利用PCR富集扩增法对抗逆性DNA聚合酶的高通量筛选方法

技术领域

本发明涉及突变体的筛选方法技术领域，具体为利用PCR富集扩增法对抗逆性DNA聚合酶的高通量筛选方法。

背景技术

自然进化是一个缓慢的过程，依赖于基因突变的逐渐积累，近年来，科学家们找到了在小范围内加快这一过程的方法，使他们能够在实验室里快速制造新的蛋白质和其他分子，往往从无到有地凭空创造一个具备某种特定性能的蛋白分子是比较困难的，最常见的方法是在有较理想原料(亲本)的基础之上进行突变，以获得快速进化，其中最常用的是无性进化和有性进化。无性进化主要通过易错PCR，定点突变和饱和突变等方法，有性进化是指通过基因改组技术对不同来源的基因进行组合，这样可以在短时间内完成自然界需要成千上万年才能发生的突变，产生的大量突变基因中只包括少量的目的突变，要在如此大量的突变中找到目的突变基因是一个较有挑战性的工作。

目前对于突变体的筛选方式根据突变的性能要求各有不同，可以通过施加筛选压力、表现的性状或蛋白的生物活性(酶活)等条件来进行重组子的确认，一般情况采用的筛选方法可以通过单菌的培养，单独进行检测确认，通量一般不会太大，通过96孔板印迹转印培养，这样筛选的通量做到万级的水平已经比较困难，对于Taq酶这种需要进行PCR验证活性的分子酶其筛选难度更大。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供利用PCR富集扩增法对抗逆性DNA聚合酶的高通量筛选方法，以解决背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：利用PCR富集扩增法对抗逆性DNA聚合酶的高通量筛选方法，包括以下步骤：

步骤一：Taq酶原始序列的确定，根据氨基酸序列进行基因合成，将目的片段构建入pET30a载体中；

步骤二：采用易错PCR对目的基因的核苷酸进行突变，并构建突变体表达文库

将构建的基因进行易错PCR进行随机突变，提取质粒DNA并溶解于水中至浓度为50-100ng/ul作为扩增模板，取16个PCR管进行扩增，通过梯度稀释扩增，提取扩增产物，经过同源重组技术将目的基因克隆至表达载体中转化入大肠杆菌表达宿主中，构建突变体文库；

步骤三：突变体库的诱导表达

取突变体库菌种1ml转接入50ml的LB培养基中，37℃在摇床上进行160rpm振荡培养，待菌液OD600达到0.5左右时，降温至30℃，加入无菌过滤的IPTG至终浓度为0.1mmol/L，诱导表达3h，离心收集菌体，用漂洗液对菌体进行重悬漂洗，离心，重复3次后离心收菌冷藏保存，即刻进行接下来的实验，以保证菌体的新鲜；

步骤四：猪血扩增体系配制及微液滴制备

将上步中收集的菌体进行稀释，稀释至OD600为1OD时，继续稀释1000倍，此时进行微液滴包埋，最终保证每个微液滴中至多只含有1个细胞；

步骤五：提取扩增产物

将扩增产物用济凡生物的高通量核酸提取设备进行提取，采用磁珠法提取扩增产物并电泳检测。结果显示，其中有两个微孔中出现了扩增条带；

步骤六：基因测序获得目的基因

将PCR扩增产物送交爱赛生物进行测序，其中一个样本经测序鉴定为假阳性，经序列分析发现发生了3个点突变，其中1个为同义突变，另2个为错义突变；

步骤七：目的基因表达验证及性能检测

将此基因进行基因合成并克隆至表达载体中进行表达，蛋白经纯化后对猪血含量达20％的体系进行扩增对其进行验证。

作为本发明的一种优选技术方案，所述微液滴中包埋的缓冲体系包括氯化镁、氯化钾和Tris-HCl(pH7.5)，所述氯化镁的浓度为1mM，所述氯化钾的浓度为200mM，所述Tris-HCl(pH7.5)的浓度为10mM，。

作为本发明的一种优选技术方案，所述微液滴中包埋的缓冲体系还包括BSA和甘油，所述BSA的浓度为6mg/ml，所述甘油的浓度为0.8％(V/V)。

作为本发明的一种优选技术方案，所述微液滴中包埋的缓冲体系还包括曲拉通X100、正向引物和反向引物，所述曲拉通X100的浓度为1‰(V/V)，所述正向引物与反向引物的浓度均为800nM。

作为本发明的一种优选技术方案，所述微液滴中包埋的缓冲体系还包括抗凝猪血和DdH2O，所述dNTP的浓度为0.4mM，所述抗凝猪血的浓度为20％(V/V)。

本发明具备以下有益效果：

该利用PCR富集扩增法对抗逆性DNA聚合酶的高通量筛选方法，利用微液滴法隔绝内外环境，使扩增环境相对独立，只能扩增自身的目的基因，扩增产物的指向性较好，即凡扩增出的PCR产物均是可以在当时有抑制物的情况下扩增出来的，而且扩增出的PCR产物即是抗逆的目的基因，另外，采用此发明，不需要进行荧光探针法检测，只需要采用常规的PCR条件即可，对设备要求低，较易实现，同时，此发明在筛选时不需要靶向到特定的单细胞，主要通过优势积累，只对最终的产物进行提取分析，即可获得目的基因或目的突变文库，且，由于PCR产物的量和单菌个数比较有着绝对的优势，所以此发明的筛选通量比常规方法要高得多，每次可达10万-100万的筛选规模，较容易获得目的突变的基因。

附图说明

图1为PCR反应混合体系图；

图2为结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本实施方案中：利用PCR富集扩增法对抗逆性DNA聚合酶的高通量筛选方法，包括以下步骤：

步骤一：Taq酶原始序列的确定，根据氨基酸序列进行基因合成，将目的片段构建入pET30a载体中；

步骤二：采用易错PCR对目的基因的核苷酸进行突变，并构建突变体表达文库

将构建的基因进行易错PCR进行随机突变，提取质粒DNA并溶解于水中至浓度为50-100ng/ul作为扩增模板，10×PCR buffer:100mM Tris–HCl,pH 8.3,15mM MgCl2和500mM KCl；取16个PCR管进行扩增；

上游引物：atgagggggatgctgcccctcttt

下游引物：ctccttggcggagagccagtcctc

通过梯度稀释扩增，提取扩增产物，经过同源重组技术将目的基因克隆至表达载体中转化入大肠杆菌表达宿主中，构建突变体文库；

步骤三：突变体库的诱导表达

取突变体库菌种1ml转接入50ml的LB培养基中，37℃在摇床上进行160rpm振荡培养，待菌液OD600达到0.5左右时，降温至30℃，加入无菌过滤的IPTG至终浓度为0.1mmol/L，诱导表达3h，离心收集菌体，用漂洗液对菌体进行重悬漂洗，离心，重复3次后离心收菌冷藏保存，即刻进行接下来的实验，以保证菌体的新鲜；

步骤四：猪血扩增体系配制及微液滴制备

将上步中收集的菌体进行稀释，稀释至OD600为1OD时，继续稀释1000倍，此时进行微液滴包埋，最终保证每个微液滴中至多只含有1个细胞；

微液滴中包埋的缓冲体系为：

吸取微液滴至96孔微孔板中，每孔100ul反应体系，进行PCR扩增，具体条件如下：

步骤五：提取扩增产物

将扩增产物用济凡生物的高通量核酸提取设备进行提取，采用磁珠法提取扩增产物并电泳检测。结果显示，其中有两个微孔中出现了扩增条带；

步骤六：基因测序获得目的基因

将PCR扩增产物送交爱赛生物进行测序，其中一个样本经测序鉴定为假阳性，经序列分析发现发生了3个点突变，其中1个为同义突变，另2个为错义突变；

步骤七：目的基因表达验证及性能检测

将此基因进行基因合成并克隆至表达载体中进行表达，蛋白经纯化后对猪血含量达20％的体系进行扩增对其进行验证；

结果可见，此突变后(Mut)的DNA聚合酶在20％的猪血中可以成功扩增出目的片段，而原始的则几乎无扩增，此结果验证了采用此发明进行筛选是可行的。

本实施例中，微液滴中包埋的缓冲体系包括氯化镁、氯化钾和Tris-HCl(pH7.5)，氯化镁的浓度为1mM，氯化钾的浓度为200mM，Tris-HCl(pH7.5)的浓度为10mM，微液滴中包埋的缓冲体系还包括BSA和甘油，BSA的浓度为6mg/ml，甘油的浓度为0.8％(V/V)微液滴中包埋的缓冲体系还包括曲拉通X100、正向引物和反向引物，曲拉通X100的浓度为1‰(V/V)，正向引物与反向引物的浓度均为800nM，微液滴中包埋的缓冲体系还包括抗凝猪血和DdH2O，dNTP的浓度为0.4mM，抗凝猪血的浓度为20％(V/V)。

实施列一：

文献调研获得原始序列

SEQ1:

MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHALHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE；

其对应的原始核苷酸序列为：atgagggggatgctgcccctctttgagcccaagggccgggtcctcctggtggacggccaccacctggcctaccgcaccttccacgccctgaagggcctcaccaccagccggggggagccggtgcaggcggtctacggcttcgccaagagcctcctcaaggccctcaaggaggacggggacgcggtgatcgtg

gtctttgacgccaaggccccctccttccgccacgaggcctacggggggtacaaggcgggccggg

cccccacgccggaggactttccccggcaactcgccctcatcaaggagctggtggacctcctggg

gctggcgcgcctcgaggtcccgggctacgaggcggacgacgtcctggccagcctggccaagaag

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cttctggccctggccgccgccagggggggccgggtccaccgggcccccgagccttataaagccc

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tcccctggccgtgcccctggaggtggaggtggggataggggaggactggctctccgccaaggagtga；

另一测序结果如下：

atgagggggatgctgcccctctttgagcccaagggccgggtcctcctggtggacggccaccacctggcctaccgcaccttccacgccctgaagggcctcaccaccagccggggggagccggtgcaggcggtctacggcttcgccaagagcctcctcaaggccctcaaggaggacggggacgcggtgatcgtggtctttgacgccaaggccccctccttccgccacgaggcctacggggggtacaaggcgggccgggcccccacgccggaggactttccccggcaactcgccctcatcaaggagctggtggacctcctggggctggcgcgcctcgaggtcccgggctacgaggcggacgacgtcctggccagcctggccaa

gaaggcggaaaaggagggctacgaggtccgcatcctcaccgccgacaaagacctttaccagctc

ctttccgaccgcatccacgccctccaccccgaggggtacctcatcaccccggcctggctttggg

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尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。