一种沙门菌和停乳链球菌双重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种沙门菌和停乳链球菌双重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法。

背景技术

随着人民生活水平的提高，人们对生鲜乳的需求激增，但微生物极易在生鲜乳中生存，进而影响了生鲜乳品质。因此，提升奶源品质对人们身体健康至关重要。

沙门菌是一种重要的食源性致病菌，是食品安全中主要检测对象之一，其在生鲜乳中的相关报道也很多，其一般无特异性宿主，可以感染人和多种动物。停乳链球菌广泛存在于大自然中，如奶牛饮用水的水源，分泌的乳汁，以及皮肤上，其也是引起奶牛患病的常见链球菌之一，传染性强。上述病原菌严重影响养殖场奶牛的饲养，对养殖场经济效益带来了巨大威胁。因此，针对上述病原菌的高效诊断显得尤为重要。传统的检测方法一般采取细菌的分离鉴定，一般需要3-7天才能完成，耗时费力，不适用于临床快速检测。

因此，迫切需要建立一种快速、准确性高，适用于临床诊断的沙门菌与停乳链球菌的联合检测方法。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供一种沙门菌和停乳链球菌双重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法。

本发明技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种沙门菌和停乳链球菌双重荧光定量PCR检测的引物和探针组合物，包括：沙门菌invA基因的引物及探针；停乳链球菌gapC基因的引物及探针；

沙门菌invA基因的引物及探针的序列如下：

invA-F：GCTTTACCACTGTCTGGCGG；

invA-R：CGTGGCATGTCTGAGCACTT；

invA-FAM探针：FAM-ATCCTTGACGGACCACACCGTGGTGGT-BHQ1；

invA-FAM探针序列的的5'端标记有荧光报告基团FAM，3'端标记有荧光淬灭基团BHQ1；

停乳链球菌gapC基因的引物及探针的序列如下：

gapC-F：GGCTAAGCTCTTCACGATGC；

gapC-R：ACAATGTTTGCAGCACCAGC；

gapC-CY5探针：CY5-GGCGCGCAACGTCAATGAA-BHQ2；

gapC-CY5探针序列的的5'端标记有荧光报告基团CY5，3'端标记有荧光淬灭基团BHQ2。

相对于现有技术，本发明选取沙门菌invA基因和停乳链球菌gapC基因为诊断靶标进行引物的设计并标记探针，本发明上述沙门菌和停乳链球菌的引物相互之间不会产生干扰，可以满足多重PCR的要求，能够在同一PCR体系中，同时完成沙门菌和停乳链球菌的检测，较单重的荧光定量PCR更加高效，省时省力。

第二方面，本发明还提供用于非诊断目的的试剂盒，包括上述沙门菌和停乳链球菌双重荧光定量PCR检测的引物和探针组合物。

优选地，还包括阴性对照、阳性对照、荧光PCR反应液和ddH

第三方面，本发明还提供一种沙门菌和停乳链球菌的双重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

S1:获得DNA模板；

S2:将上述DNA模板进行双重荧光定量PCR反应；

S3:结果分析和判定；

所述S2中双重荧光定量PCR反应体系为：

上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

本发明建立的沙门菌和停乳链球菌的双重荧光定量PCR检测方法，与常见的无乳链球菌、乳房链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌等无交叉反应，特异性好，灵敏度分别为1.56×10

优选地，双重荧光定量PCR反应体系为：

优选地，步骤二中反应体系的反应条件为37℃污染消化2min，95℃预变性5min，然后，95℃10s；60℃退火30s，反应45个循环。

第四方面，本发明还提供上述方法用于检测鉴定沙门菌invA基因和停乳链球菌gapC基因的用途。

第五方面，本发明还提供上述方法用于检测鉴定沙门菌和停乳链球菌的用途。

优选地，具体指用于检测乳制品中的沙门菌和停乳链球菌。

优选地，获得乳制品中DNA模板的提取方法为EDTA-Triton-HCL法、Chelex-100法或煮样法。

附图说明

图1为沙门菌invA基因与停乳链球菌gapC基因的T载体菌液电泳图；

图2为荧光定量PCR引物浓度优化；

图3为荧光定量PCR探针浓度优化；

图4为沙门菌invA基因与停乳链球菌gapC基因双重荧光定量PCR；

图5为沙门菌荧光定量PCR标准曲线；

图6为停乳链球菌荧光定量PCR标准曲线；

图7为沙门菌invA基因与停乳链球菌gapC双重荧光定量PCR特异性检测；

图8为沙门菌invA基因与停乳链球菌gapC基因双重荧光定量PCR灵敏性检测；

图9为停乳链球菌常规PCR灵敏度检测；

图10为沙门菌常规PCR灵敏度检测；

图11为沙门菌与停乳链球菌人工污染生鲜乳的双重qPCR特异性检测；

图12为沙门菌与停乳链球菌人工污染生鲜乳的双重qPCR灵敏性检测；

图13为停乳链球菌的人工污染乳常规PCR灵敏性试验；

图14为沙门菌人工污染乳常规PCR灵敏性试验；

图15为人工污染生鲜乳中细菌DNA提取方法的筛选。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

下述微生物均由石河子大学人兽共患病试验室储存。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

(1)沙门菌和停乳链球菌样品DNA的提取

于超净工作台中，以1：1 000的比例，将实验室保存的菌种转接于LB或TSB培养基中，放至恒温培养箱中进行培养，使其OD值至0.5左右。吸取细菌培养液，根据天根生化科技有限公司的细菌DNA试剂盒(DP302)说明书，依次对沙门菌、停乳链球菌进行核酸提取。最后将得到的DNA产物保存在-20℃，以防DNA降解。

(2)沙门菌和停乳链球菌标准质粒的构建

1.invA基因和gapC基因的PCR扩增

分别将设计的沙门菌定量引物invA-F，invA-R和停乳链球菌gapC-F，gapC-R，并以提取的细菌DNA为模板，完成PCR扩增反应，具体反应条件如表1、表2所示。并使用2％琼脂糖凝胶进行电泳，观察试验结果。

表1沙门菌invA基因PCR反应体系与程序

表2停乳链球菌gapC PCR反应体系与程序

2.PCR扩增产物的纯化

事先准备好洁净的EP管，将含有目的基因的琼脂糖凝胶快速切下，装入管中。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行核酸扩增产物的回收、纯化。使用Nano Drop 2000测定DNA浓度，做好标记。

3.T载体的连接与转化

参照TaKaRa的pMD

表3测试结果

实施例1沙门菌和停乳链球菌双重qPCR检测方法的建立

(一)沙门菌和停乳链球菌引物的设计与合成

登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)，分别查找沙门菌invA基因(登录号：NC_003197.2)、停乳链球菌gapC基因(登录号：AF375662.1)并下载。参考引物设计原则进行引物与探针的设计如下，由安徽通用公司负责合成。

沙门菌invA基因的引物及探针的序列如下：

上游引物invA-F：GCTTTACCACTGTCTGGCGG；

下游引物invA-R：CGTGGCATGTCTGAGCACTT；

invA-FAM探针：FAM-ATCCTTGACGGACCACACCGTGGTGGT-BHQ1；

所述停乳链球菌gapC基因的引物及探针的序列如下：

上游引物gapC-F：GGCTAAGCTCTTCACGATGC；

下游引物gapC-R：ACAATGTTTGCAGCACCAGC；

gapC-CY5探针：CY5-GGCGCGCAACGTCAATGAA-BHQ2。

(二)沙门菌与停乳链球菌荧光定量PCR检测方法的建立

2.1沙门菌invA基因和停乳链球菌gapC基因荧光定量PCR反应体系初建

依据AceQ Universal U+Probe Master Mix V2试剂的说明书，建立荧光定量PCR反应体系。具体如表4。

表4荧光定量PCR反应体系

2.2沙门菌与停乳链球菌荧光定量PCR引物浓度的优化

分别使用ddH

2.3沙门菌与停乳链球菌荧光定量PCR探针浓度的优化

以上述优化后的最适引物浓度进行探针最佳浓度的摸索。分别对沙门菌与停乳链球菌的CY-5探针和FAM探针的浓度进行梯度稀释，分别为50nM/L，100nM/L，150nM/L，200nM/L，250nM/L。结果如图3所示。从图3可知，沙门菌invA基因的TaqMan探针最佳浓度均为250nM/L。停乳链球菌当TaqMan探针引物浓度为250nM/L时，所建立的停乳链球菌荧光定量PCR反应体系扩增更好。

(三)沙门菌与停乳链球菌双重荧光定量PCR检测方法的建立

分别取沙门菌重组质粒pMD19-T-invA和停乳链球菌重组质粒pMD19-T-gapC混匀，并对新的组合质粒命名为pMD19-T-invA-gapC。以上述优化后的荧光定量PCR体系进行沙门菌与停乳链球菌双重qPCR反应体系的建立。

将沙门菌与停乳链球菌的混合质粒作为模板，以无酶水为阴性对照进行试验。反应体系：Mix 12.5μL；0.4μM invA-F 1.0μL；0.4μM invA-R 1.0μL；250nM invA-FAM 0.5μL；0.2μM gapC-F 1.0μL；0.2μM gapC-R 1.0μL；250nM gapC-CY5 0.5μL；ddH

图4为沙门菌invA基因与停乳链球菌gapC基因双重荧光定量PCR；1，沙门菌invA基因扩增曲线；2：停乳链球菌gapC基因扩增曲线；3，阴性对照扩增曲线。结果表明：本试验建立的沙门菌与停乳链球菌双重荧光定量扩增效果良好。

(四)沙门菌与停乳链球菌荧光定量PCR标准曲线的绘制

将构建的pMD19-T-invA标准质粒，使用无菌去离子水进行不同浓度的倍比稀释，得到质粒浓度为1.56×10

图5为沙门菌荧光定量PCR标准曲线；1-6，质粒拷贝数分别为：1.56×10

实施例2反应特异性评价

为了验证沙门菌与停乳链球菌双重qPCR的特异性，分别以沙门菌和停乳链球菌混合重组质粒、缓慢葡萄球菌、乳房链球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、海氏肠球菌、LM90、LM EDG-e、产色葡萄球菌基因组DNA为模板，以无酶水为阴性对照。反应体系：Mix 12.5μL；0.4μMinvA-F 1.0μL；0.4μM invA-R 1.0μL；250nM invA-FAM 0.5μL；0.2μMgapC-F 1.0μL；0.2μM gapC-R 1.0μL；250nM gapC-CY5 0.5μL；ddH

图7为沙门菌invA基因与停乳链球菌gapC双重荧光定量PCR特异性检测；1，沙门菌与停乳链球菌混合质粒DNA；2-10，依次为缓慢葡萄球菌、乳房链球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、海氏肠球菌、LM90、LM EDG-e、产色葡萄球菌基因组DNA；11，阴性对照。结果表明：所建立的双重qPCR特异性高。

实施例3反应灵敏性评价

分别以沙门菌pMD19-T-invA和停乳链球菌pMD19-T-gapC重组质粒为模板，使用梯度稀释法将两个重组质粒分别进行倍比稀释，进行双重qPCR反应检测灵敏性试验，双重qPCR反应同具体实施例2。将稀释后的标准质粒，使用定量引物进行扩增，与qPCR进行灵敏度对比。

图8为沙门菌invA基因与停乳链球菌gapC基因双重荧光定量PCR灵敏性检测；1-9，分别为1.5×10

实施例4

沙门菌与停乳链球菌人工污染生鲜乳双重qPCR检测方法特异性评价

分别使用沙门菌、停乳链球菌、产色葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、无乳链球菌、海氏肠球菌、大肠杆菌、LM90、乳房链球菌进行人工污染生鲜乳，以未掺菌乳作为阴性对照，以ddH

图11为沙门菌与停乳链球菌人工污染生鲜乳的双重qPCR特异性检测；1，沙门菌和停乳链球菌混合基因组DNA；2-11，分别为缓慢葡萄球菌、乳房链球菌、人葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌、海氏肠球菌、LM90、LM EDG-e、产色葡萄球菌基因组DNA；12，阴性对照；13，空白对照。结果表明，本发明所提供的检测方法具有良好特异性，可以实现对乳样中沙门菌与停乳链球菌的检测。

实施例5

沙门菌与停乳链球菌人工污染生鲜乳荧光定量PCR灵敏性评价

将沙门菌活化，使用比浊仪测定菌落总数，初始浓度约为3.11×10

图12为沙门菌与停乳链球菌人工污染生鲜乳的双重qPCR灵敏性检测；1-8：停乳链球菌CFU为：2.76×10

实施例6

将培养后的沙门菌、停乳链球菌分别与生鲜乳混合，进行人工样品的污染。为了能提升验证沙门菌与停乳链球菌荧光定量PCR检测方法的临床效果，同时排除生鲜乳中其他因素的干扰，本发明对生鲜乳DNA提取方法进行筛选。

分别采用EDTA-Triton-HCL法、试剂盒法、煮样法、Chelex-100法、EtNa法、NaOH裂解法、NaOH-Tris-HC裂解法、PBS裂解法对乳样进行细菌DNA提取，对提取后的DNA进行双重qPCR检测，并以沙门菌基因组DNA和停乳链球菌基因组DNA为阳性对照，ddH

表5人工污染生鲜乳中DNA提取后双重qPCR反应平均Ct值

图15为人工污染生鲜乳中细菌DNA提取方法的筛选；A为沙门菌人工污染生鲜乳中细菌DNA提取方法的筛选，1，沙门菌基因组DNA；2，试剂盒法；3，NaOH-Tris-HCL裂解法；4，NaOH裂解法；5，PBS裂解法；6：煮样法；7，Chelex-100法；8，EtNa法；9，EDTA-Triton-HCL法；10，阴性对照；B停乳链球菌人工污染生鲜乳中细菌DNA提取方法的筛选，1，停乳链球菌基因组DNA；2，EDTA-Triton-HCL法；3，试剂盒法；4，煮样法；5，Chelex-100法；6，EtNa法；7，NaOH裂解法；8，NaOH-Tris-HC裂解法；9，PBS裂解法10，阴性对照。由图15A和图15B结果可知，对于本发明所建立的检测方法，沙门菌人工污染乳样最佳DNA提取方法为Chelex-100法，平均Ct值为12.5710，其次为煮样法、EDTA-Triton-HCL法、NaOH-Tris-HC裂解法；停乳链球菌人工污染乳样最佳DNA提取方法为EDTA-Triton-HCL法，平均Ct值为10.8947，其次为试剂盒提取法、煮样法、Chelex-100法。因此，综合两种细菌提取方法，推荐使用EDTA-Triton-HCL法、Chelex-100法和煮样法。以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。