一种脂肪酶突变体及其在天然维生素E纯化中的应用

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白质工程改造技术领域，具体涉及一种脂肪酶突变体及其在天然维生素E纯化中的应用。

背景技术

脱臭馏出物是提取天然维生素E的重要原料，作为油脂精炼过程中的副产物，其主要成分为游离脂肪酸、甘油酯、天然维生素E、甾醇、甾醇酯及其他氧化分解产物。但是，由于各组分的理化性质比较相近，并且天然维生素E很容易被氧化，所以直接从脱臭馏出物中提取高含量的天然维生素E往往比较困难，需要对原料进行预处理，以提高分离过程的选择性。

国内天然维生素E生产厂家主要采用酯化-冷析-分子蒸馏的工艺，一般情况下会先将脱臭馏出物中的游离脂肪酸、甘油酯与甲醇进行甲酯化反应，转化成沸点较低的脂肪酸甲酯，同时降低整个体系的粘度，有利于后期植物甾醇的分离，从而达到纯化天然维生素E的目的。

脱臭馏出物的传统化学法预处理工艺通常采用浓硫酸作为催化剂，反应时间短，酯化效率高，但是反应温度较高，生产设备要有较强的耐腐蚀性，同时生产过程产生大量的废酸水排，污染环境。

为克服化学法的缺点，生物酶法甲酯化是近年来的研究热点，脂肪酶可以催化多种反应类型，包括酯化反应、酯交换反应和水解反应等。酶法反应条件温和，高效专一，具有低能耗、得率高、易于产物分离纯化的特点，符合新时代绿色环保、可持续发展的理念。但是由于脱臭馏出物中脂肪酸的存在，初始pH较低，酶的活性受到很大抑制，催化效率大大下降，通过碱液调节pH，容易造成维生素E活性结构破坏，而采用脂肪酶固定化的方式虽然提高了酶对酸性环境的耐受性，但是又会造成成本上升。因此，迫切需要开发一种耐酸性，催化活力高的脂肪酶菌株以提高生产效率、降低生产成本。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种脂肪酶突变体及其在天然维生素E纯化中的应用。本发明在脂肪酶TLS的基础上通过大量的突变筛选，最终获得耐酸性得到显著提高的脂肪酶突变体，其具有良好的催化活性，可在应用过程中提高生产效率，减少化学试剂使用，降低生产成本。

本发明一方面提供了一种脂肪酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脂肪酶的第136位氨基酸由Thr变为Trp

上述脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:4。

本发明一方面提供了一种脂肪酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:3的脂肪酶的第113位氨基酸由Gly变为Val。

上述脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:6。

本发明一方面提供了一种脂肪酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:5的脂肪酶的第277位氨基酸由Ile变为Pro。

本发明还涉及编码上述脂肪酶突变体的DNA分子。

本发明还包括携带有上述DNA分子的重组表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。

所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)。

本发明以野生型脂肪酶TLS为基础，提供了分别包含T136W单点、G113V/T136W两点、G113V/T136W/I277P三点突变的脂肪酶突变体。与野生型相比，所述脂肪酶突变体对酸性条件的耐受性显著增强。在pH3.0条件下处理15min后，所述突变体的酶活残留率仍能达到30.20％-44.33％，远高于野生型；其中，包含G113V/T136W/I277P三点突变的脂肪酶突变体的酶活残留率最高，达到44.33％。所述脂肪酶突变体能显著促进游离脂肪酸的甲酯化，转化率高达72.40％-89.23％；其中，包含G113V/T136W/I277P三点突变的脂肪酶突变体的甲酯转化率最高，达到89.23％，取得了意料不到的技术效果。所述脂肪酶突变体可广泛用于天然维生素E的纯化。

具体实施方式

下面结合具体实施案例对本发明做出进一步的说明，本领域相关的技术人员可以借此更好地理解和掌握本发明。本实施例中未作具体说明的实验条件和方法可参照《分子克隆：实验室指南》(Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或按照生产厂商所建议的条件进行，对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法用量使用。本领域技术人员在本发明原理基础上做出的非创造性改进均视为本发明的保护范围。

实验材料和试剂：

实验菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k购自Invitrogen公司。

主要试剂：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机突变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。

培养基配方：

大肠杆菌培养基(LB培养基)：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH7.0；

LB+Amp培养基：LB培养基加100μg/mL氨苄青霉素；

LB+Kana培养基：LB培养基加50μg/mL卡那霉素；

酵母培养基(YPD培养基)：1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖；

酵母筛选培养基(MD培养基)：2％葡萄糖、1.34％ YNB、4×10

BMGY培养基：2％蛋白胨、1％酵母提取物、100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)、1.34％YNB、4×10

BMMY培养基：2％蛋白胨、1％酵母提取物、100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)、1.34％YNB、4×10

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1脂肪酶基因的合成与重组质粒的获得

以SEQ ID NO：2所示脂肪酶(命名为TLS)基因序列为参考，在上海捷瑞生物工程有限公司人工合成该基因，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

引物序列如下：

5’端引物TLS-F：GGC

3’端引物TLS-R：ATA

以合成的脂肪酶TLS基因为模板，用上述引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：模板1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、5×PSBuffer 10μL、dNTPs(2.5mM)4μL、Primer-StarDNA聚合酶1μL、ddH

实施例2脂肪酶突变体筛选

在不破坏蛋白二级结构与活性中心的前提下，为提高上述脂肪酶在酸性条件下的酶活力，进一步对该基因进行了大量突变位点的筛选，以脂肪酶TLS为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，酶切处理后与经同样酶切后的pET-28a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Kana平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mMIPTG的LB+Kana培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有脂肪酶的大肠杆菌细胞裂解液。

分别取出40ul裂解液至两块新的96孔板，分别在pH3.0和pH5.0条件下，反应15min后测定其脂肪酶酶活。结果发现，有些突变子在酸性条件下酶活力没有变化；有些突变甚至使其耐酸性或酶活变得更差了；另外还有些突变，虽然能提高脂肪酶TLS的pH耐受性，但突变后酶活性质发生了显著变化，这些都不符合要求。最终，得到了既能显著提高脂肪酶TLS的耐酸性，又不会影响其酶活及原有酶学性质的突变位点：G113V、T136W、I277P。

将含T136W单点突变的脂肪酶突变体命名为TLS-M1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，参照该序列合成一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

将含G113V/T136W两点突变的脂肪酶突变体命名为TLS-M2，其氨基酸序列为SEQIDNO:5，参照该序列合成一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

将含G113V/T136W/I277P三点突变的脂肪酶突变体命名为TLS-M3，其氨基酸序列为SEQ ID NO:7，参照该序列合成一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO:8。

实施例3毕赤酵母工程菌株的构建

3.1重组质粒构建

以上述脂肪酶TLS及其突变体的基因为模板，扩增后，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pPIC-9k载体16℃过夜连接并转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落PCR验证阳性克隆，经测序验证后最后获得了正确的重组质粒。

3.2酵母感受态制备

将毕赤酵母GS115菌株进行YPD平板活化，30℃培养48h后接种活化的GS115单克隆于5mL YPD液体培养基中，30℃、220rpm，培养约18h后转接菌液于装有50ml YPD液体培养基的三角瓶中，30℃、220rpm培养约5h经紫外分光光度计检测其菌体密度，待其OD600值在1.1～1.3范围后，4℃6000rpm离心3min分别收集5ml菌体至灭菌EP管中，轻轻弃上清，用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的2mL灭菌水重悬菌体，4℃6000rpm离心3min，轻轻弃上清，用预冷的2mL山梨醇(1mol/L)重悬菌体；4℃6000rpm离心3min，轻轻弃上清，预冷的100-150μl山梨醇(1mol/L)轻柔重悬菌体。

3.3转化和筛选

分别将上述构建的脂肪酶TLS及其突变体的重组质粒用Sac I进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法分别转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株。挑取单个转化子转接于BMGY培养基中，30℃250rpm振荡培养1d后，再转入BMMY培养基中30℃250rpm振荡培养，每天添加0.5％的甲醇。诱导表达3d后，离心去除菌体获得上清液，测定脂肪酶的活力。

结果显示，本发明构建得到的重组表达脂肪酶TLS及其突变体的毕赤酵母工程菌株发酵上清液中脂肪酶的酶活力为176-225U/ml。

脂肪酶酶活测定

(1)酶活单位的定义

参考GB/T23535-2009，在温度40℃和pH值为7.5的条件下，每分钟生成1μmol脂肪酸所需要的酶量，定义为一个酶活力单位，用U表示。

(2)测定方法

橄榄油与4％(w/v)聚乙烯醇(PVA)按1：3(v/v)的比例混合，用高速匀浆机分两次处理，间隔5min，每次处理3min，即可得到乳白色PVA乳化液，以乳化后的橄榄油作为脂肪酶水解底物。取两个100mL烧杯，于空白杯(A)和样品杯(B)中各加入4mL橄榄油乳化液和5mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液，再于A杯中加入95％乙醇15mL，于40℃水浴中预热5min，然后于A、B杯中各加入待测酶液1mL，立即混匀计时，准确反应15min后，于B杯中立即补加95％乙醇15mL终止反应，取出；将烧杯置于磁力搅拌器上，边搅拌边用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不褪色为滴定终点，记录消耗的氢氧化钠标准溶液体积。

酶活计算公式：

式中：X

实施例4脂肪酶突变体耐酸性分析

将上述构建得到的重组表达脂肪酶及其突变体的毕赤酵母发酵上清液分别加入pH3.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，15min后检测脂肪酶的残存活力，以初始酶活为100％相对酶活，计算相对酶活(见表1)。

表1脂肪酶突变体耐酸性分析

从表1结果可知，与野生型脂肪酶TLS相比，本发明提供的脂肪酶突变体对酸性条件的耐受性大大增强。在pH3.0条件下处理15min后，所述突变体的酶活残留率仍能达到30.20％-44.33％，远高于野生型。其中，包含G113V/T136W/I277P三点突变的脂肪酶突变体的酶活残留率最高，达到44.33％，取得了意料不到的技术效果。

实施例5脂肪酶突变体在天然维生素E纯化中的应用

植物油脱臭馏出物(deodorizer distillates)是植物油在脱臭过程中所得到的各馏分的混合物，其中主要含有大量游离脂肪酸、维生素E、甘油酯及其他组分等。基于维生素E与脂肪酸单酯易于分离的特点，一般都是将脱臭馏出物中的游离脂肪酸和中性油脂先转化为脂肪酸单酯，然后进一步实现维生素E与上述脂肪酸单酯的分离。而脂肪酶可用于植物油脱臭馏出物中的游离脂肪酸的甲酯化，从而有利于实现对维生素E的纯化。

1、酶液：

实施例3构建的重组表达脂肪酶TLS及其突变体的毕赤酵母工程菌株发酵上清液。

2、酯化过程

吸取20μL酶液，与80μL水，300μL大豆油脱臭馏出物，40μL甲醇(每半小时加入5μL，共8次)，放置于振荡器，40℃，1000rpm反应12h，12000rpm离心3min后，按照国标GB5009.229-2016中热乙醇法对上层油相的酸价进行测定，按如下公式计算甲酯转化率：

式中：C为甲酯转化率，％；X

表2脂肪酶突变体对游离脂肪酸甲酯转化率的影响

从表2的结果可知，与野生型脂肪酶TLS相比，本发明提供的脂肪酶突变体能显著促进游离脂肪酸的甲酯化，转化率高达72.40％-89.23％；其中，包含G113V/T136W/I277P三点突变的脂肪酶突变体的甲酯转化率最高，达到89.23％，取得了意料不到的技术效果。

本发明提供的脂肪酶突变体耐酸性强，可广泛用于游离脂肪酸的甲酯化，提高转化效率，进而有利于实现对维生素E的纯化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。