一种用于刺梨汁的超临界CO

技术领域

本发明涉及CO

背景技术

刺梨为蔷薇科蔷薇属植物缫丝花的果实，为药食两用植物资源，既是美味可口的营养珍果，被誉为“三王水果”，又是传统中药，具有健胃消食、收敛止泻的功效，用于治疗积食腹胀、泄泻、腹痛等。现代研究表明，刺梨含有Vc、SOD、多酚、黄酮、多糖等成分，具有抗氧化、保肝护肝、延缓衰老等药理作用。目前，用刺梨开发的产品主要以刺梨汁、刺梨饮料、刺梨口服液等产品为主，富含营养物质的刺梨汁类液态物料也为微生物提供了较好的生长条件。有研究表明刺梨中多种致病微生物易引发疾病或加速疾病的发生发展，如人体在发生免疫缺陷时红球菌引起的发病率有所增加，同时通过大量流行病学数据分析可以把红球菌感染引起的症状看作艾滋病发病的开始；厚壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌科，葡萄球菌属，葡萄球菌属是最常见的化脓性球菌，可以通过多种途径侵入机体，从而造成皮肤组织感染化脓，内脏多器官感染如肺炎、中耳炎，心包炎等，严重的会引起败血症和脓毒血症等全身性感染。刺梨在加工和贮藏过程中，刺梨中的多种微生物容易引起生物活性物质与营养物质的分解。因此，目前的以液态物料为主的刺梨汁原料或产品在生产过程中需要进行灭菌。现有传统技术中用于刺梨汁的灭菌方法主要是高温湿热灭菌，如传统巴氏灭菌法，由于温度高、时间长，易使刺梨汁中SOD、Vc等热敏性物质损失破坏，不能有效保持物料的有效成分，从而导致刺梨汁质量发生变化。

如何达到无菌要求的同时又能保留刺梨汁的风味、营养和活性成分是刺梨生产中的关键技术瓶颈问题。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明的目的在于为刺梨提供一种低温、绿色的灭菌方法，能够有效保持刺梨汁的热敏成分。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，一种用于刺梨汁的超临界CO

通过刺梨汁中真菌和细菌的灭菌效果及灭菌时间得到用于刺梨汁的超临界CO

通过HPLC建立的多指标定量方法，测定超临界CO

超临界灭菌，Vc(mg/mL)的损失率(％)均值为2.719880114％；

超临界灭菌，SOD(U/mL)的损失率(％)均值为3.216106879％；

超临界灭菌，原花青素B1(mg/mL)的损失率(％)均值为0.848936025％；

超临界灭菌，儿茶素(mg/mL)的损失率(％)均值为1.630432375％；

超临界灭菌，柠檬酸(mg/mL)的损失率(％)均值为2.225934585％；

超临界灭菌，没食子酸(mg/mL)的损失率(％)均值为1.826510093％；

超临界灭菌，原儿茶酸(mg/mL)的损失率(％)均值为1.905103053％；

作为优选方案，通过对超临界CO

作为优选方案，所述刺梨汁包括：

A1、清洗：将采集的新鲜果实清洗干净；

A2、压榨：将果肉或整个鲜果使用压汁机压榨直至无果汁流出；

A3、过滤及离心：将果汁用过滤后静置1h，之后离心使果汁呈现澄清的状态收集上清液，备用；

作为优选方案，所述超临界CO

S1、将制备的刺梨汁样品放置超临界CO

S2、通过高压泵输入CO

S3、将灭菌后的刺梨汁样品收集于经消毒处理的容器，密闭保存。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种用于刺梨汁的超临界CO

本发明为刺梨提供了一种低温、绿色的灭菌方法，本发明将刺梨汁置于超临界CO

附图说明

图1为本发明对照品溶液HPLC图；

图2为本发明热敏性成分标准曲线的回归方程、相关系数线性范围示意图；

图3为本发明总SOD活性测定方法检测原理图；

图4为本发明不同灭菌方法下刺梨中热敏性成分含量变化示意图；

图5为本发明16SrDNA丰度等级曲线图；

图6为本发明ITS丰度等级；

图7为本发明刺梨超临界CO

图8为本发明刺梨超临界CO

具体实施方式

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明做进一步阐述和说明:

请参阅图1-8，本发明：一种用于刺梨汁的超临界CO

本发明通过压力将刺梨汁置于超临界CO

首先是刺梨汁的制备：将采集的新鲜果实清洗干净，将果肉或整个鲜果使用压汁机压榨直至无果汁流出，将果汁过滤后静置1h，之后离心使果汁呈现澄清的状态收集上清液，备用。其刺梨汁还可通过市场购买，同样可以应用于本发明实验中。

其次是微生物的培养，其包括微生物培养基的配制、样品稀释液的配制和样品系列稀释、微生物的培养并统计菌落数；

其中，微生物培养基的配制：胰酪大豆琼脂(TSA)培养基的培养原理为：胰酪胨(酪蛋白胰酶水解物)大豆木瓜蛋白酶水解物提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂。常用于药品中需氧菌总数计数，以及医药工业洁净室无菌程度的检测及消毒剂效果测试(CP、USP、EP、GB)。沙氏葡萄糖琼脂(SDA)培养基的培养原理为葡萄糖提供碳源；动物组织的胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物提供氮源，琼脂是凝固剂。因为沙氏葡萄糖琼脂培养基含糖量比较高，其PH值比较低，这种特性非常有利于真菌的生长，并且可以有效的抑制细菌的生长故常用于真菌和酵母菌的培养，按照下表一准确称量胰酪大豆琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基粉末加入蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃左右时，倾入无菌平皿待其凝固后备用；

如表一所示：

样品稀释液的配制：准确称量磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化钠和蛋白胨加入蒸馏水，搅拌加热至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷却后备用；

表一

如表二所示：

样品系列稀释：稀释法将样品配置成不同浓度的菌液，稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上形成的单一菌落，即单细胞繁殖这一培养特征而设计的计数方法，一个菌落代表单细胞；计数时，首先使检体成为均匀的系列稀释液，尽量使检体中的微生物细胞分散，作为单一细胞存在，然后取一定的稀释度、一定量的稀释液，均匀地分布在平板中的培养基内，培养后，各个细胞增殖形成菌落，通过计数菌落数，可以计算样品中的菌数。

表二

稀释涂布平板法计数公式：是每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。

微生物的培养并统计菌落数：

用移液枪吸取表二系列稀释的菌液100μl轻轻加到表一准备好的琼脂板上，同时设置空白和对照组(每个样设置3个重复)，再用一次性涂布棒将菌液在平板上涂抹均匀，相同的稀释度可使用一个涂布棒，更换稀释度时需更换新的涂布棒。将涂抹好的平板平放于桌上20～30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，TSA培养皿、SDA培养皿分别在37℃、28℃培养箱中培养，至长出菌落后即可计数。选择生长为单独菌落、在可统计范围内和生长均匀的稀释倍数的菌液，进行正式的实验。

进一步的，本发明实验采用的是超临界CO

S1、将制备的刺梨汁样品放置超临界CO

S2、通过高压泵输入CO

S3、将灭菌后的刺梨汁样品收集于经消毒处理的容器，密闭保存。

具体的，本发明的超临界CO

A1、关闭阀门：在泵入CO

A2、输入CO

A3、关闭CO

A4、打开阀门：灭菌结束后，打开萃取釜和分离釜I的阀门同时确保分离釜II、III的阀门开启；

A5、压力释放：使其萃取釜中的压力充分释放到解析系统后，即当三个分离斧的压力几乎相等时；

A6、回收CO

A7、释放CO

A8、取样：完全卸压后打开萃取釜取样，灭菌后的样品进行密闭保存。

更进一步的，本发明是通过HPLC建立的多指标定量方法，测定并对比超临界CO

具体的，刺梨中热敏性成分测定方法的建立包括高效液相色谱多指标定量方法、方法学考察和总SOD活性测定方法的建立，高效液相色谱多指标定量方法的色谱条件如下：色谱柱Agilent C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流速0.8mL/min，波长为210nm和368nm，柱温为30℃，梯度洗脱程序见下表三。

表三

按此色谱条件测得的供试品以及对照品溶液的液相色谱图详见说明书附图1。

本发明中方法学考察包括线性范围试验、精密度试验、重复性试验、稳定性试验和加样回收试验。

其中，线性范围试验：

精密称量适量Vc、柠檬酸、没食子酸、原儿茶酸、原花青素B1、儿茶素、芦丁对照品，配制成不同质量水平的对照品溶液，以各对照品浓度(mg/mL)为横坐标，各峰面积为为纵坐标，线性回归，各标准曲线的回归方程、相关系数线性范围如说明书附图2所示,其刺梨热敏性成分对照品线性关系如下表四所示。

表四

精密度试验：

按照上述色谱条件对对照品溶液连续进样6次，测得各色谱峰峰面积，并计算其相对标准偏差，得到对照品Vc、柠檬酸、没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、原花青素B1、芦丁的RSD值分别为1.97％、1.48％、1.36％、1.70％、0.65％、0.54％、1.41％，结果表明仪器精密度良好。

重复性试验：

按照上述方法，平行制备供试品6份，每份进样10μL，分别重复2次，测定并计算RSD值，Vc、柠檬酸、没食子酸、原儿茶酸、原花青素B1、儿茶素、芦丁重复性试验RSD分别为1.53％、2.39％、2.08％、2.08％、0.32％、0.44％、1.50％，均小于3％，说明该测定方法重复性良好。

稳定性试验：

按照上述色谱条件，使用供试品溶液，分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h进样，计算各成分的峰面积RSD值，Vc、柠檬酸、没食子酸、原儿茶酸、原花青素B1、儿茶素、芦丁分别为3.21％、2.03％、1.50％、2.75％、1.77％、2.16％、2.66％，表明供试品溶液在24h内稳定。

加样回收试验：

按照上述方法，平行制备供试品6份，每份中加入等体积同一对照品溶液，测定，计算回收率。

进一步的，总SOD活性测定方法的建立：

参照碧云天总SOD活性检测试剂盒(NBT法)说明书。氮蓝四唑显色法通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2·-)，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜，后者在560nm处有强吸收。而SOD可清除超氧阴离子，从而抑制了甲臜的形成。反应液蓝色越深，说明超氧化物歧化酶活性越低，反之则越高。检测原理图说明书附图3所示。

总的来说吗，如图4所示，同灭菌方法下刺梨中热敏性成分含量变化(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，(x±s，n＝3)，由图A-F可知，Vc、SOD、儿茶素、原花青素B1、柠檬酸和没食子酸这6中刺梨中热敏性成分，从巴氏灭菌和未灭菌对比结果可以看出，采用巴氏灭菌时，这6种成分含量均有显著降低；超临界CO

表五

由表五中可以看出，热敏性成分损失率均小于5％，其中：

超临界灭菌，Vc(mg/mL)的损失率(％)均值为2.719880114％；

超临界灭菌，SOD(U/mL)的损失率(％)均值为3.216106879％；

超临界灭菌，原花青素B1(mg/mL)的损失率(％)均值为0.848936025％；

超临界灭菌，儿茶素(mg/mL)的损失率(％)均值为1.630432375％；

超临界灭菌，柠檬酸(mg/mL)的损失率(％)均值为2.225934585％；

超临界灭菌，没食子酸(mg/mL)的损失率(％)均值为1.826510093％；

超临界灭菌，原儿茶酸(mg/mL)的损失率(％)均值为1.905103053％；

该研究结果证明了超临界CO

本发明通过对临界CO

微生物多样性分析

Illumina测序得到的PEreads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析，基于OTU可以进行多种多样性指数分析，基于OTU聚类分析结果，可以对OTU进行多种多样性指数分析以及对测序深度的检测；基于分类学信息，可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。在上述分析的基础上，可以对多样本的群落组成和系统发育信息进行多元分析和差异显著性检验。

(1)OUT聚类分析

rank-abundance曲线(丰度等级曲线)以物种数目排序的等级和物种数目的百分含量进行作图，该曲线可以反应物种的丰富程度和均匀程度。丰富程度由曲线在横轴上的宽度体现，曲线越宽表示物种的多样性越高，反之则越单一；物种的均匀程度由曲线的形状体现，若曲线下降越平缓说明样本的多样性越高，反之若曲线下降越陡则说明该样本中的优势菌群所占比例很高，其多样性也越小。

通过对比图5和图6可知，刺梨样品中细菌菌落种类远远高于真菌，说明刺梨可能更容易滋生细菌。同时通过对比组内不同灭菌时间下的曲线发现，随着灭菌时间的延长其样品多样性明显降低。

其中16SrDNA测序OUT序列表如下表六所示,ITS测序OUT序列表如下表七所示。注：前8列为对应的域、界、门、纲、目、科、属、种的物种名，第9列为该物种对应的OTU编号信息。

表六

表七

从表六和表七可以看出，细菌的生物多样性明显高于真菌的多样性，通过OUT序列表计算得知细菌的菌落的种类数是真菌的248.3倍，而细菌大多属于厌氧微生物，所以在刺梨的储存过程中应保持环境的通风。样品的一些优势细菌包括放线菌门，放线菌纲，棒状杆菌目，诺卡氏菌科，红球菌属，红球菌属有的菌种是人类和动物共同的致病菌可以引起发烧乏力等症状同时也是肺脓肿的发病原因之一，也有研究表明人体在发生免疫缺陷时尤其是感染HIV后红球菌引起的发病率有所增加，同时通过大量流行病学数据分析可以把红球菌感染引起的症状看作艾滋病发病的开始；厚壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目，葡萄球菌科，葡萄球菌属，葡萄球菌属是最常见的化脓性球菌，可以通过多种途径侵入机体，从而造成皮肤组织感染化脓，内脏多器官感染如：肺炎、中耳炎，心包炎等，严重的会引起败血症和脓毒血症等全身性感染；变形菌门，β-变形菌纲，奈瑟菌目，奈瑟菌科，莫拉菌属，莫拉菌是人体皮肤和黏膜表面的寄生菌，多为条件性致病菌，在肿瘤患者或放疗化疗等免疫力低下的病人中容易引发脑膜炎、败血症、肺部感染等疾病；变形菌门，β-变形菌纲，伯克霍尔德目，产碱杆菌科，无色杆菌属，无色杆菌属多存在于潮湿的环境中，也属于条件致病菌易感染一些免疫力低下、有基础疾病和长期服用激素或抗生素的人群，引发肺炎、脑膜炎和败血症等，同时无色杆菌成为肺囊性纤维化的新兴的病原菌的观点也被逐渐热认可。而真菌的种类就相对比较单一了，主要就是子囊菌门，酵母菌纲，酵母菌目，毕赤菌属，毕赤菌属是第二大酵母菌类群仅次于假丝酵母菌现目前对于其致病性未见报道，常被当作益生酵母被广泛运用，如动物的微生物饲料添加剂；子囊菌门，芽孢菌纲，隐球酵母目，隐球酵母科，念珠菌属，念珠菌属又称假丝酵母菌属是酵母菌中最重要的一个属于条件致病菌，容易侵染免疫力低下的人群，主要引起人体皮肤、黏膜及内脏的急性或慢性炎症，常见的症状如：甲沟炎、鹅口疮、生殖器念珠菌病等，是深部真菌感染的主要病菌。综上所述，以上均为刺梨汁中所滋生的优势微生物，具有较强的致病性以及会造成刺梨活性成分的降解，所以一个适用于刺梨的灭菌技术的开发具有重要的意义。

从上述结果来看发现刺梨较真菌来说更容易滋生细菌，细菌中的优势菌前三为红球菌、葡萄球菌、莫拉菌均为致病菌，此外发现超临界设备对革兰氏阴性杆菌的杀灭作用比革兰氏阳性杆菌更显著，超临界设备对真菌的杀灭作用比细菌的更显著，下面将结合具体实施例对本发明超临界CO

实施例1

灭菌条件对真菌的影响：

在温度40℃的低温条件下，考察超临界CO

空白皿未长菌说明该实验结果的可靠性：如表八所示，与未灭菌的样品比较，超临界CO

表八

通过对菌落数的计数并换算稀释倍数可知未灭菌的样品中的真菌菌落浓度为8.55*107个/mL，通过对灭菌率作图如说明书附图7所示：

抑制率(％)＝×100％。

实施例2

灭菌条件对细菌的影响：

在温度40℃的低温条件下，考察超临界CO

空白皿未长菌说明该实验结果的可靠性：如表九所示，与未灭菌的样品比较，超临界CO

表九

通过对菌落数的计数并换算稀释倍数可知未灭菌的样品中的真菌菌落浓度为5.81*107个/mL，通过对灭菌率作图如说明书附图8所示。

从图8可直观的看到，灭菌率随着压力的增加而增加，在较低压力15Mpa时，在5-15min范围内灭菌率显著增加，之后随着时间的延长灭菌率增加缓慢，直到60min达到最大值；在30Mpa的压力下，在5-15min范围内灭菌率缓慢增加，25min之后达到平衡值；在45Mpa的压力下，灭菌率5min之后即达到平衡值，在60Mpa的压力下，灭菌率1min之后即达到平衡值。综合灭菌效果和时间、设备成本考虑，45Mpa、5min为最佳的灭菌条件。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。