一种基于振镜扫描的晶格光片显微成像方法和装置

技术领域

本发明属于光学超分辨显微成像领域，特别涉及一种基于振镜扫描的晶格光片显微成像方法和装置。

背景技术

光学显微镜在生命科学研究中扮演着重要角色。其中，光片荧光显微镜是样品三维长时程成像研究中最具有前景的工具之一。光片显微镜采取侧向照明的策略，从侧向照明样品并利用与激发光轴垂直的探测物镜收集样品的荧光信号，避免了样品的轴外激发，天然地具备光学层切能力，可以在弱光照光功率照射下获取信噪比良好的图像，避免对样品造成过早的光漂白和光毒性，可对细胞样品进行长时程活体成像。此外，由于探测路采取的是宽场探测的方式，成像速度块，有利于捕获生物样品的动态过程。但是，光片显微镜的成像分辨率较低，不利于对样品的精细结构进行探测。

近年来，为了提高光片显微镜的成像分辨率，科研工作者们提出了多种分辨率增强的方法。如通过使用较高数值孔径(NA)的激发物镜产生较薄的高斯光片，并利用高NA的探测物镜对样品进行探测可以有效提高其分辨率。但是，这一类的方法会使得光片快速的汇聚和发散，导致成像视场变小，损害了成像速度。后续，科研工作者利用贝塞尔光束替代高斯光束在保证成像视场的同时提高其轴向分辨率。但是贝塞尔光片的旁瓣会对样品进行轴外激发，降低光片显微镜的光学层切能力，给样品带来更多的光毒性。

为了解决贝塞尔光束旁瓣带来的问题，公开号为CN110220875A的专利申请提供一种晶格光片显微镜，利用贝塞尔光束阵列之间的干涉效应，成功地抑制了贝塞尔光束的旁瓣，得到厚度薄、视场大的晶格光片，具备了成像分辨率高和成像速度快的优势。但是，为了获取上述的晶格光片，原始的晶格光片显微成像系统采用了二值空间光调制器对入射的光束进行调制，并通过掩模板对衍射光束进行滤波，只保留正负一级衍射光被应用于晶格光片的产生。由于空间光调制器像素间隙的存在，大部分入射光能量集中于未被调制和利用的零级衍射光中，导致了系统的光能利用率非常低。

为了解决这一问题，科研工作者提出将产生的圆环光束通过一个定制的只有4个狭缝可透光的掩模板，从而获得激发物镜后焦面的准确光场分布，形成晶格光片照明样品。但是，由于掩模板遮挡了大部分的光源，系统的光能利用率仍然不高，且由于掩膜板是固定的，大致激发物镜入瞳处光束NA的切换不够灵活。公开号为CN110687670A的专利申请提供一种场合成光片显微镜，利用扫描振镜在激发物镜的入瞳处连续或者离散式地扫描光束，可以大大提升系统的光能利用率。但是，场合成光片显微镜无法与结构光照明显微成像技术兼容，使得其成像分辨率难以提高，同时由于入瞳需要扫描，一定程度上损害了成像速度。

发明内容

本发明提供了一种基于振镜扫描的晶格光片显微成像方法和装置，利用振镜扫描灵活切换光束NA，利用光束干涉效应在样品面上产生结构光图样。

为实现上述的发明目的，本发明所采用的具体技术方案如下：

一种基于振镜扫描的晶格光片显微成像方法，包括以下步骤：

1)激光光束分成三路振动方向相同的线偏振光；

2)三路线偏振光整形成线状光束，经激发物镜投射到荧光样品上发生相互干涉产生晶格条纹结构光照明图样；

3)多次改变干涉晶格条纹的相位，探测物镜收集对应相位下的多幅荧光强度图像；

4)利用多幅荧光强度图像进行数据处理，重构得到超分辨图像。

在步骤3)中，需要至少五次改变干涉晶格条纹的相位使光片以结构光条纹或均匀的光片照明样品。

本发明中，单幅结构光图样投射到样品上获得的荧光强度信息中包含五个频率分量，为了分离这五个频率分量，需要得到五个方程。原始的晶格光片显微成像系统利用与激发物镜后焦面共轭的x扫描振镜对产生的晶格光束沿着x方向上进行步进实现晶格条纹结构光照明图样的相移，而本发明通过电光调制器对光束的光程进行快速改变，从而改变投射到样品上的干涉晶格条纹的相位，得到五幅相移后的荧光图像，从而对频率分量进行提取和移动。

作为优选的，电光调制器可以控制干涉晶格条纹相移0°、72°、144°、216°和288°。此处仅限于作为最优的实例，从理论上来说，相移角度可以是任意的数值，仅需保证样品可以得到均匀的照明即可。另外，也可以令电光调制器快速地改变光束的相位，从而形成均匀的照明光片，该操作与晶格光片显微镜的抖动模式相匹配，相比结构光照明模式，其成像速度更快但成像分辨率相对较低。

本发明与传统晶格光片显微成像技术所运用的图像重构算法完全兼容，在图像数据处理和重构可基于现有的算法实现。

本发明提供一种基于振镜扫描的晶格光片显微成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块；

所述的激发光路模块具有依次布置的：

激光器，发出激光光束；

中心光束整形系统，用于将光束整形成线状线振光并从激发物镜后焦面的中心入射照明样品；

振镜分束系统，用于将激光光束分成两束传播方向对称且振动方向相同的线状线偏振光并从激发物镜后焦面的边缘入射照明样品；

z扫描振镜，用于扫描光束，对样品进行轴向扫描；

激发物镜，用于将三束线状光束聚焦到样品表面进行干涉产生干涉晶格条纹图案，并激发样品荧光强度信号；

所述的成像光路模块包括：

探测物镜，用于收集样品的荧光信号；

相机，用于记录所述的荧光强度信号；

计算机，用于控制所述中心光束整形系统和振镜分束系统改变干涉晶格图案的相位、数值孔径和旋向；用于控制所述z扫描振镜对样品进行轴向扫描；用于控制所述相机采集的荧光强度信号；并用于数据处理，得到超分辨图像。

作为优选的，所述的中心光束整形系统包括：

第一偏振分束镜，用于将入射的圆偏振光分成两路线偏振光光束；

依次设置在偏振分束镜的反射光路上包括第一电光调制器、第一柱透镜和第一环形掩膜板。所述的第一电光调制器用于快速控制反射光路光束的光程，从而改变在样品平面出干涉晶格条纹的相位；所述的第一柱透镜用于对圆形激光光束进整形，形成沿着x方向进行压缩、z方向保持平行的线状线偏振光；所述的第一环形掩膜板位于第一柱透镜的焦平面处，用于对光束进行滤波；

依次设置在第一偏振分束镜的透射光路包括第一四分之一波片和振镜分束系统。所述的第一四分之一波片用于将透射的p偏振光转变成圆形偏振光。

作为优选的，所述的振镜分束系统包括：

偏振分束镜，用于将入射的圆偏振光分成两路线偏振光光束；

依次设置在偏振分束镜的透射光路上的第二四分之一波片、反射镜、第二柱透镜、第一扫描振镜和第一扫描透镜；所述的第二四分之一波片用于将线偏振光转换成圆偏振光，反射镜用于反射圆偏振光再次通过第二四分之一波片变成s偏振光，能被第二偏振分束镜再次反射；所述的第二柱透镜用于对圆形激光光束进整形，形成沿着z方向进行压缩、x方向保持平行的线状线偏振光；所述的第一扫描振镜用于对光束在激发物镜入瞳处沿着x方向进行扫描；所述的第一扫描透镜用于将线状光束转变成沿着x方向进行压缩、z方向保持平行的线状线偏振光；

依次设置在第二偏振分束镜的反射光路上的第二电光调制器、第二柱透镜、第二扫描振镜和第二扫描透镜；所述的第二电光调制器用于快速控制反射光路光束的光程，从而改变在样品平面出干涉晶格条纹的相位；所述的第三柱透镜用于对圆形激光光束进整形，形成沿着z方向进行压缩、x方向保持平行的线状线偏振光；所述的第二扫描振镜用于对光束在激发物镜入瞳处沿着x方向进行扫描；所述的第二扫描透镜用于将线状光束转变成沿着x方向进行压缩、z方向保持平行的线状线偏振光；

本发明中，所述的振镜分束系统包括：三角反射镜，用于将从第一扫描透镜和第二扫描透镜出射的两路线偏振光进行合束；

作为优选的，所述的振镜分束系统包括：第二环形掩膜板，用于对合束的两路线偏振光进行滤波。

所述激光器与中心光束整形系统之间依次放置有：准直透镜，用于激光光束进行准直；起偏器，用于将激光光束变为线偏振光；和二分之一波片，用于改变线偏振光的旋向，调节从偏振分束镜透射和反射两束线偏振光的光强比例。

所述振镜分束系统和激发物镜之间依次放置有非偏振分束镜、z扫描振镜、第三扫描透镜和第一管镜。所述的非偏振反射镜用于将从三束线状线偏振光进行合束进入后续系统；所述z扫描振镜用于控制光束沿着z方向扫描待测样品；所述的第三扫描透镜和管镜构成4f系统，用于将z扫描振镜上的光束共轭到激发物镜的后焦面。

所述激发物镜用于将三束振动方向相同的线状线偏振光传递到待测样品表面进行干涉产生干涉晶格条纹。

所述成像光路模块依次布置探测物镜、滤光片、第二管镜和相机。所述探测物镜与激发物镜相互垂直，用于收集样品的荧光信号；所述滤光片用于滤去待测样品发出的荧光中的杂散光；所述管镜用于将荧光信号聚焦到相机。

在另一个技术方案中，本发明还提供一种基于振镜扫描的晶格光片显微成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块；

所述的激发光路模块具有依次布置的：

激光器，发出激光光束；

中心光束整形系统，用于将光束整形成线状线振光并从激发物镜后焦面的中心入射照明样品；

振镜分束系统，用于将激光光束分成两束传播方向对称且振动方向相同的线状线偏振光并从激发物镜后焦面的边缘入射照明样品；

z扫描振镜，用于扫描光束，对样品进行轴向扫描；

激发物镜，用于将三束线状光束聚焦到样品表面进行干涉产生干涉晶格条纹图案，并激发样品荧光强度信号；

所述的成像光路模块包括：

探测物镜，用于收集样品的荧光信号；

相机，用于记录所述的荧光强度信号；

计算机，用于控制所述中心光束整形系统和振镜分束系统改变干涉晶格图案的相位、数值孔径和旋向；用于控制所述z扫描振镜对样品进行轴向扫描；用于控制所述相机采集的荧光强度信号；并用于数据处理，得到超分辨图像。

作为优选的，所述的中心光束整形系统包括：

第一偏振分束镜，用于将入射的圆偏振光分成两路线偏振光光束；

依次设置在偏振分束镜的反射光路上包括第一电光调制器、第一柱透镜和第一环形掩膜板。所述的第一电光调制器用于快速控制反射光路光束的光程，从而改变在样品平面出干涉晶格条纹的相位；所述的第一柱透镜用于对圆形激光光束进整形，形成沿着x方向进行压缩、z方向保持平行的线状线偏振光；所述的第一环形掩膜板位于第一柱透镜的焦平面处，用于对光束进行滤波。

依次设置在第一偏振分束镜的透射光路包括第一四分之一波片和振镜分束系统。所述的第一四分之一波片用于将透射的p偏振光转变成圆形偏振光。

作为优选的，所述的振镜分束系统包括：

第一偏振分束镜，用于将入射的圆偏振光分成两路线偏振光光束；

依次设置在第一偏振分束镜的透射光路上的第二柱透镜、第一扫描振镜、第一扫描透镜和第二二分之一波片；所述的第二柱透镜用于对圆形激光光束进整形，形成沿着z方向进行压缩、x方向保持平行的线状线偏振光；所述的第一扫描振镜用于对光束在激发物镜入瞳处沿着x方向进行扫描；所述的第一扫描透镜用于将线状光束转变成沿着x方向进行压缩、z方向保持平行的线状线偏振光；所述的第二二分之一波片用于改变光束的偏振态为s偏振光束。

依次设置在第一偏振分束镜的反射光路上的第二电光调制器、第三柱透镜、第二扫描振镜、第二扫描透镜和第三二分之一波片；所述的第二电光调制器用于快速控制反射光路光束的光程，从而改变在样品平面出干涉条纹的相位；所述的第三柱透镜用于对圆形激光光束进整形，形成沿着z方向进行压缩、x方向保持平行的线状线偏振光；所述的第二扫描振镜用于对光束在激发物镜入瞳处沿着x方向进行扫描；所述的第二扫描透镜用于将线状光束转变成沿着x方向进行压缩、z方向保持平行的线状线偏振光；所述的第三二分之一波片用于改变光束的偏振态为p偏振光束。

本发明中，所述的振镜分束系统包括：第三偏振分束镜，用于将经过第一扫描透镜和第二扫描透镜出射的线偏振光进行合束；第二四分之一波片，用于将经过第一扫描透镜和第二扫描透镜出射的线偏振光进行转变成圆偏振光；第二环形掩膜板，用于对合束的两路圆偏振光进行滤波；切向光偏振片，用于将对两束圆偏振光转变成切向线偏振光。

本发明中，所述激光器与第一偏振分束镜之间依次放置有：准直透镜，用于激光光束进行准直；起偏器，用于将激光光束变为线偏振光；和第一二分之一波片，用于改变线偏振光的旋向，调节从偏振分束镜透射和反射两束线偏振光的光强比例。

所述振镜分束系统和激发物镜之间依次放置有非偏振分束镜、z扫描振镜、第三扫描透镜和第一管镜。所述的非偏振反射镜用于将从三束线状线偏振光进行合束进入后续系统；所述z扫描振镜用于控制光束沿着z方向扫描待测样品；所述的扫描透镜和管镜构成4f系统，用于将z扫描振镜上的光束共轭到激发物镜的后焦面。

所述激发物镜用于将三束振动方向相同的线状线偏振光传递到待测样品表面进行干涉产生干涉晶格条纹。

所述成像光路模块依次布置探测物镜、滤光片、第二管镜和相机。所述探测物镜与激发物镜相互垂直，用于收集样品的荧光信号；所述滤光片用于滤去待测样品发出的荧光中的杂散光；所述管镜用于将荧光信号聚焦到相机。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)使用振镜分束系统代替空间光调制器和常规光栅器件获取激发物镜后焦面的光场分布和前焦面处干涉图样，提高了入射光能量利用率；

(2)使用电光调制器控制反射路的光程从而改变激发物镜前焦面反射图像的相位，相比传统的角锥棱镜位移精确度高、调制速度快；

(3)使用扫描振镜可灵活改变光束在激发物镜后焦面的分布，改变光束的NA，在样品面上获取不同模式的晶格图案；

(4)将三维超分辨结构光照明显微技术与晶格光片显微技术相结合，进一步提高了xz两个维度的成像分辨率，实现了低入射光功率条件下的超分辨率成像。

(5)装置简单、灵活，操作方便；入射光能量利用率高，干涉晶格条纹对比度高，可与结构光显微照明技术兼容，在低入射光功率条件下实现超过衍射极限的分辨率，特别适用于生命科学领域中对荧光样品进行成像。

附图说明

图1为本发明一种基于振镜扫描的晶格光片显微成像装置的示意图。

图2为控制光束光强分布与偏振状态的相关器件示意图；其中(a)为环形掩膜板示意图；(b)图为透过(a)后双光束在激发物镜后焦面光强分布示意图；(c)为切向偏振片示意图。

图3为激发光束在样品面上的分布；其中(a)为基于振镜扫描的晶格光片显微成像系统所产生的晶格图样二维示意图；(b)为图(a)对应的一维强度分布图；(c)为图(a)对应的频谱图。

图4为本发明一种基于振镜扫描的晶格干涉光片显微成像装置的示意图。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

如图1所示的光片显微成像装置，包括：激光器1、准直透镜2、起偏器3、二分之一波片4、第一反射镜5、第一偏振分束镜6、第一电光调制器7、第一透镜8、第二透镜9、第二反射镜10、第三反射镜11、第四反射镜12、第一柱透镜13、第五反射镜14、第一环形掩膜板15、第一四分之一波片16、第二偏振分束镜17、第二四分之一波片18、第六反射镜19、第三透镜20、第四透镜21、第二柱透镜22、第一扫描振镜23、第一扫描透镜24、第七反射镜25、第二电光调制器26、第五透镜27，第六透镜28、第三柱透镜29、第二扫描振镜30、第二扫描透镜31、第八反射镜32、三角反射镜33、第二环形掩膜板34、第七透镜35、第八透镜36、非偏振分束镜37、第九透镜38、第九反射镜39、z扫描振镜40、第三扫描透镜41、第一管镜42、激发物镜43、待测样品44、探测物镜45、滤光片46、第二管镜47、相机48和计算机49。

激光器1发出激光光束，准直透镜2、起偏器3和二分之一波片4依次放置在激光光束光路的光轴上。准直透镜2用于激光光束进行准直得到平行光束，起偏器3用于将出射激光转换成线偏振光，第一二分之一波片4用于改变线偏振光的旋向，调节从偏振分束镜透射和反射两束线偏振光的光强比例。

经过第一反射镜5后的圆偏振光进入第一偏振分束镜6。偏振分束镜6将光束分为两路。第一路反射光路的s偏振光经过第一电光调制器7进入由第一透镜8和第二透镜9组成的扩束系统，进行扩束。通过前后调节第二反射镜10和第三反射镜11的位置可调控改反射光路的光程。第一电光调制器7可快速改变光束的相位。光束经第四反射镜12反射入射第一柱透镜13形成沿着x方向压缩，z方向保持不变的线状s偏振光光束。经第五反射镜14反射，线光束聚焦到第一环形掩膜板15进行滤波。第二路透射的p偏振光经过第一四分之一波片16后调制成圆形偏振光，再入射第二偏振分束镜17，继而再分成两个光路。

经第二偏振分束镜17透射的p偏振光经过第二四分之一波片18，垂直入射第六反射镜19后被反射，再次经过第二四分之一波片18变成s偏振光，被第二偏振分束镜17反射出去。光束入射第三透镜20和第四透镜21后被扩束，从第二柱透镜22出射后形成沿z方向压缩，x方向平行的线偏振光，并经第一扫描振镜23，第一扫描透镜24和第七反射镜25，打到三角反射镜33上。经第二偏振分束镜17反射的s偏振光进入第二电光调制器26后出射，经过第五透镜27和第六透镜28扩束后进入第三柱透镜29，形成沿z方向压缩，x方向平行的线偏振光，并经第二扫描振镜30、第二扫描透镜31和第八反射镜32，打到三角反射镜33上。第一扫描振镜23和第二扫描振镜30可以轻松地改变出射光在激发物镜43的后焦面的位置，从而灵活地改变光束的数值孔径和旋向，实现在样品面以具有不同厚度和传播长度的光束照明待测样品44。第二电光调制器26可快速改变光束的相位，实现对样品进行结构光照明或者产生均匀光片照明待测样品44。

上下两个光束经三角反射镜31反射后被第二环形掩膜板34滤波；经过第七透镜35、非偏振分束镜37、第九透镜38和第九反射镜39后，打到z扫描振镜40。第七透镜35和第九透镜38组成一个4f成像系统，第二环形掩膜板34位于第七透镜35的前焦面，z扫描振镜40位于第九透镜38的后焦面。因此第二环形掩膜板34的像共轭到z扫描振镜40上。

第八透镜36和第九透镜38组成一个4f成像系统，第一环形掩膜板15位于第八透镜36的前焦面。因此光经非偏振反射镜37和第九反射镜39反射后，第一环形掩膜板15的像共轭到z扫描振镜40上。

三路光束被z扫描振镜40扫描，经过第三扫描透镜41和第一管镜42后进入激发物镜43，并在待测样品44平面处产生干涉光束。第三扫描透镜41和第一管镜42组成4f成像系统：z扫描振40位于第三扫描透镜41的前焦面，激发物镜43的后焦面与第一管镜42的后焦面重合。因此，第一环形掩膜板15、第二环形掩膜板34和z扫描振镜40均与激发物镜43的后焦面共轭，z扫描振镜40转动角度扫描光束使得照明光束沿着z轴方向扫描待测样品44。图2所示的控制光束光强分布与偏振状态的相关器件，图2(a)为环形掩膜板示意图；图2(b)图为透过图2(a)后双光束在激发物镜后焦面光强分布示意图；图2(c)为切向偏振片示意图。

探测物镜45与激发物镜43相互垂直。样品激发的荧光由探测物镜45收集，经过滤光片46和第二管镜47后，被相机48接收记录。滤光片46用于滤去待测样品发出的荧光中的杂散光，第二管镜47用于待测样品内部荧光强度信息成像到相机48上。如图3所示，图3(a)为基于振镜扫描的晶格光片显微成像系统所产生的晶格图样二维示意图；图3(b)为图3(a)对应的一维强度分布图；图3(c)为图3(a)对应的频谱图。

采用图1所示的基于振镜扫描的场干涉晶格光片显微成像装置工作方法如下：

激光器1发出的激光光束经过起偏器3和第一二分之一波片4，形成线偏振光后，入射到第一偏振分束镜6上和第二偏振分束镜17，总共分成三条光路。从第一偏振分束镜6反射的光束经过第一柱透镜13后，形成线状偏振光，并被第一环形掩膜板15进行滤波；从第一偏振分束镜6透射和经第二偏振分束镜17分束得到的两路线偏振光从第二柱透镜22、第一扫描振镜23、第三柱透镜29、和第二扫描振镜30出射的两束沿着z方向平行而x方向汇聚的线状线偏振光，并由第二环形掩膜板34进行滤波。三束光共轭到z扫描振镜40并成像到激发物镜43后瞳面。三束激光光束经干涉后形成周期性照明条纹激发带有荧光标记的待测样品44产生荧光信号，并被与激发物镜相垂直的探测物镜45接收并成像到相机48上。通过改变第一扫描振镜23和第二扫描振镜30的转动角度改变两束线偏振光在入瞳的位置，从而改变光束的NA。

本实施例中，可以采取两种方案来对样品进行激发。

抖动模式：使用计算机49控制第一电光调制器7和第二电光调制器26进行快速改变反射光路的光程差，使得投射到待测样品44上的晶格条纹结构光图样沿着x方向连续地快速抖动，形成均匀的照明光片。待测样品44的激发荧光信号由探测物镜45收集，经过滤波片46滤去收集到的荧光中的杂散光，被第二管镜47成像到相机48上，即可得到待测样品44的荧光强度信息。

结构光模式：利用静态的结构光照明图样激发待测样品44；待测样品44发出荧光信号被探测物镜45收集，经过滤光片46和第二管镜47成像到相机48上。单幅结构光图样投射到样品上获得的荧光强度信息中包含五个频率分量，所以需要得到五个图像方程以分离这五个频率分量，通过计算机49控制第一电光调制器7和第二电光调制器26改变光束的相位，使得投射到待测样品44上的晶格条纹结构光图样离散地相移0°、72°、144°、216°、288°，得到五幅相移后的荧光图像，从而对频率分量进行提取和移动。结合结构光显微成像技术的图像重构算法对采集到的五幅图像进行数据处理，即可获取xz方向上的超分辨图像。

实施例2

如图4所示，该实施例光片显微成像装置也可以采用切向偏振片来获取振动方向相同的线偏振光。图4与图1相比，实施例2中第二偏振分束镜的透射光路中，原始的第二四分之一波片18和第六反射镜19被替换成第十反射镜51和第十一反射镜52来控制透射光路的光程；替换原本的三角反射镜33为第三偏振分束镜54，并增加第二二分之一波片50、第三二分之一波片53来控制光束的偏振态，使两条光路的线偏振光光束都能被第三偏振分束镜54进行合束；同时增加第三四分之一波片55来将两路线偏振光转变成圆偏振光；增加切向偏振片56将两路圆偏振光转变成振动方向相同的线偏振光。

最终三束振动方向相同的线偏振光经成像到激发物镜43的后瞳面，并在待测样品44上形成干涉光束以激发待测样品44的荧光信号。

其余均与实施例1相同。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。