一种吡仑帕奈长效缓释微球、制备方法及缓释注射剂

技术领域

本发明涉及吡仑帕奈的缓释给药技术领域，具体涉及一种吡仑帕奈长效缓释微球、制备方法及缓释注射剂。

背景技术

癫痫是一种由多病因引起的、仅次于脑卒中的常见慢性神经系统疾病，需要长期服药（一般3~5年以上）。全球约有6000万名患者，其中美国约340万、日本约100万、欧洲约600万、中国约900万患者。对于新诊断的癫痫患者，使用抗癫痫药（Antiepileptic drugs,AED）治疗仍是首选，但有约30%患者的病情未得到满意的控制，此外许多患者发生了显著的不良反应。21世纪，抗癫痫药物的研发主要针对难治性癫痫，同时也以提高长期用药的便利性和降低传统药物的毒副作用为目的。

吡仑帕奈是日本卫材研发的一种高选择性、非竞争性的α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）型谷氨酸受体拮抗剂。吡仑帕奈通过与AMPA受体非竞争性结合，减少神经元过度兴奋，达到预防和治疗癫痫疾病的目的。吡仑帕奈是目前第一个被批准上市的高度选择性AMPA受体拮抗剂，具有作用机制独特、药物耐受性良好、广谱抗癫痫的特点，已在超过55个国家被应用于局灶性和全面性癫痫患者。吡仑帕奈3/4水合物分子式如图1所示。

吡仑帕奈已上市制剂有片剂（规格有2mg、4mg、6mg、8mg、10mg、12mg）、颗粒剂（1%）、口服混悬液（0.5mg/ml），均为每日给药1次；成人初始剂量2mg/天，可按每1或2周增加2mg进行加量滴定，维持剂量4~12 mg/天。吡仑帕奈的常见不良反应包括头晕、易激惹、疲劳、攻击行为、自杀倾向、恶心、体重增加等。研究提示，吡仑帕奈的不良反应呈剂量依赖性。

现有的吡仑帕奈制剂存在以下缺点：

（1）经口给药不便：吡仑帕奈上市剂型都需要经口给药，而部分癫痫患者例如呛咳、吞咽困难、鼻饲、造瘘患者等，每日口服给药十分不便。

（2）每日给药一次，血药浓度波动明显，不良反应风险高。

（3）漏服药物危害大：癫痫患者一般需要长期服药，每日一次的给药频率较频繁，患者顺应性差，还容易出现漏服药物的情况。癫痫患者漏服药物的危险性显著高于其他患者，如果癫痫患者连续几次漏药，药物疗效降低很有可能诱发癫痫发作，这种发作一般比平时更频繁、症状更严重，甚至引起癫痫持续状态危及生命。

另外，根据国家药监局公告，吡仑帕奈（包括其盐、异构体和单方制剂）自2023年7月1日起要按二类精神药品管理。以后吡仑帕奈不能经网络销售，需要患者去医院开具相应的麻醉精神药品处方后，线下获得药品。一般而言，第二类精神药品的处方不超过7天用量。这意味着患者需要频繁就诊取药，增加了用药成本。

现有研究者为减轻毒副作用、提高生物利用度和患者顺应性开发了新的吡仑帕奈制剂，包括不同于原研处方工艺的口服片剂（CN113440489A）、冻干口崩片（CN104706604A）、固体分散体干混悬剂（CN107536805A）、分散片（CN106619551A）、口腔溶膜剂（CN109106696A）、纳米混悬液（CN113069415B）等，都是即时释药制剂。另有专利CN106667968A提供了一种吡仑帕奈缓释胶囊，可延长体内吡仑帕奈治疗浓度的维持时间达12h ，给药间隔仍然很短，并未解决频繁给药的问题。

近年来，由于缓释微球具有巨大的工业价值和广阔的应用前景，使其成为药剂学研究热点之一，被各大国际医药巨头所重视。微球是指药物溶解或分散在载体辅料中形成的微小球状实体，通常粒径在1~250μm之间。微球经注射进入体内后，经药物扩散或载体溶蚀机理，以一定速率释放缓慢药物，在病灶部位维持稳定的血药浓度。

然而，尽管经过大量检索，尚未发现专利或论文文献公开有效的吡仑帕奈长效缓释微球制剂。因此，开发吡仑帕奈长效缓释微球制剂，以降低给药频次、减少患者就诊次数，增加患者用药便利性和顺应性，避免峰谷现象、减少毒副作用和耐药性的发生，有着重大临床意义和经济学意义。

发明内容

本发明提供一种吡仑帕奈长效缓释微球、制备方法及缓释注射剂，目的在于降低吡仑帕奈给药频次，提高患者用药的便利性，同时也减轻因药物在体内浓度波动而引起的毒副作用。

本发明第一方面是提供一种吡仑帕奈长效缓释微球，含有吡仑帕奈活性成分和高分子载体材料，其中吡仑帕奈活性成分理论的质量占比为10%~35%，药载比1:9~7:13。经过实测，载药量9~34%，包封率45.8%~99.2%（较佳达90%以上），普遍能持续释放吡仑帕奈14~42天。

所述的吡仑帕奈活性成分可为无水物、水合物及其盐中的一种或多种的混合物。

所述的高分子载体材料选自重均分子量为12~145KDa聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、聚乳酸（PLA）或聚己内酯（PCL）。

其中，PLGA具有灵活的可调节性，除分子量以外PLGA还可改变端基种类、乳酸/羟基乙酸单体摩尔比（L/G），获得不同特性的微球，因此载体材料更优选为PLGA。

进一步地， PLGA重均分子量优选为47~145 KDa，端基可为酯基、羟基、羧基，L/G可为50/50~75/25。

进一步地，所述吡仑帕奈长效缓释微球的粒径D90≤150μm、跨距SPAN≤2，粒径小且分布均匀，具有较好的通针性。

本发明第二方面是提供一种吡仑帕奈长效缓释微球的制备方法，包括如下步骤：

S1、将高分子载体材料溶解于油相溶剂中；

S2、将吡仑帕奈活性成分溶解于含有高分子载体材料的油相溶剂中，形成油相（O）；

S3、将稳定剂溶于水中形成水相（W）；

S4、在搅拌条件下，将S2所得油相（O）加入S3所得水相（W）中，混合均匀，形成O/W乳液；

S5、搅拌条件下，将O/W乳液加入固化相中，乳液滴在固化相中固化形成微球，得到含微球的悬浮液；

S6、从含微球的悬浮液中提取得到微球，即吡仑帕奈长效缓释微球。

具体地，S1所述油相溶剂需包含主溶剂成分和次溶剂成分，其中主溶剂成分为二氯甲烷，次溶剂成分选自甲醇、乙醇、丙二醇、乙酸乙酯中的任意一种或多种。

在本发明的实现过程中，通过大量实验证发现，油相溶剂的种类、组成比例对吡仑帕奈微球的制备至关重要。已知乳酸单体摩尔比（LA比例）≥50%的PLGA溶于二氯甲烷，并且二氯甲烷沸点低（约为39.8℃），在水中具有一定溶解性，因此二氯甲烷能从油相扩散至水相中再经液气表面挥发除去，是制备微球产品的理想溶剂。本发明中吡仑帕奈几乎不溶于水，易溶于二氯甲烷，略溶于乙腈、丙酮，微溶于乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙二醇，适合用O/W乳化溶剂挥发法制备微球。但是实验发现，仅采用二氯甲烷作为油相溶剂时，药物-载体材料混合物析出得到不规则颗粒，难以制备出形状圆润、包封率高的微球。在采用单一油相溶剂二氯甲烷的条件下，本发明还尝试了几种不同的高分子载体材料，但发现无论如何调整方案，均无法制得综合性能合格的微球产品。

在本发明的实现过程中，发现将油相溶剂设置为含有主溶剂成分和次溶剂成分，其中主溶剂成分为二氯甲烷，次溶剂成分选自甲醇、乙醇、丙二醇、乙酸乙酯，并在此前提下通过对载体材料、制备工艺等进行综合优化调整，可以制得一系列长效的吡仑帕奈微球，吡仑帕奈持续稳定释放的周期普遍达2周以上，较佳的方案制得的微球样品其吡仑帕奈持续稳定释放的周期可达6周。相比于普通制剂（如片剂），可大幅度延长给药间隔，增加用药便利性，提高患者顺应性，降低漏服药物的可能性。

进一步地，次溶剂成分优选为甲醇、乙醇或丙二醇，更优选为乙醇。

进一步地，油相溶剂中，主溶剂成分与次溶剂成分的质量比可为4/1~6/1，优选为5/1。

进一步地，高分子载体材料在油相（O）中的质量百分比优选为10~14%。

进一步地，吡仑帕奈活性成分与载体材料的质量比（药载比）为1:9~7:13，即微球理论载药量为10~35%，优选为10%~30%。

进一步地，S3中所述稳定剂选自聚乙烯醇（PVA）、吐温、司盘、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆中的一种或几种，优选为聚乙烯醇（PVA）。PVA浓度优选为0.1~5%，更优选为1%。

进一步地，油相与水相的质量比选自1:1~1:100，优选1:1~1:30，更优选为1:10~1:30。

进一步地，S4中“混合均匀”的方式选自搅拌、均质、超声、静态混合的方式。优选方式为均质，转速1000~10000rpm。

具体地，S5中所述固化相为载体材料的非溶剂，即载体材料在其中难溶或不溶。

较佳地，固化相可以是水或含有添加剂的水溶液，添加剂可以是吐温、司盘、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、泊洛沙姆、PVA等。

进一步地，固化相用量可选择为微球理论重量的0~1000倍，优选为100~400倍。

进一步地，S6中通过过滤、洗涤、干燥可以从含微球的悬浮液中提取得到微球，得到干燥洁净的吡仑帕奈长效缓释微球。

本发明第三方面是提供一种吡仑帕奈长效缓释注射剂，其含有上述的吡仑帕奈长效缓释微球。

本发明涉及的术语的解释

理论载药量：理论微球中所含药物的重量百分率。理论载药量=（理论投药量/（理论投药量+理论载体重量））×100%。

实测载药量：实测微球中所含药物的重量百分率。实测载药量=（微球中含药量/微球重量）×100%。

包封率：微球中被包封药物的重量百分率。包封率=（微球包封的药量/微球中包封与未包封的总药量）×100% =（1－液体中未包封的药量/微球中包封与未包封的总药量）×100%。

D

跨距SPAN=（D

有益效果

本发明研究制备了一种吡仑帕奈长效缓释微球，其微球形貌圆整，载药量良好，包封率高，粒径适宜且分布均匀，能持续释放吡仑帕奈药物14~42天。本发明制得的吡仑帕奈长效缓释微球可进一步开发制成吡仑帕奈长效缓释注射剂，相比于吡仑帕奈上市制剂的每日给药一次，可显著延长给药间隔，降低就诊取药次数，增加用药便利性，提高患者顺应性，降低因漏服药物诱发癫痫发作的风险。特别是对于一些不适于经口给药的患者，例如呛咳、吞咽困难、鼻饲、造瘘患者等，长效的吡仑帕奈微球及制剂提供了一种给药更加便利和安全的新选择。

附图说明

附图1所示为吡仑帕奈3/4水合物的分子结构式。

附图2所示为实施例1~8及对比例1~4的显微镜下形貌图。

附图3所示为实施例1~8及对比例1~4的检测结果汇总。

附图4所示为实施例2、9、10的检测结果汇总。

附图5所示为实施例2、11~14的检测结果汇总。

附图6所示为实施例13、15~18的检测结果汇总。

附图7所示为实施例13、19~21的检测结果汇总。

附图8所示为实施例13、22、23的显微镜下形貌图。

附图9所示为实施例13、22、23的检测结果汇总。

附图10所示为实施例13、22、23的体外释放曲线。

附图11所示为对比例5、6的体外释放曲线。

附图12所示为实施例24~28的检测结果汇总。

附图13所示为实施例24~28的体外释放曲线。

附图14所示为实施例22、29~31的检测结果汇总。

附图15所示为实施例22、29~31的体外释放曲线。

附图16所示为实施例22、32~38的检测结果汇总。

附图17所示为实施例22、32~38的体外释放曲线。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中所使用的术语具有与本发明所涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

检测方法：

微球形貌：取适量微球用0.1%PVA溶液分散后，滴加至载玻片上，于光学显微镜下观察形貌。

载药量：称取微球50~60mg，加定量乙腈溶解，然后用HPLC法检测吡仑帕奈浓度，计算载药量。

包封率：称取微球50~60mg，在定量无水乙醇中分散5分钟，然后检测无水乙醇中吡仑帕奈浓度，得到游离药物量，按照包封率=（1-游离药物量/微球载药量）×100%公式计算包封率。

粒径及粒径分布：称取微球约50mg ，置10mL西林瓶中，加入0.1%吐温80水溶液，超声1min，用激光粒度仪测定微球粒径及粒径分布。

体外释放：（1）释放介质：1%十二烷基硫酸钠、25%乙醇的pH7.4磷酸盐缓冲液，有机系滤膜抽滤。（2）取微球10mg置150ml玻璃瓶中，加介质100ml，于37℃水浴振荡中进行体外释放试验，转速100r/min，于各取样点取样分析，并补液。HPLC法检测各样品中吡仑帕奈浓度，计算累计释药量并计算累积释放率（%）=累计释药量/理论微球载药量×100%，作出体外累积释放曲线。

实施例1：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25 ，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g甲醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液27.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次，冷冻干燥后即得粉末状微球。

实施例2：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液27.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例3：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g丙二醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液27.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例4：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g乙酸乙酯中，得油相。称取1%PVA溶液27.00g作为水相，在5000rpm转速均质条件下，将油相加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例5：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.05g二氯甲烷、1.51g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液54.0g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例6：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.48g二氯甲烷、1.08g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液54.0g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例7：

称取1.08gPLA（Mw=180 KDa）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液27.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例8：

称取1.08gPCL（粘度1.75dl/g）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液27.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

对比例1：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端），溶解于7.56g二氯甲烷中，得油相溶液。称取1%PVA溶液45.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用90μm筛网过滤混悬液，收集筛下的固化颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

对比例2：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于7.56g二氯甲烷中，得油相溶液。称取1%PVA溶液27.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm的筛网过滤混悬液，收集筛下的固化颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

对比例3：

称取1.08gPLA（Mw=180 KDa）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于7.56g二氯甲烷中，得油相溶液。称取1%PVA溶液27.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm的筛网过滤混悬液，收集筛下的固化颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

对比例4：

称取1.08gPCL（粘度1.75dl/g）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于7.56g二氯甲烷中，得油相溶液。称取1%PVA溶液27.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm的筛网过滤混悬液，收集筛下的固化颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

测试例1

取实施例1~8样品检测微球形貌、载药量、包封率，对比例1检测微球形貌，对比例2~4检测微球形貌、载药量、包封率，结果见图2和图3。图2中S1~S8所示形貌分别为对应实施例1~8的形貌，图2中D1~D4所示形貌分别为对应对比例1~4的形貌。

对比例1、2结果显示吡仑帕奈原料药本身会对微球的形成造成不利的影响。对比例1未添加吡仑帕奈药物，得到了形貌圆润的PLGA微球。对比例2中添加了吡仑帕奈，导致无法形成规则球状的微球颗粒，实际载药量23.98%，但包封率极低仅10.74%。这表明吡仑帕奈原料药的存在不仅抑制规整微球的形成，同时自身也难以在微球形成过程中被均匀地包封在微球内，而是主要以附着的形式蓄积在微球的表层。这种极低的包封率不仅不利于延长药物的释放周期，同时也容易在给药初期形成突释现象，造成吡仑帕奈在体内的浓度大幅偏离预设范围。

对比例3、4与对比例2的结果类似，虽然尝试更换了不同的载体材料，包括PLA和PCL，但包封率仍然极低，显微镜下表现为不规则颗粒，未能形成圆整球形 。

实施例1~4结果显示油相溶剂组成对吡仑帕奈微球的形貌和包封率具有显著影响。采用二氯甲烷加甲醇、乙醇、丙二醇、乙酸乙酯的混合溶剂作为油相溶剂，所得微球与对比例2~4相比，形貌和包封率均显著改善。当油相溶剂为二氯甲烷加乙醇时所得微球最圆整、表面突起少，包封率也更高。

实施例5、6结果显示，二氯甲烷与乙醇质量比对吡仑帕奈微球的形貌、包封率有影响，乙醇比例偏高或偏低包封率都会下降。但实施例5、6与对比例2~4相比，所得微球仍形貌明显改善、包封率显著提高。进一步地，实施例2、实施例7、8结果表明载体材料种类对吡仑帕奈微球形貌、包封率、载药量也有一定影响。

实施例9：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于7.79g二氯甲烷、1.56g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液27.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例10：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于5.22g二氯甲烷、1.04g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液27.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

测试例2：

取实施例9、10样品检测微球载药量、包封率，结果见图4。结果显示，本方案制备工艺条件下，PLGA浓度（PLGA浓度=PLGA质量/油相总质量×100%）介于10~14%之间时，对包封率影响较小，14%时载药量最高。

实施例11~14：

实施例11~14的吡仑帕奈微球的制备方法基本与实施例2相同，不同在于水相1%PVA溶液的重量，分别为9.00g、54.00g、90.00g、270.0g1%PVA溶液。

测试例3：

取实施例11~14样品检测微球载药量、包封率。实施例2、11~14油水比、载药量、包封率结果见附图5。结果显示，油水比对吡仑帕奈微球载药量、包封率有影响。油水比1:1~1:30时，包封率可达70%以上。包封率较高情况下，考虑节能减排，更优选为油水比1:10。

实施例15：

实施例15的吡仑帕奈微球的制备方法基本与实施例2相同，不同在于水相重量为90.00g以及水相组成为5%PVA溶液，具体如下。

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取5%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例16~18：

实施例16~18吡仑帕奈微球的制备方法基本与实施例15相同，不同在于水相组成分别为0.1%PVA溶液、1%吐温80、0.1%十二烷基硫酸钠。

测试例4：

取实施例15~18样品检测微球载药量、包封率，取实施例13、15~18样品检测微球粒径及粒径分布，结果见附图6。结果显示，水相稳定剂浓度、种类对吡仑帕奈微球载药量、包封率影响较小。

实施例19

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取144.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例20、21中吡仑帕奈微球的制备方法基本与实施例19相同，不同在于固化相重量分别为1440.0g、72.0g，具体如下。

实施例20：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取1440.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例21：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取72.0g水作为固化相，边搅拌边将O/W乳液加入固化相中，然后持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。再用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

测试例5：

检测实施例19~21的载药量、包封率、粒径及粒径分布，结果见附图7。实施例13、实施例19~21结果显示，固化相用量对载药量、包封率有影响，固化相用量为微球理论质量的100倍以上时包封率可达80%以上。

实施例22：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯基端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，预先用冰水浴冷至5℃左右，然后边搅拌边将O/W乳液加入固化相中，再持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例23：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯基端）、吡仑帕奈0.36g，溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，预先用冰水浴冷至5℃左右，然后边搅拌边将O/W乳液加入固化相中，再持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

测试例6：

检测实施例22、23样品的载药量、包封率、粒径及粒径分布，检测实施例13、22、23的微球形貌、体外释放情况；结果见附图8~10。图8中S13、S22、S23所示分别对应实施例13、实施例22、实施例23的样品形貌。

实施例13、22的吡仑帕奈微球形貌圆整、粒径均一，结果显示固化温度对吡仑帕奈微球载药量、体外释放有影响。与实施例13相比，实施例22采用低温固化工艺，在保持高包封率的同时保持较高的载药量。固化温度不同使得释药速率略有不同，但均可持续释放42天。

实施例22、23的结果显示，采用吡仑帕奈3/4水合物或吡仑帕奈均可制备出形貌圆整、载药量较好、包封率高的微球，体外释放速率略有不同，但均可持续释放42天。

对比例5：

取原料药吡仑帕奈2.5mg置150ml玻璃瓶中，加释放介质（1%十二烷基硫酸钠、25%乙醇的pH7.4磷酸盐缓冲液）100ml，于37℃水浴振荡中进行体外释放试验，转速100r/min，于5、15、30、60min后取样分析，并补液。HPLC法检测各样品中吡仑帕奈浓度，计算累计释药量并计算累积释放率（%），作出体外累积释放曲线。释放曲线结果见附图11。

对比例6：

取原料药吡仑帕奈3/4水合物2.5mg置150ml玻璃瓶中，加释放介质（1%十二烷基硫酸钠、25%乙醇的pH7.4磷酸盐缓冲液）100ml，于37℃水浴振荡中进行体外释放试验，转速100r/min，于5、15、30、60min后取样分析，并补液。HPLC法检测各样品中吡仑帕奈浓度，计算累计释药量并计算累积释放率（%），作出体外累积释放曲线。释放曲线结果见附图11。

对比例5、6在与微球体外释放相同条件下，将原料药吡仑帕奈、吡仑帕奈3/4水合物加入释放介质后，药物迅速溶解，60min已释放完全。相比之下，实施例制成的吡仑帕奈微球有非常显著的缓释作用。

实施例24

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在1000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，预先用冰水浴冷至5℃左右，然后边搅拌边将O/W乳液加入固化相中，再持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径150μm的筛网过滤混悬液，收集筛下混悬液，然后分装至离心管中经5000rpm×5min离心后收集沉淀物，然后经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例25~28吡仑帕奈微球的制备方法基本与实施例24相同，不同在于均质条件分别为3000、5000、7000、10000rpm。

测试例7：

取实施例24~28样品检测微球载药量、包封率、粒径及粒径分布、体外释放，结果见附图12、13。结果显示，均质转速对吡仑帕奈微球粒径有较大影响，进而影响体外释放。转速1000~10000rpm范围内，微球载药、包封情况良好，体外可维持释放28天以上。

实施例29：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.124g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.12g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，预先用冰水浴冷至5℃左右，然后边搅拌边将O/W乳液加入固化相中，再持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例30：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.477g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.46g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，预先用冰水浴冷至5℃左右，然后边搅拌边将O/W乳液加入固化相中，再持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例31：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，酯封端）、吡仑帕奈3/4水合物0.60g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.58g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，预先用冰水浴冷至5℃左右，然后边搅拌边将O/W乳液加入固化相中，再持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

测试例8：

检测实施例29~31样品的载药量、包封率、粒径、体外释放，结果见附图14、15。结果表明理论载药量对包封率、体外释放有影响。理论载药量10%~35%之间时，包封率可达77%以上，体外均能持续释放35天以上，但释放速率有所不同，理论载药35%时，初始突释最高、释放最快。

实施例32：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=140 KDa，羟基端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，预先用冰水浴冷至5℃左右，然后边搅拌边将O/W乳液加入固化相中，再持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例33：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=145 KDa，羧基端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，预先用冰水浴冷至5℃左右，然后边搅拌边将O/W乳液加入固化相中，再持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例34：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=120 KDa，酯基端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，预先用冰水浴冷至5℃左右，然后边搅拌边将O/W乳液加入固化相中，再持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例35：

称取1.08gPLGA（L:G=75:25，Mw=47 KDa，酯基端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，预先用冰水浴冷至5℃左右，然后边搅拌边将O/W乳液加入固化相中，再持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例36：

称取2.16gPLGA（L:G=75:25，Mw=12 KDa，酯基端）、吡仑帕奈3/4水合物0.746g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.72g），溶解于12.60g二氯甲烷、2.52g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取1152.0g水作为固化相，预先用冰水浴冷至5℃左右，然后边搅拌边将O/W乳液加入固化相中，再持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例37：

称取1.08gPLGA（L:G=65:35，Mw=60 KDa，羧基端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，预先用冰水浴冷至5℃左右，然后边搅拌边将O/W乳液加入固化相中，再持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

实施例38：

称取1.08gPLGA（L:G=50:50，Mw=55 KDa，羧基端）、吡仑帕奈3/4水合物0.373g（水分3.5%，相当于吡仑帕奈0.36g），溶解于6.30g二氯甲烷、1.26g无水乙醇中，得油相溶液。称取1%PVA溶液90.00g作为水相，在5000rpm转速条件下，边均质边将油相溶液缓慢加入水相中，形成O/W乳液。称取576.0g水作为固化相，预先用冰水浴冷至5℃左右，然后边搅拌边将O/W乳液加入固化相中，再持续搅拌4小时，固化微球，得到混悬液。然后用孔径90μm、20μm的筛网过滤混悬液，收集介于90μm与20μm筛网之间的颗粒，经水洗涤3次后，干燥即得粉末状微球。

测试例9：

检测实施例32~38样品的载药量、包封率、粒径、体外释放，结果见附图16、17。结果表明PLGA的端基、分子量、L/G对体外释放的影响较大。L/G=75/25、酯基端时，PLGA分子量越小释放越快，分子量12KDa时包封率显著下降，且释放迅速，约1周即释放完全，分子量47KDa及以上时包封率可达90%以上，且释放可持续14天及以上。分子量在140~145KDa、L/G=75/25时，端基为羧基时释放最快，羟基次之，酯基最慢。分子量55~60 KDa、端羧基时，G占比越大，释放越快。

通过改变PLGA分子量、L/G、端基可以调节吡仑帕奈微球的释药速度，有开发成不同给药周期缓释制剂的潜力，具有广泛的应用前景，例如实施例36可开发成1周/次的给药周期的制剂，实施例38可开发成2周/次的给药周期的制剂，实施例37可开发成3周/次的给药周期的制剂，实施例35可开发成4周/次的给药周期的制剂，实施例32、33、34可开发成5周/次的给药周期的制剂，实施例22可开发成6周/次的给药周期的制剂。