一种非泼罗尼滴剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种非泼罗尼滴剂及其制备方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

非泼罗尼（Fipronil），又名氟虫腈，化学名为：5-氨基-3-氰基-1-（2,6-二氯-4-三氟甲苯基）-4-三氟甲基亚磺酰基吡唑，是一种苯基吡唑类杀虫剂，作用机制是与昆虫中枢神经细胞膜上的γ-氨基丁酸（GABA）受体结合，关闭神经细胞的氯离子通道，干扰中枢神经系统的正常功能，从而使虫体的神经与肌肉长期处于兴奋状态，最终导致虫体死亡。其主要通过胃毒和触杀的方式对虫体起作用，也有一定的内吸传导作用。与传统杀虫剂相比（如苯并咪唑、氨基甲酸盐等），非泼罗尼对非靶标动物较为安全，但对人体和动物仍有一定毒性。

目前国内市场的驱虫产品中，法国梅瑞尔公司的福莱恩占据很大份额，其产品包括滴剂（有效成分为非泼罗尼和甲氧普烯）和喷剂（有效成分为非泼罗尼），用于驱杀犬猫体表的成年跳蚤、跳蚤卵、幼虫和蜱。其中喷剂适用于治疗跳蚤和皮肤严重感染的犬猫，滴剂可用作定期预防。其产品施用于动物皮肤表面后，有效成分随着皮脂扩散至全身体表，并储存于皮脂腺中，此后药剂不断随著皮脂腺分泌的油脂，顺着毛囊持续补充至全身体表，驱杀效力约为一个月。

但是发明人发现，对于需要经常接触外界复杂环境的犬、猫，驱虫需要定期进行，并且考虑到驱虫产品价格高、施用药剂时动物的顺应性差，一个月的驱杀效力显然不能满足用户需求。另外，福莱恩滴剂施用后，仍有部分药物透皮进入动物的循环系统中，具有潜在的毒副作用，且有部分动物施用后出现皮肤红肿，脱毛等现象。

发明内容

为了解决现有技术中存在的驱虫产品驱杀时效短、安全性低的技术问题，本发明公开了一种驱杀时效更长、安全性更高的非泼罗尼滴剂及其制备方法和应用，以甲氧基聚乙二醇-聚（D,L-丙交酯-co-乙交酯）（MPEG-PLGA）微球负载药物非泼罗尼制备滴剂，并且通过控制微球的载药、粒径、释放行为，以实现长效驱虫和提高安全性的目的。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

在本发明的第一方面，提供一种非泼罗尼滴剂，其包含：非泼罗尼微球以及溶媒；

所述非泼罗尼微球包含非泼罗尼和甲氧基聚乙二醇-聚（D,L-丙交酯-co-乙交酯）（MPEG-PLGA）；

所述溶媒包含溶剂和抗氧剂。

在一种具体的实施方式中，所述MPEG的重均分子量为1000 Da ~ 2000 Da；所述PLGA为75:25型PLGA，其重均分子量为10000 Da ~ 80000 Da，优选为30000 Da ~ 50000Da。

在一种具体的实施方式中，所述非泼罗尼微球中非泼罗尼与MPEG-PLGA的用量比以重量比计为1：3~5。

在一种具体的实施方式中，所述非泼罗尼微球的粒径为1~50 μm，多分散指数PDI为0.05~0.4；优选地，所述非泼罗尼微球的粒径为5~10 μm，多分散指数PDI为0.1~0.35。

在一种具体的实施方式中，所述非泼罗尼与溶剂的用量比为50 ~ 300 mg：1 mL，例如100 mg：1mL，150 mg：1mL，200 mg：1mL；所述抗氧剂用量为溶剂的0.05~0.2%，w/v。

优选地，所述溶剂为乙醇。

在一种具体的实施方式中，所述抗氧化剂选自丁基羟基甲苯（BHT）、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、特丁基对苯二酚（TBHQ）中的一种或几种；

优选地，所述抗氧化剂为丁基羟基甲苯（BHT）。

考虑到微球的稳定性和释药性质，本发明非泼罗尼滴剂中，将所述非泼罗尼微球和溶媒分开保存，使用前混匀制成滴剂。

在本发明的第二方面，提供一种所述非泼罗尼微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）将非泼罗尼与甲氧基聚乙二醇-聚（D,L-丙交酯-co-乙交酯）（MPEG-PLGA）溶于丙酮中，得到油相A；将聚乙烯醇（PVA）溶于水中得到水相B，在高速剪切下，将油相A注入水相B中，两相混合乳化形成O/W乳液；

（2）将上述O/W乳液在低温下减压干燥，去除丙酮，进行微球固化，固化后，过滤去除体系中水，得到固化微球；

（3）将固化微球分散于聚乙烯吡咯烷酮（PVP）水溶液中，冻干即得所述非泼罗尼微球。

在一种具体的实施方式中，步骤（1）中所述PEG的重均分子量为1000 Da ~2000Da； 所述PLGA为75:25型PLGA，其重均分子量为10000 Da ~ 80000 Da，优选为30000Da ~ 50000 Da。

在一种具体的实施方式中，所述非泼罗尼与MPEG-PLGA的用量比以重量比计为1:3~5。此比例范围可以获得载药量和粒径较优的微球，而高于或低于此范围，会导致溶液过于粘稠不能形成乳液，或造成微球载药量低或微球粒径不均或过大。

在一种具体的实施方式中，步骤（1）中，所述非泼罗尼的质量为所述丙酮的质量的10~25%，优选为10~15%。

在一种具体的实施方式中，步骤（1）中，所述聚乙烯醇（PVA）为醇解度为88%的药用聚乙烯醇，其重均分子量范围为30000 Da~100000 Da，优选为30000 Da~50000 Da。所述聚乙烯醇（PVA）的质量占水质量的百分比为0.05~2%，优选为0.08~1.2%。PVA作为乳化剂，在该浓度范围内可以在O/W乳液的制备过程有效分散乳液液滴，起到稳定液滴的作用。发明人研究发现，PVA分子量大小和浓度对乳液的形成和稳定有影响，上述范围较为适宜。

在一种具体的实施方式中，步骤（1）中，所述油相A和水相B的体积比为1:1~5，优选为1:2~3。高于该比例范围，导致粒径过小，载药量偏低，低于该比例范围，导致粒径过大且分布不均匀，进而影响药物的释放。

在一种具体的实施方式中，步骤（1）中，所述高速剪切的转速为5000 ~ 20000rpm，优选为10000 ~ 15000 rpm。

在一种具体的实施方式中，步骤（2）中，所述低温下减压干燥的条件为：温度为0~25℃，真空度在0 ~ -0.10 MPa。

在一种具体的实施方式中，步骤（3）中，所述聚乙烯吡咯烷酮（PVP）选自型号PVPK25或PVP K30，优选为PVP K30；所述聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在PVP水溶液的质量百分比为1~ 5%，优选为2 ~ 4%。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为冻干保护剂，微球分散于其中，起到保护微球结构和支撑作用。因此，采用此制备方法制备的非泼罗尼微球，其组分还包括冻干保护剂。

在一种具体的实施方式中，所述非泼罗尼微球的制备方法制得的非泼罗尼微球的粒径为1~50 μm，多分散指数PDI为0.05 ~ 0.4；优选地，粒径为5 ~ 20 μm，多分散指数PDI为0.1 ~ 0.35。此粒径范围内的微球利于进入皮脂腺，并具有较长时间的缓释效果。

在本发明的第三方面，提供一种第一方面所述非泼罗尼滴剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）将抗氧化剂溶于溶剂中，得到溶媒；

（2）将所述溶媒加入至本发明第二方面所述非泼罗尼微球的制备方法制备得到的非泼罗尼微球中，混匀，即得所述非泼罗尼滴剂。

在一种具体的实施方式中，步骤（1）中的所述抗氧化剂选自丁基羟基甲苯（BHT）、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、特丁基对苯二酚（TBHQ）中的一种或多种。

在一种具体的实施方式中，所述非泼罗尼与溶剂的用量比为：50~300 mg:1mL，例如100 mg:1mL，150 mg:1mL，200 mg:1mL；所述抗氧剂用量为溶剂的0.05 ~ 0.2%,w/v。

本发明的第四方面，提供一种组合药物，其包括：组分A：第二方面所述非泼罗尼微球的制备方法制备得到的非泼罗尼微球，组分B：溶媒；两者独立保存，保存方式不限，例如可以分别包装在西林瓶或特制的便于给药的塑料瓶中。

本发明的第五方面，提供上述非泼罗尼滴剂或上述组合药物在制备用于预防和/或驱除哺乳动物寄生虫的药物中的应用。

在一种具体的实施方式中，所述寄生虫包括跳蚤、蜱。

在一种具体的实施方式中，所述哺乳动物包括猫科动物、犬科动物、猪、牛、马羊、驴等；优选的，所述哺乳动物为猫科动物、犬科动物。

本发明还提供一种用于预防和/或驱除哺乳动物寄生虫的方法，所述方法使用上述非泼罗尼滴剂或上述组合药物对哺乳动物寄生虫进行预防和/或驱除；

具体地，所述方法包括：使用上述非泼罗尼滴剂或者将上述组合药物中组分A和B混匀得到滴剂后，分开动物肩胛骨间的毛发，将滴剂沿脊柱滴于皮肤，至吸收完全即可。

本发明具有以下有益效果：

本发明中的非泼罗尼滴剂具有近2个月的长效释药性质，可以大幅度延长驱虫周期。

本发明的滴剂处方中仅含有效成分、MPEG-PLGA、溶剂乙醇和抗氧化剂，成分简单，降低了产品对皮肤的刺激性；并且由于微球的包载和缓慢释药特性，明显降低了施用动物进入循环系统中的药物量，进一步降低了药物带来的毒副作用，在安全性上显著优于市场上现有产品。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

基于现有驱虫产品存在的问题，本发明提供了一种非泼罗尼滴剂及其制备方法和应用，考虑到该制剂需要局部皮肤给药且应尽力避免其透皮吸收进入循环系统，药物应主要储存于皮脂腺并随其分泌的油脂长期释放。发明人通过对制剂的载药量、包封率和动物体长效驱虫实验研究中发现，很多高分子材料作为载体材料时，例如聚乳酸（PLA）或单独的PLGA等无法长效释放药物；而以PLGA作为主体材料，修饰较低分子量的PEG，可以延长药物缓释时间。但过高分子量的PEG修饰导致微球粒径过大，且载药量、包封率低，不适用于本发明的给药系统。发明人进一步对不同型号的PLGA的释药行为进行研究时，发现95:5型和50:50型PLGA的释放效果均不佳，唯有75:25型PLGA能够对非泼罗尼进行理想释放，进而确定了以PEG-PLGA作为微球的载体材料。在此基础上，本发明通过完善非泼罗尼微球制备工艺中的药辅比、乳化剂用量等参数，控制微球粒径和载药，进一步控制微球的释放行为。将该微球用于滴剂制备中时，在动物实验中得到长效驱虫达近2个月效果的验证，同时还有效降低了的毒副作用。

以下实施例仅用于举例说明本发明的实施方案，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改，这些修改均落入本发明的保护范围。

本发明中所用各型号MPEG-PLGA结构为：

本发明所用MPEG-PLGA材料均定制于重庆渝偲医药科技有限公司。其余如无特殊说明，所用试剂均可常规商购得到，所用设备及测试方法均为本领域常规设备和方法。

实施例1

非泼罗尼滴剂-1的制备

（1）将5 g非泼罗尼与25 g MPEG（1000 Da）-PLGA（75:25型，30000 Da）溶于60 mL丙酮中，得到油相A；将120 mg醇解度为88%的药用PVA（重均分子量为30000 Da）溶于120 g水中得到水相B，在10000 rpm的高速剪切下，将油相A注入水相B中，两相混合乳化形成O/W乳液；

（2）将上述O/W乳液在5℃，-0.10 MPa条件下减压干燥，去除丙酮，进行微球固化，固化后，过滤去除体系中水，得到固化微球；

（3）将固化微球分散于10 mL 1%的聚乙烯吡咯烷酮PVP K30水溶液中，冻干即得非泼罗尼微球a；

（4）将0.5 mg抗氧化剂BHT溶于1mL乙醇中，得到抗氧剂BHT用量为溶剂乙醇的0.05% w/v BHT的溶媒；

（5）取适量上述非泼罗尼微球a（其中含非泼罗尼150 mg），将上述溶媒加入至非泼罗尼微球中，混匀，即得所述非泼罗尼滴剂-1。

实施例2

非泼罗尼滴剂-2的制备

（1）将5 g非泼罗尼与15 g MPEG（1500 Da）-PLGA（75:25型，50000 Da）溶于60 mL丙酮中，得到油相A；将120 mg醇解度为88%的药用PVA（重均分子量为30000 Da）溶于120 g水中得到水相B，在12000 rpm的高速剪切下，将油相A注入水相B中，两相混合乳化形成O/W乳液；

（2）将上述O/W乳液在5℃，-0.10 MPa条件下减压干燥，去除丙酮，进行微球固化，固化后，过滤去除体系中水，得到固化微球；

（3）将固化微球分散于10 mL 3%的聚乙烯吡咯烷酮PVP K30水溶液中，冻干即得非泼罗尼微球b；

（4）将2 mg抗氧化剂BHT溶于1mL乙醇中，得到抗氧剂BHT用量为溶剂乙醇的0.2%w/v BHT的溶媒；

（5）取适量步骤（3）制备的非泼罗尼微球b（其中含非泼罗尼150 mg），将步骤（4）得到的溶媒加入至非泼罗尼微球中，混匀，即得所述非泼罗尼滴剂-2。

对比例1

非泼罗尼微球c的制备：

与实施例1的区别在于：步骤（1）中将MPEG（1000 Da）-PLGA（75:25型，30000 Da）替换为MPEG（5000 Da）-PLGA（75:25型，30000 Da），其他步骤与实施例1的步骤相同，在步骤（3）中制得非泼罗尼微球c。对比例1仅制备了非泼罗尼微球，未制备滴剂。

对比例2

非泼罗尼滴剂-3的制备：

与实施例1的区别在于：步骤（1）中将MPEG（1000 Da）-PLGA（75:25型，30000 Da）替换为MPEG（1000 Da）-PLGA（50:50型，30000 Da），其他步骤与实施例1的步骤相同，在步骤（3）中制得非泼罗尼微球d；最终获得非泼罗尼滴剂-3。

对比例3

非泼罗尼滴剂-4的制备：

与实施例1的区别在于：步骤（1）中将MPEG（1000 Da）-PLGA（75:25型，30000 Da）替换为MPEG（1000 Da）-PLGA（95：5型，30000 Da），其他步骤与实施例1的步骤相同，在步骤（3）中制得非泼罗尼微球e；最终获得非泼罗尼滴剂-4。

对比例4

非泼罗尼滴剂-5的制备：

与实施例1的区别在于：步骤（1）中将MPEG（1000 Da）-PLGA（75:25型，30000 Da）替换为PLGA（75:25型，30000 Da），其他步骤与实施例1的步骤相同，在步骤（3）中制得非泼罗尼微球f；最终获得非泼罗尼滴剂-5。

对比例5

非泼罗尼滴剂-6的制备：

与实施例1的区别在于：步骤（1）中将MPEG（1000 Da）-PLGA（75:25型，30000 Da）替换为PLA（30000 Da），其他步骤与实施例1的步骤相同，在步骤（3）中制得非泼罗尼微球g；最终获得非泼罗尼滴剂-6。

对比例6

非泼罗尼微球h的制备：

与实施例1的区别在于：步骤（1）中将MPEG（1000 Da）-PLGA（75:25型，30000 Da）用量由20 g改为10 g，其他步骤与实施例1的步骤相同，在步骤（3）中制得非泼罗尼微球h；对比例6仅制备了非泼罗尼微球，未制备滴剂。

对比例7

非泼罗尼MPEG-PLGA微球的制备：

与实施例1的区别在于：步骤（1）中将MPEG（1000 Da）-PLGA（75:25型，30000 Da）用量由20 g改为30 g，试验中发现，系统粘度过高，不能形成乳液。

对比例8

非泼罗尼MPEG-PLGA微球的制备：

与实施例1的区别在于：步骤（1）中将PVA用量由120 mg改为360 mg，试验中发现，该PVA用量导致乳液制备中容易起沫，无法制备均一乳液。

对比例9

非泼罗尼MPEG-PLGA微球的制备：

与实施例1的区别在于：步骤（1）中将PVA用量由120 mg改为48 mg，试验中发现，乳液制备完成后不稳定，容易破乳。

测试实施例1

非泼罗尼微球理化性质研究

上述实施例和对比例制备得到的非泼罗尼微球粒径用马尔文3000激光粒度仪进行分析，载药量、包封率使用HPLC测定并计算得到，结果见表1。

表1

由中数据可知，实施例1-2制备的非泼罗尼MPEG-PLGA微球具有较高的载药量和包封率，对制剂中包载有效剂量的非泼罗尼有重要意义；并且较低的粒径使得微球更易进入毛孔进而在皮脂腺中储存。而使用较高分子量的MPEG的对比例1制备得到的微球较实施例的微球粒径大且载药量降低明显，不利于皮肤给药。另外对比例2-5制备的微球也具有可接受的载药量和粒径，而对比例6因MPEG-PLGA用量过低，导致载药量过低，不能满足制剂要求。对比例7-9则不能形成乳液，无法完成非泼罗尼滴剂的制备。

测试实施例2

动物试验

本实施例利用动物实验研究非泼罗尼微球制备成滴剂后的驱虫效果。

试验动物：经临床检查和实验室诊断确定感染蜱虫的犬，且近6个月未接受过驱虫治疗；试验犬在试验前感染蜱虫数量≥1只，品种和性别不限，年龄8周龄或以上。

制剂：实施例1制备得到的非泼罗尼滴剂-1、实施例2制备得到的非泼罗尼滴剂-2和对比例2-5制备得到的非泼罗尼滴剂3-6（含150 mg非泼罗尼，1mL）；对照药品：福莱恩滴剂（规格：100 mg非泼罗尼+90 mg甲氧普烯，0.67 mL）。

试验方法：

将试验动物分成7组，每组6只，分别施用上述制剂和对照药品。给药方法为：将试验犬肩胛骨处毛发分拨开来，沿脊柱将药品滴涂施用于皮肤，待药物完全吸收，总共给药1次，给药后试验犬不洗澡，直至试验结束。

给药剂量分别为：体重10 kg以下的试验犬使用1 mL非泼罗尼滴剂1-6或0.67 mL福莱恩滴剂；体重10~20 kg的试验犬使用2 mL非泼罗尼滴剂1-6或1.34 mL福莱恩滴剂1.34mL；体重20~40 kg的试验犬使用3mL非泼罗尼滴剂1-6或2.68 mL福莱恩滴剂；体重大于40kg的试验犬，每增加n个10 kg，则使用3 mL+n×1 mL的非泼罗尼滴剂1-6或2.68 mL+n×0.67 mL的福莱恩滴剂。

试验周期为60天，分别用药当天（0 d）、用药后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42d、49 d、56 d、60 d观察皮肤状态，收集并记录体表蜱虫的数量，结果见表2。

表2.

由表2可知，对照药品福莱恩滴剂在用后第三天即起效，在第28天观察到有蜱虫的重新感染。而本发明实施例1制备的非泼罗尼滴剂-1和实施例2制备的非泼罗尼滴剂-2，起效稍稍较慢，在第三天观察到有蜱虫感染数量减少，这可能与药物需要从微球中缓慢释放有关，但从长期驱虫效果来看，非泼罗尼滴剂-1、非泼罗尼滴剂-2在施药后的第56天或第60天后才重新出现蜱虫感染，这说明微球起到了长期的缓释作用。作为对比例2（非泼罗尼滴剂-3）的以50:50型的PLGA制备的非泼罗尼滴剂-3，其起效时间较短，在施药后第3天即起到了全面的驱虫效果，这可能与以50:50型的PLGA制备的微球施药较快有关，但其长期施药性能不佳。使用95：5型PLGA（非泼罗尼滴剂-4）、单纯PLGA（非泼罗尼滴剂-5）或单纯PLA（非泼罗尼滴剂-6）制备的非泼罗尼滴剂同样出现了驱虫效果延迟，但更差的情况是，在第28天即出现了蜱虫重新感染，这可能是由于上述相应的微球不能在皮脂腺中长期保留，或微球的药物累积释放率低导致。

另外，在对照药品福莱恩滴剂施用第3天，观察到1例皮肤红疹的出现，后在一周内消退。而本发明实施例1、2和对比例2-5制备的非泼罗尼滴剂在全程试验中均未出现明显的皮肤红疹和瘙痒症状，说明了本发明滴剂的安全性更高。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。