一种抗糖尿病骨质疏松药物评价与筛选的方法

技术领域

本发明属于药物评价与筛选的技术领域，具体涉及一种建立糖尿病骨质疏松斑马鱼模型的方法，以及运用该模型在评价药物抗糖尿病骨质疏松功效中的应用。

背景技术

糖尿病骨质疏松症是指糖尿病并发骨量减少、骨微结构改变、骨强度降低、骨脆性增加等易发生骨折的一种退行性、全身性、代谢性骨骼疾病。糖尿病骨质疏松症临床治疗一般采用降糖药物、骨吸收抑制剂及骨形成促进剂等。但是存在降糖药物的骨形成促进效果不佳，双磷酸盐类、雌激素等易造成下颔部坏死、乳腺癌高发等副作用，甲状旁腺激素/类似肽、氟化物等有导致骨肉瘤或其他骨肿瘤的风险。糖尿病骨质疏松症 的临床治疗效果不理想，亟需研究更加安全、经济有效的 DOP 治疗药物。

目前，用于骨质疏松药物评价的动物模型主要由大鼠、小鼠和斑马鱼。相对于大鼠小鼠而言，斑马鱼个体小、药物用量小、生长周期快、繁殖和饲养成本第，是更具优势的骨质疏松模型动物。根据已有研究，糖尿病骨质疏松药物评价多用体外模型或基于大/小鼠的模型动物。体外模型的评价结果假阳性较高，而大/小鼠模型成本高、周期长，难以快速评价抗骨质疏松药物功效。因此缺乏快速有效的体内功效评价方法已成为该类药物研发的瓶颈问题。

常用构建斑马鱼骨质疏松模型的药物为糖皮质激素类药物，如泼尼松龙和地塞米松。但是，以上方法无法造成高血糖、高血脂等糖尿病典型病理特征，难以模拟糖尿病病理环境中的骨丢失情况，不能真实评价抗糖尿病骨质疏松药物的功效。

因此，本领域亟待提出一种评价抗糖尿病骨质疏松药物功效的方法，能够快速、高效地用于广泛评价和筛选抗糖尿病药物。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种操作方便、成本低、化合物用量少、劳动强度低、且仅需在一般实验室就可以进行的抗糖尿病骨质疏松药物评价与筛选的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种抗糖尿病骨质疏松药物评价与筛选的方法，包括以下步骤：

1）、将受精后2天的发育正常的斑马鱼置于含有四氧嘧啶10-1000μM的培养水溶液中，25-30℃恒温培养2-10天，制得斑马鱼模型组；将受精后2天的发育正常的斑马鱼置于含有四氧嘧啶10-1000μM、待测化合物浓度为0.1-1000μM的培养水溶液中，25-30℃恒温培养2-10天，制得斑马鱼治疗组；将受精后2天的发育正常的斑马鱼置于培养水溶液中，25-30℃恒温培养2-10天，制得斑马鱼正常组；以上三组每隔1天更换相应培养水溶液；

2）、观察步骤（1）制得的斑马鱼正常组、模型组和治疗组的形态和长度；

3）、用茜素红染色法观察斑马鱼正常组、模型组和治疗组的颅骨骨骼，包括以下步骤：

3.1）、去除培养液，加入固定液将斑马鱼进行固定；

3.2）、去除固定液，加入脱色液脱去斑马鱼色素；

3.3）、脱水剂对斑马鱼进行脱水处理；

3.4）、然后用染色液对斑马鱼进行染色；

3.5）、用超纯水洗去染液，用透化剂透化斑马鱼；

3.6）、取出斑马鱼，保存甘油中，用显微镜观察斑马鱼颅骨，记录并计算斑马鱼颅骨光密度；

4）、用酶联免疫法检测斑马鱼正常组、模型组和治疗组的血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯表达水平。

作为优选方案，所述酶联免疫法分析步骤包括：

第一步：将3-20尾斑马鱼合并为一个样本，去除培养液，用2-20mL生理盐水清洗3次，加入150-1000μL生理盐水；

第二步：按照酶联免疫法试剂盒要求检测血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯表达水平。

作为优选方案，每尾鱼加入50μL生理盐水体积，用手持匀浆机或自动匀浆机进行匀浆，然后4℃离心5-20分钟，移取上清液作为酶联免疫法样品。

作为优选方案，所述的固定液为质量浓度1-5%多聚甲醛水溶液，所述固定液处理时间为5-30分钟。

作为优选方案，所述的脱色液组分包括质量浓度1-3%双氧水和0.5-2%KOH水溶液，所述脱色处理时间为5-120分钟。

作为优选方案，所述脱水剂为10-90%乙醇水溶液；所述脱水处理时间为5-30分钟。

作为优选方案，所述染色液为0.5%KOH配制的质量浓度1-10%茜素红溶液；所述染色处理时间为2-48小时。

作为优选方案，所述透化剂包括三种溶剂：第一种，含0.375%KOH和25%甘油的水溶液；第二种含0.25% KOH和50%甘油的水溶液；第三种，含0.125% KOH和75%甘油的水溶液，所述透化处理步骤包括：

第一步，采用以上第一种透化剂浸泡斑马鱼0.5-24小时，第二步，采用以上第二种透化剂浸泡斑马鱼0.5-24小时，第三步，采用以上第三种透化剂浸泡斑马鱼0.5-24小时。

作为优选方案，所述显微镜观察为体式显微镜下观察，记录为拍照记录，计算为利用图像处理软件计算。

本发明首次利用四氧嘧啶建立斑马鱼糖尿病骨质疏松模型，建立的斑马鱼糖尿病骨质疏松模型具有制作简单、快速、稳定可靠和重复性好的优点，用于药物功效评价时药物用量小，降低了糖尿病骨质疏松模型的制作成本和相关药物功效评价成本，提高了实验结果的可靠性和评价效率。

本发明在利用四氧嘧啶建立斑马鱼糖尿病骨质疏松模型的前提下，采用首次将长度、颅骨面积、血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯多指标综合作为斑马鱼糖尿病骨质疏松的评价指标，更加科学、客观，提高了结果的准确性，客服了现有技术误差大的缺陷；

本发明中所用的模式动物斑马鱼，既具有体外细胞株快速筛选、药物用量少的优点，有具有整体动物体内验证的优势，利用斑马鱼幼鱼进行大规模化合物的抗糖尿病骨质疏松功效评价，有助于提高实验效率和降低实验成本。

附图说明

图1为四氧嘧啶和治疗药物对斑马鱼长度（L, μm）影响；

图2为四氧嘧啶和治疗药物对斑马鱼颅骨钙化面积（M）影响；

图3为四氧嘧啶和治疗药物对斑马鱼血糖(G,mmol/L)影响；

图4为四氧嘧啶和治疗药物对斑马鱼高密度脂蛋白(H,mmol/gprot)影响；

图5为四氧嘧啶和治疗药物对斑马鱼甘油三酯(T, mmol/gprot))影响；

以上图中：A-空白组；B-100μM四氧嘧啶处理的模型组；C-300μM四氧嘧啶处理的模型组；D-500μM四氧嘧啶处理的模型组；E-700μM四氧嘧啶处理的模型组；F-25μM泼尼松龙处理的模型组；I-：300μM四氧嘧啶+100μM阿伦磷酸钠处理的治疗组；J：300μM四氧嘧啶+1μM二甲双胍处理的治疗组；K：300μM四氧嘧啶+25μM知母皂苷BII处理的治疗组。**：与空白组比较，P<0.01; *：与空白组比较，P<0.05。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1：斑马鱼糖尿病骨质疏松模型的建立和验证

（1）斑马鱼幼鱼的获得与使用

采用斑马鱼购自国家斑马鱼资源中心，按雌雄1/1的比例放入交配缸内，光照刺激使其排卵。收集受精卵，移入斑马鱼胚胎培养用水中。从斑马鱼幼鱼出生后2天，选取发育正常的斑马鱼幼鱼，放入24孔板，每孔5尾，每组4个平行孔。

（2）化合物处理

设置6个实验组：1个空白对照组，4个四氧嘧啶处理组，1个泼尼松龙处理组。一处微孔板中的培养睡，空白组加入2mL培养水，四氧嘧啶处理组分别加入100μM、300μM、500μM、700μM四氧嘧啶溶液，由培养水与相应浓度的四氧嘧啶储液配制获得。所述的培养水溶液包括如下组分：NaCl 5mM， KCl 0.17mM, CaCl2 0.4mM, MgSO4 0.16mM，去离子水。然后放入28℃恒温培养箱培养8天。每隔1天换液1/3。

（3）形态学观察

于施药后8天，将斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉，然后用4%多聚甲醛固定于载玻片上，体式显微镜下观察斑马鱼形态。用图像处理软件ImageJ测量斑马鱼长度。

（4）骨骼观察

于施药后8天，将斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉，然后用4%多聚甲醛固定于24孔板上，固定时间为，15分钟；去除固定液，加入脱色液（1.5%双氧水和1%KOH水溶液）脱去斑马鱼色素，脱色处理时间为60分钟；脱水剂（50%乙醇）对斑马鱼进行脱水处理10分钟；用染色液（0.5%KOH配制的质量浓度2%茜素红溶液）对斑马鱼进行染色12小时；用超纯水50mL洗去染液，用透化剂含0.375%KOH和25%甘油的水溶液透化处理2小时，弃去溶剂，用含0.25%KOH和50%甘油的水溶液透化处理1小时，弃去溶剂，用含0.125% KOH和75%甘油的水溶液透化处理1小时；取出斑马鱼，保存甘油中，用体式显微镜观察斑马鱼颅骨，拍照记录，用图像处理软件ImageJ计算斑马鱼颅骨光密度。

（5）将培养条件完全一致的5尾斑马鱼合并，作为一个样本。去除培养液，用10mL生理盐水清洗3次，弃去溶剂，加入250μL生理盐水。用手持匀浆机进行匀浆。然后4℃离心15分钟。移取上清液作为酶联免疫法样品。按照酶联免疫法试剂盒要求检测血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯表达水平。

各组斑马鱼的长度、颅骨面积、血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯水平以平均值±标准偏差表示，采用独立样本t检验法分析比较组间差异的显著性。

实施例2：知母皂苷BII对四氧嘧啶引起的斑马鱼糖尿病骨质疏松的保护作用

设置以下实验组：1个正常组，1个糖尿病骨质疏松模型组，1个阿伦磷酸钠治疗组。1个二甲双胍治疗组，1个知母皂苷BII治疗组。按每组20尾鱼开展实验，取正常发育2天的斑马鱼幼鱼置于24孔板中。空白组加入2mL培养水，糖尿病骨质疏松模型组加入300μM四氧嘧啶溶液，由培养水与相应浓度的四氧嘧啶储液配制获得。阿伦磷酸钠治疗组由四氧嘧啶溶液和阿伦磷酸钠储备液配制获得，其中四氧嘧啶终浓度为300μM。二甲双胍钠治疗组由四氧嘧啶溶液和二甲双胍储备液配制获得，其中四氧嘧啶终浓度为300μM。知母皂苷BII治疗组由四氧嘧啶溶液和知母皂苷BII储备液配制获得，其中四氧嘧啶终浓度为300μM。然后放入28℃恒温培养箱培养8天。每隔1天换液1/3。

于施药后8天，将斑马鱼进行茜素红染色，用体式显微镜观察斑马鱼长度、颅骨，拍照记录，用图像处理软件ImageJ计算斑马鱼颅骨面积。以酶联免疫法分析斑马鱼组织匀浆中的血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯表达水平。

实施例3：动物模型造模方法和给药方法的重复性研究

以10尾雌性成鱼和10尾雄性成鱼开展实验，随机配对后，培养收集来源于以上10对亲鱼的幼鱼，每对亲鱼提供约60尾幼鱼，分为以下实验组：10个正常组，10个糖尿病骨质疏松模型组，10个二甲双胍治疗组，按每组20尾鱼开展实验。取正常发育2天的斑马鱼幼鱼置于24孔板中。空白组加入2mL培养水，糖尿病骨质疏松模型组加入300μM四氧嘧啶溶液，由培养水与相应浓度的四氧嘧啶储液配制获得。二甲双胍钠治疗组由四氧嘧啶溶液和二甲双胍储备液配制获得，其中四氧嘧啶终浓度为300μM。然后放入28℃恒温培养箱培养8天。每隔1天换液1/3。

于施药后8天，将斑马鱼进行茜素红染色，用体式显微镜观察斑马鱼颅骨，拍照记录，用图像处理软件ImageJ计算斑马鱼颅骨面积。以酶联免疫法分析斑马鱼组织匀浆中的血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯表达水平。

造模方法和给药方案相同的情况下，来源不同亲鱼10组幼鱼的颅骨面积、血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯表达水平的相对标准偏差均小于10%。表明该模型稳定，使用该模型评价药物的实验结果重现性好。

结果分析：

以实施例1制备的所述斑马鱼糖尿病骨质疏松模型，观察斑马鱼骨骨骼情况、测定组织中的血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯水平。统计结果显示，与空白组相比，四氧嘧啶和25μM泼尼松龙处理的颅骨面积和鱼长度均显著下降（P<0.01）。可见，300-700μM四氧嘧啶和25μM泼尼松龙均能造成斑马鱼骨质疏松症状。与空白组相比，100-700μM四氧嘧啶处理组在血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯水平显著升高（P<0.05），而25μM泼尼松龙组未造成以上指标显著变化。可见，与泼尼松龙等糖皮质激素造模药物不同，四氧嘧啶会导致斑马鱼糖代谢紊乱，从而造成糖尿病骨质疏松症状。在4组四氧嘧啶处理组中，100μM四氧嘧啶并未造成显著的骨质疏松症状，300μM四氧嘧啶剂量组的骨质疏松症状明显，未出现水肿、畸形及大量幼鱼死亡现象。因此选择300μM四氧嘧啶作为斑马鱼糖尿病骨质疏松模型组。

以实施例2评价阿伦磷酸钠、二甲双胍和知母皂苷BII对斑马鱼糖尿病骨质疏松的保护作用，观察斑马鱼骨骨骼情况、测定组织中的血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯、碱性磷酸酶水平。统计结果显示，与模型组相比，二甲双胍和知母皂苷BII能显著提高颅骨面积和鱼长度（P<0.05）。与模型组相比，阿仑膦酸钠不能显著降低血糖、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯（P>0.05）。二甲双胍和知母皂苷BII能显著降低血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯（P<0.05）。 由此可见，二甲双胍和知母皂苷BII提高骨形成活性的作用与它们能够调控糖脂参数有密切联系。

以实施例3评价本发明的糖尿病骨质疏松模型造模方法和给药方法的重复性，发现即使亲鱼不同，采用本发明的造模方法和给药方法仍具有很好的可重复性，其关键指标如颅骨面积、血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯表达水平稳定，实验结果重复性好。

由上述实施例和对比例的结果可以看出，本发明所述的模型相对已报道的抗糖尿病骨质疏松药物评价模型有以下优点：（1）首次利用斑马鱼建立糖尿病骨质疏松模型。与目前常用的骨质疏松造模药物泼尼松龙相比，四氧嘧啶能够更好模拟糖尿病病理情况下的骨质疏松症状；（2）四氧嘧啶是直接加入斑马鱼培养水中，相对大鼠/小鼠的灌胃法和腹腔注射法操作更为简便，用量更为节省，实验可重复性高；（3）首次采用骨组织和糖脂参数等多指标综合考虑斑马鱼糖尿病骨质疏松的改善情况，避免单一采用骨骼形态或某一生化指标评价，更为科学、客观，提高了结果的准确性，适用于保护或改善糖尿病骨质疏松药物的快速评价。

应当指出，以上实施例仅是本发明的代表性例子。本发明还可以有许多变形。凡是依据本发明的实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均应认为属于本发明的保护范围。