一种自合成单磷酸尿苷的人造细胞模型的制备方法

技术领域

本发明属于合成生物学技术领域，具体涉及一种自合成单磷酸尿苷的人造细胞模型的制备方法。

背景技术

核苷酸是生物体中极为重要的物质之一。核苷酸是构成DNA、RNA的基本组成单位，也参与辅酶Ⅰ、Ⅱ等辅酶的合成，另外三磷酸腺苷、鸟苷、尿苷直接参与能量供应，对生命体的遗传、发育、生长等生命过程不可或缺。此外，核苷酸及其类似物还是多种药物的前体，在药物化学中被广泛应用。

核苷酸代谢途径尤其是嘧啶合成途径，对于生命活动至关重要。对于生长、分裂的细胞，嘧啶补救合成的途径往往无法满足细胞对于嘧啶核苷酸的需求，故嘧啶的从头合成途径多被研究，同时已有很多抑制剂被报道，以期望能抑制或阻止癌细胞的繁殖分裂，或阻止有害微生物或寄生虫的繁殖。

人造细胞作为一个新兴领域，通过自下而上的方式构建并模拟真实细胞，极大地简化了细胞模型，为探索生命奥秘、揭示生命起源找到一个新的方式。人造细胞内已模拟出多个生物过程，包括光合作用、细胞分裂、相分离、信号转导等，对于研究生命体的代谢、信号交流等生命过程，深入理解细胞的工作机制提供了很大的帮助。但是现有的人造细胞还无法实现复杂的代谢模拟。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前的人造细胞无法实现复杂代谢的问题，提供一种自合成单磷酸尿苷的人造细胞模型的制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种自合成单磷酸尿苷的人造细胞模型的制备方法，所述方法具体为：

步骤一：质粒的构建：在NCBI官网找到所需八种酶的基因序列并重组到载体上，进行质粒合成，载体选择pET28a，保留N端His标签；

步骤二：细菌培养与蛋白质提取：将质粒转染进感受态大肠杆菌中，均匀涂布至固体培养基平板上；12-18小时后挑单菌落于30-100mL液体培养基中过夜培养；将所得菌液以1：100的体积比加入液体培养基中进行扩大培养，培养至菌液OD600值为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2-1mmol的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)并将培养温度调整至18℃诱导12-20小时；离心收集菌体，重悬菌体后破碎；所得破碎菌体再次离心后取上清液通过镍螯合亲和层析柱进行纯化，获得目的酶蛋白，通过SDS-PAGE检测酶的纯度，并置于-80℃待用；

步骤三：乳液法制备包封八种酶的人造细胞：通过乳液法将ADP、天冬氨酸、六聚磷酸钠、核糖、氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨酰酶、二氢乳清酶、二氢乳清酸脱氢酶、核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶、AMP磷酸转移酶和尿苷酸合成酶包封到囊泡中；氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨酰酶、二氢乳清酶、二氢乳清酸脱氢酶共同构成一个酶级联反应生成乳清酸，核糖激酶和磷酸核糖焦磷酸合成酶构成一个酶级联反应生成磷酸核糖焦磷酸，AMP磷酸转移酶再生ATP用以提供能量，尿苷酸合成酶将先前生成的乳清酸和磷酸核糖焦磷酸合成为单磷酸尿苷。

步骤四：蜂毒素打孔使碳酸氢根离子和铵根离子进入：向步骤三得到的包封有底物与酶的磷脂囊泡溶液中加入蜂毒素，使蜂毒素的终浓度为1-2μg/mL，放置10min-20min，然后向囊泡溶液中加入碳酸氢铵，通过蜂毒素孔进入囊泡内部，碳酸氢铵、天冬氨酸和ATP在氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨酰酶、二氢乳清酶、二氢乳清酸脱氢酶的催化下生成乳清酸，而核糖和ATP在核糖激酶和磷酸核糖焦磷酸合成酶的催化下生成磷酸核糖焦磷酸，二者再在尿嘧啶核苷酸合成酶的作用下生成单磷酸尿苷，AMP磷酸转移酶则负责从聚磷酸盐种再生ATP，提供能量，实现从简单化合物从头合成单磷酸尿苷。

进一步地，在人造细胞中部署氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨酰酶、二氢乳清酶、二氢乳清酸脱氢酶、核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶、AMP磷酸转移酶和尿苷酸合成酶等，在人造细胞中实现从简单化合物碳酸氢铵、天冬氨酸、核糖生成所有嘧啶核苷酸的前体单磷酸尿苷，囊泡中pH为7，温度为40℃，利用蜂毒素使囊泡形成孔洞，使外部的碳酸氢铵进入囊泡内引发反应，实现两种无机离子的固定。

进一步地，所述步骤二具体为：将质粒转染进感受态大肠杆菌中，均匀涂布至固体培养基平板上；12-18小时后挑单菌落于30-100mL液体培养基中，37℃，200-220rpm过夜培养；将所得菌液以1：100的体积比加入液体培养基中进行扩大培养，37℃，200-220rpm培养至菌液OD600值为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2-1mmol的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)并将培养温度调整至18℃诱导12-20小时；8000-10000rpm离心收集菌体，重悬菌体后用超声破碎仪破碎；所得破碎菌体于4℃，12000rpm离心后取上清液通过镍螯合亲和层析柱进行纯化，获得目的酶蛋白，通过SDS-PAGE检测酶的纯度，并置于-80℃待用。

本发明相对于现有技术的有益效果为：本发明主要通过在囊泡中部署氨甲酰磷酸合成酶等八种酶，通过蜂毒素在磷脂囊泡上产生孔洞，可以使外界的碳酸氢根离子和铵根离子进入磷脂囊泡内部，引发一系列的反应，获得可进行自合成单磷酸尿苷的人造细胞模型。

附图说明

图1为酶级联反应示意图。

图2为纯化的氨甲酰磷酸合成酶的凝胶电泳图。

图3为乳液法制作的包封有底物与酶的人造细胞显微镜照片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明将氨甲酰磷酸合成酶，天冬氨酸转氨酰酶、二氢乳清酶、二氢乳清酸脱氢酶、核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶、尿苷酸合成酶、AMP磷酸转移酶、ADP、六聚磷酸钠、天冬氨酸和核糖包封到人造细胞中，在使用蜂毒素在磷脂囊泡表面打孔后，碳酸氢根离子和铵根离子可进入囊泡内部，引发囊泡中酶级联反应，生成单磷酸尿苷；AMP磷酸转移酶再生ATP，为体系提供充足的能量，实现人造细胞中由简单化合物至单磷酸尿苷的合成。该方法操作简单，可持续产生大量的尿嘧啶核苷酸。

癌细胞或肿瘤细胞中单磷酸尿苷(UMP)的合成是必须的，否则无法繁殖；有害微生物或寄生虫中UMP的合成也是繁殖的前提，所以抑制细胞中UMP的合成可以高效地减缓癌细胞或微生物的繁殖。但在真实细胞中物质和代谢过程非常多且相互影响，无法准确判断某一条单个途径的代谢过程，抑制剂的作用和效果也无法准确判断，而在人造细胞中单拿出来这条代谢途径能准确的对UMP的合成进行研究，可以应用于生物医药领域嘧啶合成途径抑制剂的研制等等。

实施例1：

(1)质粒的构建：在NCBI官网找到目的基因序列，共八种酶，其中氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨酰酶、二氢乳清酶、核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶的物种来源均选择大肠杆菌K12 MG1655，二氢乳清酸脱氢酶的物种来源选择克氏锥虫，尿苷酸合成酶的物种来源选择秀丽隐杆线虫，AMP磷酸转移酶的物种来源选择丹毒科细菌，依据是均为胞质蛋白，可大量表达且活性优良。载体选择pET28a，N端保留His标签，便于后期纯化。

(2)细菌培养：菌株选择BL21(DE3)菌。将菌株从-80℃中取出置于冰上，待5-10min解冻后加入10μL的1ng/μL的质粒溶液，然后将菌株置于冰上30分钟，待质粒附着于菌体，将菌株置于42℃水浴锅中热激60秒，之后迅速置于冰上冷却，2-3min后加入900μL的LB培养基(10g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母浸粉)，37℃，150rpm复苏菌体1小时。取100μl-200μl菌液均匀涂布于固体培养基(10g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母浸粉，15g/L琼脂)中，倒置平板于37℃过夜培养12-16小时。挑平板上的单个菌落于60mL卡那霉素终浓度为50μg/mL的液体培养基中，37℃、200rpm过夜培养。以上述菌液与液体培养基体积比为1：100加入至300ml液体培养基中进行扩大培养，待菌液OD

(3)酶的提纯：将菌体用重悬缓冲液(300mM NaCl、20mM Tris、20mM咪唑，pH＝8)重悬。充分搅拌后置于冰上用超声破碎仪充分破碎(功率为65％，破碎时间4.5s，停止时间5.5s，总时间20min)，将所得破碎菌液在4℃、12000rpm下离心15min，取上清液通过45μm超滤膜并以1mL/min的流速通过镍离子螯合亲和层析柱，用不同浓度的洗脱缓冲液(300mMNaCl，20mM Tris，50mM、100mM、200mM、300mM、400mM咪唑，pH＝8)洗脱，取纯度最高的一管蛋白液，用超滤管进行浓缩蛋白(氨甲酰磷酸合成酶选择50kDa超滤管，其他酶选择10kDa超滤管)，并将蛋白的盐溶液替换成10mM PB缓冲液(10mM NaH

(4)酶活性的测量：氨甲酰磷酸合成酶活性通过与天冬氨酸转氨酰酶偶联测定；天冬氨酸转氨酰酶活性利用产物氨甲酰天冬氨酸与二乙酰一肟反应生成氨甲酰二乙酰，再与安替比林生成黄色物质通过紫外-可见分光光度计测定；二氢乳清酶活性通过底物氨甲酰天冬氨酸与对二甲氨基苯甲醛反应生成黄色物质通过紫外-可见分光光度计测定；二氢乳清酸脱氢酶活性通过液相色谱测定产物乳清酸；核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和AMP磷酸转移酶的活性测定通过液相色谱测定ATP的含量；尿苷酸合成酶的活性通过液相色谱测定单磷酸尿苷的含量。最终多酶级联体系温度确定为40℃，pH确定为7。酶的动力学参数通过测定不同底物浓度时单位时间内底物的消耗量确定。

(5)包封酶与底物的囊泡的制备：采用乳液法制备磷脂囊泡。将磷脂1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)氯仿溶解，加入适量矿物油混合，以形成0.1mg/mL POPC溶液(载脂油)，置于80℃加热30min以蒸干氯仿，后冷却至室温。囊泡内部的水溶液由50mM的PB缓冲液(pH＝7)，150mM六聚磷酸钠溶液，1mMATP，10mM天冬氨酸、10mM D-核糖以及之前提取的适量浓度的八种酶构成。囊泡外部的水溶液由900mM的葡萄糖构成。将50μL内部水溶液与400μL载脂油放入1.5mL离心管中，涡旋40s或用移液枪反复吹打得到单层的油包水乳液结构。将所得乳液轻轻加入到200μL等渗的葡萄糖溶液中，置于1.5mL离心管中以10000g离心力离心15分钟，底部沉淀即为包封酶与底物的囊泡。将沉淀取出分散在900mM葡萄糖溶液中，在荧光显微镜下观察。观察结果如图3所示，成功将酶与底物包裹在了磷脂囊泡中。

(6)蜂毒素在囊泡表面打孔：向包含有氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨酰酶、二氢乳清酶、二氢乳清酸脱氢酶、核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶、尿苷酸合成酶、AMP磷酸转移酶、ADP、六聚磷酸钠、天冬氨酸和核糖的囊泡溶液中加入蜂毒素，使蜂毒素的终浓度为1-2μg/mL，放置10min-20min；向囊泡溶液中加入碳酸氢铵，碳酸氢铵通过蜂毒素孔进入囊泡内部，引发酶级联反应生成尿嘧啶核苷酸，实现人造细胞中UMP的从头合成。