一种功能香基配方的解析方法

技术领域

本发明涉及香料成分剖析技术领域，尤其涉及一种功能香基配方的解析方法。

背景技术

天然香料是指未经过加工处理，通过物理方法提取或精炼而不改变其原始成分的香料，相较于人工合成香料，天然香料因香气物质成分丰富饱满，更具香韵等优势，被广泛应用于食品、药品、烟草、化妆品和奢侈品中进行增香除味、杀菌防腐。近年来，在烟草行业实施“减害降焦”工程后，烟味变淡，香气减弱，难以被消费者所接受。所以卷烟企业通过加香技术使卷烟在燃烧过程中产生的香气成分与天然香料中香气成分相互作用来改善卷烟消费体验，且利用不同天然香料具有不同的指纹特征，形成具有独特风味和功效的香烟品牌。因此，以传统中草药(例如：菊苣、苜蓿、当归、枸杞子、蒲公英等)为主要研究目标的天然植物香原料的成分剖析以及功能香基模块的应用开发成为烟草行业香精香料研发的热点。

从基质复杂的化合物中解析更多成分对于功能香基溯源研究至关重要，更多成分的解析通常与实验装置中使用的提取技术直接相关。目前，常规的提取方法包括：液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、液相微萃取(LPME)。LLE由于不改变物质结构和化学性质、萃取效率高、易于操作和成本低等优势被广泛用于组分复杂且物质含量差异大的混合物的分离。然而，常规的LLE萃取容量有限、且萃取效率与萃取剂选择紧密相连，对于复杂基质，无法获取更为丰富的成分信息。而功能香基是含有多种香味成分的、具有一定香型的混合物，成分相对复杂，除溶剂、少量挥发性成分外，还含有大量的糖、酸、色素、蜡质等成分，复杂的基底会导致低含量香味成分的信息被掩盖，导致功能香基配方解析的准确度较低。因此，利用LLE萃取基质复杂的天然香料时无法进行准确的定性定量分析以及溯源研究。

此外，成分剖析技术为烟用香精香料的“成分可知”提供必要的分析手段。目前，成分剖析技术的方法包括采用GC-MS分析并结合自建调香系统软件，对未知的香精样品进行成分剖析；也可以利用二氯甲烷超声提取香精和单体香原料的挥发性成分，进行GC-MS进样分析。二者均借鉴了GC-MS强大的定性能力，并结合相应的化学计量学及系统软件，对香精样品进行成分剖析。GC-MS检测虽然能够获得丰富的三维数据，但是通过人工筛查、核对的方式得到化学成分中暗含的关系不仅耗时耗力，还可能存在信息发现不彻底的问题。因此，亟需提供一种高效、且检测结果准确度高的功能香基配方的解析方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效、且检测结果准确度高的功能香基配方的解析方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种功能香基配方的解析方法，包括以下步骤：

(1)对多种天然香料提取物水溶液分别进行极性梯度萃取，得到每种天然香料提取物水溶液的各梯度萃取的有机相和最后一次萃取的水相；所述极性梯度萃取时，按照有机溶剂的极性参数从小到大的顺序依次进行萃取；所述有机溶剂的极性参数为0～4；

(2)将所述步骤(1)得到的各种天然香料提取物水溶液的各梯度萃取的有机相和水相分别进行干燥，然后分别采用GC-MS进行定性分析，得到预处理数据；所述预处理数据包括各梯度萃取的有机相和水相中的提取成分的相对百分含量；

(3)根据所述步骤(2)得到的预处理数据进行有监督模式的化学计量模式识别分析，建立PLS-DA等回归模型或OPLS-DA等回归模型，根据变量重要性因子>1和ANOVAp<0.05的标准筛选出标志性差异化合物作为天然香料的特征成分，得到天然香料的特征成分数据库；

(4)按所述步骤(1)～(3)中处理天然香料提取物水溶液的方法对待解析功能香基水溶液进行处理，得到功能香基的特征成分，将所述功能香基的特征成分与所述步骤(3)得到的天然香料的特征成分数据库进行建模分析得到PLS-DA得分图或OPLS-DA得分图，在所述PLS-DA得分图或OPLS-DA得分图中以天然香料和功能香基的特征成分之间的平方距离为判断依据，按照所述平方距离由小到大的顺序排列，取对应的前八种天然香料，判定为待解析功能香基中含有所述八种天然香料中的一种或多种。

优选地，所述步骤(1)中极性梯度萃取的梯度次数为3～5次。

优选地，所述有机溶剂为正己烷、甲基叔丁基醚、1,2-二氯乙烷、乙酸正丁酯和正丁醇中的三种以上。

优选地，所述步骤(1)中天然香料提取物水溶液中的天然香料提取物包括菊苣提取物、角豆提取物、酸角提取物、苜蓿提取物、当归提取物、葡萄干提取物、无花果提取物、梅子提取物、罗马春黄菊提取物、枸杞子浸膏、蒲公英浸膏、麦芽浸膏、枣酊、山楂酊和缬草根酊中的一种。

优选地，所述步骤(1)中天然香料提取物水溶液的质量浓度为5～20％。

优选地，所述步骤(1)中极性梯度萃取时每个梯度萃取的有机溶剂与待萃取水相的体积之比为3:1～1:2。

优选地，所述步骤(1)中极性梯度萃取时每个梯度的萃取时间为10～50min。

优选地，所述步骤(3)中得到的水相干燥后，经衍生化处理后再采用GC-MS进行定性分析。

优选地，所述衍生化处理的衍生化试剂为BSTFA和TMCS的混合溶液，所述TMCS占BSTFA的体积百分比为1～10％。

优选地，所述步骤(3)中GC-MS进行定性分析的参数包括：

色谱参数包括：色谱柱为SH-Rxi-5MS毛细管气相色谱柱，型号为30m×0.25mm,0.25μm；采用高纯氦气作为载气，流量为1～3mL/min；采用分流模式，有机相样品的分流比为10:1，水相样品的分流比为15:1；进样口温度为200～300℃，有机相的进样量为1μL，水相样品的进样量为0.2μL；设定温度程序为：初始温度在40℃保持2min，然后以6℃/min的速率上升到300℃，并在此温度下保持20min；

质谱条件包括：离子源温度为200～230℃；电离电压为70eV；扫描模式为全扫描模式，有机相的扫描范围为33amu～550amu，水相样品的扫描范围为33amu～1050amu。

本发明提供了一种功能香基配方的解析方法，本发明通过采用极性梯度萃取分别对天然香料提取物水溶液进行萃取，将在水油两相中分配系数具有差异的化学成分进行梯度分离，得到不同极性范围的化学成分，天然香料提取物经过极性梯度萃取处理后，能有效降低复杂基质的影响，减少高含量化学成分对痕量化学成分的掩盖作用，利于抓住被主要成分掩盖的关键次要成分，进而能够得到更为丰富的提取物质信息，为准确解析功能香基配方提供丰富的数据基础；本发明通过分别对极性梯度萃取得到的各梯度萃取的有机相和最后一次萃取的水相采用GC-MS进行定性分析，然后进行有监督模式(PLS-DA和OPLS-DA)的化学计量模式识别分析，建立PLS-DA等回归模型或OPLS-DA等回归模型，根据变量重要性因子(VIP)>1和ANOVAp<0.05的标准筛选出标志性差异化合物作为天然香料的特征成分，得到天然香料的特征成分数据库；再利用同样方法对待解析功能香基水溶液进行处理，得到功能香基的特征成分，将所述功能香基的特征成分与所述天然香料的特征成分数据库进行建模分析得到PLS-DA得分图或OPLS-DA得分图，在所述PLS-DA得分图或OPLS-DA得分图中以天然香料和功能香基的特征成分之间的平方距离为判断依据，按照所述平方距离由小到大的顺序排列，取对应的前八种天然香料，判定为待解析功能香基中含有所述八种天然香料中的一种或多种。本发明提供的用于提取特征成分的回归模型具有良好的交叉验证预测能力；通过限定VIP>1和ANOVAp<0.05的标准能够筛选出天然香料的特征成分，能够简化数据，且更有利于准确地解析功能香基的配方。实施例结果显示，本发明提供的方法对4种功能香基进行相同的分离检测分析后，模式识别溯源正确率可以达到87.5％，而企业标准功能香基配方解析出的前八种天然香料中正确率达到70％以上则认为香基配方溯源成功。因此，本发明提供的方法对于功能香基配方的解析具有较高的准确性。

附图说明

图1为本发明极性梯度萃取实验流程图；

图2为本发明不同萃取方式对萃取效果影响结果图；

图3为本发明极性萃取的萃取时间对萃取效率影响结果图；

图4为本发明O/W对萃取效果的影响结果图；

图5为本发明15种天然香料的化学成分分析结果图；

图6为本发明4种功能香基的特征成分与15种天然香料筛选出的特征成分数据库进行的多元统计分析图。

具体实施方式

本发明提供了一种功能香基配方的解析方法，包括以下步骤：

(1)对多种天然香料提取物水溶液分别进行极性梯度萃取，得到每种天然香料提取物水溶液的各梯度萃取的有机相和最后一次萃取的水相；所述极性梯度萃取时，按照有机溶剂的极性参数从小到大的顺序依次进行萃取；所述有机溶剂的极性参数为0～4；

(2)将所述步骤(1)得到的各种天然香料提取物水溶液的各梯度萃取的有机相和水相分别进行干燥，然后分别采用GC-MS进行定性分析，得到预处理数据；所述预处理数据包括各梯度萃取的有机相和水相中的提取成分的相对百分含量；

(3)根据所述步骤(2)得到的预处理数据进行有监督模式的化学计量模式识别分析，建立PLS-DA等回归模型或OPLS-DA等回归模型，根据变量重要性因子>1和ANOVAp<0.05的标准筛选出标志性差异化合物作为天然香料的特征成分，得到天然香料的特征成分数据库；

(4)按所述步骤(1)～(3)中处理天然香料提取物水溶液的方法对待解析功能香基水溶液进行处理，得到功能香基的特征成分，将所述功能香基的特征成分与所述步骤(3)得到的天然香料的特征成分数据库进行建模分析得到PLS-DA得分图或OPLS-DA得分图，在所述PLS-DA得分图或OPLS-DA得分图中以天然香料和功能香基的特征成分之间的平方距离为判断依据，按照所述平方距离由小到大的顺序排列，取对应的前八种天然香料，判定为待解析功能香基中含有所述八种天然香料中的一种或多种。

本发明对多种天然香料提取物水溶液分别进行极性梯度萃取，得到每种天然香料提取物水溶液的各梯度萃取的有机相和最后一次萃取的水相。

在本发明中，所述天然香料提取物水溶液中的天然香料提取物优选包括菊苣提取物、角豆提取物、酸角提取物、苜蓿提取物、当归提取物、葡萄干提取物、无花果提取物、梅子提取物、罗马春黄菊提取物、枸杞子浸膏、蒲公英浸膏、麦芽浸膏、枣酊、山楂酊和缬草根酊中的一种。本发明通过采用上述天然香料提取物中的一种进行梯度萃取，能够获知每种天然香料提取后的有机相和水相中的提取物。在本发明中，所述天然香料提取物水溶液的质量浓度优选为5～20％，更优选为10～20％。本发明优选在建立数据库时，可以对天然香料提取物的总数进行调整，所述天然香料提取物的总数优选为10～15个，更优选为15个。本发明采用的上述天然香料提取物为烟草行业常用的香精香料组分，含有丰富的香气成分，以其作为原料来获取天然香料的特征成分数据库更有利于准确解析功能香基的配方。本发明对所述天然香料提取物的来源没有特殊限定，采用常规的市售产品即可。在本发明中，所述天然香料提取物优选由湖南中烟工业有限责任公司(长沙，中国)提供。

本发明对所述极性梯度萃取的操作方法没有特殊限定，采用常规的极性梯度萃取的操作方法即可。在本发明中，所述极性梯度萃取的方法优选包括：(a)将第一有机溶剂与天然香料提取物水溶液混合，进行第一梯度的萃取，离心分层后得到第一梯度萃取的有机相和第一梯度萃取的水相；(b)将第二有机溶剂与所述步骤(a)第一梯度萃取的水相混合，进行第二萃取，离心分层后得到第二梯度萃取的有机相和第二梯度萃取的水相，以此类推，将每个梯度萃取后得到的水相与下一梯度的有机溶剂混合，进行萃取，直至设定次数的最后一次梯度萃取，得到最后一次萃取的有机相和最后一次萃取的水相。

在本发明中，所述极性梯度萃取时，按照有机溶剂的极性参数从小到大的顺序依次进行萃取。本发明按照有机溶剂的极性参数从小到大的顺序，依次采用不同极性的有机溶剂对天然香料提取物水溶液进行极性梯度萃取，能够将在水油两相中分配系数具有差异的化学成分进行梯度分离，得到不同极性范围的化学成分。本发明对所述极性梯度萃取的梯度次数没有特殊限定，根据需要进行调整即可。在本发明中，所述极性梯度萃取的梯度次数优选为3～5次，更优选为5次。

在本发明中，所述有机溶剂的极性参数为0～4。本发明采用上述极性参数的有机溶剂对天然香料提取物水溶液进行极性梯度萃取，能够将天然香料提取物水溶液的提取物充分分离。本发明对所述极性梯度萃取时，每次梯度萃取的有机溶剂的极性参数没有特殊限定，有机溶剂的极性参数在0～4的范围内选择，且极性梯度萃取时按照有机溶剂的极性参数从小到大的顺序进行即可。

在本发明中，所述有机溶剂优选为正己烷、甲基叔丁基醚、1,2-二氯乙烷、乙酸正丁酯和正丁醇中的三种以上，更优选为正己烷、甲基叔丁基醚、1,2-二氯乙烷、乙酸正丁酯和正丁醇。本发明通过选用上述有机溶剂进行极性梯度萃取，更有利于分离出更多的提取物。

在本发明中，所述极性梯度萃取时每个梯度萃取的有机溶剂与待萃取水相的体积之比优选为3:1～1:2，更优选为1:1。在本发明中，所述极性梯度萃取时每个梯度萃取的有机溶剂与待萃取水相的体积之比记为O/W，本发明通过将O/W控制在上述范围，能够防止O/W太大时有机相太多导致萃取容量较大，进一步导致分配系数小或者浓度小的化学成分跟随分配系数大、含量高的物质部分萃取至有机相，检测时这些物质可能由于含量太低被掩盖；又能防止O/W太小时水相过多造成乳化严重，分层界面不清晰，不利于萃取实验的顺利进行；故本发明将O/W控制在上述范围时能够提高萃取效率。

在本发明中，所述极性梯度萃取时每个梯度的萃取时间优选为10～50min，更优选为30～40min。本发明将每个梯度的萃取时间控制在上述范围时既能够达到萃取平衡，又能够防止时间过长导致热敏感或易氧化的组分发生了降解或氧化，进而可提高萃取效率。

在本发明中，所述极性梯度萃取时每个梯度的萃取温度优选为5～25℃，更优选为5～10℃。本发明将极性梯度萃取时每个梯度的萃取温度控制在上述范围时能够防止温度过高导致热敏感或易氧化的组分发生了降解或氧化，进而可提高萃取效率。

本发明通过采用极性梯度萃取分别对多种天然香料提取物水溶液进行极性梯度萃取，能有效降低复杂基质的影响，减少高含量化学成分对痕量化学成分的掩盖作用，利于抓住被主要成分掩盖的关键次要成分，进而能够得到更为丰富的提取物质信息，为准确解析功能香基配方提供数据基础。

得到各梯度萃取的有机相和最后一次萃取的水相后，本发明将所述各梯度萃取的有机相和水相分别进行干燥，然后分别采用GC-MS进行定性分析，得到预处理数据，所述预处理数据包括各梯度萃取的有机相和水相中的提取成分的相对百分含量。

本发明对所述各梯度萃取的有机相和水相分别进行干燥的方法没有特殊限定，采用常规的干燥方法即可。在本发明中，所述各梯度萃取的有机相干燥的方法优选为向所述各梯度萃取的有机相中投加无水硫酸钠，充分干燥后，进行过滤得到有机相样品。本发明对所述过滤的方法没有特殊限定，采用常规的过滤方法即可。在本发明中，所述过滤优选为采用0.22μm有机针式滤膜过滤。在本发明中，所述水相的干燥方法优选为冷冻干燥。本发明对所述冷冻干燥的温度和时间没有特殊限定，根据需要进行调整，能够使水相充分干燥即可。

本发明优选在对水相干燥后，将干燥得到的固体经衍生化处理后再采用GC-MS进行定性分析。本发明对所述衍生化处理的方法没有特殊限定，采用常规的衍生化处理的方法即可。在本发明中，所述衍生化处理的方法优选为将水相干燥后得到的固体溶于盐酸羟胺无水吡啶溶液，在70℃下加热30min，冷却至室温得到混合溶液；向所述混合溶液中加入衍生化试剂，70℃下加热30min，冷却至室温。本发明采用上述衍生化处理的方法能够利用吡啶作为酸清除溶剂，使副产物HCl在引入GC-MS系统之前除去。在本发明中，所述盐酸羟胺无水吡啶溶液的浓度优选为30mg/mL；所述衍生化处理的试剂优选为BSTFA和TMCS的混合溶液，所述TMCS占BSTFA的体积百分比优选为1～10％，更优选为1％。

在本发明中，所述GC-MS进行定性分析的参数优选包括：色谱参数优选包括：色谱柱为SH-Rxi-5MS毛细管气相色谱柱，型号为30m×0.25mm,0.25μm；采用高纯氦气作为载气，所述高纯氩气的纯度优选为：99.999％，载气的流量优选为1～3mL/min，更优选为1mL/min；采用分流模式，有机相样品的分流比为10:1，水相样品的分流比为15:1；进样口温度优选为200～300℃，更优选为300℃，有机相的进样量为1μL，水相样品的进样量为0.2μL；设定温度程序为：初始温度在40℃保持2min，然后以6℃/min的速率上升到300℃，并在此温度下保持20min；

质谱条件优选包括：离子源温度为200～230℃；电离电压为70eV；扫描模式为全扫描模式，有机相的扫描范围为33amu～550amu，水相样品的扫描范围为33amu～1050amu。本发明对所述GC-MS进行定性分析时的溶剂延迟时间没有特殊限定，根据溶剂的不同进行选择即可。本发明通过限定上述GC-MS进行定性分析的参数，能够使成分复杂的物质大部分达到最好的分离状态，便于在此方法下检测到最多的物质；具体地，本发明通过限定色谱柱的种类和型号能够在最少的时间达到最大的分离效果；通过高纯氦气作为载气可以避免检测时色谱峰出现异常(如：基线偏高、鬼峰、负峰等)，也可以避免杂质气体(如：氢气、氧气)与样品反应，并减少色谱柱流失；本发明通过限定载气的流量能够使不同的提取物充分分离；本发明通过根据溶剂的选择去调整溶剂延迟时间，能够去除溶剂饱和的影响。

在本发明中，所述GC-MS进行定性分析的方法优选为：采用全扫描模式采集分析物的总离子流色谱图和质谱图，利用GC-MS岛津再分析软件(岛津，日本)进行数据预处理，将每个色谱峰的质谱裂解图与NIST17标准谱库检索对比，选取匹配分数≥80以上的物质作为初步定性依据，将各梯度萃取的有机相检测得到的组分峰面积经归一化处理后计算相对百分含量，最后一次萃取的水相衍生化样品的峰面积单独进行归一化处理后计算相对百分含量。

得到预处理数据后，本发明将所述预处理数据进行有监督模式(PLS-DA和OPLS-DA)的化学计量模式识别分析，建立PLS-DA等回归模型或OPLS-DA等回归模型，根据变量重要性因子(VIP)>1和ANOVAp<0.05的标准筛选出标志性差异化合物作为天然香料的特征成分，得到天然香料的特征成分数据库。

本发明对所述有监督模式(PLS-DA和OPLS-DA)的操作方法没有特殊限定，采用常规的分析方法获取即可。

本发明优选对所述预处理数据进行无监督模式(PCA和HCA)分析，以从整体了解香料中化合物的分布。本发明对所述无监督模式的操作方法没有特殊限定，采用常规的分析方法获取即可。

在本发明中，所述特征成分优选为进行归一化处理后的相对表达变化显示为聚类热图，本发明通过聚类热图可以对数据库进行可视化。在本发明中，聚类热图是将对象变量按相似程度距离远近划分类别，使得同一类中元素的相似性比其它类元素的相似性更强，能够使类间元素的同质性最大化和类与类间元素的异质性最大化。

得到天然香料的特征成分数据库后，本发明按所述处理天然香料提取物水溶液的方法对待解析功能香基水溶液进行处理，得到功能香基的特征成分，将所述功能香基的特征成分与所述天然香料的特征成分数据库进行建模分析得到PLS-DA得分图或OPLS-DA得分图，在所述PLS-DA得分图或OPLS-DA得分图中以天然香料和功能香基的特征成分之间的平方距离为判断依据，按照所述平方距离由小到大的顺序排列，取对应的前八种天然香料，判定为待解析功能香基中含有所述八种天然香料中的一种或多种。

在本发明中，对待解析功能香基水溶液进行处理的方法与上述处理天然香料提取物水溶液的方法相同，此处不再进行赘述。

本发明对所述待解析功能香基水溶液的待解析功能香基的种类没有特殊限定，根据需要解析的香基进行选择即可。在本发明中，为了判断溯源方法的准确性，本发明采用已知配方的功能香基为研究对象。在本发明中，所述功能香基优选为由湖南中烟工业有限责任公司(长沙，中国)提供的香基A、香基B、香基C和香基D。在本发明中，所述功能香基水溶液的质量浓度优选为75～90％。

在本发明中，极性梯度萃取和定性分析的实验流程图优选如图1所示。本发明采用极性梯度萃取分别对天然香料提取物水溶液进行萃取，然后将得到各梯度萃取得到的有机相和最后一次萃取得到的水相经干燥后采用CC-MS进行定性分析。本发明通过采用极性梯度萃取分别对天然香料提取物水溶液进行萃取，能够得到更为丰富的提取物质信息，为准确解析功能香基配方提供数据基础；本发明通过对极性梯度萃取得到的各梯度萃取的有机相和最后一次萃取的水相采用GC-MS进行定性分析，然后进行有监督模式的化学计量模式识别分析，建立PLS-DA等回归模型或OPLS-DA等回归模型，根据VIP>1和ANOVAp<0.05的标准筛选出标志性差异化合物作为天然香料的特征成分，得到天然香料的特征成分数据库。因此，本发明提供的方法对于功能香基配方的解析具有较高的准确性。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种功能香基配方的解析方法，步骤为：

(1)对15种天然香料提取物水溶液分别进行极性梯度萃取，得到每种天然香料提取物水溶液的各梯度萃取的有机相和最后一次萃取的水相；其中，15种天然香料提取物分别为菊苣提取物、角豆提取物、酸角提取物、苜蓿提取物、当归提取物、葡萄干提取物、无花果提取物、梅子提取物、罗马春黄菊提取物、枸杞子浸膏、蒲公英浸膏、麦芽浸膏、枣酊、山楂酊和缬草根酊；

极性梯度萃取的具体方法为：将天然香料用去离子水溶解制备成质量浓度为10％的天然香料提取物水溶液，按照有机溶剂极性梯度大小将实验设计成五级梯度液-液萃取，梯度设计的有机溶剂顺序依次为正己烷、甲基叔丁基醚、1,2-二氯乙烷、乙酸正丁酯和正丁醇；

先取正己烷和天然香料提取物水溶液O/W(18:18,v:v)在5℃水浴恒温振荡器条件下充分振荡30min进行第一梯度的萃取，然后以3000r/min的转速在高速旋转离心机下离心3～5min分层，得到有机层和第一萃取的水相；取第一萃取的水相进入下一步萃取，以甲基叔丁基醚为第二有机溶剂，保持O/W＝1:1，重复操作，得到第二梯度萃取的有机相和第二梯度萃取的水相；取第二萃取的水相进入下一步萃取，以1,2-二氯乙烷为第三有机溶剂，保持O/W＝1:1，重复操作，得到第三梯度萃取的有机相和第三梯度萃取的水相；取第三萃取的水相进入下一步萃取，以乙酸正丁酯为第四有机溶剂，保持O/W＝1:1，重复操作，得到第四梯度萃取的有机相和第四梯度萃取的水相；取第四萃取的水相进入下一步萃取，以正丁醇为第五有机溶剂，保持O/W＝1:1，重复操作，得到第五梯度萃取的有机相和第五梯度萃取的水相；

(2)向所述步骤(1)得到的各种天然香料提取物水溶液的各梯度萃取的有机相分别加入适量无水硫酸钠充分干燥，经0.22μm有机针式滤膜过滤，然后采用GC-MS进行定性分析；将所述步骤(1)得到的水相经冷冻干燥后进行衍生化处理，步骤为：移取0.1mL极性梯度萃取最后一步萃取的萃余水相，置于1.5mL衍生化小瓶中，真空冷冻干燥；加入0.2mL 30mg/mL盐酸羟胺无水吡啶溶液，70℃下加热30min，冷却至室温；快速加入0.6mLBSTFA(含1％TMCS)，70℃下加热30min，冷却至室温，取样经0.22μm有机针式滤膜过滤后进行GC-MS分析；

GC-MS进行定性分析的参数为：采用SH-Rxi-5MS(30m×0.25mm,0.25μm)毛细管气相色谱柱进行分离；色谱条件：采用高纯氦气(纯度：99.999％)作为载气，流量为1mL/min；采用分流模式，萃取有机相分流比为10:1，萃余水相衍生化样品分流比为15:1。进样口温度为300℃，萃取有机相进样量为1μL，萃余水相衍生化样品进样量为0.2μL；设定温度程序如下：初始温度在40℃保持2min，然后以6℃/min的速率上升到300℃，并在此温度下保持20min；质谱条件：离子源温度为230℃；电离电压为70eV；扫描模式为全扫描模式(Scan)，萃取有机相扫描范围为33amu～550amu，水相衍生化扫描范围为33amu～1050amu；溶剂延迟时间为正己烷相、甲基叔丁基醚相和1,2-二氯乙烷相4.5min、乙酸正丁酯相12min、正丁醇相13.5min、水相衍生化样品为7.5min；

定性分析采用全扫描模式采集分析物的总离子流色谱图和质谱图，利用GC-MS岛津再分析软件(岛津，日本)进行数据预处理，将每个色谱峰的质谱裂解图与NIST17标准谱库检索对比，选取匹配分数≥80以上的物质作为初步定性依据；五种萃取有机相检测得到的组分峰面积经归一化处理后计算相对百分含量，萃余水相衍生化样品的峰面积单独进行归一化处理后计算相对百分含量，得到预处理数据；

(3)根据所述步骤(2)得到的预处理数据进行有监督模式(PLS-DA和OPLS-DA)的化学计量模式识别分析，建立PLS-DA和OPLS-DA等回归模型，根据VIP>1和ANOVAp<0.05的标准筛选出标志性差异化合物作为天然香料的特征成分，得到天然香料的特征成分数据库；

具体为：本实施建立PLS-DA和OPLS-DA等回归模型寻找特征物质；R

(4)按所述步骤(1)～(3)中处理天然香料提取物水溶液的方法对质量浓度为75％的待解析功能香基水溶液(待解析功能香基为由湖南中烟工业有限责任公司(长沙，中国)提供的香基A，由枸杞子、梅子、葡萄干和无花果的体积比为10:10:10:10组成)进行处理，得到功能香基的特征成分，将所述功能香基与天然香料特征成分数据库进行建模分析，在OPLS-DA得分图中以天然香料的特征成分和功能香基的特征成分之间的平方距离为判断依据，按照所述平方距离由小到大的顺序排列，取对应的前八种天然香料，判定为功能香基中含有所述八种天然香料中的一种或多种。

实施例2

与实施例1不同之处在于步骤(4)中待解析功能香基水溶液(待解析功能香基为由湖南中烟工业有限责任公司(长沙，中国)提供的香基B，由蒲公英、酸角、菊苣、角豆、葡萄干和麦芽按体积比为10:5:10:5:15:15组成)。

实施例3

与实施例1不同之处在于步骤(4)中待解析功能香基水溶液(待解析功能香基为由湖南中烟工业有限责任公司(长沙，中国)提供的香基C，由罗马春黄菊、山楂酊、枣酊、当归、苜蓿、梅子、无花果和缬草根酊按体积比为15:5:5:8:12:8:8:5组成)。

实施例4

与实施例1不同之处在于步骤(4)中待解析功能香基水溶液(待解析功能香基为由湖南中烟工业有限责任公司(长沙，中国)提供的香基D，由罗马春黄菊、菊苣、枸杞子、无花果、当归、角豆、苜蓿、山楂酊、麦芽和蒲公英按体积比为12:8:5:5:12:10:10:5:8:5组成)。

实施例5

与实施例1不同之处在于步骤(4)中待解析功能香基水溶液的浓度为90％，其余与实施例1相同。

实施例6

与实施例2不同之处在于步骤(4)中待解析功能香基水溶液的浓度为90％，其余与实施例2相同。

实施例7

与实施例3不同之处在于步骤(4)中待解析功能香基水溶液的浓度为90％，其余与实施例3相同。

实施例8

与实施例4不同之处在于步骤(4)中待解析功能香基水溶液的浓度为90％，其余与实施例4相同。

实施例9

萃取的对象为菊苣提取物，与实施例1不同之处在于，极性梯度萃取时每次梯度萃取的时间为10min，其余步骤与实施例1相同。

实施例10

萃取的对象为菊苣提取物，与实施例1不同之处在于，极性梯度萃取时每次梯度萃取的时间为20min，其余步骤与实施例1相同。

实施例11

萃取的对象为菊苣提取物，与实施例1不同之处在于，极性梯度萃取时每次梯度萃取的时间为40min，其余步骤与实施例1相同。

实施例12

萃取的对象为菊苣提取物，与实施例1不同之处在于，极性梯度萃取时每次梯度萃取的时间为50min，其余步骤与实施例1相同。

实施例13

萃取的对象为菊苣提取物，与实施例1不同之处在于，极性梯度萃取时每次梯度萃取的O/W为3:1，其余步骤与实施例1相同。

实施例14

萃取的对象为菊苣提取物，与实施例1不同之处在于，极性梯度萃取时每次梯度萃取的O/W为2:1，其余步骤与实施例1相同。

实施例15

萃取的对象为菊苣提取物，与实施例1不同之处在于，极性梯度萃取时每次梯度萃取的O/W为1:2，其余步骤与实施例1相同。

对比例1

以菊苣提取物为对象，分别采用正己烷、甲基叔丁基醚、1,2-二氯乙烷、乙酸正丁酯和正丁醇对菊苣提取物进行单级液-液萃取(SLLE)。

具体方法为：取正己烷和菊苣提取物水溶液O/W(18:18,v:v)在5℃水浴恒温振荡器条件下充分振荡30min进行萃取，得到有机相和水相；按照同样的方法分别将甲基叔丁基醚、1,2-二氯乙烷、乙酸正丁酯和正丁醇对菊苣提取物单级液-液萃取，得到有机相和水相；将得到的有机相和水相分别按照实施例1的方法干燥后进行GC-MS进行定性分析。

测试例

(1)图2为不同萃取方式对萃取效果影响结果图；实施例1对菊苣提取物水溶液进行极性梯度萃取后有机相得到的总离子流色谱图如图2A所示，实施例1和对比例1对菊苣提取物水溶液进行萃取后萃取剂和萃取梯度设置的影响如图2B所示。实施例1的方法在有机相中检测到97种物质，对比例1的方法在有机相中检测到70种物质，且在实施例1提供的方法中检测到的独有化学成分高于在对比例1的SLLE方法中检测到的独有化学成分；从图2B也可以看出，除了正己烷相中极性梯度萃取检测到的化学成分个数略低于SLLE且两者唯一检测到的化学成分个数相等以外，其余有机溶剂中使用极性梯度萃取方法所得到的化学成分个数以及在此种溶剂中唯一检测到的化学成分个数都大于或等于SLLE方法。溶剂中唯一检测到的物质个数可以表明所选择的每一种溶剂都有存在的必要性。极性梯度萃取相比于SLLE能使更多的物质萃取出来，可能原因是天然香料化学成分丰富，含量差异较大，不同的物质在不同的有机溶剂中具有不同的分配行为，经过梯度萃取将分配系数大的物质含量降低同时低于有机溶剂萃取容量时，分配系数小的物质就可能被萃取至有机溶剂中富集，所以使用多种不同极性溶剂对这种具有复杂体系的天然香料进行梯度萃取相较于传统的单级萃取会有更好的效果，为准确解析功能香基提供丰富的数据基础。

(2)图3为极性梯度萃取的萃取时间对萃取效率影响结果图，即实施例1、实施例9～12对菊苣提取物水溶液进行极性梯度萃取后萃取时间对菊苣在萃取有机相、萃余水相衍生化中物质个数和峰面积的影响。从图3可以看出，在萃取时间为10～50min时，均具有较好的萃取效果，但是在萃取时间为30min时，有机相中物质个数略低于其余时间点，而水相衍生化中物质个数以及有机相和水相衍生化样品的峰面积均为最大值，可能原因是萃取时间低于30min时没有达到萃取平衡，而高于30min时，一些热敏感或易氧化的组分发生了降解或氧化；因此，选择30min作为天然香料的最佳液-液萃取时间。

(3)图4为实施例1、实施例13～15对菊苣提取物水溶液进行极性梯度萃取时O/W对萃取效果影响结果图，即O/W对菊苣在萃取有机相、萃余水相衍生化中物质个数和峰面积的影响。极性梯度萃取从图4可以看出，随着O/W相比从3:1(v/v)到1:2(v/v)，菊苣萃取有机相中物质个数呈现一个先下降后上升的过程，萃取有机相峰面积由于更多水相的加入呈现先上升后微微下降的效果；O/W相比为1:2(v/v)时，有机相中峰面积下降的原因可能是由于实验过程中乳化较为严重导致的。随着相比的增加，菊苣水相衍生化样品中峰面积呈现逐步上升的趋势；在O/W为1:1(v:v)时水相衍生化样品中物质个数最多，O/W为1:2(v/v)时物质个数略有下降，可能原因是O/W＝1:2时有机溶剂达到了萃取容量，所以很多物质留在了最后一步萃取的水相中，导致衍生化样品中物质浓度增加，掩盖了一些痕量化学成分。综合考虑实验结果与实验过程简便、高效的情况下，选择O/W＝1:1(v/v)作为天然香料最佳萃取相比条件。

(4)实施例1步骤(2)检测结果显示，菊苣提取物在极性梯度萃取体系中共检测到143种物质，其中有机相样品中96种物质，水相衍生化样品中47种物质。正己烷相中检测到30种物质，甲基叔丁基醚相中检测到55种物质，1,2-二氯乙烷相中检测到33种物质，乙酸正丁酯相中检测到28种物质，正丁醇相中检测到16种物质，各萃取相中存在着物质重叠现象。菊苣在极性梯度萃取中检测到的成分按照官能团分为烃类、醚类、酯类、羰基类(包括醛类、酮类)、胺类、醇类、酚类、酸类、其它类。不同萃取有机相和萃余水相衍生化样品检测到的物质个数和含量结果显示大部分为酯类、醇类、酸类、糖类物质，而糖类和醇类占据了水相衍生化样品相对含量的65.55％。本发明提供的极性梯度萃取体系，可以减小高含量物质对痕量物质的掩盖作用，以便获取到香料中更多的化学成分信息用于后续特征成分寻找，并通过建立的特征成分数据库进行功能香基的溯源研究。

(5)实施例1中15种天然香料的化学成分分析

如图5A和图5B所示为15种天然香料在有机相中和水相衍生化中检测到的不同种类化学成分相对含量的分布以及物质总个数的分布情况。结合两张图可以看出，烃类、羰基类、酚类化合物几乎均在萃取的有机相中检测出来，而醇类、糖类物质大多都在水相衍生化样品中检测出来；有机相中蒲公英和枸杞子所得到的化学成分信息最多，水相衍生化中所得到的化学成分信息，除酸角略低一些外，差别不大，可能原因是萃余水相本身留下的就是以氨基酸、有机酸、糖类为主的高极性、高沸点化学物质，而衍生化旨在改变特定官能团得到目标产物，所以通过同一种衍生化方案得到的物质差别不大；菊苣、角豆、酸角和蒲公英中几乎没有检测到胺类物质；葡萄干、无花果、麦芽中酸类物质含量较小；蒲公英中含有较多的酸类物质；角豆中糖含量较高。

(6)实施例1中15种天然香料的定性定量结果建立PCA模型，PC1和PC2得分的2D散点图共同解释了总方差的69.73％(R

(7)实施例1中15种天然香料特征成分的提取和识别

15种天然香料建立的回归模型参数如表1所示，均具有良好的拟合参数来表明模型的准确度(R

表1实施例1中15种天然香料建立的回归模型参数

表2实施例1中15种天然香料的特征成分数据分类情况

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(8)实施例1～8中4种功能香基成分分析结果

通过GC-MS进行定性定量分析可知，质量浓度75％和90％的功能香基A分别匹配物质133和166个；质量浓度75％和90％的功能香基B分别匹配172和141个物质；质量浓度为75％和90％的功能香基C匹配物质个数分别为186和215个；质量浓度75％和90％的功能香基D匹配物质个数分别为203和143个。由于香基本身就是不同香料按不同比例调配而成，所以达到最佳萃取状态的质量浓度是不一致的。化学计量模式识别方法可以捕获大量的微量成分信息，从而消除浓度变化引起的干扰，并成功溯源香基配方。

(9)图6显示了实施例1～4中4种功能香基的特征成分与15种天然香料筛选出的特征成分数据库(VIP>1andANOVAp<0.05)之间的多元统计分析结果。基于企业标准，功能香基配方解析出的前八种天然香料中正确率达到70％以上则认为香基配方溯源成功。如图6A所示，为香基A与特征成分数据之间建立的OPLS-DA(UV)得分图，R

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。