导航：首页> 特别适用于特定应用领域的信息通信技术〔ICT〕〔2018.01〕>一种类肽化合物、其制备方法及应用

一种类肽化合物、其制备方法及应用

文献发布时间：2024-04-18 19:53:33

本申请要求于2022年04月19日提交中国专利局、申请号为202210411656.7、发明名称为“一种类肽化合物、其制备方法及应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，尤其涉及一种类肽化合物、其制备方法及应用。

背景技术

RGD三肽序列存在于许多蛋白质中，在细胞粘附中发挥作用。含有RGD三肽序列的蛋白质包括胶原蛋白、纤维连接蛋白、玻璃体连接蛋白、血管性血友病因子(VWF)、某些崩解素、整合素是异二聚体细胞表面受体，通过与具有暴露RGD序列的配体结合，介导细胞与细胞外基质(ECM)之间的粘附。正常的整合素RGD结合被认为在参与细胞生长、迁移和生存的基因表达中发挥作用。这些细胞的生长、迁移和存活的调控不当可会导致多种疾病状态，包括血栓、炎症和癌症。因此，RGD多肽已经被研究作为潜在的细胞粘附蛋白的模拟物，以及它们与整合素结合的能力，用于抑制凋亡、血管生成、肿瘤发生等治疗目的，它们的多聚体形式用于内部放射治疗剂和癌症显像剂，以及它们的抗癌药物携带能力。

在眼睛中，整合素影响许多过程，包括眼部发育、细胞迁移、愈合和一些病理过程。整合素还可以调节眼组织的炎症和血栓形成。在动物模型中，注射RGD肽也被报道导致玻璃体视网膜后部脱离，因此，可能用于治疗某些视网膜疾病和/或促进玻璃体切除在玻璃体切除手术中取出玻璃体。因此，研究抑制整合素的药物非常重要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种可抑制整合素活性的类肽化合物、其制备方法及应用。

本发明提供了一种类肽化合物，包括式(I)所示的序列相连的氨基酸片段：

AA2-AA3-AA4式(I)；

其中，所述AA2选自碱性氨基酸、碱性类氨基酸、上述氨基酸或类氨基酸的N端取代衍生物；

AA3选自非极性氨基酸、非极性类氨基酸、极性中性氨基酸、极性中性类氨基酸、上述氨基酸或类氨基酸的N端取代衍生物；

所述AA4选自侧链含有羟基的氨基酸或侧链含有羟基的类氨基酸；

所述AA2、AA3与AA4之间通过缩合成酰胺键连接。

优选的，具有式(II)或式(III)所示的结构：

AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6式(II)；

cycl[AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6]式(III)；

其中，AA1、AA3与AA6各自独立地选自非极性氨基酸、非极性类氨基酸、极性中性氨基酸、极性中性类氨基酸、上述氨基酸或类氨基酸的N端取代衍生物；

所述AA2选自碱性氨基酸、碱性类氨基酸、上述氨基酸或类氨基酸的N端取代衍生物；

所述AA4选自侧链含有羟基的氨基酸或侧链含有羟基的类氨基酸；

所述AA5选自极性中性氨基酸或极性中性类氨基酸；

所述AA1、AA2、AA3、AA4、AA5与AA6之间通过缩合为酰胺键连接，且AA1为N端；

cycl表示AA1～AA5中的任意一个与AA6通过缩合为酰胺键成环。

优选的，所述AA1与AA3各自独立地选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲基酪氨酸、乙基酪氨酸、蛋氨酸、式(1)～式(5)中任意一项所示的类氨基酸或取代的上述氨基酸或类氨基酸：

其中，-X

所述取代的C1～C8的烷基、取代的C2～C8的烯基、取代的C3～C10的脂肪环基、取代的C6～C20的芳香环基、取代的C2～C20的杂环基、取代的C1～C8的烷烃酰基与取代的C1～C8的烷烃磺酰基中的取代基各自独立地选自卤素、羟基、氨基、羧基、磺酸基、巯基、甲硫醚基、乙硫醚基、磷酸基、硝基、-SOMe，-SO

m1为1～17的整数；m2为0～13的整数；

所述取代的上述氨基酸或类氨基酸的取代基各自独立地选自卤素、羟基与巯基中的一种或多种。

优选的，所述AA1与AA3各自独立地选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲基酪氨酸、乙基酪氨酸、蛋氨酸、上述氨基酸的L构型氨基酸、上述氨基酸的D构型氨基酸、式(6)～式(12)中任意一项所示的类氨基酸或取代的上述氨基酸或类氨基酸：

m1为1～17的整数；m2为0～13的整数；

所述取代的上述氨基酸或类氨基酸的取代基各自独立地选自卤素、羟基与巯基中的一种或多种。

优选的，所述AA2选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、Arg(Pbf)、上述氨基酸N端烷基化衍生物或上述氨基酸的D构型氨基酸；

所述AA4的侧链包括磺基、硼酸基、酰胺基与羧基中的一种或多种；

所述AA5选自苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、上述氨基酸N端烷基化衍生物或上述氨基酸的D构型氨基酸。

优选的，所述AA4选自磺基丙氨酸、式(13)～式(16)任意一项所示的氨基酸：

所述R

n1～n7各自独立选自0～13的整数；

所述取代的C1～C8的亚烷基与取代的C6～C20的亚芳基中的取代基各自独立地选自卤素、羟基、氨基、羧基、磺酸基、巯基、甲硫醚基、乙硫醚基、磷酸基、硝基、-SOMe，-SO

优选的，所述AA6选自式(17)～式(24)所示结构中的一种：

所述R

本发明还提供了一种上述的类肽化合物在制备抑制整合素的药物中的应用。

本发明还提供了一种上述的类肽化合物在制备抑制Arg-Gly-Asp结合位点的细胞粘附的药物中的应用。

本发明提供了一种类肽化合物，包括式(I)所示的序列相连的氨基酸片段：AA2-AA3-AA4式(I)；其中，所述AA2选自碱性氨基酸、碱性类氨基酸、上述氨基酸或类氨基酸的N端取代衍生物；AA3选自非极性氨基酸、非极性类氨基酸、极性中性氨基酸、极性中性类氨基酸、上述氨基酸或类氨基酸的N端取代衍生物；所述AA4选自侧链含有羟基的氨基酸或侧链含有羟基的类氨基酸；所述AA2、AA3与AA4之间通过缩合成酰胺键连接。与现有技术相比，本发明提供的类肽化合物可以抑制整合素的活性，肽靶向αvβ5、α5β1、αvβ3等整合素类蛋白，并通过多种受体抑制信号传导，该受体包括血管内皮生长因子受体(VEGFR)、肝细胞生长因子受体(HGFR)、胰岛素样生长因子受体(IGFR)和血小板源生长因子受体(PDGFR)，通过以上信号通路达到抑制新生血管生成，从而可用于炎症、伤口愈合、疤痕形成的预防、血栓形成、玻璃体视网膜疾病的发病机制，如飞蚊、特发性黄斑裂孔、玻璃体黄斑牵引、年龄相关性黄斑变性、湿性黄斑变性等。脉络膜新生血管，玻璃体视网膜手术，静脉闭塞。角膜新生血管，缺血性视神经。青光眼手术中虹膜红变与瘢痕形成的预防。

附图说明

图1为本发明实施例1中得到的化合物TM的LCMS谱图；

图2为本发明实施例2中得到的化合物TM10的LCMS谱图；

图3为本发明实施例3中得到的化合物TM19的LCMS谱图；

图4为本发明实施例4中得到的化合物TM20的LCMS谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种类肽化合物，包括式(I)所示的序列相连的氨基酸片段：

AA2-AA3-AA4式(I)；

其中，所述AA2为碱性氨基酸、碱性类氨基酸、上述氨基酸或类氨基酸的N端取代衍生物；当上述氨基酸为手性氨基酸时，其构型可为R构型也可为S构型，并无特殊的限制；优选的，所述AA2为精氨酸、赖氨酸、组氨酸、Arg(Pbf)、上述氨基酸N端烷基化衍生物或上述氨基酸的D构型氨基酸。

AA3为非极性氨基酸、非极性类氨基酸、极性中性氨基酸、极性中性类氨基酸、上述氨基酸或类氨基酸的N端取代衍生物；当上述氨基酸为手性氨基酸时，其构型可为R构型也可为S构型，并无特殊的限制；优选的，所述AA3为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲基酪氨酸、乙基酪氨酸、蛋氨酸、上述氨基酸的D构型氨基酸、上述氨基酸的L构型氨基酸、式(1)～式(5)中任意一项所示的类氨基酸或取代的上述氨基酸或类氨基酸；当上述氨基酸或类氨基酸包括手性结构时，上述氨基酸及通式中的结构具有手性时包括其S和R构型；在本发明中进一步优选的，所述AA3为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲基酪氨酸、乙基酪氨酸与蛋氨酸为其D构型氨基酸。

其中，-X

所述取代的C1～C8的烷基、取代的C2～C8的烯基、取代的C3～C10的脂肪环基、取代的C6～C20的芳香环基、取代的C2～C20的杂环基、取代的C1～C8的烷烃酰基与取代的C1～C8的烷烃磺酰基中的取代基各自独立地为卤素、羟基、氨基、羧基、磺酸基、巯基、甲硫醚基、乙硫醚基、磷酸基、硝基、-SOMe，-SO

所述取代的C1～C8的亚烷基、取代的C2～C8的亚烯基、取代的C2～C8的亚炔基、取代的C3～C10的脂肪环基、取代C6～C20的芳香环基与取代的C2～C20的杂环基中的取代基各自独立地优选为卤素、羟基、氨基、羧基、磺酸基、巯基、甲硫醚基、乙硫醚基、磷酸基、硝基、-SOMe、-SO

m1为1～17的整数，优选为1～15的整数，更优选为1～12的整数，再优选为1～10的整数，再优选为1～8的整数，再优选为1～5的整数，再优选为1～4的整数，再优选为1～3的整数，最优选为1或2；m2为0～13的整数，优选为0～10的整数，更优选为0～8的整数，再优选为0～5的整数，再优选为0～4的整数，再优选为0～3的整数，最优选为0～2即可为0、1或2。

所述取代的上述氨基酸或类氨基酸的取代基各自独立地优选为卤素、羟基与巯基中的一种或多种；在本发明中，取代的上述氨基酸或类氨基酸指的式上述的氨基酸及类氨基酸的亚甲基中的氢可被取代，引入卤素、羟基与巯基的一种或多种，以便于后续药化分子优化；所述卤素优选为氟、氯或溴。

进一步优选的，所述AA3为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲基酪氨酸、乙基酪氨酸、蛋氨酸、上述氨基酸的L构型氨基酸、上述氨基酸的D构型氨基酸、式(6)～式(12)中任意一项所示的类氨基酸或取代的上述氨基酸或类氨基酸：

m1为1～17的整数；m2为0～13的整数；所述m1与m2均同上所述，在此不再赘述。

所述取代的上述氨基酸或类氨基酸的取代基各自独立地选自卤素、羟基与巯基中的一种或多种。

所述AA4为侧链含有羟基的氨基酸或侧链含有羟基的类氨基酸；优选的，AA4的侧链包括磺基、硼酸基、酰胺基与羧基中的一种或多种；进一步优选的，所述AA4选自磺基丙氨酸、式(13)～式(16)任意一项所示的氨基酸：

所述R

n1～n7各自独立选自0～13的整数，优选各自独立地为0～10的整数，更优选各自独立地为0～8的整数，再优选各自独立地为0～6的整数，再优选各自独立地为0～4的整数，最优选各自独立地为0、1、2或3。

所述取代的C1～C8的亚烷基与取代的C6～C20的亚芳基中的取代基各自独立地优选为卤素、羟基、氨基、羧基、磺酸基、巯基、甲硫醚基、乙硫醚基、磷酸基、硝基、-SOMe，-SO

在本发明中，所述AA4可为具有手性的氨基酸或类氨基酸，也可为不具有手性的氨基酸或类氨基酸，并无特殊的限制，在本发明中具体的，所述AA4具有以下片段，以下片段左端氮端与AA3氨基酸的羧酸连接，右端羰基端与AA5的氮端连接，具体片段如下：

本发明提供的类肽化合物在包含上述序列相连的氨基酸片段外，在两端还可包括通过酰胺键相连其他氨基酸，且氨基酸的个数也不受限制，可为一个，也可为多个。

按照本发明，优选的，所述类肽化合物具有式(II)或式(III)所示的结构：

AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6式(II)；

cycl[AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6]式(III)；

其中，AA1、AA3与AA6各自独立地为非极性氨基酸、非极性类氨基酸、极性中性氨基酸、极性中性类氨基酸、上述氨基酸或类氨基酸的N端取代衍生物；当上述氨基酸为手性氨基酸时，其构型可为R构型也可为S构型，并无特殊的限制。

优选的，所述AA1与AA3各自独立地为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲基酪氨酸、乙基酪氨酸、蛋氨酸、上述氨基酸的D构型氨基酸、上述氨基酸的L构型氨基酸、式(1)～式(5)中任意一项所示的类氨基酸或取代的上述氨基酸或类氨基酸；当上述氨基酸或类氨基酸包括手性结构时，上述氨基酸及通式中的结构具有手性时包括其S和R构型。

其中，-X

进一步优选的，所述AA1与AA3各自独立地为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲基酪氨酸、乙基酪氨酸、蛋氨酸、上述氨基酸的L构型氨基酸、上述氨基酸的D构型氨基酸、式(6)～式(12)中任意一项所示的类氨基酸或取代的上述氨基酸或类氨基酸：

m1为1～17的整数；m2为0～13的整数；所述m1与m2均同上所述，在此不再赘述。

所述取代的上述氨基酸或类氨基酸的取代基各自独立地选自卤素、羟基与巯基中的一种或多种。

所述AA2为碱性氨基酸、碱性类氨基酸、上述氨基酸或类氨基酸的N端取代衍生物；所述AA2同上所述，在此不再赘述。

所述AA4为侧链含有羟基的氨基酸或侧链含有羟基的类氨基酸；所述AA4同上所述，在此不再赘述。

所述AA5为极性中性氨基酸或极性中性类氨基酸，优选为苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、上述氨基酸N端烷基化衍生物或上述氨基酸的D构型氨基酸。

优选的，所述AA6为式(17)～式(24)所示结构中的一种：

所述R

进一步优选的，所述AA6为下式结构中的一种：

所述AA1、AA2、AA3、AA4、AA5与AA6之间通过缩合为酰胺键连接，且AA1为N端；

cycl表示AA1～AA5中的任意一个与AA6通过缩合为酰胺键成环。

在本发明中，最优选的，所述类肽化合物如如TM1～TM72所示中的一种：

本发明还提供了一种上述类肽化合物的制备方法，其按照本领域技术人员熟知的多肽的合成方法制备即可，并无特殊的限制，本发明中优选采用固相合成方法，将类肽化合物C端第一氨基酸的C端通过共价键与固相载体连接，再以该氨基酸N端为合成起点，经过脱去氨基保护基和过量的已活化的第二个氨基酸进行缩合反应，接长肽链，重复操作，达到类肽化合物的肽链长度，最后将其从树脂上裂解下来，分离纯化，得到类肽化合物；在本发明提供的实施例中具体以Fmoc多肽合成法为例进行说明；所述树脂为本领域技术人员熟知的熟知即可，并无特殊的限制，本发明提供的实施例中具体以CTC树脂为例进行说明；在本发明中，优选采用有机碱与缩合剂活化氨基酸；所述有机碱优选为DIEA、TEA与NMM中的一种或多种；所述缩合剂选自DCC、DIC、EDC、BOP、pyBOP、AOP、TBTU、HBTU与HATU中的一种或多种。

本发明还提供了一种上述的类肽化合物在制备抑制整合素的药物中的应用。

本发明还提供了一种上述类肽化合物在制备抑制Arg-Gly-Asp结合位点的细胞粘附的药物中的应用。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种类肽化合物、其制备方法及应用进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

其中20种氨基酸英文名、中文名及字母表示如下表所示。

化合物的合成工艺

所有化合物的合成工艺按照实施例1、实施例2和实施例3进行平行合成。详细合成策略选择如下：

直链肽类型选择合成方法按照实施例1或实施例2进行合成；

环肽合成方法按照实施例3或实施例4进行合成。

详细合成方法如下

实施例1：合成阳性一(TM)

合成路线

步骤一：合成M1

称取CTC树脂0.503g(sub＝1.0mmol/g)加入多肽合成管中，加入DCM(10ml)，溶胀0.5h；称取Fmoc-Pro-OH(0.202g，0.6mmol)，溶于DCM(10ml)溶液中，加入DIEA(0.2ml，1.2mmol)，反应1h，用DCM(10ml)洗涤树脂3次；加入10ml封闭液(体积比DCM：MeOH：DIEA＝70:25:5),封闭15min，用DMF洗涤树脂6次，得到中间体M1，直接用于下一步反应。

步骤二：合成M2

脱Fmoc：加入哌啶/DMF(体积比1/4)溶液10ml，脱保护5min，抽干并再次加入哌啶/DMF(体积比1/4)溶液10ml，脱保护反应10min，抽干并用DMF洗涤树脂6次，取少量树脂用5％的茚三酮的乙醇溶液检测(取少量树脂加入1ml的5％茚三酮溶液在100℃加热5min)树脂显深蓝色，直接用于下一步反应。

偶联：将Fmoc-Thr(tBu)-OH(0.598g,1.5mmol)溶于5ml的DMF中，在冰浴下将TBTU(0.492g,1.5mmol)和DIEA(0.391g，3mmol)加入反应液中搅拌反应10min。反应结束后将活化液加入脱完Fmoc的树脂中，反应1h，取少量树脂用5％的茚三酮的乙醇溶液检测(取少量树脂加入1ml的5％茚三酮溶液在100℃加热5min)树脂显无色。抽干反应液，并用DMF(10ml)洗涤6次，得到树脂直接用于下一步反应。

偶联循环，依次按照上述操作偶联Fmoc-Cysteic-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-Gly-OH，最后得到中间体M2，直接用于下一步反应。

步骤三：合成M3

脱Fmoc：加入哌啶/DMF(体积比1/4)溶液10ml，脱保护5min，抽干并再次加入哌啶/DMF(体积比1/4)溶液10ml，脱保护反应10min，抽干并用DMF洗涤树脂6次，取少量树脂用5％的茚三酮的乙醇溶液检测(取少量树脂加入1ml的5％茚三酮溶液在100℃加热5min)树脂显深蓝色，用DCM、MeOH各10ml，交替洗涤3次，抽干，转移至真空烘箱中，在30℃干燥2h得树脂0.983g，直接用于下一步反应。

步骤四：合成TM(阳性一)

向树脂0.983g中加入10ml的裂解液(TFA:H

利用质谱对得到的TM进行分析，得到MS(ESI):m/z 638.4[M+H]

利用核磁共振对实施例1中得到的TM进行分析，得到

实施例2：HTPM7002-041(TM10)

合成路线

步骤一：合成M1

步骤二：合成M2

偶联循环，依次按照上述操作偶联Fmoc-Asp(OAll)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-Gly-OH，最后得到中间体M2，直接用于下一步反应。

步骤三：合成M3

脱All：加入苯硅烷(0.738ml，6.0mmol)，加入DCM(5ml)，反应3min后，继续加入有四三苯基磷钯(57mg，0.05mmol)的DCM溶液5ml,反应2h，用DCM(10ml)洗涤树脂8次；直接用于下一步反应。

步骤四：合成M4

偶联：称取氨基甲磺酸66mg(0.6mmol)，TBTU 192mg(0.6mmol)，加入DMF 10ml，加入DIEA 0.2ml(1.2mmol)，反应2h；抽干反应液，并用DMF(10ml)洗涤6次，得到树脂直接用于下一步反应。

步骤五：合成M5

步骤六：合成TM10

向树脂M5(0.983g)中加入10ml的裂解液(TFA:H

利用质谱对其进行分析，得到MS(ESI):m/z 695.4[M+H]

利用核磁共振对实施例2中得到的TM10进行分析，得到

实施例3：合成化合物TM19

步骤一：合成M1

步骤二：合成M2

偶联：将Fmoc-Thr(tBu)-OH(0.601g,1.5mmol)溶于5ml的DMF中，在冰浴下将TBTU(0.496g,1.5mmol)和DIEA(0.393g，3mmol)加入反应液中搅拌反应10min。反应结束后将活化液加入脱完Fmoc的树脂中，反应1h，取少量树脂用5％的茚三酮的乙醇溶液检测(取少量树脂加入1ml的5％茚三酮溶液在100℃加热5min)树脂显无色。抽干反应液，并用DMF(10ml)洗涤6次，得到树脂直接用于下一步反应。

偶联循环，依次按照上述操作偶联Fmoc-Cysteic-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-Gly-OH，最后得到中间体M2，直接用于下一步反应。

步骤三：合成M3

步骤四：合成M4

向树脂0.944g中加入10ml的裂解液(TFA:TIS:H

步骤五：合成TM19

加入DCM(10ml)溶解加入TBTU(194mg，0.6mmol)，HOBT(83mg,0.6mmol)，加入DIEA(0.2ml,1.2mmol)，反应10h后，旋蒸除去DCM后，经高压制备纯化得到纯化液，纯化液浓缩取出大部分有机溶剂，将其冻干得10.03mg的98.36％纯度的TM19，收率3.02％。

利用质谱对其进行分析，得到MS(ESI):m/z664.6[M+H]

利用核磁共振对得到的TM19进行分析，得到

实施例4：合成化合物TM20

步骤一：合成M1

步骤二：合成M2

偶联循环，依次按照上述操作偶联Fmoc-Cysteic-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-Gly-OH，最后得到中间体M2，直接用于下一步反应。

步骤三：合成M3

步骤四：合成M4

向树脂0.941g中加入10ml的裂解液(TFE：DCM体积比为1：1)，反应1h，抽滤，并用5ml的DCM洗涤树脂，合并滤液，重复上述操作1次，旋蒸除去大部分溶剂后，将滤液滴加入加入-5℃左右甲基叔丁基醚(100ml)，沉降1h，离心，去除上清液；加入MTBE(100ml)，洗涤，离心，去除上清液，重复此操作3次，得白色固体。将固体转移至真空干燥箱，在30℃下干燥2h，得粗肽0.230g。

步骤五：合成TM20

加入DCM(10ml)溶解加入TBTU(192mg，0.6mmol)，HOBT(81mg,0.6mmol)，加入DIEA(0.2ml,1.2mmol)，反应10h后，旋蒸除去DCM后，经高压制备纯化得到纯化液，纯化液浓缩取出大部分有机溶剂，将其冻干得18.37mg的96.51％纯度的TM20，收率4.00％。

利用质谱对其进行分析，得到MS(ESI):m/z916.6[M+H]

利用核磁共振对得到的TM20进行分析，得到

生物活性测试

用ELISA测试实施例化合物对integrinαvβ3、αvβ5、α5β1与其配体Vitronectin、Fibronectin的抑制作用。用Vitronectin或Fibronectin包被96孔板，将不同实施例化合物梯度稀释后加50μl到96孔板中，再加入50μl生物素标记的integrinαvβ3、αvβ5、α5β1，室温孵育1个小时后用TBS buffer洗脱3次，加入50μlStreptavidin-HRP室温孵育30分钟，用TBSbuffer洗脱3次后加入100μlHRP底物TMB，室温孵育30分钟后加入50μl 1M硫酸溶液终止反应，用酶标仪读取450nm波长下每孔的吸光度。用公式(OD

通过ELISA测试，本发明涉及到的实施例化合物在5mM、2mM浓度下对integrinαvβ3、αvβ5、α5β1与其配体Vitronectin、Fibronectin结合的抑制率见表1。本发明涉及到的实施例化合物对integrin αvβ3、αvβ5、α5β1与其配体Vitronectin、Fibronectin结合的抑制的IC

表1.实施例化合物对integrin与其配体结合的抑制率

由表1可知，实施例化合物中TM21、TM22、TM11、TM13、TM14在5mM、2mM浓度下对integrin αvβ3与其配体Vitronectin结合的抑制率高于阳性化合物。

实施例化合物中TM22、TM30在5mM、2mM浓度下对integrin αvβ5与其配体Vitronectin结合的抑制率高于阳性化合物。

实施例化合物中TM1、TM10、TM21、TM11、TM30、TM66、TM69等在5mM、2mM浓度下对integrin α5β1与其配体Fibronectin结合的抑制率高于阳性化合物。

表2实施例化合物对integrin与其配体结合抑制的IC

由表2可知，实施例化合物中TM22(HTPM7002-043)、TM13(HTPM7002-057)、TM14(HTPM7002-058)、TM34(HTPM7002-092)对integrin αvβ3与其配体Vitronectin结合抑制的IC

实施例化合物中TM34(HTPM7002-092)对integrin αvβ5与其配体Vitronectin结合抑制的IC

实施例化合物中TM10(HTPM7002-041)对integrin α5β1与其配体Fibronectin结合抑制的IC

细胞粘附实验

用1×coating buffer(Solarbio/C1055)将蛋白稀释成2.5μg/mL Fibronectin或10μg/mLVitronectin，以100μL/well加入96孔板，4℃过夜。随后弃去包被蛋白，PBS洗2次，每次200μL，吸干。取对数生长期的HUVEC细胞用1ml胰酶-EDTA(Solarbio/T1300)消化，在显微镜下观察细胞成圆形，立刻使用完全培养基(45 ml DMEM基础培养基(gibco/C11965500BT+4.5 ml FBS(Sigma-F8318)+0.5 ml青霉素-链霉素溶液(Biosharp-BL505A)))将细胞稀释至6.66×10

表3细胞粘附试验结果

眼部PK

取空白大鼠玻璃体匀浆样品5μL，分别加入生理盐水45μL，HTPM7002-041(TM10)标准系列溶液50μL(10 ng/mL，100 ng/mL，4000 ng/mL)，内标25μL，150μL10％TCA，涡旋混合2min，4℃3800 rpm离心20 min，取上清液用于LC-MS/MS分析，制备标曲。随后取大鼠玻璃体样品匀浆后，取5μL，加入45μL生理盐水，超声2 min，涡旋1 min后，加入甲醇50μL，内标25μL，10％TCA150μL，涡旋混合2 min，4℃3800 rpm离心20 min，取上清液用于LC-MS/MS分析样品，得到结果如表4所示。

色谱条件

仪器设备：SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱系统

色谱柱：HypersilGOLD Aq,3μm，3*100 mm

流动相A:0.2％甲酸水

流动相B:乙腈

梯度洗脱程序：

流速：0.5mL/min

柱温：40℃

进样体积：10μL

内标：格列齐特(100ng/mL甲醇溶液)

保留时间：HTPM7002-041:2.80min；格列齐特：3.28min。

质谱条件

仪器设备：API4000三重四级杆质谱仪

数据采集：Analyst 1.6

表4 LC-MS/MS分析样品结果

肝微粒体稳定性

肝脏微粒体信息如表5所示。

表5肝脏微粒体信息

微粒体工作溶液：在100mM磷酸钾缓冲液中制备适当浓度的微粒体工作溶液终止液准备：4℃下，将含有200ng/mL甲苯磺丁脲和200ng/mL拉贝洛尔作为内标(IS)的甲醇(MeOH)用作终止液。使用Apricot自动化工作站，除空白板外，(T0、T5、T15、T30、T40、T45、T60、NCF60)其余96孔反应板均加入2μL/孔的复合工作溶液。然后向所有反应板(Blank、T0、T5、T5、T15、T30、T45、T60、NCF60)添加100μL/孔的微粒体溶液。所有含有化合物和微粒体混合物的反应在37℃下预孵育10分钟。在反应板NCF60中加入98μL/孔的100mM磷酸钾缓冲液，反应板NCF60在37℃孵育，启动计时器。

NCF60培养

预孵育后，除NCF60外(Blank、T0、T5、T15、T30、T45、T60)每个反应板均加入98μL/孔的NADPH再生系统，开始反应。

培养基中各成分的最终浓度

反应板在37℃下孵育，并启动计时器

反应板培养

在每个反应板的适当终点时间点，加入200μL/孔的4％磷酸和800μL/孔的终止液，终止反应。每个板密封震荡10min后，4度4000rpm离心，20min。最后从每个反应板取300μl体积转移到新的96孔板中，LC-MS/MS进行分析，得到结果如表6所示。

表6肝微粒体稳定性T1/2(min)

血浆稳定性

实验前，将冷冻血浆在37℃的水浴中解冻。血浆以4000rpm离心5min，使用Apricot自动化工作站，在所有96孔反应板中加入98μL/孔的空白plsma。(空白对照、T0、T10、T30、T60和T120)；在除空白对照外的所有孔上加入2μL/孔的工作溶液(100μM)。(T0、T10、T30、T60、T120)，37℃的水浴中孵育，并开始计时。孵育结束时加入500μL终止液(将HTPM7002-041化合物用含有200ng/mL甲苯磺丁脲和200ng/mL拉贝洛尔0.1％FA的CAN溶液溶解)沉淀蛋白，密封震荡20min后，4度4000rpm离心，20min。将反应板中上清液转移至新板中，密封震荡10min，LC-MS/MS进行分析，得到结果如表7所示。

表7血浆稳定性测试结果

完整全部详细技术资料下载

该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
专利发明人：
专利申请人：杭州禾泰健宇生物科技有限公司;