。也许我们可以尝试通过将抗体与抗原的关键氨基酸对应起来，建立数据库，从而丰富我们对于抗原表位的认知。

另一方面，我们通过计算机分子模拟技术合成了能诱导产生抗流感病毒HA抗体的非流感病毒多肽，这种新理念的建立及实践，为多肽疫苗、多价疫苗和多肽药物的研发提供了新的理论和应用研究思路。我们的单肽负载多表位的理念将有利于新型新冠疫苗的设计和应用。此外，我们的方法还可以被用于其他研究，如在研究自身免疫病方面，我们将抛弃以前在现存抗原表位库与人体自身抗原表位找对应关系的尝试，利用免疫显性基组合的概念来找虽结构或序列不同，但诱发的抗体功能相近的抗原表位。另外，我们的方法还可以在肿瘤相关(特异性)开发，多肽相关新型诊断表位确认以及多肽药物研发等方面加以利用。

实施例2筛选方法在制备多肽疫苗、多价疫苗或者多肽药物中的应用

针对新冠病毒的易变异性，采用本发明的方法，把新冠病毒重要的Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron五种亚型病毒各自与ACE2结合所使用的关键氨基酸组合，在计算机分子模拟技术的指导下进行拆分、重新组合成很多条多抗原表位肽，然后用它们各自结合的ACE2受体蛋白晶体模型与每条多抗原表位肽进行模拟结合，筛选出能与ACE2受体结合的各种多肽，标记载体，免疫小鼠，通过生物学中和试验对免疫血清进行检测，确定能同时阻断五个主要亚型病毒与ACE2结合、效价较高的血清，用制备该血清的多抗原表位肽做新冠病毒疫苗，即可研发出针对五种新冠病毒亚型、抗原性较强的多价疫苗。

针对免疫原性较弱，接种后不易刺激接种者产生中和抗体，或产生的中和抗体维持时间较短的新冠病毒疫苗、HIV疫苗等，可以通过对天然疫苗进行重组改造。如对与ACE2受体蛋白结合的、新冠病毒S蛋白刺突上的16个氨基酸，在计算机分子模拟技术的指导下进行序列重组，然后用ACE2受体蛋白对重组多肽进行模拟结合，筛选出与受体蛋白结合良好的重组多肽，然后对重组多肽进行载体标记，常规免疫动物，检测免疫血清中对新冠病毒中和抗体效价的高低，选出能刺激高效价中和抗体的重组多肽制备疫苗。