花椒艾叶精油微乳及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于植物化学、植物药物领域。

背景技术

花椒精油,外文名称为Chinese prickly ash oil,系从天然植物花椒果壳中提取出来的具有天然麻辣味的稠膏状流体。高纯度、高浓度的花椒精油浓缩品,具有香气浓郁、麻味纯正、使用方便等特点，既可做为食品添加剂和调味品使用，又是医药、化工不可或缺的高价值原料；加热至45"C以上为黄绿色液体,又叫花椒树脂，为含有多种成分的混合物,其中主要成分为:β-水芹烯(24.30％)、4-经基3,5-二甲氧基苯乙酮(17.3％).4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮(7.61％)、土青木香(6.938％)、9月桂烯(6.38％)、缬草妇醇(3.32％)。

艾叶，中药名。为菊科植物艾Artemisia argyi Levl.et Vant.的干燥叶。温经止血，散寒止痛；外用祛湿止痒。用于吐血，衄血，崩漏，月经过多，胎漏下血，少腹冷痛，经寒不调，宫冷不孕；外治皮肤瘙痒。醋艾炭温经止血，用于虚寒性出血。艾叶精油是一种植物精油，它是从多年生草本植物艾草中提取出的天然物质，它可以用来做香薰，也能直接涂抹肌肤，具有一定的保健和美容作用。艾叶精油的功效与作用艾叶精油有自然的香气，它能提神醒脑，也能温养经络，而且能益气活血，除此以外，它还能驱寒止痛，促进血液循环，更能增强人体免疫力，在日常生活中，人们出现关节疼痛和皮肤痛痒以及免疫力低下时，都能使用艾叶精油来调来，它能让人体出现的不良症状，尽快减轻或消失。

发明内容

花椒精油、艾叶精油，都具有稳定性差、挥发性强、不溶于水等特点，本发明希望通过制剂技术解决上述问题。

微乳(micro emulsion，ME)是水，油，表面活性剂和助表面活性剂按适当的比例混合，自发形成的各向同性，透明，热力学稳定的分散体系。除了具有乳剂的一般特征外，还具有粒径小，透明或半透明，稳定等特殊优点，在药物制剂及临床方面的应用也日益广泛，微乳是一新型理想的药物释放载体。具有透明，稳定吸收完善，靶向释药等特点，并提高了药物疗效，降低毒副作用。临床应用价值日益提高，具有很大的发展前景。

10、本发明实际是通过将花椒精油、艾叶精油制备成微乳，从而提高其稳定性和疗效。具体地，本发明提供了一种花椒艾叶精油微乳，它包括如下组份：花椒精油和艾叶精油共计10～15％、混合表面活性剂25～35％、余量为水；

其中，花椒精油与艾叶精油的质量比为2～4:6～8；

混合表面活性剂由表面活性剂与助表面活性剂的质量比1～4：1组成；

混合表面活性剂与两种精油总量的质量比为1～9:1～9；

表面活性剂选自Cremophor RH 40、Tween 60、Tween 80、Tween 80：司盘80＝7.7：3中的一种或多种的组合；

助表面活性剂选自无水乙醇、1,2-丙二醇、丙三醇、聚乙二醇400。

其中，组份配比进一步选自花椒精油和艾叶精油共计13％、混合表面活性剂30.4％、余量为水。

进一步地，表面活性剂选自Cremophor RH 40。

进一步地，助表面活性剂选自聚乙二醇400。

进一步地，花椒精油与艾叶精油的质量比为3:7。

进一步地，混合表面活性剂由表面活性剂与助表面活性剂的质量比1：1组成。

进一步地，混合表面活性剂与两种精油总量的质量比为7:3。

其中，所述微乳的粒径为41.79±1.22nm、PDI为0.059±0.026、Zate电位-3.96±1.67mV。

本发明还提供了上述花椒艾叶精油微乳的制备方法，它包括如下内容：

(1)表面活性剂与助表面活性剂均匀混合制成混合活性剂；

(2)将混合表面活性剂与花椒精油、艾叶精油混合，作为油相混合物，边搅拌边缓慢加水，使溶液由澄清变浑浊、再变澄清，即得微乳。

本发明还提供了上述花椒艾叶精油微乳在制备抑菌活性产品中的用途。

本发明还提供了上述花椒艾叶精油微乳在制备清除自由基产品中的用途。

本发明研究发现，花椒-艾叶微乳液具备良好的自由基清除能力和抑菌活性，显著优于两者的精油组合物。

附图说明

图1不同种类表面活性剂花椒-艾叶精油微乳拟三相图

图2助表面活性剂的筛选结果图

图3Km筛选结果图

图4微乳液构型分析结果图

图5微乳粒径测定结果图

图6 O/W型花椒-艾叶精油微乳微观照片：(a)比例尺200纳米，(b)比例尺50纳米

图7离心稳定性结果图

图8热稳定性结果图

图9精油微乳自由基清除率结果

图10抑菌性研究结果图

具体实施方式

本发明试验中使用的精油，购自江西雪松天然药用油有限公司，艾叶精油密度1-1.2之间，花椒精油密度在0.92-0.94之间。

实施例1

首先称取Cremophor RH 40和聚乙二醇400各1g于烧杯中，在磁力搅拌器350r/min搅拌5min，静置5min，再加入0.857g混合后的精油，搅拌10min，静置20min后，边搅拌边加水直至总重量6.58g,控制精油含量在12％以上。

实施例2

1.实验方法

1.1伪三元图的构建

首先，将表面活性剂与助表面活性剂按照一定比例均匀混合制成混合活性剂(S+Cs)，两者的质量比为Km；其次，将混合表面活性剂与花椒-艾叶精油按质量比为Smix，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，1:9，作为油相混合物，边磁力搅拌边缓慢滴加去离子水，使溶液由澄清变浑浊、再变澄清，最终记录临界点样品各成分的百分含量。按其含量的质量分数，分别以油相、水相和混表面活性剂为三相图顶点，利用Origin 8.5软件绘制拟三相图，确定微乳区域，计算微乳区域的面积。

1.2表面活性剂的筛选

将表面活性剂(Tween 60、Tween 80、Cremophor RH 40、Tween 80：司盘80＝7.7：3)和助表面活性剂(丙三醇)以质量比2：1混合搅拌，按照1.1的方法滴定，记录相转变点，按要求绘制相应的拟三元相图，并计算各微乳面积百分比及最小可稀释比。

1.3助表面活性剂的筛选

以无水乙醇、1,2-丙二醇、聚乙二醇400、丙三醇为助表面活性剂，并与Tween 80按照质量比1：2混合。记录这四种助表面活性剂在滴定过程中发生相转变的去离子水的添加量，以混合表面活性剂、精油和去离子水作为顶点用Origin制作拟三相图，并计算面积。

1.4Km的筛选

Km值为表面活性剂与助表面活性剂的质量比。以Cremophor RH 40为表面活性剂，聚乙二醇400为助表面活性剂。选取Km分别为1.0、2.0、3.0、4.0，按照1.1的方法滴定，绘制相应的拟三元相图，通过筛选，确定花椒-艾叶精油微乳体系的最佳Km。

1.5染色法鉴定微乳类型

微乳液制备完成后，依据国家标准，在储存期间，微乳液应该是清澈透明或半透明，不会分层或破乳等，视为合格。

微乳液类型采用染色法鉴定，取适量ME/CEO置于试管中，分别加入水溶性染料亚甲基蓝(1.0g/L)和油溶性染料苏丹红Ⅲ(1.0g/L)染色液各两滴，静置，观察苏丹红Ⅲ(红色)和亚甲基蓝(蓝色)染料在微乳中的扩散速度，若蓝色扩散速度快于红色，说明制备的微乳液为O/W型，反之为W/O型。

1.6微乳粒径测定

采用马尔文激光粒度仪在室温下测定粒径尺寸、多分散指数(Polydispersityindex，PDI)，zeta电位，平行测定3次，记录测试的平均粒径。

1.7透射电镜观察微乳形态

通过透射电子显微镜观察O/W型微乳的形态。将铜网置于蜡板上，滴加2μL微乳，自然风干，把质量分数2％磷钨酸(pH 7.4)滴在蜡板上，将晾干的铜网倒置于染液上，负染15min，用蒸馏水冲洗，吸干，在电镜下观察。

1.8数据处理及分析

本文采用Origin 8.5软件绘制三相图，采用SPSS21.0对数据进行显著性分析(p<0.05时，表明数据呈显著性)，采用Photoshop计算微乳面积，各组实验做三个平行。

2.实验结果

2.1花椒-艾叶精油微乳表面活性剂的筛选

表面活性剂是同时具有亲水基团和疏水基团的物质。具有同样亲水(疏水)基团的表面活性剂会因疏水(亲水)基团的不同而表现出不同的亲水亲油平衡性(HLB值)，同一系列的表面活性剂在微乳制备过程中表现不一样的乳化能力。本实验选择在制剂领域应用广泛的Tween、Cremophor两个系列的表面活性剂制备可稀释花椒-艾叶精油微乳，表面活性剂制备可稀释花椒-艾叶精油微乳的实验结果三相图如图1所示，实验结果如下表1所示。

表1不同种类表面活性剂的花椒-艾叶精油微乳相图面积的相关信息

注：DR：最小可稀释比，即混合表面活性剂与花椒-艾叶精油最小质量比。

在微乳拟三元相图中，微乳区域面积大小能够反映活性物质的载量，混合表面活性剂和花椒-艾叶精油的最小可稀释比能够反映制备可稀释微乳的最小表面活性剂用量。由表1可以看出，以微乳区面积为指标，表面活性剂的微乳形成能力大小依次为：CremophorRH 40>Tween 60>Tween 80。本实验所有四种不同表面活性剂相比，其中Cremophor RH 40的最小可稀释比为6：4，综合考虑乳化面积，本实验选择Cremophor RH 40作为表面活性剂。

2.2助表面活性剂的筛选

微乳助表面活性剂应用最广泛的是短链醇，助表面活性剂作用于界面膜表面活性剂分子之间，降低液面张力，形成微乳球状分子所需的液面曲率，提高界面流动性，调节表面活性剂的HLB值，提高乳化效率。本实验选用无水乙醇、1,2-丙二醇、丙三醇、聚乙二醇400作为助表面活性剂进行优选，实验结果如下所示。

表2

结果显示，当助表面活性剂为聚乙二醇400时，微乳区域的面积比最大，达到7.52％，流动性好，微乳最稳定，说明聚乙二醇400作为助表面活性剂时可以更好地降低体系黏度，提高流动性，降低液面张力，调节水相、油相在界面的分布，而且聚乙二醇-400刺激性小。

2.3Km的筛选

Km值在很大程度上决定了微乳面积的大小，对于不同的乳化体系，Km的值也有所区别。本文选择乳化效果较好的Cremophor RH 40与聚乙二醇400以Km为1、2、3和4的比例进行混合，考察不同Km值对花椒-艾叶精油微乳面积大小的影响。由表可知，微乳面积随着 Km值增大而减小， 由 8.34％下降到4.88％。这表明Km值较高时，较高浓度的表面活性剂由于缺少助表面活性剂的助乳化作用而导致自身微乳形成能力的降低。结合微乳区的面积和微乳液的稳定性来说，当Km值为1时是表面活性剂和助表面活性剂的最佳比例。

表3

2.4花椒-艾叶精油微乳液构型分析

染色法判定微乳液的类型是基于“相似相溶”，水溶性染料亚甲基蓝在水相中扩散速度快，而油溶性的苏丹III在油相中扩散速度较快。通过比较分析两种染液的扩散速度来判断微乳液的类型是一种比较直观的方法。

从图4可以直观的看出，微乳液中亚甲基蓝的扩散速度快于苏丹III，表明本研究所制备的花椒-艾叶精油微乳液为O/W型。O/W型微乳液在实际应用中具有更高的价值，因为它具有在不改变其结构的条件下能够被水无限稀释的特性。

2.5微乳粒径测定结果分析

Zetasizer Nano可以为胶体和聚合物提供综合测量的三项最重要参数，即粒度、zeta电位和PDI。微乳粒径是一个重要表征指标，可通过粒径大小判断是否为微乳，微乳的粒径一般为10-100nm，zeta电位和PDI可表明微乳的稳定性。本实验结果如图5所示。

本实验以RH-40为表面活性剂，PEG-400为助表面活性剂，Km＝1，Smix＝7：3，制备14％的花椒-艾叶精油微乳，测定结果：粒径为41.79±1.22nm、PDI为0.059±0.026、Zate电位-3.96±1.67mV，结果表明微乳粒径较小，PDI分散均匀，带负电荷，体系稳定。

2.6透射电镜分析

花椒-艾叶精油微乳液在Km＝1，Smix＝7：3，制备13％的花椒-艾叶精油微乳，稀释10倍处理后的透射电镜图如图所示，微乳颗粒表面呈凹凸的球状分布，从图中可知该微乳体系中粒子分散均匀、不聚集。图6(a)是在放大倍数和电压是100000×100kv，比例尺200nm条件下拍摄，微乳颗粒呈单一球形、均匀分散；图6(b)是在放大倍数和电压是400000×100kv，比例尺为50nm条件下拍摄，呈球形或椭圆形，体系具有光学透明性，此时的液滴是O/W型。该结果表明微乳体系均一，稳定。

实施例3

1稳定性研究

1.1离心稳定性

取适量制备的精油微乳，分别于4000r/min、7000r/min、10000r/min下离心30min，以去离子水为空白对照，测定离心前后微乳在550nm处的吸光度，按公式(3-1)计算透光率：

T(％)＝A

式中：T：透光率；

A

A

1.2热稳定性

将微乳分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅中，加热30min，以去离子水为空白对照，测定在550nm下的吸光度，透光率计算公式如(3-2)：

T(％)＝A

式中：T：透光率；

A

A

1.3储藏稳定性

将精油微乳样品置于4℃、25℃下储藏，在第1、3、5、9、15d时分别测定微乳的透光率和粒径。

T(％)＝A

式中：T：透光率；

A

A

2pH测定

利用pH计进行测定。

3自由基清除率的研究

由于DPPH在室温下具有稳定的自由基和独特的紫红色，紫色的强度(517nm)在被电子或抗氧化化合物的氢自由基还原后会减弱，那么植物提取物/化合物/挥发油的抗氧化能力则取决于它们减少DPPH自由基的能力，而DPPH自由基是通过记录吸光度值的降低来测量的。因此，本实验通过研究精油及微乳对DPPH自由基的清除能力来考察其抗氧化活性。

配制浓度为0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液，贮存于避光棕色瓶中。取不同精油含量微乳溶液2.0mL，各加入DPPH乙醇溶液2.0mL与微乳混合摇匀后在暗处避光反应30min，在517nm下测定吸光度A

DPPH自由基清除率计算公式如下:

清除率(％)＝(A

4抑菌性研究

菌悬液的制备：在无菌工作台上，用接种环刮下菌种放入无菌生理盐水中，震荡混匀。用无菌生理盐水稀释，使菌悬液浓度为1×106cfu/ml。

花椒-艾叶精油及其微乳液抑菌活性的测定：

本实验采用平板涂布法测定花椒-艾叶精油及其微乳的抑菌活性。首先制备培养基；然后在超净工作台中，将20mL培养基倒入无菌培养皿中，冷却凝固备用。吸取100uL的106cfu/mL的菌悬液于培养基的表面，涂布均匀，待菌悬液渗透后，打孔器打孔直径为6mm的孔，滴加精油含量为13％微乳液和13％的精油，另设置无菌生理盐水、表面活性剂和助表面活性剂空白对照组。最后，细菌在37℃下培养48h，真菌在28℃下培养14d，观察抑菌效果。

最低抑菌浓度测定：

采用微量二倍稀释法测定细菌的最低抑菌浓度，将花椒-艾叶精油(用无菌水稀释，获得4.667、3.111、2.074、1.383、0.922、0.615、0.410、0.273％的精油。分别上样无菌MH肉汤培养基100μL和200μL不同样品溶液，吸取第一个孔200μL于第二个孔，依次直到第八个孔弃掉200μL，再每孔加入100μL菌液，最后得到共8个浓度梯度(精油含量4.667、3.111、2.074、1.383、0.922、0.615、0.410、0.273％)。阳性对照孔细菌生长，呈浑浊状，阴性对照孔无细菌生长，呈澄清、透明状。肉眼观察其他各孔情况，如果孔内澄清、透明，则没有细菌生长。没有细菌生长的最低稀释度即为最低抑菌浓度。

采用二倍稀释法，将培养基和精油微乳提取液均匀混合，制作含药培养基共得到8个浓度梯度(精油含量7.80、3.9、1.95、0.975、0.487、0.244、0.122、0.061％)，凝固后分别取100.00μL菌悬液注入固体培养基表面，用无菌涂布棒涂布均匀，放置5min，然后放入培养箱中进行真菌培养14d-21d。

5实验结果

5.1稳定性分析

5.1.1离心稳定性分析

微乳在不同转速下离心30min，考察微乳的离心稳定性，以便为其储备条件提供依据。实验结果如表4和图7所示。

从实验结果可以看出，微乳经不同转速离心总体均未出现浑浊分层现象，始终保澄清透明状态。在离心速率4000-7000r/min范围内，随着转速增大，透光率增大，这可能是随着离心加速度变大，油相和表面活性剂混合更均匀；而离心速率在7000-10000r/min时，微乳的透光率降低，可能是离心加速度过大，导致部分微乳颗粒聚集，使透光率下降。综上所述，微乳具有较好的离心稳定性。

表4

5.1.2热稳定性

将微乳在不同温度下加热30min，考察微乳在不同温度下的稳定性，为其实际应用提供依据。图8是不同加热温度下微乳液外观变化情况。

非离子表面活性剂在水中的溶解性受温度的影响，温度较高时，水与聚氧乙烯链的氢键被破坏，表面活性剂在水中溶解度迅速下降而析出，从而导致体系产生浑浊或分层，此现象称之为起昙，温度称之为昙点，当环境温度比昙点低时，一些体系恢复澄清透明，有的则难以恢复。微乳液是一种表面活性剂含量较高的体系，考察热稳定性是必要的。从图8和表5肉眼观察结果显示，在不同加热温度下，微乳液的外观清澈透明，透光率均保持在99％以上，微乳显示出较好的热稳定性。

表5

5.1.3储藏稳定性

将精油微乳样品置于4℃、25℃下储藏，在第0、10、15、30、45d时分别测定微乳的透光率和粒径。在25℃条件下保存，微乳粒径增加的幅度少于4℃储藏条件时的，但两者的差异不大。在25℃储藏条件下，粒径和PDI的变化幅度不大，储藏时间为45天时，粒径增加仅为3.42nm，PDI的增加值仅为0.137。在4℃条件下储藏45天，粒径从40.93nm增加到45.78nm，PDI从0.034增加到0.246。分析原因可能是在4℃条件下，精油形成的固体态晶体会破坏微乳界面膜，破坏微乳结构，使微乳颗粒粒径增大，均一性变差，同时低温环境会降低颗粒的热能，在储藏的过程中颗粒发生少量聚集，这表明低温环境不利于微乳的储藏。综上所述，本实验结果表明，与低温相比，在25℃恒温环境下储藏的微乳能够保持良好的稳定性，更有利于花椒-艾叶精油微乳的储藏。

表6微乳在不同温度下储藏过程中粒径和PDI的变化

5.2pH值测定

正常情况下健康皮肤正常pH值为4.5～6.5，本品在不加pH调节剂的情况下，pH值为6.03-6.05，制剂中性，与正常皮肤pH值接近，对皮肤无刺激性。

5.3精油微乳自由基清除率

DPPH自由基清除率是评价物质抗氧化能力的一种简便快捷、灵敏可行的方法，常作为检测物质抗氧化活性的指标。DPPH的醇溶液表现为深紫色，在517nm波长处有最大吸收。在DPPH分子结构中带有未配对电子的氮原子可以捕获自由基，当体系中有自由基清除剂存在时，它将与DPPH分子上的单个电子原子配对，形成DPPH-H形式，使体系颜色变浅，吸光度值会降低。采用DPPH法分析了精油及其微乳液的体外抗氧化作用。结果表明，精油及其微乳液均显示出对DPPH自由基清除效果，且自由基清除能力与浓度呈正相关。花椒-艾叶微乳液对DPPH自由基的清除能力优于花椒-艾叶精油(P<0.05)，但要弱于阳性对照VC对DPPH自由基的清除能力(P<0.05)，如图9所示。表明微乳液能增加精油在水相环境中的DPPH自由基清除能力。

5.4抑菌性研究

本实验采用打孔法测定了不同浓度精油及其微乳的抑菌性，观察滤纸片周围有无菌落生长，无菌落生长则会出现抑菌圈。此实验方法可明显观察出不同浓度的精油及其微乳的抑菌效果，为后续实验提供理论依据，实验结果表7-9和图10所示。其中A

表7 13％精油及微乳抑菌圈直径

表8花椒-艾叶精油微乳最低抑菌浓度(1)

注:-表示抑菌；+表示细菌生长；++表示细菌生长旺盛

表9花椒-艾叶精油微乳最低抑菌浓度(2)

注:-表示抑菌；+表示细菌生长；++表示细菌生长旺盛。