一种定量检测25-羟基维生素D的试剂盒、方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种定量检测25-羟基维生素D的试剂盒、方法及其应用。

背景技术

维生素D是一种脂溶性维生素，是维持人类身体健康必需的一种化合物。维生素D包括5种化合物，与健康密切相关的是维生素D2和维生素D3。维生素D2和维生素D3经肝脏的单氧化酶（25-羟基氧化酶）氧化形成25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，在肾脏中进一步代谢形成1,25-二羟基维生素D。在血液中，维生素D的最主要存在形式为25-羟基维生素D，约占维生素D总量的95%，且半衰期最长，性质非常稳定。因此，25-羟基维生素D成为维生素D在人体内的浓度指示剂，是人体维生素D营养状况的评价指标。

目前，人体中25-羟基维生素D的检测方法主要有电化学发光免疫法、放射免疫法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等。免疫法普遍存在特异性低、对基质效应敏感、无法区分25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3等缺点。高效液相色谱法也存在前处理复杂、灵敏度低、容易受到干扰等缺点。液相色谱串联质谱法具有高选择性、特异性和灵敏度等优点，越来越广泛地用于临床检验，是目前公认的25-羟基维生素D定量检测的金标准方法。目前，采用液相色谱-串联质谱法检测25-羟基维生素D浓度的血液样本类型有干血片、全血、血清、血浆等，然而至今还没有一款试剂盒可以同时定量检测干血片和微量的全血、血清、血浆中的25-羟基维生素D，不同类型的样本检测需要购买不同的试剂盒，这不仅增加了检测成本，也降低了检测效率。因此，迫切需要开发一种可定量检测干血片和微量的全血、血清、血浆等多种类型血液样本中25-羟基维生素D的检测试剂盒及方法，使其可以克服现有试剂盒和方法的不足。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种定量检测25-羟基维生素D的试剂盒，可同时定量检测干血片和微量的全血、血清、血浆中25-羟基维生素D浓度。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种定量检测25-羟基维生素D的试剂盒，所述试剂盒包括校准品、质控品、样本提取液、衍生剂溶液、终止液、复溶液和流动相添加剂；所述样本提取液为含有25-羟基维生素D2-d6和25-羟基维生素D3-d3的甲醇乙腈溶液，所述甲醇和乙腈的体积比为（1~9.5）：1。

优选的，所述校准品为系列标准浓度的干血片，分别为S0：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度均为0ng/mL，S1：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度均为2ng/mL，S2：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度均为12ng/mL，S3：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度均为20ng/mL，S4：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度均为40ng/mL，S5：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度均为120ng/mL，S6：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度均为200ng/mL。

更优选的，所述校准品的制备方法包括如下步骤：

配置含25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的5%BSA缓冲溶液，所述25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的浓度均分别为0、4、24、40、80、240、400ng/mL；

处理全血得到不含25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的红细胞；将所述红细胞与不同浓度的BSA缓冲溶液等体积混合，滴于滤纸片上晾干即得系列标准浓度的干血片校准品。

优选的，所述质控品为三个不同浓度的干血片，分别为QC1：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的浓度均为10ng/mL，QC2：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的浓度均为20ng/mL，QC3：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的浓度均为40ng/mL。

更优选的，所述质控品的制备方法包括如下步骤：

检测全血样本25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度，用5%BSA缓冲溶液将其稀释至QC1对应的浓度，加标至QC2和QC3对应的浓度，滴于滤纸片上晾干，即得三个不同浓度的干血片质控品。

优选的，所述衍生剂溶液为0.2mg/mL的PTDA乙酸乙酯溶液；所述终止液为无水乙醇；所述复溶液为0.1%甲酸-80%甲醇水溶液；所述的流动相添加剂为50%甲酸水溶液。

本发明还提供了一种定量检测25-羟基维生素D的方法，所述方法包括如下步骤：

将校准品干血片和质控品干血片与待测样本混合，加入样本提取液后震荡离心，所得上清液与衍生剂溶液混合进行衍生反应，然后依次加入终止液和复溶液，所得溶液过滤后进行检测分析即可计算待测样本中的25-羟基维生素D浓度。

优选的，所述检测分析采用液相色谱串联质谱，所述质谱条件为：正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描；所述正离子模式中，目标定量离子对包括：25基羟维生素D2衍生化产物570.4→298.1，25-羟基维生素D2-d6衍生化产物576.4→298.1，25-羟基维生素D3衍生化产物558.4→298.1，25-羟基维生素D3-d3衍生化产物561.4→301.2。

更优选的，所述液相色谱的色谱柱为C18，所述液相色谱的流动相A为含0.1-0.3%的甲酸水，流动相B为含0.1-0.3%甲酸的甲醇；所述液相色谱的流速为0.2-1.0mL/min，柱温为30-45℃，进样体积为20-40µL。

本发明还提供了上述的试剂盒或上述的方法在定量检测微量的全血、血清、血浆和/或干血片中25-羟基维生素D的应用。

本发明提供了一种定量检测25-羟基维生素D的试剂盒，所述试剂盒的样本提取液为含有25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3同位素内标的甲醇乙腈溶液，使用稳定同位素内标消除基质效应的影响，实现多种微量样本类型的同时测定，可直接高效地萃取干血纸片/全血/血清/血浆中25-羟基维生素D；前处理采用96孔板提高了自动化水平和分析通量；使用液相色谱-串联质谱同时检测25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，且通过衍生化反应增强分析物的离子化效率，进一步提高了检测的灵敏，降低了样本用量。经试验可知，本发明所述试剂盒检测只需要两片3/6mm血斑、20µL全血、10µL血清样本或10µL血浆，样本使用量少且样本类型多，适合多种采样方法和多种人群的检测筛查尤其是新生儿以及儿童，实现了一个试剂盒可同时检测多种样本类型。

附图说明

图1为25-羟基维生素D2校准品S5的色谱图。

图2为25-羟基维生素D3校准品S5的色谱图。

图3为25-羟基维生素D2校准品S0的色谱图。

图4为25-羟基维生素D3校准品S0的色谱图

图5为25-羟基维生素D2干血纸片样本的色谱图。

图6为25-羟基维生素D3干血纸片样本的色谱图。

图7为25-羟基维生素D2全血样本的色谱图。

图8为25-羟基维生素D3全血样本的色谱图。

图9为25-羟基维生素D2血浆样本的色谱图。

图10为25-羟基维生素D3血浆样本的色谱图。

图11为25-羟基维生素D2血清样本的色谱图。

图12为25-羟基维生素D3血清样本的色谱图。

图13为定量下限为2ng/mL的25-羟基维生素D2的色谱图。

图14为定量下限为2ng/mL的25-羟基维生素D3的色谱图。

图15是25-羟基维生素D2在2ng/mL~200ng/mL范围内的标准曲线图。

图16是25-羟基维生素D3在2ng/mL~200ng/mL范围内的标准曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种定量检测25-羟基维生素D的试剂盒，所述试剂盒包括校准品、质控品、样本提取液、衍生剂溶液、终止液、复溶液和流动相添加剂；所述样本提取液为含有25-羟基维生素D2-d6和25-羟基维生素D3-d3的甲醇乙腈溶液，所述甲醇和乙腈的体积比为（1~9.5）：1。

本发明中，所述样本提取液中25-羟基维生素D2-d6的浓度优选为10~100ng/mL，更优选为20ng/mL；所述25-羟基维生素D3-d3的浓度优选为10~100ng/mL，更优选为20ng/mL。本发明样本提取液采用含有25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3同位素内标的甲醇乙腈溶液，使用稳定同位素内标消除基质效应的影响，实现多种微量样本类型的同时测定，可直接高效地萃取干血纸片/全血/血清/血浆中25-羟基维生素D，从而同时实现干血片和微量的全血、血清、血浆等多种样本类型中25-羟基维生素D的检测。

本发明中，所述校准品为系列标准浓度的干血片，分别为S0：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度均为0ng/mL，S1：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度均为2ng/mL，S2：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度均为12ng/mL，S3：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度均为20ng/mL，S4：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度均为40ng/mL，S5：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度均为120ng/mL，S6：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度均为200ng/mL。本发明中，所述校准品的制备方法优选的包括如下步骤：配置含25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的5%BSA缓冲溶液，所述25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的浓度均分别为0、4、24、40、80、240、400ng/mL；处理全血得到不含25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的红细胞；将所述红细胞与不同浓度的BSA缓冲溶液等体积混合，滴于滤纸片上晾干即得系列标准浓度的干血片校准品。本发明中，所述滴于滤纸片上的混合液的优选为50~100µL，更优选为75µL。

本发明中，所述质控品为三个不同浓度的干血片，分别为QC1：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的浓度均为10ng/mL，QC2：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的浓度均为20ng/mL，QC3：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的浓度均为40ng/mL。本发明中，所述质控品的制备方法优选的包括如下步骤：检测全血样本25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度，用5%BSA缓冲溶液将其稀释至QC1对应的浓度，加标至QC2和QC3对应的浓度，滴于滤纸片上晾干，即得三个不同浓度的干血片质控品。本发明中，所述5%BSA缓冲溶液优选为含25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的5%BSA缓冲溶液，所述缓冲溶液中25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的浓度均分别为0、4、24、40、80、240、400ng/mL。本发明中，所述滴于滤纸片上的混合液的优选为50~100µL，更优选为75µL。

本发明中，所述衍生剂溶液优选为0.2mg/mL的PTDA（4-苯基-1,2,4-三唑林-3,5-二酮）乙酸乙酯溶液；所述终止液优选为无水乙醇；所述复溶液优选为0.1%甲酸-80%甲醇水溶液；所述的流动相添加剂优选为50%甲酸水溶液。

本发明中，所述试剂盒优选的还包括耗材，所述耗材优选的包括96孔板、96孔过滤板、96孔锥底收集板、96孔板硅胶盖、操作说明书。

本发明还提供了一种定量检测25-羟基维生素D的方法，所述方法包括如下步骤：

将校准品干血片和质控品干血片与待测样本混合，加入样本提取液后震荡离心，所得上清液与衍生剂溶液混合进行衍生反应，然后依次加入终止液和复溶液，所得溶液过滤后进行检测分析即可计算待测样本中的25-羟基维生素D浓度。

本发明中，所述校准品、质控品、样本提取液、衍生剂溶液、复溶液、流动相添加剂和耗材在使用前优选的平衡至室温。本发明中，所述校准品干血片和质控品干血片均优选为2片。本发明中，所述待测样本优选为干血片、全血、血清或血浆。所述待测样本为干血片时，待测样本的添加量优选为2张3mm血斑；所述待测样本为全血时，待测样本的添加量优选为20µL；所述待测样本为血清时，待测样本的添加量优选为10µL，所述待测样本为血浆时，待测样本的添加量优选为10µL。本发明中，样本提取液的添加量优选为150-300µL，衍生剂溶液的添加量优选为50-250µL，终止液的添加量优选为10-50µL，复溶液的添加量优选为50-150µL。本发明中，所述衍生反应的时间优选为20~60min，更优选为30min；所述过滤优选的在96孔过滤板中进行。

本发明中，所述检测分析优选为液相色谱串联质谱，所述质谱条件优选为：正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描；所述正离子模式中，目标定量离子对包括：25基羟维生素D2衍生化产物570.4→298.1，25-羟基维生素D2-d6衍生化产物576.4→298.1，25-羟基维生素D3衍生化产物558.4→298.1，25-羟基维生素D3-d3衍生化产物561.4→301.2。所述液相色谱的色谱柱优选为C18，所述液相色谱的条件优选为：流动相A为含0.1-0.3%的甲酸水，流动相B为含0.1-0.3%甲酸的甲醇；所述液相色谱的流速为0.2-1.0mL/min，柱温为30-45℃，进样体积为20-40µL。本发明中，所述计算待测样本中的25-羟基维生素D浓度的方法优选为：采用校准品中的25-羟基维生素D及其内标的峰面积的比值与理论浓度构建的标准曲线，即可计算出样品或质控品中的25-羟基维生素D的浓度。

本发明还提供了上述的试剂盒或上述的方法在定量检测微量的全血、血清、血浆和/或干血片中25-羟基维生素D的应用。

本发明提供了一种可同时定量检测干血片和微量的全血、血清、血浆中25-羟基维生素D的试剂盒，检测只需要两片3/6mm血斑、20μL全血、10μL血清样本或10μL血浆，样本使用量少且样本类型多，适合多种采样方法和多种人群的检测筛查尤其是新生儿以及儿童，实现了一个试剂盒可同时检测多种样本类型，极大地提高了检测效率，降低了检测成本。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本发明提供的一种定量检测25-羟基维生素D的试剂盒的检测指标包括：25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D（25-羟基维生素D2与25-羟基维生素D3之和）。

本实施例提供的一种定量检测25-羟基维生素D的试剂盒组成如表1所示。

表1 一种定量检测25-羟基维生素D的试剂盒组成

表1中校准品为干血片，分别为S0：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度为0ng/mL，S1：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度为2ng/mL，S2：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度为12ng/mL，S3：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度为20ng/mL，S4：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度为40ng/mL，S5：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度为120ng/mL，S6：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度为200ng/mL。

所述校准品制备方法为：配置一系列含25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的5%BSA缓冲溶液，其浓度分别0、2、12、20、40、120、200ng/mL，同时处理全血得到不含25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的红细胞，然后分别取等体积红细胞和的不同浓度25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的BSA缓冲溶液进行混合，得到含有不同浓度25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的全血校准品，取75μL滴于滤纸片上，自然晾干，得到一系列的干血片校准品。

表1中的质控品为低、中、高三个不同浓度的干血片，分别为QC1：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的浓度为10ng/mL，QC2：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的浓度为20ng/mL，QC3：25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的浓度为40ng/mL。

所述质控品制备方法为：检测全血样本25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度，用5%BSA缓冲溶液将其稀释至QC1对应的浓度，加标至QC2和QC3对应的浓度，得到低、中、高浓度的全血质控品，然后再取75μL滴于滤纸片上，自然晾干。

表1中的样本提取液为含浓度为30ng/mL的25-羟基维生素D2-d6和25-羟基维生素D3-d6的甲醇乙腈溶液，甲醇和乙腈体积比为90：10；样本提取液衍生剂溶液为0.2mg/mL的PTDA（4-苯基-1,2,4-三唑林-3,5-二酮）乙酸乙酯溶液；终止液为无水乙醇；复溶液为0.1%甲酸-80%甲醇水溶液；所述的流动相添加剂为50%甲酸水溶液。

实施例2

利用实施例1定量检测25-羟基维生素D试剂盒检测25-羟基维生素D的方法

主要步骤如下：

1.样本前处理

（1）取出实施例1所述的校准品、质控品、样本提取液、衍生剂溶液、复溶液、流动相添加剂，平衡至室温；

（2）分别取2张校准品、2张质控品和适量的样本加入到96孔板中（干血片样本为两张3/6 mm血斑，全血样本为20μL，血清样本为10μL，血浆样本为10μL）；

（3）加入200μL样本提取液，室温下震荡30 min；

（4）取全部上清液至新的96孔板中，室温氮吹至干；

（5）加入100μL衍生剂溶液，室温下衍生反应30 min；

（6）加入20μL终止液，静置10 min，将反应液室温氮吹至干；

（7）加入80μL复溶液，室温下震荡5 min；

（8）将上述溶液全部转移至96孔过滤板中，盖上硅胶盖，并于室温下离心10 min（3000 r/min），溶液收集于96孔锥底收集板中，盖上硅胶盖。至此得到待上机的校准品、质控品和样品。

2.液相色谱串联质谱检测

（1）上机准备

配制流动相，A为1000 mL去离子水中加入2 mL流动相添加剂，B为1000 mL甲醇中加入2 mL流动相添加剂，混匀，过滤；将仪器的流动相更换成上述已配置的流动相，连接色谱柱Thermo C18色谱柱（50mm×2.1mm, 2.6μm）；将待测96孔锥底样品板转移至LC-MS/MS进样系统中，采用对应的色谱质谱方法先平衡仪器，进行检测。

（2）色谱方法

超高效液相色谱：岛津LC-30液相系统。

色谱柱：Thermo C18色谱柱（50mm×2.1mm, 2.6μm）；

柱温：40℃ ；

进样器温度：10℃ ；

进样体积：10μL ；

流动相：A相为0.1%甲酸水，B相为含0.1%甲酸的甲醇；

流速为0.4 mL/min；

洗脱梯度如表2所示：

表2 液相色谱洗脱梯度

上述色谱条件下，25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的保留时间分别为1.99min和1.97 min。

（3）质谱方法

采用具有电喷雾离子源的串联质谱仪作为检测器进行分析。其中，气帘气压力为20.0psi，加热气压力为50 psi，辅助加热气压力为50psi，加热气温度为500℃，碰撞气为高纯氮气，压力为6 psi；电喷雾针电压为5500 V。采用正离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描。待测物随流动相流出分析柱后，在压力的作用下进入质谱仪离子源，由六通阀控制进入离子源的样品通道。在离子源内液体样品被汽化并且电离为带电分子，带电分子在电压和真空作用下，进入Q1、Q2和Q3，其中，Q1和Q3为质量过滤器，只允许根据25-羟基维生素D及其内标物衍生化产物的质荷比选择的母离子和子离子通过，Q2为碰撞单元，母离子在此处与惰性气体原子碰撞，产生特定的碎片离子。质谱仪的第一个四极（Q1）选择具有25羟维生素D及其内标物衍生化产物的特定质荷比m/z的母离子，具有这些m/z比的母离子被允许进入Q2，Q2产生的碎片离子进入到Q3，其中25羟维生素D及其内标物衍生化产物的碎片离子（子离子）被选择通过，而其它离子被除去。参数详见表3。

表3 多反应监测离子扫描参数

随着离子与检测器碰撞，它们将捕获到的离子数转化成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被传递到计算机，其将所收集的离子数对时间作图，即得总离子流图（TIC图）（如图1和图2所示）。

从图1-图4、图13可以看出，25-羟基维生素D2峰型对称，无干扰，其含量在2.0 ng/mL时，仍具有很好的峰高、峰形，具有10倍以上的信噪比，2.0 ng/mL的含量值可被定量；从图1-图4、图14可以看出，25-羟基维生素D3峰型对称，无干扰，其含量在2.0 ng/mL时，仍具有很好的峰高、峰形，具有10倍以上的信噪比，2.0 ng/mL的含量值可被定量，方法灵敏度高。

采用内标法建立标准曲线，如图15、图16和表4所示，25羟基维生素D2在2 ng/mL~200 ng/mL线性范围内，25-羟基维生素D3在2 ng/mL~200 ng/mL线性范围内线性相关性良好，相关系数r分别为0.99548和0.99762。

表4 标准曲线结果

采集志愿者的血液样本，分别制备得到干血片、微量全血、微量血清、微量血浆，平行测定三次，结果如表5可知，25-羟基维生素D2的检出浓度为0.5101 ng/mL，相对标准偏差为4.37%，25-羟基维生素D3的检出浓度为13.28 ng/mL，相对标准偏差为5.73%，重复性可靠、检测误差小。

表5 重复性测定结果

由以上实施例可以看出，本发明试剂盒可同时定量检测干血片和微量的全血、血清、血浆中25-羟基维生素D的浓度，实现了一个试剂盒可同时检测多种样本类型，极大地提高了检测效率；而且本发明试剂盒降低了样本的用量，检测灵敏度高，重复性好，具有良好的应用前景。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。