泌尿器官中的肿瘤的检测

技术领域

本发明涉及肿瘤检测领域。确切地说，本发明涉及使用微RNA检测泌尿器官中的肿瘤。

背景技术

尿道上皮癌(UCC)，也是移行细胞癌(TCC)，是通常在泌尿系统中发生的一类癌症。其表征了膀胱癌和输尿管、尿道和脐尿管的癌症的最常见形式。然而，肾盂和输尿管(上尿路)的尿道上皮肿瘤相对较少。膀胱为UCC的最常见部位，比肾盂UCC常见50倍，并且比输尿管UCC常见100倍。膀胱UCC是整个尿路的最常见肿瘤。

在2017年，据估计在美国有17000例死亡由膀胱癌(BCa)引起。从国家癌症研究所(National Cancer Institute)的SEER数据库来看，非侵入性膀胱癌为几乎可治愈的疾病，如5年存活率为90-95％，但转移性疾病的后果极差，如5年存活率为约12％。所有阶段中的5年存活率的总体预后仍相当差，仅为约45％。因此，早期检测是尿道上皮癌的主要管理方法。使用全范围的常规诊断方法(包括膀胱镜检查、尿液细胞学检查、排泄性尿路造影和超声波检查)来诊断和监测UCC。一些方法是不舒适、费时且侵入性的；其敏感性和特异性也不足。

US 20070054287A1提供通过使用微RNA作为组织特异性生物标记物来检测生物病况(例如癌症)的方法。US 20110312516A1涉及miRNA的识别和用途，以检测、诊断和/或预测膀胱癌的病程、进展或治疗反应性。

目前，UCC的监测标准需要每3个月重复膀胱镜检查，然后在接下来的2年每6个月复查，并且再10年每年复查。尽管据报导膀胱镜检查的敏感度为90％，但测试是高度侵入性的；在一些情况下，其不提供明确的诊断，确切地说，在肿瘤尺寸太小的情况下或在原位癌的情况下。此外，尿液细胞学检查是当前用于早期诊断和随访的非侵入性程序的标准；令人遗憾的是，其使用受到其低敏感度的限制。

发明内容

本发明发现miR-200c-5p、miR-214p-3p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p和/或miR-200b-3p可用作泌尿器官中的肿瘤的生物标记物。本文所述的生物标记物的表达可以指示泌尿器官中的肿瘤或泌尿器官中的肿瘤的预后。

在一个方面，本发明提供一种检测或诊断个体是否患有泌尿器官中的肿瘤、个体的泌尿器官中的肿瘤或处于患上所述肿瘤的风险下、或评定泌尿器官中的肿瘤的预后的方法，其包含a)在取自所述个体的生物样品中测量选自由以下组成的群组的一或多种微RNA(miRNA)的表达水平：miR-200c-5p、miR-214-3p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p和miR-200b-3p，以及b)比较所述一或多种miRNA的所测量水平与相同的一或多种miRNA的参考表达水平，其中相比于所述相同的一或多种miRNA的所述参考表达水平，所述一或多种miRNA的表达水平增加指示所述个体患有泌尿器官中的肿瘤或处于患上所述肿瘤的风险下，或具有针对所述个体存活的不良预后。

在一个实施例中，生物样品为尿液样品。

在一个实施例中，miRNA组合使用。

在一个实施例中，miRNA包含选自由以下组成的群组的至少两种miRNA：miR-200c-5p、miR-214-3p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p和miR-200b-3p。

在一些实施例中，miRNA包含至少miR-21-3p或miR-21-5p。在一些实施例中，miRNA包含选自由以下组成的群组的组合：miR-21-3p与miR-210-3p；miR-21-3p与miR-214-3p；miR-214-3p与miR-210-3p；miR-214-3p、miR-21-3p与miR-210-3p；miR-21-3p与miR-21-5p；miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p；以及miR-214-3p、miR-21-5p与miR-210-3p。

在一些实施例中，泌尿器官中的肿瘤为尿道上皮癌(UCC)或肾细胞癌(RCC)。

在一个实施例中，泌尿器官中的肿瘤的检测或诊断是早期检测或诊断。

在一个实施例中，泌尿器官中的肿瘤是转移性的。

在一个实施例中，个体为人类。

在一些实施例中，一或多种特定微RNA的存在或水平通过实时PCR或表面等离子体共振(SPR)测定。在另一些实施例中，表面等离子体共振为纳米-SPR(表面等离子体共振)。在一些实施例中，以实时PCR测定，个体中miR-200c-5p、miR-214-3p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p和miR-200b-3p的表达水平，相比于参考表达水平，分别高于约30+/-10倍、约7.5+/-1.5倍、约18+/-2倍、约2.5+/-0.5倍、约9+/-2倍与约7.5+/-2倍。在另一些实施例中，以SPR测定，个体中miR-200c-5p、miR-214-3p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p和miR-200b-3p的表达水平，相比于参考表达水平，分别高于约1.3+/-0.05倍、约1.67+/-0.01倍、约1.08+/-0.04倍、约2.5+/-0.01倍、约4+/-0.02倍与约7+/-0.02倍。

在另一方面，本发明提供一种用于测量一或多种miRNA的表达水平的试剂盒，其包含与选自由以下组成的群组的一或多种miRNA互补的一或多种序列：miR-200c-5p、miR-214-3p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p和miR-200b-3p。在一个实施例中，序列为探针、引物或cDNA。

在另一个方面，本发明提供一种用于测量一或多种miRNA的表达水平的系统，其包含a)微流体芯片，所述微流体芯片含有与选自由以下组成的群组的一或多种miRNA互补的一或多种序列：miR-200c-5p、miR-214-3p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p和miR-200b-3p，以及b)表面等离子体共振传感器装置。

附图说明

图1A至F显示实时PCR测定中，UCC患者的尿液样品中的miR-200c-5p、miR-214-3p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p和miR-200b-3p中的每一者的表达水平。

图2A至F显示SPR测定中，UCC患者的尿液样品中的miR-200c-5p、miR-214-3p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p和miR-200b-3p中的每一者的表达水平。

图3A与B显示SPR测定可实时监测在微流体芯片中，尿液样品(A)与稀释样品(B)中的三种miRNA(miR-214-3p,miR-21-3p and miR-210-3p)的信号。

具体实施方式

下文提供如本说明书中所使用的某些术语的定义。除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语通常具有与此本发明技术所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。

除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数个参考物。

本文任一处所用的术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的全部或任何其它组合”的含义。

如本文所用，术语“个体(subject)”、“个体(individual)”或“患者”可为个别生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。

如本文所用，术语“生物标记物”可被定义为在生物样品中发现的生物分子，其为正常或异常过程、或病况或疾病的指示物。

如本文所用，术语“转移性(metastatic)”(以及所有其它形式和时态，包括例如转移(metastasis)、转移(metastasize)等)当单独使用或与癌症结合使用时是指癌症从身体的一个部位扩散到另一部位，除非另外由用途或上下文指示。通常，由已扩散的细胞形成的肿瘤称为“转移性肿瘤”或“转移瘤”。转移性肿瘤含有的细胞与原始(原发性)肿瘤中的细胞相似。

如本文所用，术语“生物样品”意指源自正常或患病个体的身体的任何体液或其它材料，如组织、血液、血清、血浆、淋巴、尿液、唾液、泪液、脑脊髓液、羊膜液、胆液、腹水液、脓液等。获得生物样品的方法在本领域中是众所周知的。可使用本领域中众所周知的方法从生物样品提取RNA(例如miRNA)。

如本文所用，术语“微RNA”、“miRNA”和“miR”同义地使用是指源于内源基因的约18-25个核苷酸(nt)长的非编码RNA。“微RNA”(miRNA)包括编码成熟miRNA的初级miRNA转录物(pri-miRNA)或其它mRNA转录物(例如，由从mRNA转录物切除的内含子加工的miRNA)、前驱体miRNA(pre-miRNA)、成熟单链miRNA和其变体，其可以是天然存在的。术语“miRNA”包括人类和来自其它哺乳动物的miRNA。在一些情况下，术语“miRNA”还包括初级miRNA转录物和双螺旋miRNA。除非另外指出，否则当本文中使用时，特定miRNA的名称是指前驱体miRNA的成熟miRNA。一些单一初级miRNA转录物可含有多于一种前驱体/成熟miRNA。一些成熟miRNA可以源于多于一种前驱体miRNA。

如本文所用，术语“参考表达谱”或miR分子或标记物的其它生物标记物的其它计算水平可以是待与标记物的测试量比较的任何量或量范围。

如本文所用，术语“表达”表示通过基因的转录或由核苷酸序列所编码的蛋白质产物的产生而产生的RNA的产物。

如本文所用，术语“表达增加(increased expression)”或“表达增加(increasingexpression)”指示细胞、组织、器官或生物体中的特定基因序列的表达已经相对于未处理或对照的细胞、组织、器官或生物体增加。

如本文所用，如本文所用的术语“诊断(diagnosing)”和“诊断(diagnosis)”是指所属领域的技术人员可以估计并且甚至确定个体是否罹患既定疾病或病况的方法。所属领域的技术人员通常基于一或多个诊断指标(例如生物标记物(例如miRNA表达水平))作出诊断，所述诊断指标的量(包括存在或不存在)指示病况的存在、严重程度或不存在。

如本文所用，术语“预后(prognose)”、“预后(prognosing)”、“预后(prognosis)”和其变化形式是指患有疾病或病况的个体的疾病或病况的过程(例如患者存活)，并且此类术语涵盖在向个体施用治疗或疗法之后对疾病响应的评估。

迫切需要早期诊断在泌尿器官中有肿瘤的患者的新颖策略。本发明出人意料地发现，生物样品中的一或多种微RNA(miRNA)可用作生物标记物用于检测或诊断泌尿器官中的肿瘤或评定泌尿器官中的肿瘤的预后，所述一或多种miRNA选自由以下组成的群组：miR-200c-5p、miR-214-3p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p和miR-200b-3p。在生物样品中使用miRNA表达水平作为生物标记物改进了泌尿器官中肿瘤的诊断工具。确切地说，生物样品为尿液样品。

微RNA(miRNA)是长度为约19-25个核苷酸的单链RNA分子，其调节基因表达。miRNA是从非蛋白质编码转录物表达或主要从蛋白质编码转录物表达。将其从初级转录物(称为pri-miRNA)加工为较短茎-环结构(称为pre-miRNA)，并且最后加工为功能性成熟miRNA。成熟miRNA分子与一或多个信使RNA(mRNA)分子部分互补，且其主要功能为抑制基因表达。这可通过阻止mRNA转译或增加mRNA转化/降解而发生。

miRNA生物标记物可以离体施加于从个体获得的尿液样品，以便促进所述个体的早期和精确诊断和/或预后。本文所述的miRNA的使用可以改进泌尿器官中肿瘤的诊断并且允许较早诊断。迫切需要对泌尿器官的恶性病况的早期诊断，以使癌症患者在较不晚期阶段进行治疗。确切地说，泌尿器官中的肿瘤为尿道上皮癌(UCC)或肾细胞癌(RCC)。

因此，本文提供用于检测或诊断个体是否患有泌尿器官中的肿瘤、个体的泌尿器官中的肿瘤或处于患上所述肿瘤的风险下、或评定泌尿器官中的肿瘤的预后的方法和系统，其包含以下步骤：在取自所述个体的生物样品中测量选自由以下组成的群组的一或多种微RNA(miRNA)的表达水平：miR-200c-5p、miR-214-3p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p和miR-200b-3p，并且确定所述个体是否患有泌尿器官中的肿瘤或处于患上所述肿瘤的风险下，或具有针对个体存活的不良预后。

预期在一个实施例中所述miRNA中的至少一个的表达水平在来自个体的样品中进行测量，并且接着使所述miRNA表达水平与预后相关。

在一个实施例中，miRNA组合使用；即，选自由以下组成的群组的至少两种miRNA的表达水平：miR-200c-5p、miR-214-3p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p和miR-200b-3p。在另一实施例中，所述miRNA包含至少miR-21-5p和miR-21-3p。

在进行根据本发明的方法之前，必要时，RNA可从生物样品提取且使用本领域中已知的方法进行纯化。已知许多方法用于分离总RNA，或确切地提取包括miRNA的小RNA。RNA可以使用可商购的试剂盒(例如，Perfect RNA总RNA分离试剂盒，Five Prime-Three Prime公司；

可以使用测量或定量生物样品中miRNA的量的任何方法。优选的方法对于用作本发明的各方面中的生物标记物的特定miRNA是可靠、敏感且具特异性的。方法的实例包括但不限于PCR方法、北方印迹分析(northern blot analysis)、亲和基质和表面等离子体共振。诸如差异显示、RNA酶保护分析和北方或南方印迹的方法可以用于定量生物样品中的miRNA，或通过扩增和检测与miRNA生物标记物(完全或部分)互补或(完全或部分)相同的cDNA寡核苷酸来间接定量生物样品中的miRNA。qRT-PCR提供对样品中miRNA更敏感且更省力的定量。在测量之前，可以或可以不通过例如聚合酶链反应(PCR)的技术扩增miRNA，或可以在扩增期间直接或间接测量miRNA的量。定量评定(例如实时定量PCR(qRT-PCR)分析)为简单、敏感、可再现且节约成本的；因此其适合于用作诊断工具。

在一个实施例中，一或多种特定miRNA的水平通过实时PCR测定。在一些实施例中，本发明的方法包含扩增miRNA。存在许多用于扩增miRNA核酸序列，如成熟miRNA、初级miRNA和前驱体miRNA的方法。适合的核酸聚合和扩增技术包括逆转录(RT)、聚合酶链反应(PCR)、实时PCR(定量PCR(q-PCR))、基于核酸序列的扩增(NASBA)、连接酶链反应、多重连接探针扩增(multiplex ligatable probe amplification)、侵入者技术(invader technology)(第三浪潮(Third Wave))、滚环扩增、活体外转录(IVT)、链置换扩增、转录介导的扩增(TMA)、RNA(艾博文(Eberwine))扩增和所属领域的技术人员已知的其它方法。在某些实施例中，使用超过一种扩增方法，如逆转录，接着实时定量PCR(qRT-PCR)。

在一个实施例中，一或多种特定miRNA的水平是通过表面等离子体共振(SPR)与微流体芯片的组合来测定。本发明使用本文所述的新开发的miRNA、微流体学和纳米-SPR(表面等离子体共振)技术来开发可检测患者尿液中的微RNA(miR)的便携式尿液检测器。因此，本发明提供一种用于检测尿液样品中的生物标记物的便携式SPR系统。

在一个实施例中，通过北方印迹技术测定一或多种miRNA的表达水平。北方印迹是用于检查样品中RNA序列的存在的方法。北方印迹组合了用于RNA的尺寸分离的变性琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳与将经尺寸分离的RNA转移到过滤膜进行探针杂交的方法。杂交探针可以由DNA或RNA制成。

在一些方面，检测扩增或未扩增miRNA或完全或部分地互补或完全或部分地相同cDNA的探针和或引物可以是具有与扩增miRNA或cDNA完全或部分地互补或完全或部分地相同的序列的寡核苷酸。在一个实施例中，探针和/或引物为cDNA。在一个实施例中，标记探针和或引物以帮助检测扩增或未扩增miRNA或完全或部分地互补或完全或部分地相同cDNA。

现已大体上描述本发明，通过参考以下实例将更容易理解本发明，除非指定，否则所述实例以说明方式提供并且并不打算限制本发明。

实例

尿液样本

从2019年3月至2019年4月，在台北医学大学附设医院获得了总共66份人类尿液样本。该研究项目由台北医科大学附属联合机构审查委员会(TMU-JIRB N201902019)批准，并且根据批准的方案和指南，在组织活检或手术前，从25位健康志愿者，4位肺癌患者和36位UCC患者获得了同意。在这项研究中，样本收集自UCC患者，这些患者被定义为接受了“黄金标准”膀胱镜检查的患者，并且已经接受了组织病理学分析和临床访谈。收集尿液样品，并以16,000rpm离心20分钟，将上清液等分到微量离心管中，并在-80℃下保存直至使用。这些参与者的相关信息列于表1。

表1 UCC患者的基线临床和病理特征

靶标miRNA的选择

从四个不同的miRNA家族(miR-21，miR-214，miR-210，miR-200)中总共选择了9个miRNA用于当前研究。

RNA分离

使用QiAMP循环核酸试剂盒(Qiagen，Germantown，MD)提取人尿RNA。根据制造商的说明进行RNA分离。

定量PCR和逆转录PCR

将ABI第一步加实时PCR系统(ABI Step One Plus Real-Time PCR System；ABI)(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)用于定量PCR(q-PCR)分析。为检测miRNA(miR-21-5p，miR-21-3p，miR-200c-3p，miR-210-3p，miR-214-5p，miR-214-3p，miR-200b-3p)表达，根据标准程序(Life Technologies，CA，USA)，使用TaqMan miRNA Assays与UniversalMaster Mix II进行200c-5p)进行茎环q-PCR。使用TaqMan 2×通用预混液和20x TaqManmiRNA分析(引物和探针)进行Q-PCR。所有样品均进行二重复，并将所得Ct值平均。通过比较阈值循环法评估相对表达。将miRNA的表达标准化为Cel-miR-39的表达，后者通常用作miRNA定量中的参考基因(Poel,D.,T.E.Buffart,J.Oosterling-Jansen,H.M.W.Verheuland J.Voortman,Evaluation of several methodological challenges in circulatingmiRNA qPCR studies in patients with head and neck cancer.Experimental&Molecular Medicine,2018.50(3):p.e454-e454)。

t-SPR的工作原理和双重杂交测定

这项工作中的所有传输SPR测量都是使用定制平台执行的。稳定化的准直光照射到传感器上，并以微型光谱仪收集透射光。XY载物台和光谱仪由内部构建的LabVIEW软件控制。将固定化的CG纳米-缝集成微流体芯片(immobilized CG nano-slit integratedmicrofluidic chips)安装到XY载物台上的样品架上。总共可以同时分析4个集成的微流体芯片。

抛弃式PMMA微流体芯片与功能化的包覆金纳米缝隙(CG nano-slit)传感器集成在一起。专用于每个miRNA的独立感应区域排列在CG纳米狭缝上。功能化方法如下所述。这项工作基于双重杂交方法，其中固定在CG纳米缝表面上的监测探针是3'硫醇修饰的22-mer寡核苷酸(poly(dT)11间隔基和11个互补碱基)，而捕获探针则固定在市售的AuNP是5'硫醇修饰的22-mer寡核苷酸(poly(dT)11间隔基和11个互补碱基)。简而言之，尿标靶miRNA的11-mer与形成工作溶液的AuNP上的捕获探针结合。当将工作溶液引入微流体装置时，由于靶miRNA与监测探针的特异性互补配对，功能化的AuNP靶(f(AuNP)-靶)复合物会结合到传感器表面，从而完成双重杂交过程。

就光学结构而言，t-SPR测量金属层表面上的RI变化。归因于纳米狭缝结构，腔模和表面等离子体共振模式的干涉产生了不对称的法诺共振峰(Fano resonance peak)。互补杂交方法将f(AuNP)-靶结合到靠近传感器表面的位置，AuNP和金纳米狭缝传感器之间的等离子体共振干扰导致信号变化的放大。

使用注射泵，以240升/分钟的速率从储液器中抽出PBS缓冲液10分钟，以填充微流体芯片，每分钟记录各自的光谱作为系统基线参考。将含有60微升尿液的等分试样在4℃解冻，与6微升RIPA裂解试剂(ThermoScientific Cat#89900)混合并涡旋30秒钟。制备了用捕获探针功能化的市售AuNP(Nanocomposix，CA d＝7nm，1.44x 1013颗粒/mL)，并出于多重检测的目的，将90微升相应的功能化AuNP添加到每个靶miRNA的工作溶液中。同样，将20倍SSC(30微升)添加到工作溶液中以增强杂交并震动30秒，随后添加到微流体芯片的入口处储液器中，而无需额外的培养时间。含有功能化AuNP的尿液样品以240升/小时的速度在传感器表面上进行1.5小时，t-SPR系统由内部设计的过程控制，以记录每个传感区域每分钟的一次光谱测量。使用以前的工作中所述的方法(Yeung,W.K.,H.-Y.Chen,J.-J.Sun,T.-H.Hsieh,M.Z.Mousavi,H.-H.Chen,K.-L.Lee,H.Lin,P.-K.Wei and J.-Y.Cheng,Multiplex detection of urinary miRNA biomarkers by transmission surfaceplasmon resonance.Analyst,2018.143(19):p.4715-4722)。简而言之，它整合了670–690nm光谱范围内的面积，并将面积变化与t＝0时的面积变化进行比较。＝0。t-SPR测量是在单盲试验下进行的。

实例1 UCC患者的尿液样品中的miRNA的实时PCR分析

如图1中所显示，UCC患者的尿液样品中的miR-200c-5p、miR-214-3p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p和miR-200b-3p中的每一者的表达水平高于不患有UCC的个体的表达水平。

实例2 UCC患者的尿液样品中的miRNA的SPR分析

取样自UCC患者与健康控制组的尿液样品以SPR检测miRNA表达。如图2中所显示，UCC患者的尿液样品中的miR-200c-5p、miR-214-3p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-210-3p和miR-200b-3p中的每一者的表达水平高于不患有UCC的个体的表达水平。

实例3用于测量UCC患者的尿液样品中的miRNA的自动SPR测量系统

自动SPR测量系统使用透射表面等离子体共振与位置自动控制和微流体芯片的组合来测量和分析由目标miRNA与其互补序列结合所引起的光谱变化(Methods MolBiol.2009；503:37-47。稳定的光将准直光照射到传感器表面上且由微型化光谱仪捕获。XY工作台和光谱仪由内置LabVIEW软件控制。SPR微流体芯片安装到可编程X Y工作台上的样品固持器上。SPR微流体芯片安装到可编程X Y工作台上的样品固持器上。所述系统为便携式的并且可以极低浓度(33fM)测量miRNA。图3显示可以同时测量尿液样品中的三种miRNA(miR-214-3p、miR-21-3p和miR-210-3p)的信号并且检测极限是33fM。不需要PCR。实时监测微流体芯片中的目标序列的动态结合和针对三种不同目标：I、II和III((miR-214-3p、miR-21-3p和miR-210-3p)(其掺入健康参与者的尿液中)的各种浓度获得的校准曲线。dA为表示目标结合的测量信号。误差条表示均值的标准误差。