一种纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及物理化学胶束领域和药剂学领域，具体涉及一种纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂及其制备方法，以及其作为抗菌剂的应用。

背景技术

二氢杨梅素，分子式C

目前对此类化合物增溶的方法有纳米微粒法、微胶囊法、囊泡法、乳化法等。相比其他方法，利用表面活性剂的乳化增溶方法，制备过程简单有效，可以形成均一稳定的纳米体系。然而，传统乳化法在制备胶束的过程中通常需要油相来溶解药物，而目前常用的油相是二氯甲烷和植物油，前者作为一种有机试剂，毒性较大，不适合使用在皮肤上，且在挥发的过程中有残留，对环境也会造成一定污染；而后者，由于两次连续的溶解，最终导致形成的乳液浓度低。因此，在无油相的条件下制备一种高溶解度的植物源活性因子纳米级乳液或胶束，是当今学术界亟待解决的关键科学问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂及其制备方法与其作为抗菌剂的应用。

本发明的实现过程如下：

一种纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂，由以下质量百分比的组分组成：

聚乙二醇2000，0.10％；

薄荷精油，0.17％；

丙二醇，0.19％；

茶树精油，0.33％；

丙三醇，0.50％；

二氢杨梅素，1.30％；

聚乙二醇400，3.11％；

椰油酰胺丙基甜菜碱，5.50％；

脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸，8.80％；

去离子水，80.00％。

上述纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1)按质量百分比称取二氢杨梅素、薄荷精油和茶树精油，并置于样品瓶中，室温搅拌至二氢杨梅素粉末完全润湿，成为粘土状混合物，备用；

2)按质量百分比称取脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸、椰油酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇400，并置于样品瓶中，在水浴锅中加热搅拌至完全溶解为透明的粘稠混合物，冷却后备用；

3)按质量百分比称取去离子水、聚乙二醇2000、丙二醇和丙三醇，并置于样品瓶中，在水浴锅中加热至完全溶解为透明无色水溶液，冷却后备用；

4)将1)和2)得到的两种混合物置于同一个样品瓶中，室温下缓慢搅拌至完全溶解为透明无色粘稠混合物，继续搅拌，同时迅速加入3)得到的水溶液，直至完全分散，形成半透明或乳白色混合物，冷却至室温，所得即为纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂，装上封口膜，至于4℃冰箱中冷藏保存。

进一步，步骤(2)中，水浴锅的加热温度为45℃。

进一步，步骤(3)中，水浴锅的加热温度为60℃。

上述纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂中二氢杨梅素作为唯一活性成分在制备抗菌药物中的应用。

本发明的设计思路：本发明为了得到可有效增溶二氢杨梅素并用于抗菌剂的纳米胶束型二氢杨梅素，采用在乳化法的基础上，舍弃油相，直接以液态的表面活性剂溶解植物源活性成分二氢杨梅素，首次以脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸 (AEC-9H)、椰油酰胺丙基甜菜碱、聚乙二醇400混合物作为溶媒和表面活性剂，完成了一种纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂的组分设计、制备步骤、抗自由基清除和抑菌活性工作，以解决现有技术中存在的缺陷。

本发明的积极效果：

(1)本发明方法制备所得的纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂，其活性成分二氢杨梅素在水中的浓度最高可达为13.0mg/mL。

(2)抗菌剂中不含有有机溶剂、人工香料、色素等组分，具有自然环保、安全系数高、易于贮存、成分可降解的巨大优势，且不会产生耐药菌(超级细菌)。

(3)抗菌剂的水合粒子尺寸为77.98±12.28nm，带负电荷，Zeta电位为 -28.0±3.37mV，可以在低于40℃的水中稳定分散。

(4)本发明所得纳米胶束型的二氢杨梅素对0.1mmol/L的DPPH自由基清除率为94.6±0.4％，可快速高效的清除自由基。

(5)本发明所得纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂具有良好的杀菌活性，0.2mL 的抗菌剂可以完全杀灭2mL溶液中的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，杀菌率 100％，菌液浓度均为1*10

附图说明

图1为系列质量分数的二氢杨梅素实验样品的透过率图；

图2为纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂的丁达尔效应对比图，其中a为光照前， b为光照后；

图3为纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂的储存稳定性对比图，其中a为15天前，b为15天后；

图4为纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂的温度稳定性对比图；

图5为纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂的杀菌活性实验结果图；

图6为自由基清除实验中空白对照组和实验组的吸光度测试图；

图7为纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂在水溶液中的粒度分布图；

图8为纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂在水溶液中的ζ-电位图。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明，但不以此来定义本发明。

实施例1

本实施例100g的纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂，由以下组分组成：

聚乙二醇2000，0.10g；

薄荷精油，0.17g；

丙二醇，0.19g；

茶树精油，0.33g；

丙三醇，0.50g；

二氢杨梅素，1.30g；

聚乙二醇400，3.11g；

椰油酰胺丙基甜菜碱，5.50g；

脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸(AEC-9H)，8.80g；

去离子水，80.00g。

上述纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：

1)将其按照质量分数为1.30g的二氢杨梅素、0.17g的薄荷精油和0.33g的茶树精油依次在电子天平上称量相应质量于5mL样品瓶中，室温下缓慢搅拌，直至精油将二氢杨梅素粉末完全润湿，成为浅黄色粘土状混合物，备用。

2)将其按照质量分数为8.8g的脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸(AEC-9H)、5.50g的椰油酰胺丙基甜菜碱、3.11g的聚乙二醇400，在电子天平上称量相应质量于5mL 样品瓶中，在45℃磁力搅拌水浴锅中加热至完全溶解为透明浅黄色粘稠混合物，冷却后备用。

3)将按照质量分数为80.00g的去离子水、0.10％的聚乙二醇2000、0.19g 的丙二醇和0.50g的丙三醇，依次在电子天平上称量相应质量于50mL样品瓶中，在60℃磁力搅拌水浴锅中加热至完全溶解为透明无色水溶液，冷却后备用。

4)将1)和2)得到的两种混合物充分置于100mL样品瓶中，室温下缓慢搅拌，至完全溶解为透明无色粘稠混合物，继续搅拌，同时迅速加入3)得到的水溶液，直至完全分散，形成半透明或乳白色混合物，冷却至室温，所得即为纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂(DMYNanomicelles)，装上封口膜，至于4℃冰箱中冷藏保存。

结论：本发明方法制备所得的纳米胶束型二氢杨梅素在水中的浓度约为13.0 mg/mL。其中不含有有机溶剂、人工香料、色素等组分，具有自然环保、安全系数高、易于贮存、成分可降解、且不易产生多药耐药性的巨大优势。

本发明组分中二氢杨梅素的最佳质量浓度的选定

固定表面活性剂AEC-9H在体系中的质量分数为8.8％，增加二氢杨梅素在其中的浓度，当体系中二氢杨梅素质量分数达到1.7％时，室温放置3-5即天有沉淀产生。然后配制系列质量分数的二氢杨梅素实验样品，测定在860nm处测定透过率，根据图1，最终我们选定的二氢杨梅素的最佳质量分数为1.3％。

丁达尔效应实验

实施例1所得的纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂是均一稳定的纳米胶束，具有良好的丁达尔效应，见图2。

稳定性实验

储存稳定性：将实施例1所得的纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂密封在样品瓶中，室温条件下存储15天。从图3的对比结果看，实验样品均未出现分层、沉淀、或浑浊现象，所以本发明方法所得的纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂的稳定性良好，易于贮存。

温度稳定性：将实施例1所得的纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂分别置于5℃、 25℃、40℃的恒温环境中，保存1天。从图4的对比结果看，实验样品均未出现分层、沉淀、或浑浊现象，所以本发明方法所得的纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂的稳定性良好，易于贮存。

杀菌活性实验

菌落计数法：选择革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌作为模型。将0.2mL的纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂原液、2mL的PBS缓冲溶液和 20μL的标准细菌悬液加入离心管中，在37℃恒温环境中接触1小时，然后将混合液稀释10倍，取20μL滴加到LB琼脂板上，涂布均匀，平板在37℃恒温培养箱中培养18小时，手动计算菌落数。根据以下公式计算薄膜的杀菌效率：

结论：纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂能够有效杀死革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)，杀菌率均为100％，见图5。

抗氧化活性实验

使用0.1mmol的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)测定纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂的抗氧化活性。具体的步骤如下

(1)配置浓度为0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液，轻微振荡使其完全溶解得到深紫色的DPPH无水乙醇溶液，置于低温5℃且避光处4h以上备用。

(2)分别设置空白对照组(2.9mL的DPPH溶液+0.1mLEtOH)以及实验组(2.9mL的DPPH溶液+0.1mL纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂)，每组有三个平行实验，将以上三组实验配置好后，避光静置1h，取出，用紫外-可见分光光度计在测定517nm处测量混合体系的吸光度。

(3)利用以下公式计算自由基清除率，用来评估米胶束型二氢杨梅素的抗氧化活性(AOA)。

公式中AOA表示自由基清除率，A

用稳定的纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂原液进行自由基清除实验，测定吸光度，如图6所示。计算自由基清除率，可达94.6±0.4％。

结论：本发明所得的纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂对0.1mmol/L的DPPH自由基清除率为94.6±0.4％，可快速高效的杀灭体外DPPH自由基。

粒度分布和ζ-电位

使用马尔文ZS90动态光散射仪，在室温下测量纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂在水溶液中的粒度分布和ζ-电位，见图7和图8。

结论：纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂的平均直径为77.98±12.28nm，Zeta电位为-28.0±3.37mV，胶束表面带负电荷。

本发明所述纳米胶束型二氢杨梅素抗菌剂中包含唯一的活性成分二氢杨梅素，对0.1mmol/L的DPPH自由基清除率为94.6±0.4％，对10

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作出的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施仅限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干简单推演或替换，都应该视为属于本发明的保护范围。