一种D-BL仿生物膜的构建方法

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种D-BL仿生物膜技术的开发及在化妆品中的应用，可以解决胜肽类、胶原蛋白类等大分子的不稳定性、生物利用度低、易酶解、渗透性差、传递效率与靶向性较低等问题。

背景技术

抗衰老成分，比如多肽、胶原蛋白等，它们共有的特点就是分子量较大，部分存在透皮性差、驻留性差，形成旁路透皮，导致其只能在皮肤表面驻留。在调研的一项关于体外皮肤渗透的研究中，发现大部分的肽残留在皮肤表面，随后被冲走，只有0.22％的总量渗透通过皮肤并保留在角质层内，即最顶层的皮肤；0.01％的肽进入表皮。这样的皮肤低渗透性导致肽的大量浪费，形成了不必要的高生产成本和不理想的产品，因此其皮肤递送具有高度挑战性。

六胜肽，又名乙酰基六肽-8、阿基瑞林，是一种神经递质抑制类的抗皱胜肽，其在化妆品领域中被广泛应用于抗皱产品中。其作为一种水溶性短肽，也存在一定的缺点：1)性质不稳定，在体内外环境中受到多种复杂的化学降解以及物理变化的影响而失活；2)在非注射给药途径的生物利用度低；3)渗透性差、分配系数小，使其难通过生物屏障及脂质膜，传递效率与靶向性较低等。

为了解决上述问题，在应用于化妆品时，研究者发现可以通过化学修饰、加入吸收促进剂、应用新型载体技术等手段来提高多肽在皮肤中的渗透性、耐酶解能力等。有较多的专利及文献报道将有效成分使用脂质体进行包裹来解决上述问题，这是由于脂质体具有低毒性、与细胞的亲和性、长效性、缓释性等特性，但是，通过已有方法得到的脂质体仍存在稳定性低、包封率低、成分较易渗漏、在储存过程中会出现细菌滋生和沉降凝聚、并难以控制粒径且粒径分布宽等问题。

因此，开发一种针对胜肽类、胶原蛋白类等大分子的性质不稳定、生物利用度低、渗透性差、传递效率与靶向性较低等问题，以及脂质体稳定性低、包封率低、成分较易渗漏、在储存过程中会出现细菌滋生和沉降凝聚、并难以控制粒径且粒径分布宽等问题的技术尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于数字控制的人工生物膜技术(Diginal-BiomimeticLiposomes Technology，简称D-BL仿生物膜技术)构建具有生物安全性、稳定性、缓释性、耐酶解、促进透皮吸收、靶向性等性能的D-BL仿生物膜的方法。

针对上述目的，本发明提供的D-BL仿生物膜的构建方法包括下述步骤：

步骤1：计算机模型构建

从PubChem数据库下载受体R的分子三维结构，从蛋白质晶体数据库(ProteinData Bank，PDB)搜索配体L的同源蛋白结构，寻找与目标对接物的模型骨架，构建目标对接物的结构可变区。

步骤2：分子对接

将配体L放置在受体R活性口袋的位置，按照几何形状、静电相互作用、氢键相互作用、疏水相互作用互补匹配原则来评价配体L与受体R相互作用的好坏，并找到配体L与受体R两个分子之间最佳的结合模式，获得初始结构组合物。所述初始结构组合物由受体R和配体L、目标对接物按不同质量配比组成。

步骤3：分子动力学模拟

将获得的初始结构组合物使用Amber软件进行能量最小化以及分子动力学模拟。

步骤4：结合自由能计算

利用Amber软件中的MMPBSA.py模块，采用MM-PBSA方法计算初始结构组合物的体系结合自由能，获得能量最低、最稳定的组合物。所述组合物的体系结合自由能由下式表示：

△G

△E

△G

式中，△G

步骤5：制备D-BL仿生物膜

依据得到的能量最低、最稳定的组合物的配方组成比例进行D-BL仿生物膜制备，并进行性能验证。

上述步骤1中，所述受体R为多肽，所述多肽可以是一般寡肽类(寡肽-1、寡肽-3、寡肽-2、三肽-1、六肽-1、寡肽-5、六肽-9、寡肽-6、五肽-1、六肽-11、五肽-3、六肽-3等)、乙酰基寡肽类(乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-5、乙酰基六肽-1、乙酰基四肽-2、乙酰基八肽-3、乙酰基四肽-9等)、棕榈酰寡肽类(棕榈酰五肽-4、棕榈酰四肽-7、棕榈酰三肽-5、棕榈酰三肽-1、棕榈酰寡肽、棕榈酰六肽-12、棕榈酰五肽-5等)及其他肽类(肌肽、谷胱甘肽等)。

上述步骤1中，所述配体L为蛋白，所述蛋白可以是胶原蛋白、弹性蛋白、牛奶蛋白、鹿骨胶原蛋白、野大豆蛋白、乳清蛋白、血清白蛋白、角蛋白、(动物)胎盘蛋白、小麦蛋白、纤连蛋白等。

上述步骤1中，目标对接物为卵磷脂和胆固醇组成的双分子层磷脂。

上述步骤2中，优选使用GOLD对接程序，采用遗传算法在受体R活性位点中搜索配体L的结合模式，在对接过程中允许配体L全范围的柔性构象和局部柔性，基于GOLD预测组合物的结合模式，获得初始结构组合物。

上述步骤3中，优选所述能量最小化采用共轭梯度法，消除体系中原子的不合理接触，在缓慢升温的过程中，对模拟体系的溶质分子进行约束保持其构象，在恒温恒压的条件下模拟体系达到热力学平衡，监测体系构象变化、温度、能量等参数。

上述步骤5中，所述性能包括安全性、渗透性、耐酶解能力、缓释性能、功效性。

上述步骤5中，所述D-BL仿生物膜呈现核小体大的特点，其内核大小在10～100nm之间，身体大小在100～1000nm之间。

本发明利用计算机模拟技术旨在借助计算机的算法程序和生物信息学数据的积累，利用计算机模拟所需限定成分环境下受体R(功效成分)和配体L(修饰成分)最有可能的结合方式(受体R与配体L之间的结合，存在静电相互作用、氢键相互作用、范德华相互作用和疏水相互作用，作用的方式需要遵循几何形状、静电相互作用(正电荷对应负电荷)、氢键相互作用(氢键供体对氢键受体)、疏水相互作用(疏水区对应疏水区)等互补匹配原则)，计算结合自由能，并通过分子动力学方法模拟受体与配体结合过程，最终通过计算化学的方式筛选出活性功效、修饰成分在化妆品配方中的使用配比，优化其最佳使用比例，制备成D-BL仿生物膜。并通过实验室方法对该D-BL仿生物膜的安全性、渗透性、耐酶解能力、缓释性能、功效性等性能进行验证。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明所使用的计算机模拟过程具有高效、快速、低成本的优点，是高通量筛选的一个重要辅助方法，可以优化受体R与配体L的最佳结合方式，节约需大量通过正交实验法优化活性成分使用比例的时间，可用于后期解释、预测、指导化妆品配方设计。

2、采用本发明方法构建的D-BL仿生物膜具有安全性、靶向性、与细胞的亲和性、缓释性、耐酶解、促进透皮吸收等多种优良特性，也是一类功效成分的载体，其可以将修饰后的抗皱、保湿、舒缓、紧致等功效成分有靶向性的作用于皮肤，从而实现精准化数字化护肤，解决了胜肽护肤的难题。

3、采用本发明方法构建的D-BL仿生物膜与皮肤细胞膜相似，都是双分子层的磷脂结构，具有相似相溶的特点，磷脂双分子层是构成细胞膜的基本支架，因此其可以发挥相似相溶的特点，增强透皮吸收作用。

4、采用本发明方法构建的D-BL仿生物膜具有强大的水合作用，可以直接穿透皮肤的砖墙结构，将功效成分作用于皮肤表面或进入表皮、真皮并在该部位积聚和发挥作用；可以通过调节不同的受体与配体成分，不同的成分可以加强“相似相溶”和强化水合作用，且可以作为功效成分的载体，从而达到多重功效的协同作用。本发明的衍生意义在于D-BL仿生物膜技术不仅可以用于上述多肽类的大分子，也可以衍生到其他类似的肽类、蛋白类等大分子的物质，发挥其最大作用。

附图说明

图1是DBL-8的RMSD随时间变化的曲线(分子动力学模拟图)。

图2是DBL-8鸡胚绒毛尿囊膜试验图。

图3是DBL-8、LIP-8和NLIP-8不同时间点累积透皮吸收量。

图4是DBL-8、LIP-8和NLIP-8不同时间点皮肤渗透性测试荧光强度变化图。

图5是DBL-8、LIP-8和NLIP-8不同时间点酶解率测试结果。

图6是DBL-8、LIP-8和NLIP-8不同时间点乙酰基六肽-8累计释放率测试结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

本实施例所使用的受体R为乙酰基六肽-8、三肽-1、棕榈酰五肽-5，所使用的配体L为人源重组胶原蛋白，经过D-BL仿生物膜技术处理后，筛选出能量最低、最稳定的组合物，最后将该组合物与脂质体以及非脂质体进行比对，证明它们在安全性、渗透性、耐酶解能力、缓释性能、功效性方面的差异。具体方法如下：

步骤1：计算机模型构建

从PubChem数据库下载受体R的分子三维结构，从蛋白质晶体数据库搜索配体L的同源蛋白结构，限定目标对接物为卵磷脂和胆固醇，寻找与目标对接物的模型骨架，构建目标对接物的结构可变区。

步骤2：分子对接

使用GOLD对接程序，将配体L放置在受体R活性口袋的位置，按照几何形状、静电相互作用、氢键相互作用、疏水相互作用互补匹配原则，采用遗传算法在受体R活性位点中搜索配体L的结合模式，在对接过程中允许配体L全范围的柔性构象和局部柔性，基于GOLD预测组合物的结合模式。采用AutoDock-vina软件对所有结合模式的组合物进行打分，从理论计算角度，筛选得到表1中打分较高的初始结构组合物。所述初始结构组合物由受体R和配体L、目标对接物按不同质量配比组成。

表1初始结构组合物打分结果

步骤3：分子动力学模拟

将获得的初始结构组合物使用Amber软件进行能量最小化以及分子动力学模拟。能量最小化采用共轭梯度法，消除体系中原子的不合理接触，在缓慢升温的过程中，对模拟体系的溶质分子进行约束保持其构象，在恒温恒压的条件下模拟体系达到热力学平衡，监测体系构象变化、温度、能量等参数。具体方法为：将组合物置于水中进行50ns的分子动力学模拟，以其加热阶段的构象作为参考结构，采用均方根偏差(RMSD)来评估组合物的稳定性。组合物的分子动力学模拟结果见表2。

表2组合物分子动力学模拟结果

通过表2中的分子动力学模拟结果可以看出，组合物1、组合物6、组合物12分别在30、32、33ns时已经收敛达到平衡，RMSD在

步骤4：结合自由能计算

利用Amber软件中的MMPBSA.py模块，采用MM-PBSA方法计算初始结构组合物的体系结合自由能，获得能量最低、最稳定的组合物；所述组合物的体系结合自由能由下式表示：

△G

△E

△G

式中，△G

表3组合物的体系结合自由能计算结果

由表3中体系结合自由能的计算结果可以看出，固定配体L，通过改变不同的受体R，所得到的组合物1的体系结合自由能最低，说明该组合物的结构最稳定。

步骤5：制备D-BL仿生物膜

依据得到的能量最低、最稳定的组合物1(DBL-8)的配方组成(质量比)：卵磷脂：胆固醇：乙酰基六肽-8：人源重组胶原＝1:0.25:0.75:1，进行D-BL仿生物膜制备，具体制备方法为：将卵磷脂和胆固醇用三氯甲烷溶解后加入到茄形瓶中，水浴超声1min，然后将茄形瓶置于35℃水浴锅中，140rpm旋蒸成膜；成膜后将茄形瓶放置于冰浴下，加乙醚溶解膜，然后向其中加入完全溶解于去离子水中的乙酰基六肽-8与人源重组胶原，使用功率为40％的探头超声，超声3s停3s，超声1min，再将其置于冰浴中140rpm旋蒸成膜，即获得DBL-8仿生物膜。

分别以上述DBL-8仿生物膜(重组胶原蛋白修饰的乙酰基六肽-8)、LIP-8(代表乙酰基六肽-8脂质体)、NLIP-8(代表乙酰基六肽-8)为受试物，在安全性、渗透性、耐酶解能力、缓释性能、功效性方面进行性能对比，具体实验和实验结果如下：

1、安全性实验评价

(1)鸡胚绒毛尿囊膜试验

准备白莱杭鸡受精鸡胚每组6只，鸡胚重量50～60g，孵化至第8日用照蛋器照蛋检查，弃未受精、无活性的鸡胚，选取血管发育良好的鸡胚，在蛋壳表面标记气室位置。称取0.3mL受试物后作用于绒毛尿囊膜(CAM)。采用0.9％的氯化钠溶液为阴性对照，0.1mol/L氢氧化钠溶液为阳性对照。第9日开始试验。用牙科弯镊小心剥去气室蛋壳部分，在蛋壳膜表面滴生理盐水使其充分润湿，倾出后，用镊子小心除去蛋壳膜，保证暴露的尿囊膜完整不受任何损伤。取0.3g受试物直接作用CAM。尽量涂布开，确保覆盖面积达到至少50％。作用3min后，用双蒸水轻轻冲洗CAM表面，在30s内冲洗完成，倾出液体，立即在体视显微镜下观察每种毒性效应变化程度，给予ES评分。在3min暴露完成后观察开始时立即拍照。根据SN/T2329-2009《化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验》中评分方法判定刺激性分类。实验结果见表4。

表4实验结果

由表4结果可见，在1％测试浓度下，DBL-8、LIP-8和NLIP-8的ES评分分别为0、8、10分，与阴性对照及阳性对照相比，其显示出无刺激性或具有轻微刺激性，且根据图2中DBL-8鸡胚绒毛尿囊膜试验图可以看出，DBL-8未看到有出血、凝血和血管溶解的情况，因此，该实验说明采用本发明方法构建的DBL-8仿生物膜具有一定的安全性，为后续的人体使用安全提供了保障。

(2)人体皮肤斑贴试验

选择30名志愿者进行皮肤封闭型斑贴试验，选用面积不超过50mm

表5斑贴实验结果

表5中的人体皮肤斑贴试验结果显示：在1％的测试浓度条件下，30人中30例出现0级不良反应，0例出现1级不良反应，0例出现2级不良反应，0例出现3级不良反应，0例出现4级不良反应，此结果说明DBL-8、LIP-8和NLIP-8在人体中使用时是安全的。

因此，结合上述鸡胚绒毛尿囊膜试验和人体皮肤斑贴试验，证实经过不同方法处理的乙酰基六肽-8均具有一定的安全性，可以将其安全的用于化妆品产品中。

2、皮肤渗透性评价

化妆品中的透皮吸收指的是化妆品中的功能性成分按产品的有效性，作用于皮肤表面或进入表皮、真皮并在该部位积聚和发挥作用的过程。化妆品功效成分的透皮吸收并不需要透过皮肤进入体循环，这是它与药物的主要区别。因此采用以下透皮试验来证明经过不同方法处理的乙酰基六肽-8的透皮吸收情况。

(1)透皮吸收试验

本实验采用乳猪皮作为皮肤模型，实验前将乳猪皮用生理盐水洗净备用。将处理好的皮肤置于扩散池中间，角质层朝向供给室，接收室中加入生理盐水，扩散池夹层水浴温度维持在(37±0.5)℃，平衡30min左右。取不同时间点溶液进行检测。使用HPLC测定乙酰基六肽-8的浓度，计算累积透皮吸收量。

由图3的累积透皮吸收量的测定结果可见，在同等活性成分下，在24h内，DBL-8、LIP-8和NLIP-8的累积透皮吸收量分别为31.04、10.47和5.06mg/cm

(2)皮肤渗透性实验

荧光素-5-异氰酸酯(FITC)的硫碳胺键可与肽链上赖氨酸的R氨基结合，形成FITC-肽结合物，具有荧光性质。本实验通过将受试物使用FITC进行荧光标记后，对FITC-肽结合物进行皮肤渗透性实验，在不同时间段30、60、120min下，使用荧光酶标仪测试其荧光强度变化。通过观察FITC-DBL-8、FITC-LIP-8、FITC-NLIP-8溶液在同等条件下皮肤中荧光强度，比较皮肤中的渗透效果。

图4结果显示：同一作用时间，DBL-8荧光强度均大于LIP-8和NLIP-8，例如在60min的条件下，DBL-8、LIP-8和NLIP-8的荧光强度分别为75AU、50AU和35AU，表明DBL-8具有更好的皮肤渗透性能。

3、耐酶解能力评价

本实验通过利用皮肤提取液模拟体外复杂酶环境，将受试物与皮肤提取液混合反应，游离的乙酰基六肽-8会与皮肤提取液中的酶进行反应并降解，酶解反应时间分别为3、60、90、120、360、1440min，后取1mL样品，与10％TRITON X-100溶液混合，超声破乳处理1min，定容至5mL。取1mL样品通过高效液相色谱检测在该酶活性环境下在不同时间点时乙酰基六肽-8的含量，从而比较DBL-8、LIP-8和NLIP-8的耐酶解能力。

图5的酶解率测试结果显示：DBL-8在各个检测时间点的酶解率均低于LIP-8和NLIP-8。DBL-8的TIC50为355.0min，LIP-8的TIC50为206.1min，NLIP-8的TIC50为100.3min，即NLIP-8和LIP-8被酶解50％所需要的时间均要短于DBL-8，DBL-8的耐酶解能力优于NLIP-8和LIP-8，说明其可以避免活性成分不被人体内的酶破坏，最终保证活性成分的效果达到最佳。

4、缓释性能评价

本实验分别移取受试物10mL至透析袋中，夹紧，放置于80mL生理盐水缓释介质中，恒温条件下恒速搅拌，并于2、4、6、8、12、24、30、36、48h定时取出1mL缓释介质，同时补充1mL新鲜的生理盐水。通过高效液相色谱检测样液中乙酰基六肽-8含量来比较各个样品的缓释性能。

通过对乙酰基六肽-8累积释放量进行拟合，在生理盐水体系中，DBL-8、LIP-8和NLIP-8的体外释放曲线均符合一级动力学方程。由图6可见，在48h后，DBL-8、LIP-8和NLIP-8的乙酰基六肽-8累积释放率分别为50％、78％和95％，DBL-8的乙酰基六肽-8累积释放率低于LIP-8和NLIP-8，该结果说明DBL-8具有一定的缓释能力，功效成分在组织中的扩散速率降低，从而延长功效成分发挥作用的时间。

5、体外功效评价

(1)透明质酸酶活性抑制试验

透明质酸酶(HAase)能够无选择地水解透明质酸钠，而得到产物β-N-乙酰葡糖胺，β-N-乙酰葡糖胺在碱性条件下可以与硼酸盐缩合生成生色原，生色原与对-二甲氨基苯甲醛(p-DMAB)在酸性条件中生色。本实验通过加入受试物来抑制透明质酸酶的活性，使其酶反应受到限制。鉴于生成体系的共轭效应，用最大吸光度下的吸光波长作为最佳选择波长，通过考察吸光度的变化，来反映受试物对透明质酸酶的抑制效率。

结果显示，在1％的测试浓度下，DBL-8、LIP-8和NLIP-8对透明质酸酶活性的抑制率分别为67.22％、42.11％和32.13％，从而说明DBL-8具有更好的舒缓修护功效。

(2)DPPH·自由基清除试验

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(简称DPPH)是一种稳定的长寿命自由基，分子内部存在有非共有电子(N·)，当与电子以及自由基反应，会转化为稳定的结构(N-H)。DPPH在醇溶液中呈深紫色，当自由基被清除，成为共价键结构后，醇溶液颜色变浅，在最大光吸收波长517nm下的吸光值下降。DPPH醇溶液褪色程度与其接受的电子数呈线性关系，从而以评价样品抗氧化能力的大小。本实验通过空白对照、阳性对照，将受试物加入到DPPH自由基溶液中，混合，摇匀，使用酶标仪在517nm处，测定吸光度并观察其颜色变化情况。

结果显示，在1％的测试浓度下，DBL-8、LIP-8和NLIP-8的DPPH·自由基的清除率分别为94.95％、47.16％和33.18％，DBL-8的抗氧化能力是LIP-8的2倍之多，证明其具有较强的抗氧化性能，并能将功效成分的作用发挥最佳。

6、人体功效评价

本测试通过招募健康的受试者，测试DBL-8、LIP-8和NLIP-8在使用前后的皮肤角质层含量、皮肤弹性R

招募合适条件的志愿者，签署知情同意书，发放产品及使用说明，分别于志愿者在使用前、使用后的4周和6周再用皮肤测试仪(水分测试探头、弹力测试探头)和VISIA-CR对上述数据进行测试，结果如下：

保湿功效：在1％测试浓度下，测试使用样品4周、6周后的样品区域的含水量，DBL-8一侧的皮肤角质层水分含量上升率分别为32.37％、42.19％，LIP-8的上升率分别为20.10％、28.15％，NLIP-8的上升率分别为11.16％、15.10％，样品间存在显著性差异，表明DBL-8保湿效果明显优于LIP-8和NLIP-8。

抗皱功效：在使用4周和6周后，DBL-8的图像皱纹面积占比相较于初始值明显减少了12.03％和12.78％，LIP-8使用后4W和6W的图像皱纹面积占比相较于初始值也有明显减少，但减少率较低，分别为7.04％、8.02％，而NLIP-8更少，此结果表明DBL-8淡化皱纹的效果明显优于LIP-8。

紧致功效：在使用4周和6周后，DBL-8的紧实度F4的变化率为13.16％、15.14％，LIP-8的紧实度F4的变化率为7.16％、9.01％，NLIP-8紧实度F4的变化率为5.06％、6.45％，此结果表明DBL-8的紧实度较LIP-8和NLIP-8更好。

舒缓功效：在使用4周和6周后，DBL-8的红区变化相较于初始值明显有所减少，且其变化程度均比LIP-8和NLIP-8的变化程度大。

受试者自我评估：连续使用测试样品6周后，受试者对DBL-8、LIP-8、NLIP-8产品的整体满意度分别为89.41％、61.25％和40.16％。

上述实验结果表明，采用本发明方法构建的D-BL仿生物膜具有安全性、靶向性、与细胞的亲和性、缓释性、耐酶解、促进透皮吸收等多种优良特性，因此，本发明方法不仅可以用于上述多肽类的大分子，也可以衍生到其他类似的肽类、蛋白类等大分子的物质，发挥其最大作用。