一种清开灵注射液类过敏反应检测模型

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种清开灵注射液类过敏反应检测模型。

背景技术

清开灵注射液主要是由栀子、板蓝根、金银花、黄芩苷、胆酸、猪去氧胆酸、珍珠母和水牛角等组方药材经现代生产工艺制备而成。清开灵注射液有类过敏反应(anaphylactoid reaction)的临床报道，因此探索清开灵注射液类过敏反应的检测方法，对于指导临床用药具有重要的意义。

《清开灵注射液类过敏反应应急检验方法探讨，余小雁，北方药学2015年第12卷》探讨了清开灵注射液类过敏反应应急检验方法，采用ICR小鼠体内类过敏反应检查法联合体外RBL-2H3细胞β-氨基己糖苷酶及组胺释放率检查法，作为清开灵注射液类过敏反应应急检验方法。但该方法在体外检测时，需要同时检测上清液和裂解液的吸光度，试验操作及数据处理过程较为繁琐，不利于大批量样品检查。

本发明人团队前期研究了一种药物类过敏反应的临床前评价方法研究《梁爱华，2012，中国中药杂志，药物类过敏反应的临床前评价方法研究(I)——小鼠类过敏反应评价方法的建立和验证》，该方法以小鼠一次性静脉注射含0.4％伊文思蓝(EB)的受试物，以耳廓蓝染发生率和EB渗出量作为类过敏评价指标来评估静脉注射类过敏反应。但是该方法对不同的注射液药品的评价差异明显，根据研究数据显示，该方法对双黄连注射液、生脉注射液的反应强；而对清开灵注射液类过敏反应测试反应率很差(反应率仅有40％，见文献中表3数据)，清开灵注射液在12ml/kg的给药浓度下，反应率(反应率＝出现耳廓蓝染的动物数/组内动物数×100％)是40％，EB渗出量数据也不理想，EB渗出量较生理盐水组增高仅1倍余。该方案针对清开灵注射液的检测效果无法满足临床需求。

因此，研究探索效率更高、耗时缩短、反应率高、检测结果更加准确和稳定的清开灵注射液类过敏反应检测方案，对清开灵注射液质量控制、工艺研究，以及临床应用安全性，具有重要价值和意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对清开灵注射液类过敏反应检测技术的不足，旨在提供一种清开灵注射液类过敏反应检测模型及检测方法。

本发明通过以下技术方案实现上述发明目的：

一种清开灵注射液类过敏反应检测模型，包括七大模块：

(1)模块一：小鼠耳蓝染面积占比测试与数据存储模块；

该模块包括：注射模块、耳蓝染面积占比统计模块、数据存储模块；

所述注射模块包括注射用试剂：清开灵注射液、伊文思蓝、组胺、生理盐水；

所述耳蓝染面积占比统计模块用于统计注射后小鼠耳蓝染面积占耳廓面积比例的数据，得到各组小鼠耳蓝染面积占比数据；所得各组数据存储入数据存储模块；

(2)模块二：小鼠耳蓝染面积评分模块；

该模块包括表1所示的评分标准；

该模块用于接收上述模块一的数据，并按照表1所示的评分标准进行分析，给出评分数据；

表1耳廓蓝染面积(S)评分标准

(3)模块三：小鼠耳蓝染面积结果判断模块；

该模块包括根据模块二的评分数据进行结果判断的标准；标准如下：

清开灵注射液组：如果各动物均未出现蓝染，则结果为阴性；

清开灵注射液组：如果出现蓝染评分≥1的动物≤30％，且评分均＜2，则结果为阴性；

清开灵注射液组：如果出现蓝染评分≥1的动物＞30％，但各动物评分≥3的动物≤10％，结果判断为可疑；

清开灵注射液组：如果出现蓝染评分≥3的动物＞10％，结果为阳性。

结果为可疑时，需再次试验；如果再次试验的结果仍然为可疑或者阴性，则判断为阴性，不再重新试验；如果再次试验结果为阳性，则再试一次，以三次试验中二次结果一致的结果作为最终判断；

(4)模块四：小鼠耳组织中伊文思蓝渗出量定量测试与数据存储模块；

该模块包括：萃取模块、过滤模块、吸光度测试模块、数据存储模块；

萃取模块包括含0.2-1.0％(优选0.5％KOH)的甲酰胺溶液，用于萃取小鼠耳组织中的伊文思蓝，可得萃取液；

过滤模块用于过滤萃取液，可得滤出液；

吸光度测试模块用于测试滤出液的吸光度数据，所得数据存储在数据存储模块并输出传给模块五；

(5)模块五：小鼠耳组织中伊文思蓝渗出量计算模块；

该模块包括伊文思蓝标准曲线；

该模块接受模块四的吸光度数据，并根据伊文思蓝标准曲线计算出各组小鼠耳组织的伊文思蓝渗出量；

(6)模块六：小鼠耳组织中伊文思蓝渗出量结果判断模块；

该模块接受模块五的各组小鼠耳组织的伊文思蓝渗出量数据，如果清开灵注射液组伊文思蓝(EB)渗出量相比阴性对照组增高幅度较大，则判断为可疑或阳性，具体判断标准如下：

增高幅度<50％，阴性；

增高幅度50-75％，且统计差异P<0.05，可疑；

增高幅度75％-100％，弱阳性；

增高幅度>100％，阳性；

(7)模块七：结果输出模块；

该模块用于按照下述标准综合分析模块三和模块六的结果，给出最终判断结果并输出：

模块三和模块六的结果均为阴性，则最终结果判断为阴性；

模块三和/或模块六的结果为可疑，则最终结果判断为可疑；

模块三和/或模块六的结果为阳性，则最终结果判断为阳性。

即综合耳廓蓝染面积评分判断和伊文思蓝(EB)渗出量判断的结果，作为最终判断结果。

优选地，上述模型的模块一中，各组数据的来源要求：

①清开灵注射液组小鼠耳蓝染面积占比数据，来源要求及测试方法：清开灵注射液与0.6-1.0％(优选0.8％)伊文思蓝溶液以体积比1:1混合后，给予小鼠静脉注射后30min内，观测到的小鼠耳蓝染面积占比数据；

②组胺阳性对照组小鼠耳蓝染面积占比数据，来源要求及测试方法：0.5-2.0mg/ml(优选1.0mg/ml)组胺与0.6-1.0％(优选0.8％)伊文思蓝溶液以体积比1:1混合后，给予小鼠静脉注射后30min内，观测到的小鼠耳蓝染面积占比数据；

③生理盐水阴性对照组小鼠耳蓝染面积占比数据，来源要求及测试方法：生理盐水与0.6-1.0％(优选0.8％)伊文思蓝溶液以体积比1:1混合后，给予小鼠静脉注射后30min内，观测到的小鼠耳蓝染面积占比数据。

优选地，清开灵注射液按照原液：生理盐水＝1:(0-1)体积比稀释后使用。文中所述清开灵注射液及组胺的浓度均指与EB溶液混合前的药物浓度。

所述原液:生理盐水＝1:0体积比稀释后使用，即为原液使用，原液与EB按1：1混合后注射，则实际给药浓度为1/2原液，按照小鼠体重20ml/kg静脉注射给药，则实际给药量为10ml/kg；

所述原液:生理盐水＝1:1体积比稀释，再与EB按1：1混合后注射，则实际给药浓度为1/4原液，按照小鼠体重20ml/kg静脉注射给药，则实际给药量为5ml/kg。

优选地，上述模型中，所述吸光度测试模块为酶标仪或紫外分光光度计，波长包括610nm。

优选地，上述模型中，所述伊文思蓝标准曲线的构建方法：以含0.5％KOH的甲酰胺为溶剂，将伊文思蓝配成0、1、2、4、6、8、10μg/ml的溶液，每个浓度做2个复孔，每孔取1ml，于波长610nm处测吸光度；以吸光度为X，EB浓度为Y，绘制标准曲线。

优选地，模型的使用方法中，模块一的数据获取过程中，小鼠静脉注射剂量按照小鼠体重20ml/kg静脉注射。

优选地，模型的使用方法中，所述小鼠为KM小鼠或ICR小鼠。

优选地，模型的使用方法中，所述小鼠性别为雄性。

优选地，模型的使用方法中，所述小鼠体重23-28g，优选26-28g。

优选地，模型的使用方法中，小鼠适应性饲养1d后，进行注射实验。

优选地，模型的使用方法中，注射速度：保持均一的速度在30s内完成注射。

优选地，模型的使用方法中，注射液采用生理盐水作为溶媒。

基于上述模型，本发明提供上述模型的使用方法，即一种清开灵注射液类过敏反应检测方法，具体操作见实施例1。

本发明的技术方案具有以下有益效果：

本发明提供一种清开灵注射液类过敏反应检测模型及方法，能够准确、真实的反应清开灵注射液是否引起类过敏反应，根据实验数据显示，清开灵注射液在10ml/kg的给药浓度下，EB渗出量是阴性对照组的6-10倍(2.51比0.24、1.43比0.24)，反应率可达100％。

而且，该方法操作简单、耗时短，重复性好，对清开灵注射液质量控制、工艺研究，以及临床应用安全性，具有重要价值和意义。

具体实施方式

以下以具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实验试剂均为市购：注射用生理盐水、甲酰胺(分析纯)、75％酒精、伊文思蓝(EB)、阳性药组胺(注射用)、氢氧化钾。

实验动物：KM小鼠、ICR、C57、BALB/C小鼠，均来源于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2016-0011。

实施例1清开灵注射液类过敏反应检测方法的建立

一、分组

将KM小鼠称重，记录每只小鼠的体重。按照体重随机分组，每组10只动物。至少应包括以下组：

(1)清开灵注射液组：

分3个浓度组，高浓度为原液(实际给药剂量为10ml/kg)，中浓度为原液与生理盐水按体积比1:1稀释(实际给药剂量为5ml/kg)，低浓度为原液与生理盐水按体积比1:3稀释(实际给药剂量为2.5ml/kg)；

(2)阳性对照组：组胺1.0mg/ml(实际给药剂量为10mg/kg)；

(3)阴性对照组：生理盐水。

分组后，将鼠笼上标记好标签。

二、处理：静脉注射给药

清开灵注射液：各浓度组清开灵注射液分别与0.8％EB溶液以体积比1:1混合后，按照小鼠体重20ml/kg静脉注射。

阳性对照组：1.0mg/ml组胺与0.8％EB溶液以体积比1:1混合后，按照小鼠体重20ml/kg静脉注射。

阴性对照组：生理盐水与0.8％EB溶液以体积比1:1混合后，按照小鼠体重20ml/kg静脉注射。

三、类过敏反应观察和记录

静脉注射给药完毕后，立刻开始观察小鼠双侧耳廓出现蓝染的情况。并在给药后30min处死动物，取耳廓组织，测试EB渗出量。

1、耳廓蓝染面积：

记录每只动物每只耳朵的蓝染面积大小，如相当于耳廓面积的1/8、1/4、1/2、3/4或整个耳廓；每组动物中出现耳廓蓝染的动物数以及蓝染耳数；

2、耳廓组织中EB渗出量定量测定：

可以采取三种测定方法：

①整只动物耳组织EB渗出量测定：从耳廓近根部剪下耳朵(注意每只动物剪开的位置需一致(由于耳廓根部血液较丰富，如果根部剪的位置不一致的话，有可能由于带入的血液量不同而造成人为误差。因此，最好每只小鼠均从离耳廓与脑部折叠转角处约2-3mm处剪下耳廓)。将每只鼠的2个耳朵用剪刀剪碎，放在同一试管中，加入含0.5％KOH的甲酰胺溶液2ml浸泡，室温下浸泡24h，待耳组织中的EB完全萃取到甲酰胺溶液中(耳组织变白，无蓝色)，用120目筛网将组织滤掉，取滤出液1ml，加入到48孔透光度很好的微孔板中，用酶标仪于波长610nm处测吸光度。根据EB标准曲线，计算EB染料渗出量(μg)。

②单只耳组织EB渗出量测定：方法同上，不同点为分左、右侧分别萃取EB后检测。

③单位面积的EB检测：用9mm打孔器打下耳片，称重，然后剪碎组织，按照上述同样的方法萃取和检测EB。注意：每只动物打下耳片的位置应该一致，另外，由于各小鼠发生类过敏反应后血管渗出在耳廓分布的位置不一定相同，故此方法有可能造成动物间差异加大。

四、绘制EB标准曲线

以含0.5％KOH的甲酰胺为溶剂，将EB配成0、1、2、4、6、8、10μg/ml的溶液，每个浓度做2个复孔，每孔取1ml，于波长610nm处测吸光度。以吸光度为X，EB浓度为Y，绘制标准曲线。

五、结果分析

(1)耳廓蓝染面积评分以及类过敏程度判断：

对每只动物按照表1评分：

表1耳廓蓝染面积(S)评分方法

/>

(2)EB渗出量：

根据EB标准曲线，计算每个小鼠的EB渗出量(μg/ml)。

六、结果判断

试验可接受的标准，如果不达到下面的标准，建议试验重做：

1、阴性对照组：蓝染评分≥1的动物数不应超过20％。不应出现评分达到或超过2分的动物；

2、阳性对照组：蓝染评分≥3的比例≥70％；

3、结果判断：

(1)耳廓蓝染面积评分判断：

药物组：如果各动物均未出现蓝染，则结果为阴性；

药物组：如果出现蓝染评分≥1的动物≤30％，且评分均＜2，则结果为阴性；

药物组：如果出现蓝染评分≥1的动物＞30％，但各动物评分≥3的动物≤10％，结果判断为可疑；

药物组：如果出现蓝染评分≥3的动物＞10％，结果为阳性。

结果为可疑时，需再次试验。如果再次试验的结果仍然为可疑或者阴性，则判断为阴性，不再重新试验。如果再次试验结果为阳性，则再试一次，以三次试验中二次结果一致的结果作为最终判断。

(2)EB渗出量判断

如果清开灵注射液组EB渗出量相比阴性对照组增高幅度较大，则判断为可疑或阳性，即需要注意可能有类过敏风险；具体判断标准如下：

增高幅度<50％，则结果为阴性；

增高幅度50-75％，且统计差异P<0.05，则结果为可疑；

增高幅度75％-100％，则结果为弱阳性；

增高幅度>100％，则结果为阳性。

综合耳廓蓝染面积评分判断和EB渗出量判断的结果，作为最终判断结果。

实施例2实验数据

利用本发明提供的清开灵注射液类过敏反应检测模型，按照实施例1的具体使用方法进行清开灵注射液类过敏反应检测实验。实验结果如表2所示。

结果表明，小鼠静脉注射阴性对照溶液生理盐水后，均未见耳廓蓝染反应，说明本实验未见假阳性反应。

阳性对照小鼠静脉注射组胺10mg/kg后，所有动物均可见耳廓血管通透性增高，耳廓蓝染较为明显，小鼠耳数20/20发生类过敏阳性及阳性以上反应(≥3分)。与阴性对照组相比，EB渗出量显著升高，提示产生了强烈的类过敏反应，说明本实验未见假阴性反应。

清开灵注射液的给药剂量为10ml/kg时，批号210805、210807的样品均引起小鼠类过敏阳性及阳性以上反应(≥3分)的耳数均为12/20。两组耳蓝染评分较阴性对照组显著升高(P＜0.001)；而且，两组EB渗出量较阴性对照组显著升高(P＜0.01，0.05)。

给药剂量为5ml/kg时，批号210805、210807的清开灵注射液引起小鼠类过敏阳性及阳性以上反应的耳数分别2/20、4/20；批号210807组小鼠耳廓蓝染评分(P＜0.05)和EB渗出(P＜0.05)较生理盐水组升高，有显著性差异。

给药剂量继续降到2.5ml/kg后，批号210805、210807都没有引起小鼠出现耳廓蓝染反应，类过敏反应呈阴性。

根据以上结果，在高、中的浓度下引起的类过敏反应的更为明显。

表2各组小鼠耳廓蓝染情况和EB渗出量情况(

注：与对照组比较1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

根据实验数据显示，清开灵注射液在10ml/kg的给药浓度下，EB渗出量是阴性对照组的6-10倍(2.51比0.24、1.43比0.24)，两个批号的反应率都是100％，实验动物均出现了不同程度的耳廓蓝染。

实施例3试剂对耳组织萃取量的影响

分别以甲酰胺为溶剂或含0.5％KOH的甲酰胺为溶剂，研究加KOH与不加KOH对耳组织萃取量的影响。

1、EB标准曲线：

EB在0-50μg/ml范围内，其浓度与吸光度值呈良好的线性。为验证加入KOH对标准曲线的影响，配制两种标准曲线溶液：

(1)以甲酰胺为溶剂，将0.8％EB溶液配制成终浓度为0、0.5、1、2、4、6、8、10μg/ml标准曲线工作液，每个浓度做2个复孔，每孔取1ml，用酶标仪于波长610nm处测吸光度。绘制标准曲线。

线性方程：y＝14.119x-0.9072(R

(2)以含0.5％KOH的甲酰胺为溶剂，将0.8％EB溶液配制成终浓度为0、0.5、1、2、4、6、8、10μg/ml标准曲线工作液，每个浓度做2个复孔，每孔取1ml，用酶标仪于波长610nm处测吸光度。绘制标准曲线。

线性方程：y＝14.386x-0.0418(R

2、加KOH与不加KOH对耳组织萃取量的影响

(1)50只小鼠，随机分成5组，阴性对照组、阳性对照组1和2、清开灵组1和2。

(2)给药剂量：

阴性对照组：按照动物体重20ml/kg静脉注射0.4％的EB溶液(用生理盐水溶解)。

阳性对照组1和2：1.0mg/ml组胺与0.8％EB溶液以1:1(体积)混合后，按照动物体重20ml/kg体积静脉注射。

清开灵组1和2：清开灵注射液原液与0.8％EB溶液以体积比1:1(体积)混合后，按照小鼠体重20ml/kg静脉注射。

(3)30分钟后，将各组动物的外耳剪下，每只动物分成左右两侧耳组织，分别剪碎后，各自单独置于试管中，其中左侧耳组织加入甲酰胺1ml，右侧耳组织加入含0.5％KOH的甲酰胺1ml。将试管口用封口膜封上，阴性对照组、阳性药组1和清开灵组1在室温下浸泡48h，阳性药组2和清开灵组2在室温下浸泡24h。过滤，吸取滤液，注入透明平底培养板中，用酶标仪检测吸光度。以相应的EB标准曲线计算耳组织EB萃取量，比较加KOH与不加KOH对耳组织萃取量的影响。

表3各给药组小鼠耳廓蓝染情况(

结果显示，与甲酰胺相比，以含0.5％KOH的甲酰胺为溶剂的EB渗出量显著增加，可显著缩短处理时间。

另外说明，上述KOH的浓度经过实验摸索而得，根据实验数据，KOH浓度可控制在0.2-1.0％范围内，优选0.5％KOH。

实施例4其他因素方法学考察

1、实验动物性别差异研究

本试验采用雄性和雌性小鼠分别测试清开灵注射液的类过敏反应，观察反应是否存在性别差异，为产品类过敏检测选择合适的动物性别提供依据。

对照组雌性动物和雄性动物均注射生理盐水和EB，所有动物均未见耳廓蓝染，说明未产生假阳性反应。阳性药组胺在雌性小鼠和雄性小鼠均可诱发较明显的耳廓蓝染反应，两种性别所有小鼠均发生阳性及阳性以上反应(≥3分)。

清开灵注射液给药剂量为2.5ml/kg时，雄性小鼠耳数16/20为阴性反应(0分)；但在同剂量清开灵注射液下，雌性小鼠耳数全部为阴性。给药剂量为5ml/kg时，雄性小鼠耳数2/20发生阳性及阳性以上反应(≥3分)，雌性小鼠没有出现阳性及阳性以上反应。给药剂量为10ml/kg时，雄性和雌性小鼠耳数发生阳性及阳性以上反应分别为10/20和4/20。此外，在各浓度条件下，雄性小鼠的耳廓蓝染评分和EB渗出量都比雌性小鼠高。

综上认为，雄性小鼠对于清开灵注射液诱发的类过敏反应更加敏感。因此建议进行清开灵注射液类过敏检测时最好采用雄性小鼠。

2、动物品系差异性比较

分别采用ICR、C57、KM、BALB/C四个品系的小鼠进行类过敏反应试验。结果表明，清开灵注射液给药剂量为2.5ml/kg在ICR、C57、KM和BALB/C小鼠上均未诱发明显的耳廓蓝染，可疑或阴性反应(≤1分)耳数均为20/20。清开灵注射液给药剂量为10ml/kg在ICR小鼠、C57小鼠、KM小鼠和BALB/C小鼠类过敏反应阳性及阳性以上反应(≥3分)耳数分别为8/20、0/20、12/20和0/20；耳廓蓝染评分排序为KM≈ICR＞BALB/C＞C57。此外，清开灵注射液给药剂量为10ml/kg引起的EB渗出量大小排序为KM＞ICR＞BALB/C＞C57。

综上所述，与其他品系小鼠相比，KM小鼠对于清开灵诱导的类过敏反应较为敏感，ICR小鼠仅次于KM小鼠，故建议进行清开灵注射液类过敏检测时最好采用KM和ICR小鼠。

3、样品与指示剂EB混合方式考察

本试验分别采用分开注射和合并注射方式，观察了清开灵的类过敏反应是否与指示剂混合方式有关，为产品类过敏检测选择合适的指示剂混合方式提供依据。

清开灵注射液给药剂量为2.5ml/kg时，分开注射和合并注射后可疑或阴性反应耳数均为20/20。给药剂量为5ml/kg时，分开注射时3/20耳数发生阳性及阳性以上反应(≥3分)，16/20为可疑或阴性(≤1分)；合并注射时20/20为可疑或阴性。给药剂量为10ml/kg时，分开注射和合并注射后引起小鼠阳性及阳性以上反应耳数为2/20和12/20。提示合并注射时耳廓蓝染评分更高，表现出更为明显的类过敏反应。EB渗出量方面，在给药剂量为10ml/kg时，合并注射比分开注射的EB渗出明显增高(P＜0.01)。

综上认为，合并注射对于清开灵诱发的类过敏反应检测更加敏感，加之试验过程中合并注射操作更为简便，因此建议进行清开灵注射液类过敏检测时可以采用合并注射方式。

4、EB专属性试验

设置两个阴性生理盐水对照组，其中一个加入EB，一个未加入EB，考察EB的专属性。结果表明，静脉给予加入EB或不加EB的阴性对照溶液生理盐水后，均未见耳廓蓝染，说明本实验中未见假阳性反应。加入EB的对照组，EB的渗出量与未加入EB的对照组相比显著升高(P＜0.01)，提示小鼠对EB敏感。因此，在进行清开灵注射液小鼠类过敏反应实验的时候，要选用添加EB的生理盐水作为阴性对照。

5、阳性药量效关系考察

将阳性对照药组胺设置为三个剂量组，给药剂量分别为20mg/kg、10mg/kg和5mg/kg，组胺溶液浓度分别为2.0mg/ml、1.0mg/ml和0.5mg/ml，与0.8％EB溶液以体积比1:1混合后，维持按照小鼠体重20ml/kg静脉注射不变，对阳性药的量效关系进行考察。

小鼠静脉注射阴性对照生理盐水后，未见耳廓蓝染，说明本实验未见假阳性反应。静脉注射组胺20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg后，各组小鼠可见不同程度的耳廓血管通透性增高，阳性及阳性以上反应(≥3分)分别为20/20、18/20、18/20；耳廓蓝染评分及EB渗出量较对照组均显著升高(P＜0.001)，表明组胺引起小鼠产生的类过敏反应存在剂量依赖关系，组胺的浓度越高其诱发的类过敏反应越明显，有一定的量效关系。但20mg/kg组和10mg/kg组蓝染评分和EB渗出量较为接近，考虑到成本节约等因素，建议在进行清开灵注射液类过敏检测时将阳性药组胺的给药剂量设置为10mg/kg。

6、动物不同体重对清开灵注射液类过敏反应的影响

分别采用四个不同体重范围的小鼠进行类过敏反应试验。结果显示，生理盐水在四种不同体重范围小鼠上均未见耳廓蓝染反应，说明无类过敏反应发生，提示不同体重范围动物均未见假阳性反应。阳性对照药组胺在体重23-25g、26-28g、29g+小鼠上诱导的类过敏反应强度接近，给予阳性药组胺后体重23-25g、26-28g、29g+小鼠发生阳性及阳性以上反应(≥3分)耳数均为20/20。而体重过小时(20-22g)，小鼠类过敏反应减弱，阳性及阳性以上反应耳数为16/20。

静脉给予清开灵注射液2.5ml/kg后体重20-22g、23-25g、26-28g、29g+小鼠的可疑或阴性反应(≤1分)耳数分别为20/20、19/20、20/20、20/20；静脉给予清开灵注射液10ml/kg后在体重20-22g、23-25g、26-28g、29g+小鼠的阳性及其以上反应(≥3分)耳数分别为5/20、11/20、12/20、10/20。相同供试品不同体重小鼠耳蓝染评分结果未见显著差异，26-28g组和23-25g组评分较其他两组高。EB渗出量结果表明，静脉给予清开灵注射液10ml/kg后，不同体重范围小鼠EB渗出均显著性升高。体重26-28g小鼠耳廓EB渗出量普遍高于其他体重范围，23-25g组次之。

因此建议进行清开灵注射液类过敏检测时，采用23-28g的小鼠进行实验是适宜的。实操建议：考虑到动物需要适应性饲养，在进行类过敏检测时体重会增长1-3g，订购小鼠的体重可以选择22-24g。

7、不同注射速度敏感性考察

以不同的注射速度静脉注射清开灵注射液进行类过敏反应试验。结果显示，不同注射速度组小鼠生理盐水对照组均未见耳廓蓝染阳性反应，说明无类过敏反应发生，提示不同速度组小鼠进行试验均未见假阳性。阳性对照药组胺在不同速度组小鼠均诱发了明显耳蓝染，且蓝染评分结果相近，均发生类过敏阳性及阳性以上反应(≥3分)，提示本实验未见假阴性反应。

清开灵注射液2.5ml/kg以3个不同的速度给小鼠尾静脉注射时，0-5s、30s和60s组小鼠的可疑或阴性反应(≤1分)耳数均为20/20；耳蓝染评分结果显示，0-5s和60s组结果相近，稍微高于30s组。静脉给予清开灵注射液10ml/kg后0-5s、30s和60s组小鼠的阳性及其以上反应(≥3分)耳数分别为13/20、8/20、12/20，耳蓝染评分结果未见显著差异；EB渗出结果表明，静脉给予清开灵注射液10ml/kg后，不同速度组小鼠EB渗出均显著性升高，但没有显著性差异。结果提示，不同速度注射引起的清开灵类过敏反应较为相近，注射速度不同对清开灵引起的类过敏反应影响不大。因此，从实验可操作性以及重复性上考虑，建议注射速度在30s内完成为宜，试验者注射操作时对速度的掌控需要加强培训，以保持注射速度的均一性。

8、清开灵注射液不同配制后放置时间敏感性考察

本试验采用小鼠类过敏模型，比较了清开灵注射液配制后放置不同时间引起类过敏反应的差异。结果显示，生理盐水对照组供试品配制完成后放置不同时间，小鼠均未见耳廓蓝染阳性反应，说明无类过敏反应发生，提示配制后不同放置时间生理盐水对照组均未见假阳性反应。阳性对照药组胺在配制完成后放置不同时间(0h、2h和4h)均诱发了明显耳廓蓝染，EB渗出量均显著升高，提示配制后不同放置时间阳性对照药组胺未见假阴性反应。

清开灵注射液2.5ml/kg给药放置不同时间(0h、2h和4h)后，引起阴性及可疑反应(≤1分)的小鼠耳数分别20/20、18/20、19/20；清开灵注射液10ml/kg给药放置不同时间(0h、2h和4h)后，引起阳性及阳性以上反应(≥3分)的小鼠耳数分别20/20、20/20、18/20，各个时间点的耳蓝染评分较生理盐水组显著升高(P<0.001)，彼此之间无显著差异。EB渗出量结果与耳廓蓝染评分一致，10ml/kg组各个时间点的EB渗出量与生理盐水相比均显著升高(P<0.001)，但彼此之间无显著性差异。结果提示，清开灵注射液配制完成后放置不同时间引起的类过敏反应较为相近，药物配制完成后放置时间不同对清开灵引起的类过敏反应影响较小，为了使用方便可采取现用现配。

9、不同动物适应性饲养时间敏感性考察

本试验比较了不同适应性饲养时间对清开灵注射液引起小鼠类过敏反应的影响。生理盐水对照组动物适应性饲养1、2、3d后，小鼠均未见耳廓蓝染阳性反应，说明无类过敏反应发生，提示不同的适应性饲养天数生理盐水对照组均未见假阳性反应。阳性对照药组胺在小鼠适应性饲养1、2、3d后均诱发了明显耳廓蓝染，所有小鼠均发生类过敏反应阳性及以上反应(≥3分)，EB渗出值均显著升高，提示不同的适应性饲养天数阳性对照组未见假阴性反应。

清开灵注射液2.5ml/kg给药时，适应性饲养时间1d、2d、3d小鼠的耳廓蓝染评分和EB渗出量与生理盐水相比均未见显著差异，发生阴性及可疑反应(≤1分)小鼠耳数分别为14/20、20/20和20/20，适应性饲养1d的耳廓蓝染评分略高于饲养2d和3d。10ml/kg给药时，适应性饲养时间1d、2d、3d小鼠的耳廓蓝染评分与生理盐水相比均显著增高(P＜0.001)，发生阳性及以上反应(≥3分)小鼠耳数分别为16/20、11/20和12/20，饲养1d的耳廓蓝染评分略高于饲养2d和3d，但无显著差异。EB渗出方面，除适应性饲养2d外，饲养1d和3d后与生理盐水相比EB渗出量均显著升高(P<0.05)。结果提示，小鼠适应性饲养1d后，清开灵注射液引起的类过敏反应的敏感性较高。结合饲养成本及实验所耗费的时间，建议小鼠适应性饲养1d后，进行清开灵注射液类过敏实验。

10、清开灵注射液量效关系考察

本试验采用前期建立的类过敏反应方法学模型，对清开灵注射液的量效关系进行考察。结果提示，生理盐水对照组所有动物均未见耳廓蓝染，说明未产生假阳性反应。阳性药组胺均可诱发较明显的耳廓蓝染，即产生了强烈的类过敏反应，说明本实验未见假阴性反应。

清开灵注射液2.5ml/kg给药时，所有动物均未见耳廓蓝染；给药浓度为1/4原液时，小鼠未见阳性及阳性以上反应，2/20耳数发生弱阳性反应，18/20发生可疑或阴性反应(≤1分)；10ml/kg给药时，6/20耳数发生阳性及阳性以上反应(≥3分)，3/20发生弱阳性反应，11/20发生可疑或阴性反应。此外，随着清开灵注射液剂量(浓度)的增长，小鼠耳蓝染评分和EB渗出量都明显增高。综上认为，清开灵注射液的类过敏反应有着明显的量效关系，在较高浓度下会产生明显的反应，但降低用药浓度可能减少风险。提示临床上用药时，应严格控制用药浓度，尽量降低给药速度，以降低体内瞬时浓度。

11、清开灵注射液的类过敏反应重复性考察

采用同一批号重复3次实验，以评估清开灵注射液类过敏反应方法学的可重复性。结果显示，3次实验阴性对照组均为阴性反应，阳性对照组均为极强阳性反应，结果均相近。清开灵注射液2.5ml/kg给药时，三次尾静脉注射后，分别引起小鼠耳数20/20、20/20、20/20为类过敏可疑或阴性反应(≤1分)；给药浓度为1/4原液时，分别引起小鼠耳数6/20、1/20、5/20为类过敏弱阳性及阳性反应(2-3分)；10ml/kg给药时，分别引起小鼠耳数7/20、8/20、11/20类过敏阳性及阳性以上反应(≥3分)。此外，随着给药剂量(浓度)的增加，三次实验的蓝染评分和EB渗出量也逐渐增加，且在相同浓度下的各组数值虽存在一定的差异，但差异无显著性意义，属于可接受范围内的波动。表明本实验建立的清开灵注射液类过敏反应方法学可重复性良好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。