Bcl-2/Bcl-xL抑制剂与化疗药的组合产品及其在预防和/或治疗疾病中的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含有Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药的组合产品及其在预防、延缓其进展和/或治疗癌症、尤其血液系统恶性肿瘤中的用途。

背景技术

细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是生物体内精准控制的细胞死亡机制。它能够有序排除体内不需要的或已受损的细胞，对胚胎发育和维持细胞稳态具有重要作用。

与细胞凋亡功能有关的Bcl-2蛋白家族被认为在细胞凋亡调节过程中起重要作用，其蛋白家族成员根据结构与功能可分为两个亚族，即抗凋亡蛋白家族如Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1等，以及促凋亡蛋白家族，如Bak、Bax、Bim、Bid、Noxa及Puma等。

抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1等参与细胞的凋亡、分化和细胞周期的调控，其能够抑制细胞死亡，因此其过度表达可导致细胞过度增殖，进而导致癌症或恶性肿瘤的发生，并与肿瘤耐药性的产生密切相关。研究已表明，抗凋亡蛋白的确在许多癌症类型中过表达，癌细胞逃避细胞凋亡的主要方式之一就是通过增量调节抗细胞凋亡的Bcl-2家族蛋白。这些过表达与数种类型癌症的预后差有关，也与对化学治疗剂和辐射的临床抵抗有关。与临床观察一致的是，实验室研究已经确定在体外和体内Bcl-2或Bcl-xL的过表达引起癌细胞对化疗变得更有抵抗力(D.T.Chao等人，Annu Rev Immunol 1998；16；395-419；J.C.Reed等人，Advances in Pharmacology 1997；41；501-553；J.C.Reed等人，J CellBiochem 1996；60:23-32；A.J.Minn等人，Advances in Immunology 1998；70；245-279；J.M.Adams等人，Science 1998；281；1322-1326)。

因此，靶向抗凋亡蛋白Bcl-2等已被作为癌症的治疗策略，抑制癌细胞的Bcl-2活性可增加癌细胞死亡，降低化学治疗抵抗。例如，抗凋亡Bcl-2家族蛋白的过表达就是血液系统恶性肿瘤如急性髓细胞白血病(AML)患者对化疗药物耐药及不良预后的常见原因，在临床前已有研究表明BCL-2抑制剂Venetoclax通过引起细胞凋亡而使急性髓细胞白血病(AML)对其敏感(Pan,R.,et al.(2017)."Synthetic Lethality of Combined Bcl-2Inhibition and p53 Activation in AML:Mechanisms and Superior AntileukemicEfficacy."Cancer Cell 32(6):748-760e746.)。因此，抑制抗凋亡Bcl-2家族蛋白是治疗癌症如血液系统恶性肿瘤、例如AML或骨髓增生异常综合征的有效策略。

抗凋亡蛋白成员Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等通过与促凋亡的蛋白如Bak、Bax、Bim、Bid等发生异二聚化而抑制细胞凋亡。因此，阻断二者之间的异二聚化的抑制剂可以作为抗凋亡蛋白Bcl-2等的拮抗剂，对于其中抗凋亡蛋白过度表达的人类癌症具有治疗潜力(WO2018027097A1)。

蛋白翻译延长抑制剂高三尖杉酯碱在中国于1990年即载入药典，用于临床治疗急性非淋巴细胞性白血病和慢性淋巴瘤等各种血液病(CN102976924B)，而且在美国已被批准用于治疗慢性粒细胞白血病。

随着分子生物学的研究进展，分子靶向治疗已成为医药研究、特别是肿瘤研究的热点，大部分肿瘤的生物学行为并非由单一信号传导通路所支配，而是多个信号传导通路共同起作用。在某些情况下，具有不同作用机制的药物可以联合使用。但是，仅就具有不同作用机制但在类似领域起作用的药物的任何联合形式而论，并不必然能够产生具有有益效果的联合形式。因此，虽然现有技术中针对不同靶蛋白和/或不同信号转导通路的联合用药的方案和产品的确存在需求，但是鉴于肿瘤发生机制的复杂性、不同药物之间相互作用的不可预见性等因素，发现可行且能够带来相比单药而言具有更优异效果(减少单药剂量、降低单药毒副作用和/或以协同作用的方式起作用等)的联合用药的方案和产品，仍然是医药领域的一大挑战。同时，在癌症的治疗实践中，肿瘤细胞对单一靶点药物产生耐药性也是一个正待克服的难题。

本发明人经过长期而广泛的研究，令人惊讶地发现，说明书中、尤其是权利要求书中所述的包含Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药的组合产品，能够以协同作用的方式对癌症、尤其是血液系统恶性肿瘤起到预防和/或治疗的效果；尤其是二者的联合用药，有望以协同方式对耐药性血液系统恶性肿瘤如AML或骨髓增生异常综合征起到预防和/或治疗的效果，从而为所述疾病提供已汇总更有效的治疗手段。

发明内容

本发明提供了一种含有Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药的组合产品及其在预防和/或治疗癌症中的用途。

具体地，本发明的第一方面涉及一种组合产品，所述组合产品包含Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药，其中所述抑制剂是具有式I-A的化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物：

其中：

A

E

或者E

或者E

X

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

在一些实施方式中，所述抑制剂选自本说明书表1和表1A～1C所示的化合物、尤其下述化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物：

在一些实施方式中，所述的组合产品中，所述抑制剂是下述化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物：

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂是具有通式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物：

其中A

取代或未取代的X

Y

Q

Z

R

R

R

R

R

R

R

取代或未取代的R

R

R

R

R

n

R

R

R

R

R

R

R

n

R

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂选自本说明书表2的化合物。在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂选自化合物81和化合物97。

在一些实施方式中，所述化疗药选自放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博莱霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、脱氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、戊柔比星、阿霉素、埃博霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊立替康、氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、培美曲塞、替尼泊苷、依托泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱或羟基喜树碱的一种或多种。

在一些实施方式中，所述化疗药选自三尖杉碱类生物碱或其活性衍生物，包括但不限于三尖杉碱、三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、脱氧三尖杉酯碱、高脱氧三尖杉酯碱、桥氧三尖杉碱(CAS No.49686-57-9)、脱甲基三尖杉酮碱(CAS No.51020-45-2)、11-羟基三尖杉碱或表台湾三尖杉碱(CAS No.39024-15-2)。

在一些实施方式中，所述化疗药是高三尖杉酯碱(HHT)。

在一些实施方式中，本发明的组合产品包含选自以下的抑制剂或其药学上可接受的盐或其溶剂化物，

和高三尖杉酯碱。

在一些实施方式中，所述组合产品呈药物组合物的形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药各自呈单独的制剂形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药同时或相继施用。

在一些实施方式中，所述组合产品还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在一些实施方式中，所述组合产品呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、粉剂、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂、软膏剂、乳膏剂和注射剂的形式。

本发明的第二方面涉及Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的用途，特别是以上第一方面所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的用途。

本发明的第三方面涉及一种用于预防和/或治疗癌症的组合产品，所述组合产品包含Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药，特别是以上第一方面所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药。

本发明的第四方面涉及一种预防和/或治疗癌症的方法，包括对有此需要的患者施用联合有效量的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药，特别是以上第一方面所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药。

对于本发明的各个方面，所述癌症包括但不限于组织癌类型如实体瘤，或转移癌类型如血液系统恶性肿瘤。所述实体瘤包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌(包括结直肠癌)、食管癌、头颈癌、肝癌、肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、黑色素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤(包括骨肉瘤)、皮肤癌(包括鳞状细胞癌)、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、间皮瘤、胆管癌、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、神经内分泌癌、卵巢癌、肾癌、唾液腺癌、梭形细胞癌引起的转移瘤；所述癌症还包括转移性肿瘤如血液系统恶性肿瘤，包括但不限于急性髓细胞性白血病(AML)、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性嗜酸粒细胞白血病、急性红细胞白血病、急性巨核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、侵袭性NK细胞白血病、肥大细胞白血病、毛细胞白血病、混合谱系白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、T淋巴母细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、骨髓增生异常综合征(MDS)、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症、原发性骨髓纤维化症。

在一些实施方式中，所述的癌症为急性髓细胞性白血病；在另一些实施方式中，所述癌症为骨髓增生异常综合征(MDS)。

在一些实施方式中，所述癌症为耐药性癌症，如耐药性血液系统恶性肿瘤，包括但不限于耐药性急性髓细胞性白血病或骨髓增生异常综合征。

在一些实施方式中，将所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-1500mg/日的量给药。

在一些实施方式中，将所述化疗药或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.005mg/日至约1000mg/日的量给药。

附图说明

图1显示了在AML/MDS细胞系中，化合物6与高三尖杉酯碱联合用药对肿瘤细胞的协同抗增殖作用：用梯度浓度的化合物6、高三尖杉酯碱(HHT)单药或联合用药处理AML/MDS细胞24h，通过CellTiter-Glo发光法检测细胞生长抑制活性，细胞活力百分比以Mean±SEM表示，n＝2。

图2显示了在AML/MDS细胞系中，化合物6与高三尖杉酯碱联合用药对肿瘤细胞的协同诱导凋亡作用：体外经10nM化合物6、10nM或30nM的高三尖杉酯碱(HHT)单药或联合用药处理24小时；

A：细胞凋亡代表图示；B：图A统计结果；

*：与DMSO组比较，P<0.05；

$：与化合物6单药组比较，P<0.05；

#：与高三尖杉酯碱(HHT)单药组比较，P<0.05；

Annexin V

图3显示了在AML/MDS细胞系中，化合物6与高三尖杉酯碱联合用药减少抗凋亡蛋白MCL-1和原癌蛋白MYC的表达并增强细胞凋亡标志物cl-Caspase(cl-胱天蛋白酶)及cl-PARP的表达：对数生长期的MV-4-11、OCI-AML-3及SKM-1细胞在体外经10nM的化合物6与指定浓度的高三尖杉酯碱联合处理4小时后收集细胞提取蛋白所进行的免疫印迹分析。

图4显示了在AML/MDS细胞系中，化合物6与高三尖杉酯碱联合用药破坏复合物Bcl-2:BIM(4A)、Mcl-1:BIM(4B)、Mcl-1:BAK(4C)和Bcl-1:PUMA(4D)、释放促凋亡蛋白BIM、BAK和PUMA：对数生长期的MV-4-11、OCI-AML-3和SKM-1细胞在体外经指定浓度的化合物6与高三尖杉酯碱(HHT)联合处理4小时后收集细胞提取蛋白并进行MSD分析。电化学信号强度以Mean±SEM表示，n＝2。

图5显示了在皮下MV-4-11AML异种移植瘤模型中化合物6和HHT的联合治疗具有显著的协同抗肿瘤作用。(A)肿瘤生长曲线，(B)体重变化(％)。

图6显示了在皮下OCI-AML-3AML异种移植瘤模型中化合物6和HHT的联合治疗具有显著的协同抗肿瘤作用。(A)肿瘤生长曲线，(B)体重变化(％)。

定义

在本文中使用的术语“Bcl-2/Bcl-xL”是指Bcl-2、Bcl-xL，或Bcl-2和Bcl-xL，即Bcl-2和/或Bcl-xL。

在本文中使用的术语“药学上可接受的盐”是指游离酸或游离碱的盐，通常通过将游离碱与合适的有机或无机酸反应或者通过将酸与合适的有机或无机碱反应而制备。该术语可以用于本发明中的任何化合物。代表性的盐包括：乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、依地酸钙盐、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐(estolate)、乙磺酸盐(esylate)、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、甘苯砷酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚酸盐(hexylresorcinate)、哈胺盐(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、亚溴酸盐、亚硝酸盐、亚硫酸盐、马来酸单钾盐、粘酸盐(Mucate)、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲葡萄糖胺盐、草酸盐、巴莫酸盐(双羟萘酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、钾盐、水杨酸盐、钠盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、对甲苯磺酸盐、三乙基碘盐(triethiodide)、三甲胺盐和戊酸盐。当酸性取代基存在时，例如-COOH，可以形成铵盐、吗啉盐、钠盐、钾盐、钡盐、钙盐等以供剂型使用。当碱性基团存在时(例如在柠檬苦素类化合物或1,1-二甲基双胍中)，例如氨基或碱性杂芳基如吡啶基，可形成酸性盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、乙酸盐、草酸盐、马来酸盐、丙酮酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、肉桂酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苦味酸盐等。

在本文中使用的术语“溶剂化物”是本发明所涉及的化合物与溶剂分子的组合、物理结合、和/或溶剂化，例如二溶剂化物、单溶剂化物、半溶剂化物。本发明涉及的化合物可以以与例如水、甲醇、乙醇等药学上可接受溶剂形成溶剂化形式，其不显著影响化合物的药理学活性或毒性且可以作为药理学等价物起作用。

在本文中所使用的术语“三尖杉碱类生物碱”是指主要来自于三尖杉属(Cephalotaxus)植物如三尖杉、粗榧、海南粗榧、日本粗榧、篦子三尖杉等植物的生物碱化合物，也包括由所述植物细胞培养而获得的生物碱化合物，或在天然三尖杉生物碱上连接事先合成的不同酯侧链而得到的半合成三尖杉生物碱化合物。该术语还包括通过全合成方法获得的三尖杉生物碱化合物。具体实例包括上文发明内容部分的相应内容。

在本文中所使用的术语“三尖杉碱类生物碱的活性衍生物”是指通过包括但不限于生物或化学等方式对三尖杉生物碱进行修饰所获得的衍生物，该衍生物保留了三尖杉生物碱的生物活性。

在本文中所使用的术语“高三尖杉酯碱”具有以下结构，CAS 26833-87-4：

在本文使用的术语“预防”是指当用于疾病或病症(例如癌症)时，与未施用化合物或药物(例如本申请要求保护的组合产品)的受试者相比，所述化合物或药物能降低受试者体内的医学病症症状的频率或推迟其发病。

在本文中使用的术语“治疗”是指减轻、缓解或改善疾病或病症的症状，改善潜在的代谢引起的的症状，抑制疾病或症状，例如阻止疾病或病症的房展、缓解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、缓解疾病或病症引起的病况、或阻止疾病或病症的症状。

在本文中使用的术语“癌症”是指由异常的不受控制的细胞生长引起的赘生物或肿瘤。癌症往往渗入毗邻组织并扩散(转移)至远程器官，例如至骨、肝、肺或脑。本文所用术语“癌症”的非限制性的例子包括转移性肿瘤类型(例如但不限于黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤及肥大细胞瘤)及组织癌类型(例如但不限于结肠直肠癌、小细胞肺癌及非小细胞肺癌、乳癌、胰脏癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、胶质母细胞瘤、原发性肝癌、卵巢癌、前列腺癌、尿道癌、甲状腺癌、食道癌及子宫平滑肌肉瘤等)，特别是那些在发明详述中所描述的示例性癌症。

本文中使用的术语“癌症”包括同时涉及恶化前癌细胞和恶性癌细胞的疾病，也包括对化疗产生耐药性的本发明所述的各类癌症。

在本文中使用的术语“受试者”是指包括人类(例如人类患者)和动物(例如小鼠、大鼠、犬、猫、兔、鸡或猴等)。当受试者是人类患者(通常体重按60kg来计算)时，除非另有说明，本发明所述的剂量可采用与实验动物的转换因子(例如人用剂量＝小鼠剂量/12.3)进行换算得到(请参考Kin Tam.“Estimating the “First in human”dose-a revisit withparticular emphasis on oncology drugs,ADMET&DMPK 1(4)(2013)63-75)。本领域的普通技术人员能够根据一般常识，根据受试者的具体体重、疾病的种类和严重程度以及其它因素对所述剂量进行合理调整，这些调整的技术方案均落入本发明要求保护的技术方案的范围之内。

在本文中使用的术语“有效量”或“预防和/或治疗有效量”是指施用的药物或化合物的足够量(例如剂量)，其将在一定程度上减轻被治疗的疾病或病症的一种或多种症状。结果可以是缩小和/或减轻病症或疾病原因或任意其它期望的生物系统的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供以使疾病或病症的临床症状显著减轻、而不产生过度的毒副作用的化合物或药物(例如本申请要求保护的组合产品)的量。

在本文中使用的术语“联合施用”、“并行给予”、“同时给予”和类似的词语是指两种或更多种药剂并行地给予待治疗的受试者。所谓“并行”是指同时给与每种药剂，或者在不同的时间点以任何顺序序贯给予每种药剂。如果不是同时给予，其是指将它们以任意顺序和足够接近的时间给予个体，以提供所需的治疗效果。

在本文中使用的术语“药盒”是指可将各成分(游离的或可药用盐或溶剂化物形式的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和本发明的联合配对化疗药)彼此独立地进行给药或者通过使用不同的含有特定量成分的固定的联合形式进行给药，即在不同的时间点给药或同时给药。因此，药盒中的各部分可以同时给药，或者按照时间顺序交错给药，也就是说将药盒中的各部分在不同的时间点以相同或不同的时间间隔给药。优选对时间间隔进行选择，从而使各部分的联合使用能够在治疗疾病或病症时产生大于单独使用任何一种成分所能达到的效果。药盒中的各成分可以各自呈单独的制剂形式，其制剂形式可以相同也可以不同。

所述“药盒”优选有至少一种有益效果，例如相互增强的各个组合成分的的效果、附加的有利效果、较少的副作用、在一种或各成分的非有效剂量下产生联合的治疗效果，以及尤其是协同作用，例如在游离的或可药用盐或溶剂化物形式的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和本发明的化疗药之间产生大于相加的效果。

如本文中使用的术语“剂量”是指每千克(kg)受试者体重的活性物质的重量(例如毫克(mg))。

如本文中使用的术语“IC

如本文使用的术语“室温”是指25℃±1℃。同时，若没有具体指明，实验温度均为室温。

如本文使用的术语“约”是指该术语所修饰的数值的±10％，更优选为±5％，最优选为±2％，因此本领域的普通技术人员能够清楚地根据所修饰的数值确定术语“约”的范围。

本文所用的未具体定义的技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。

发明详述

本发明的药理学研究已经显示，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂、尤其是本说明书和权利要求中所定义的优选抑制剂和化疗药、尤其是高三尖杉酯碱的联合使用，能够以协同方式显著地抑制癌细胞增殖、特别是急性髓细胞性白血病细胞的增殖，并以协同方式显著地诱导癌细胞、特别是急性髓细胞性白血病细胞的凋亡。

不仅如此，本发明人的研究还显示，上述二者的联合使用显著地减少了原癌蛋白MYC以及Mcl-1的水平，并能够协同地破坏癌细胞中的Bcl-2:BIM、Mcl-1:BIM、Mcl-1:BAK和Bcl-1:PUMA复合物，从而释放促凋亡蛋白BIM、BAK和PUMA。

因此，本发明的第一方面提供一种组合产品，所述组合产品包含Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药，或由它们组成，其中所述抑制剂是具有式I-A的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：

其中：

A

E

或者E

或者E

X

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

在上述式I-A的化合物中，变量R

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有所述式I-A的化合物，其中：A

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-b的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，

其中：

E

R

R

R

R

R

R

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-c的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，

其中Y

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-d的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，

其中Y

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-e的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，

其中Y

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-f的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，

其中Y

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-g的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，

其中Y

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-g的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中A

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-g的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中A

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-g的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中A

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-g的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中A

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-g的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中A

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-g的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中A

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-g的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中A

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-g的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中A

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-g的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中A

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-g的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中A

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-h的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，

其中Y

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-h的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中X

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-h的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中X

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-h的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中X

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-h的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中X

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-h的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中X

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-h的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中X

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A、I-f或I-h的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中X

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-c到I-h中的任何一个化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中Y

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-c到I-h中的任何一个化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中Y

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A或I-b～I-h中的任何一个化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-b～I-e中的任何一个化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-A或I-f到I-h中的任何一个化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-i的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R

在一些实施方式中，所述抑制剂是具有式I-i的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，术语“卤素”本身或作为另一基团的一部分使用是指-Cl、-F、-Br或-I。

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，单独使用或作为另一基团的一部分使用的术语“硝基”是指-NO

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，术语“氰基”本身或作为另一基团的一部分使用是指-CN。

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，单独使用或作为另一基团的一部分使用的术语“羟基”是指-OH。

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，术语“氨基”本身或作为另一基团的一部分使用是指-NH

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，术语“烷基”本身或作为另一基团的一部分使用是指含有一至十二个碳原子的未取代的直链或支链脂族烃，即C

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，术语“任选取代的烷基”本身或作为另一基团的一部分使用是指未取代的烷基或被一个、两个或三个取代基取代的烷基，所述取代基独立地选自卤素、硝基、氰基、羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基和任选取代的芳基。在一个实施方案中，任选取代的烷基被两个取代基取代。在另一个实施方案中，任选取代的烷基被一个取代基取代。在另一个实施方案中，任选取代的烷基是未取代的。非限制性的任选取代的烷基包括-CH

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，术语“环烷基”本身或作为另一基团的一部分使用是指未取代的饱和或部分不饱和的，例如含有一个或两个双键的环状脂族烃，含有一至三个具有三至十二个碳原子的环，即C

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，术语“任选取代的环烷基”本身或作为另一基团的一部分使用是指未取代的或被一个、两个或三个取代基取代的环烷基，所述取代基独立地选自：卤素、硝基、氰基、羟基、烷基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基和杂环基。在一个实施方案中，任选取代的环烷基被两个取代基取代。在另一个实施方案中，任选取代的环烷基被一个取代基取代。在另一个实施方案中，任选取代的环烷基是未取代的。

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，术语“卤代烷基”本身或作为另一基团的一部分使用是指被一个或多个氟、氯、溴和/或碘原子取代的烷基。在一个实施方案中，烷基被一个、两个或三个氟和/或氯原子取代。在另一个实施方案中，卤代烷基是C

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，术语“烷氧基”本身或作为另一基团的一部分使用是指与末端氧原子连接的任选取代的烷基。在一个实施方案中，烷氧基是与末端氧原子连接的C

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，术语“芳基”本身或作为另一基团的一部分使用是指具有6至14个碳原子的未取代的单环或双环芳族环系，即C

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，本文所用的术语“任选取代的芳基”本身或作为另一基团的一部分是指未取代的芳基或被1-5个取代基取代的芳基，所述取代基独立地选自卤素、硝基、氰基、羟基、烷基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基和杂环基。在一个实施方案中，任选取代的芳基是任选取代的苯基。在另一实施方案中，任选取代的苯基具有一个取代基。在另一个实施方案中，任选取代的苯基是未取代的。非限制性的示例性取代芳基包括2-甲基苯基、2-甲氧基苯基、2-氟苯基和4-氯苯基。

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，术语“杂环基”本身或作为另一基团的一部分使用是指未取代的饱和或部分不饱和的，例如含有一个或两个双键，含有一个、两个或三个环的环状基团具有3至14个环成员，即3至14元杂环，其中一个环的至少一个碳原子被杂原子取代。术语“杂环基”意指包括环状脲基，例如咪唑烷基-2-酮，环状酰胺基团，例如β-内酰胺、γ-内酰胺、δ-内酰胺和ε-内酰胺，和环状氨基甲酸酯基团，例如噁唑烷基-2-酮。在一个实施方案中，杂环基是含有一个环和一个或两个氧和/或氮原子的4-、5-、6-、7-或8-元环状基团。在一个实施方案中，杂环基是含有一个环和一个或两个氮原子的5-或6-元环状基团。在一个实施方案中，杂环基是含有两个环和一个或两个氮原子的8-、9-、10-、11-或12-元环状基团。在一个实施方案中，杂环基是含有一个环和一个氧原子的4-或5-元环状基团。杂环基可任选地通过碳或氮原子与分子的其余部分连接。非限制性示例性杂环基包括1,4-二噁烷、2-氧代吡咯烷-3-基、2-咪唑烷酮、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、吡咯烷基、8-氮杂双环[3.2.1]辛烷(降托烷)、6-氮杂螺[2.5]辛烷、6-氮杂螺[3.4]辛烷、二氢吲哚基、二氢吲哚-2-酮和1,3-二氢-2H-苯并[d]咪唑-2-酮。

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，本文所用的术语“任选取代的杂环基”本身或作为另一基团的一部分是指未取代的或被一个、两个或三个取代基取代的杂环，所述取代基独立地选自：卤素、硝基、氰基、羟基、烷基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基和杂环基。非限制性的任选取代的杂环基包括：

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，单独使用或作为另一基团的一部分使用的术语“烷基氨基”是指-NHR

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，单独使用或作为另一基团的一部分使用的术语“二烷基氨基”是指-NR

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，术语“(环烷基)烷基”本身或作为另一基团的一部分使用是指被一个任选取代的环烷基取代的烷基。在一个实施方案中，(环烷基)烷基是被一个任选取代的C

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，术语“(杂环)烷基”本身或作为另一基团的一部分使用是指被一个任选取代的杂环基取代的烷基。在一个实施方案中，(杂环)烷基是被一个任选取代的4-至6-元杂环基取代的C

对于本申请的以上式I-A～I-i抑制剂而言，本身或另一基团的一部分使用的术语“杂烷基”是指含有6至12个链原子的未取代的直链或支链脂族烃，即6至12元杂烷基，或者指定的链原子数，其中至少两个-CH

在一些实施方式中，所述式I-A～I-i抑制剂是下表中的一个或多个化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

表1

在一些实施方式中，所述式I-A～I-i抑制剂是表1-A中的一个或多个化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

表1-A

在一些实施方式中，所述式I-A～I-i抑制剂是表1-B中的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

表1-B

在一些实施方案中，所述式I-A～I-i抑制剂是选自表1-C化合物的一种或多种或其药学上可接受的盐或溶剂化物的化合物。

表1-C

用于本发明的上述通式I-A、I-b～I-i的化合物及各个具体化合物，均已经在WO2018/027097A1中披露，且可以根据WO2018/027097A1中描述的方法合成并验证其活性，该专利文献说明书的全部内容以引用的方式并入本文。

用于本发明的上述通式I-A、I-b～I-i的化合物，具有Bcl-2和/或Bcl-xL IC50小于约10μM，例如小于约5μM、小于约1μM、小于约0.5μM、小于约0.1μM、小于约0.05μM、小于约0.025μM、小于约0.010μM、小于约0.005μM、小于约0.0025μM、小于约0.001μM的Bcl-2和/或Bcl-xL IC50。尤其是表1和表1-A、1B和1-C所列的化合物，表现出对Bcl-2的选择性抑制活性。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂是具有通式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物：

其中A1环是

取代或未取代的X

Y

Q

Z

R

R

R

R

R

R

R

取代或未取代的R

R

R

R

R

n

R

R

R

R

R

R

R

n

R

上述通式(I)、(II)或(III)中，在一些实施方式中，R

在一些优选的实施方式中，X

在一些实施方式中，Y

在优选的实施方式中，n

在其它优选的实施方式中，Q

在一些实施方式中，Z

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

对于上述本发明的通式(I)～(IV)的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂而言，术语“烷基”是指直链或支链的饱和C

对于上述本发明的通式(I)～(IV)的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂而言，术语“烯基”和“亚烯基”与“烷基”和“亚烷基”相同定义，除了含有碳碳双键。术语“炔基”和“亚炔基”与“烷基”和“亚烷基”相同定义，除了含有碳碳叁键。

对于上述本发明的通式(I)～(IV)的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂而言，术语“芳基”是指单环或多环的芳族基团，优选单环或二环的芳族基团。除非另外说明，否则芳基可以是未取代的或被一个或多个、特别是1-4个基团取代，所述基团独立地选自例如卤素、烷基、烯基、-OCF

对于上述本发明的通式(I)～(IV)的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂而言，术语“杂芳基”是指单环或二环的环系统，其包含一个或两个芳族环且在芳环中包含至少一个氮、氧或硫原子。除非另外说明，否则杂芳基可以是未取代的或被一个或多个、特别是1-4个取代基取代，所述取代基选自例如卤素、烷基、烯基、-OCF

对于上述本发明的通式(I)～(IV)的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂而言，术语“环烷基”是指含有3-8个碳原子的单环脂肪族环。术语“杂环烷基”是指单环或二环的环系统，在环系统中含有至少一个氮、氧或硫原子。术语“杂芳基”和“杂环烷基”包括包含至少一个氧原子、氮原子或硫原子的环系统，和包括包含氧和氮原子、氧和硫原子、氮和硫原子、和氮、氧和硫原子的环系统。

在一些实施方式中，所述通式(I)～(IV)的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂选自下表2中的化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。

表2

在一些实施方式中，所述通式(I)～(IV)的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂为(R)-2-(1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯基氨基)-4-(苯基硫基)丁基)哌啶-4-羰基氧基)丙基膦酸(即上述表中的化合物81，有时简称为“化合物81”)或其药学上可接受的盐，如下述结构式表示：

化合物81是第二代新靶点BCL-2/Bcl-xL蛋白抑制剂，其以高亲和力与Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w蛋白选择性结合，其IC50分别为1.6nM、4.4nM、9.3nM；化合物81能与Mcl-1微弱结合。化合物81通过化学结构修饰在血液循环中有效地降低了第一代BCL-2抑制剂的血小板毒性缺陷，但是又能够在组织里获得特异酶的激活来有效地杀死肿瘤细胞，其血小板毒性减少了10-30倍，但是活性是第一代BCL-2抑制剂的10倍左右。

本发明的通式(I)～(IV)的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂还可以优选为(R)-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)-氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯氨基)-4-(苯基硫基)丁基)哌啶-4-甲酸(即上述表中的化合物97，有时简称为“化合物97”，化合物97是化合物81的活性代谢产物或其药学上可接受的盐，如下述结构式表示：

可以根据WO2014/113413A1中描述的方法来合成本发明药物组合物中的上述通式(I)～(V)的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂并验证其活性。

上述通式(I)、(II)或(III)的化合物已经在WO2014/113413A1中披露，该专利文献说明书的全部内容以引用的方式并入本文。上述通式(IV)在PCT/CN2019/070508中披露，该专利文献说明书的全部内容以引用的方式并入本文。

在一些实施方式中，用于本发明的化疗药选自放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博莱霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、脱氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、戊柔比星、阿霉素、埃博霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊立替康、氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、培美曲塞、替尼泊苷、依托泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱或羟基喜树碱。

在一些实施方式中，所述化疗药选自三尖杉碱类生物碱或其活性衍生物，包括但不限于三尖杉碱、三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、脱氧三尖杉酯碱、高脱氧三尖杉酯碱、桥氧三尖杉碱、脱甲基三尖杉酮碱、11-羟基三尖杉碱或表台湾三尖杉碱。

在优选的实施方式中，所述化疗药是高三尖杉酯碱，或其活性衍生物。

在一些实施方式中，所述组合产品呈药物组合物的形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药各自呈单独的制剂形式。

在一些实施方案中，所述组合产品呈药盒的形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药同时或相继施用。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药相继施用的时间间隔可为约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约8周、或约12周。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，各自呈单独的剂量单元形式)的含有所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药的本发明的组合产品，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，剂量单元形式)的含有所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药的本发明的组合产品，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在一些实施方式中，所述组合产品可以通过下述方式施用：口服、口腔、吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道粘膜、透黏膜、局部给药，鼻或肠道给药；注射给药，如肌肉注射、皮下注射、髓内注射，以及鞘内、脑部直接给药、原位给药、皮下、腹腔内、静脉注射、关节内滑膜、胸骨内、肝内、病灶内，颅内、腹腔、鼻腔、或眼内注射或其他药物递送方式。

在一些实施方式中，对于体重60kg的成人，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.0025-1500mg/日的量给药。所述Bcl-2选择性抑制剂的量是1mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、460mg、470mg、480mg、487mg、490mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg，以及所述各量之间的范围，例如，1mg-1000mg、30mg-900mg、30mg-800mg、30mg-900mg、30mg-800mg、30mg-700mg、30mg-600mg、30mg-500mg、30mg-490mg、30mg-487mg等，且所述化疗药或其药学上可接受的盐或溶剂化物以约0.005mg/日至约5000mg/日的量给药。所述化疗药的量，如高三尖杉酯碱的量，是0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1mg、2mg、3mg、4mg、4.1mg、4.2mg、4.3mg、4.4mg、4.5mg、4.6mg、4.7mg、4.8mg、4.88mg、4.9mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg，以及所述各量之间的范围，例如0.1mg-1000mg、0.5mg-1000mg、1mg-1000mg、4.88mg-1000mg、4.88mg-900mg、4.88mg-800mg、4.88mg-700mg、4.88mg-600mg、4.88mg-500mg、4.88mg-400mg、4.88mg-300mg、4.88mg-200mg、4.88mg-100mg、4.88mg-50mg、4.88mg-10mg等。

在一些实施方式中，所述组合产品还包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在一些实施方式中，所述组合产品呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、粉剂、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂、软膏剂、乳膏剂和注射剂的形式。

本发明的第二方面，涉及Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途，所述疾病选自癌症。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述化疗药是如在本发明的第一方面中所具体描述的那些化合物(例如化合物I-A，或式(I)～(IV)化合物)和化疗药或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一些实施方式中，所述药物呈药物组合物的形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药各自呈单独的制剂形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药同时或相继施用。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药相继施用的时间间隔可为约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约8周、或约12周。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，各自呈单独的剂量单元形式)的含有所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药的本发明的药物，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，剂量单元形式)的含有所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药的本发明的药物，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在一些实施方式中，所述药物可以通过下述方式施用：口服、口腔、吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道粘膜、透黏膜、局部给药，鼻或肠道给药；注射给药，如肌肉注射、皮下注射、髓内注射，以及鞘内、脑部直接给药、原位给药、皮下、腹腔内、静脉注射、关节内滑膜、胸骨内、肝内、病灶内，颅内、腹腔、鼻腔、或眼内注射或其他药物递送方式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及所述化疗药或其药学上可接受的盐或溶剂化物的每日给药量如在上述发明详述中的本发明第一方面所述。

进一步地，在本发明中所述的癌症包括但不限于选自下述的癌症：肾上腺癌、淋巴上皮瘤、腺样细胞癌、淋巴瘤、听神经瘤、急性淋巴细胞白血病、肢端黑色素瘤、急性髓系白血病、肢端汗腺瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性嗜酸粒细胞白血病、肝癌、急性红细胞白血病、小细胞肺癌、急性淋巴细胞白血病、非小细胞肺癌、急性巨核细胞白血病、MALT淋巴瘤、急性单核细胞白血病、恶性纤维组织细胞瘤、急性早幼粒细胞白血病、恶性外周神经鞘瘤、腺癌、恶性海马肿瘤、恶性蝾螈瘤、腺样囊性癌、套细胞淋巴瘤、腺瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、腺瘤样牙源性肿瘤、肥大细胞白血病、腺鳞癌、纵隔生殖细胞肿瘤、脂肪组织肿瘤、乳腺髓样癌、肾上腺皮质癌、甲状腺髓样癌、成人T细胞白血病/淋巴瘤、成神经管细胞瘤、侵袭性NK细胞白血病、黑色素瘤、艾滋病相关淋巴瘤、脑膜瘤、肺泡横纹肌肉瘤、默克尔细胞癌、肺泡软组织肉瘤、间皮瘤、成釉细胞瘤、成釉细胞纤维瘤、转移性尿路上皮癌、间变性大细胞淋巴瘤、混合苗勒氏肿瘤、甲状腺未分化癌、粘液性肿瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、血管平滑肌脂肪瘤、肌肉组织肿瘤、血管肉瘤、蕈样真菌病、星形细胞瘤、粘液样脂肪肉瘤、非典型畸形性横纹肌样瘤、粘液瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、粘液肉瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、鼻咽癌、B细胞淋巴瘤、神经鞘瘤、基底细胞癌、神经母细胞瘤、胆道癌、神经纤维瘤、膀胱癌、神经瘤、胚细胞瘤、结节性黑色素瘤、骨癌、眼癌、布伦纳瘤、少突细胞瘤、少突星形细胞瘤、褐色肿瘤、少突神经胶质瘤、伯基特氏淋巴瘤、嗜酸细胞瘤、乳腺癌、鞘膜脑膜瘤、视神经鞘脑膜瘤、脑癌、视神经肿瘤、癌、口腔癌、原位癌、骨肉瘤、癌肉瘤、卵巢癌、软骨肿瘤、肺上沟瘤、牙骨质瘤、乳头状甲状腺癌、骨髓瘤、骨髓样肉瘤、副神经节瘤、软骨瘤、松果体母细胞瘤、脊索瘤、松果细胞瘤、绒毛膜癌、垂体细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、垂体腺瘤、肾透明细胞肉瘤、垂体瘤、颅咽管瘤、浆细胞瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、多胚胎瘤、宫颈癌、前驱体T淋巴母细胞淋巴瘤、结直肠癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、德戈斯病、原发性积液淋巴瘤(primary effusion lymphoma)、增生性小圆细胞瘤、原发性腹膜癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、前列腺癌、胚胎发育不良的神经上皮肿瘤、胰腺癌、无性细胞瘤、咽癌、胚胎癌、腹膜假粘液瘤、内分泌腺肿瘤、肾细胞癌、内胚窦瘤、肾髓样癌、肠病相关的T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、食道癌、横纹肌瘤、胎中胎、横纹肌肉瘤、纤维瘤、Richter’s征转化、纤维肉瘤、直肠癌、滤泡性淋巴瘤、肉瘤、滤泡性甲状腺癌、神经鞘瘤病、神经节细胞瘤、精原细胞瘤、胃肠癌、支持细胞瘤、生殖细胞肿瘤、性索-性腺间质瘤、妊娠绒毛膜癌、印戒细胞癌、巨细胞成纤维细胞瘤、皮肤癌、骨巨细胞瘤、小蓝圆细胞瘤、胶质瘤、小细胞癌、多形性胶质母细胞瘤、软组织肉瘤、胶质瘤、生长抑素瘤、胶质瘤病、煤烟疣、胰高血糖素瘤、脊柱肿瘤、性腺母细胞瘤、脾边缘区淋巴瘤、颗粒细胞瘤、鳞状细胞癌、雌激素瘤、两性胚胎细胞瘤、滑膜肉瘤、胆囊癌、Sezary疾病、胃癌、小肠癌、毛细胞白血病、鳞状细胞癌、血管母细胞瘤、胃癌、头颈癌、T细胞淋巴瘤、血管外皮细胞瘤、睾丸癌、血液系统恶性肿瘤、泡膜细胞瘤、肝母细胞瘤、甲状腺癌、肝脾T细胞淋巴瘤、移行细胞癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、非霍奇金淋巴瘤、脐尿管癌、浸润性小叶癌、泌尿生殖系统癌、肠癌、尿路上皮癌、肾癌、葡萄膜黑色素瘤、喉癌、子宫癌、恶性雀斑样痣、疣状癌、致死性中线癌、视觉通路胶质瘤、白血病、外阴癌、睾丸间质细胞瘤、阴道癌、脂肪肉瘤、瓦尔登斯特伦的巨球蛋白血症、肺癌、腺淋巴瘤、淋巴管瘤、肾母细胞瘤和淋巴管肉瘤。

优选地，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌(包括结直肠癌)、食管癌、头颈癌、肝癌、肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、黑色素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤(包括骨肉瘤)、皮肤癌(包括鳞状细胞癌)、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、间皮瘤、胆管癌、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、神经内分泌癌、卵巢癌、肾癌、唾液腺癌、梭形细胞癌引起的转移瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，以及血液系统恶性肿瘤，例如急性髓细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、套细胞淋巴瘤(MCL)。

优选地，所述癌症选自血液系统恶性肿瘤，包括但不限于急性髓细胞性白血病(AML)、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性嗜酸粒细胞白血病、急性红细胞白血病、急性巨核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、侵袭性NK细胞白血病、肥大细胞白血病、毛细胞白血病、混合谱系白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、T淋巴母细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、骨髓增生异常综合征(MDS)、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症、原发性骨髓纤维化症。

优选地，所述癌症是对化疗具有耐药性的上述各类癌症。

最优选地，所述癌症是急性髓细胞性白血病(AML)或骨髓增生异常综合征(MDS)，尤其是化疗耐药性急性髓细胞白血病(AML)或骨髓增生异常综合征(MDS)。

本发明的第三方面，涉及一种用于预防和/或治疗癌症的组合产品，所述组合产品包含Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药。进一步地，所述癌症包括但不限于在上述发明详述中本发明第二方面所述的那些癌症。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂是如在本发明的第一方面中所具体描述的那些化合物(例如化合物I-A，或式(I)～(IV)化合物)或其药学上可接受的盐或溶剂化物，所述化疗药是如在本发明的第一方面中所具体描述的那些化疗药或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一些实施方式中，所述组合产品呈药物组合物的形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药各自呈单独的制剂形式。

在一些实施方案中，所述组合产品呈药盒的形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药同时或先后施用。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药先后施用的时间间隔可为约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约8周、或约12周。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，各自呈单独的剂量单元形式)的含有所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药的本发明的组合产品，例如药盒，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，剂量单元形式)的含有所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药的本发明的组合产品，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在一些实施方式中，所述组合产品可以通过下述方式施用：口服、口腔、吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道粘膜、透黏膜、局部给药，鼻或肠道给药；注射给药，如肌肉注射、皮下注射、髓内注射，以及鞘内、脑部直接给药、原位给药、皮下、腹腔内、静脉注射、关节内滑膜、胸骨内、肝内、病灶内，颅内、腹腔、鼻腔、或眼内注射或其他药物递送方式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及所述化疗药或其药学上可接受的盐或溶剂化物的每日给药量如在上述发明详述中的本发明第一方面所述。

本发明的第四方面，涉及一种预防和/或治疗癌症的方法，包括对有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药。进一步地，所述癌症包括但不限于如在上述发明详述中本发明的第二方面所述的那些癌症。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂是如在本发明的第一方面中所具体描述的那些化合物(例如化合物I-A，或式(I)～(IV)化合物)或其药学上可接受的盐或溶剂化物，所述化疗药是如在本发明的第一方面中所具体描述的那些化疗药或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药呈药物组合物的形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药各自呈单独的制剂形式，例如药盒的形式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药同时或相继施用。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药相继施用的时间间隔可为约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约8周、或约12周。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，各自呈单独的剂量单元形式)的所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在一些实施方式中，可以根据需要，将所述呈药物组合物的形式(优选地，剂量单元形式)的所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药，每天施用包括但不限于：1次、2次、3次、4次、5次或6次。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药可以通过下述方式施用：口服、口腔、吸入喷雾、舌下、直肠、透皮、阴道粘膜、透黏膜、局部给药，鼻或肠道给药；注射给药，如肌肉注射、皮下注射、髓内注射，以及鞘内、脑部直接给药、原位给药、皮下、腹腔内、静脉注射、关节内滑膜、胸骨内、肝内、病灶内，颅内、腹腔、鼻腔、或眼内注射或其他药物递送方式。

在一些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂每天的施用量是0.017mg/kg、0.083mg/kg、0.17mg/kg、0.33mg/kg、0.5mg/kg(60kg受试者每天30mg)、0.67mg/kg、0.83mg/kg、1mg/kg、1.16mg/kg、1.33mg/kg、1.5mg/kg、1.67mg/kg、2.5mg/kg、3.33mg/kg、4.17mg/kg、5mg/kg、5.83mg/kg、6.67mg/kg、7.5mg/kg、7.67mg/kg、7.83mg/kg、8mg/kg、8.12mg/kg(60kg受试者每天487mg)、8.16mg/kg、8.33mg/kg、9.17mg/kg、10mg/kg、10.83mg/kg、11.66mg/kg、12.5mg/kg、13.33mg/kg、14.17mg/kg、15mg/kg、15.83mg/kg、16.67mg/kg，以及所述各施用量之间的范围，例如，0.017mg-16.67mg/kg、0.083mg-16.67mg/kg、0.17mg-16.67mg/kg、0.33mg-16.67mg/kg、0.5mg-15mg/kg、0.5mg-13.33mg/kg、0.5mg-11.67mg/kg、0.5mg-10mg/kg、0.5mg-8.33mg/kg、0.5mg-8.16mg/kg、0.5mg-8.12mg/kg等，且所述化疗药如高三尖杉酯碱每天的施用量是0.001mg/kg、0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg、500mg，以及所述各量之间的范围，例如0.001mg-500mg/kg、0.005mg-500mg/kg、0.01mg-500mg/kg、0.05mg-500mg/kg、0.08mg-500mg/kg、0.08mg-400mg/kg、0.08mg-300mg/kg、0.08mg-200mg/kg、0.08mg-100mg/kg、0.08mg-50mg/kg、0.08mg-10mg/kg、0.08mg-1mg/kg、0.08mg-0.5mg/kg、0.08mg-0.1mg/kg等。

最令人惊奇的是，本发明人通过实验发现，联合给药本文所定义的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药不仅可以产生有益的、特别是协同的治疗效果，而且还会产生由于联合治疗所带来的额外的益处，例如出人意料地延长了效力、治疗的疾病种类更宽，以及对于和AML/MDS有关的疾病和病症的出人意料的有益效果，例如显著增强的疗效、由此延长了给药周期，使患者具有更长的生存获益。

另一个益处是可以使用较低的按照本发明联合使用的各药物的剂量，例如所需的剂量不仅更小而且使用频率也可以更少；或者可用来降低副反应的发生率，这与所治疗的患者的愿望和要求是一致的。具体而言，本发明的组合产品可以在一定程度上减少与所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂相关的血液学毒性以及与三尖杉碱类生物碱相关的心血管毒性。

可以通过本领域确定的试验模型、特别是本文中所描述的那些试验模型证实Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药、特别是化合物6和高三尖杉酯碱的联合可以更有效的预防或治疗由癌症、如AML/MDS。

相关领域的技术人员完全能够选择适宜的动物试验模型以证实在上文中以及下文中指出的治疗适应症和有益效果。药理学活性可以通过例如在小鼠中的体内试验方法或下文中描述的临床研究来证实。

本发明的各种枚举的实施方式中指定特征的一般或优选定义可以与其它指定特征的一般或优选定义组合，得到本发明另外的实施方案。就如同在本文中具体地且逐一地列出了这些相互组合而得到的方案一样，除非上下文清楚地显示并非如此。

除非结构式明显存在错误，否则当本发明的任意化合物的化学名称与所给出的结构式不一致时，以结构式为准。

在本说明书中，引用了若干在先出版物。这些出版物，不被认为与本发明的可专利性相关，但以引用方式将其全部内容结合于本文。本说明书中对任何在先出版物(或从其衍生出的信息)的引用不是、也不应当被视为确认或承认或任何形式的启示，即不应当被视为确认或承认相应的先前出版物(或从其衍生出的信息)构成本说明书涉及的技术领域中的公知常识。

具体实施方式

下面通过具体的实施例、对照例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例、对照例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照这类反应的常规条件，或按照制造商所建议的条件进行。

以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得、依据现有技术的方法制得或根据与本申请公开的类似的方法制得。

合成实施例：Bcl-2选择性抑制剂的示例性化合物(化合物3、6和13)的制备

化合物3——2-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)-N-((3-硝基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯基)磺酰)苯甲酰胺的合成

使2-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸(1.75g，3mmol)、3-硝基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯磺酰胺(1.43g，4.5mmol)、EDCI(1.15g，6mmol)和4-(N,N-二甲基氨基)吡啶(550mg，4.5mmol)和二氯甲烷(40ml)的混合物在室温下反应过夜，然后加入水。用二氯甲烷萃取水层。将合并的有机层用盐水洗涤，浓缩并通过硅胶柱纯化，得到2-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)-N-((3-硝基-4-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯基)磺酰)苯甲酰胺(1.7g，64.4％)，为黄色固体。

1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.70(d,J＝2.3Hz,1H),8.01(d,J＝2.7Hz,1H),7.87(d,J＝9.2,2.3Hz,1H),7.66(d,J＝8.9Hz,1H),7.55(d,J＝2.7Hz,1H),7.47(d,J＝3.4Hz,1H),7.38(d,J＝8.4Hz,2H),7.10(d,J＝8.4Hz,2H),6.97(d,J＝9.2Hz,1H),6.77(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),6.44(d,J＝3.4Hz,1H),6.34(d,J＝2.4Hz,1H),4.02–3.94(m,3H),3.66(s,3H),3.49–3.38(m,2H),3.41–3.25(m,7H),2.42(s,3H),2.26(s,3H),2.00–1.67(m,4H),1.45–1.38(m,2H)。

化合物13——(R)-N-((4-(((1,4-二

采用类似于合成化合物3所述的方法制备标题化合物。

1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.66(d,J＝2.4Hz,1H),7.99(d,J＝2.4Hz,1H),7.84(dd,J＝9.2,2.4Hz,1H),7.64(d,J＝8.9Hz,1H),7.51(d,J＝2.4Hz,2H),7.45(d,J＝3.3Hz,1H),7.37(d,J＝8.4Hz,2H),7.10(d,J＝8.4Hz,2H),6.94(d,J＝9.2Hz,1H),6.76(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),6.40(d,J＝3.3Hz,1H),6.36(d,J＝2.3Hz,1H),3.87(dd,J＝11.8,4.2Hz,3H),3.83–3.70(m,3H),3.67(s,2H),3.62(dd,J＝11.7,2.9Hz,1H),3.51–3.41(m,2H),3.40–3.35(m,1H),3.29(dq,J＝3.2,1.6Hz,1H),2.41(s,2H),2.26(s,2H),2.00–1.77(m,6H)。

化合物6——(S)-N-((4-(((1,4-二

采用类似于合成化合物13所述的方法制备标题化合物。MS：C

1HNMR(400MHz,d-DMSO):δppm:11.70(1H,s)；11.35(1H,br)；8.59(2H,m)；8.05(1H,d,J＝2.6)；7.84(1H,dd,J1＝9.2；J2＝2.3)；7.51(3H,m)；7.33(2H,d,J＝8.4)；7.10(1H,d,J＝9.2)；7.04(2H,d,J＝8.4)；6.66(1H,dd,J1＝8.8,J2＝1.2)；6.39(1H,dd,J1＝3.6,J2＝2.0)；6.19(1H,d,J＝1.2)；3.77～3.82(3H,m)；3.64(1H,t,J＝11.2)；3.62(1H,dd,J1＝10.8,J2＝2.4)；3.30～3.52(4H,m)；3.06(4H,m)；2.72(2H,m)；2.13～2.23(8H,m)；1.67～1.86(6H,m)；1.58(2H,m)。

活性实施例

缩写列表

通用实验材料和方法

1.细胞系

AML细胞系可从市售渠道获得，例如南京科佰生物科技有限公司(OCI-AML-3和MV-4-11)、日本癌症研究资源库(JCRB:SKM-1)。细胞在相应培养基中均于37℃，5％CO

表1.AML/MDS细胞系的培养条件

细胞抗增殖活性实验中，将细胞铺板至96孔板(Corning，Cat.3903)中，细胞数量为10000个/孔/细胞系。细胞凋亡检测实验中，将细胞铺至24孔板(Corning，Cat.3524)中，细胞数量为200000个/孔/细胞系。

2.试剂

本实验所用试剂来源如下：RPMI 1640基础培养基(Gibco，Cat.C11875500BT)、IMDM基础培养基(Gibco，Cat.C12440500BT)、青链霉素(Gibco，Cat.15140122)、胎牛血清(AUSGENEX，Cat.FBSSA500-S)、二甲基亚砜(Sigma，Cat.D8418)、ACK裂解液(Lifetechnologies，Cat.A1049201)、细胞凋亡检测试剂盒(BD，Cat.556547)、RIPA细胞裂解液(碧云天，Cat.P0013B)、PMSF(翊圣生物，Cat.20104ES08)、BCA蛋白浓度定量试剂盒(碧云天，Cat.P0012)、蛋白酶抑制剂(翊圣生物，Cat.20124ES10)、磷酸酶抑制剂(翊圣生物，Cat.20109ES05)、4-20％SDS-PAGE预制胶(金斯瑞，Cat.M42010C)、PVDF转印膜(Millipore，Cat.IPVH00010)、牛血清白蛋白(GENVIEW，Cat.FA016-250)、CellTiter-

3.受试物

受试物储存液配制所用溶媒见表2。储存液浓度为10

表2.受试物与储存液的配制

4.仪器

本实验所用仪器包括：生物安全柜(ESCO，型号AC2-4S1)；CO

5.联合用药的效果分析方法

对联合用药实验，采用CalcuSyn程序计算联合指数(combination index,CI)对结果进一步分析(Chou,T.C.(2010)."Drug combination studies and their synergyquantification using the Chou-Talalay method."Cancer Res 70(2):440-446.)。CalcuSyn是一款专业的混合药物分析软件，使用CalcuSyn软件准确的分析联合用药作用，可快速计算和分析各种药物的相互作用，包括协同作用、相加，及拮抗作用等。两药联合的CI值<1，表示两药联合具有协同作用；CI值＝1，表示两药联合具有相加作用；CI值>1，大于1表示两药联合具有拮抗作用。

CI(联合指数):

<0.1: 5+非常强

0.1～0.3: 4+强

0.3～0.7: 3+中等

0.7～0.85: 2+较轻

0.85～0.90: 1+轻度

实施例1：化合物6与高三尖杉酯碱联合用药的协同抗增殖作用

【实验方法】：CellTiter-

根据制造商说明书使用CellTiter-

首先，收集对数生长期细胞，离心，将细胞悬液计数并稀释调整至所需浓度。混匀后在96孔板中每孔加入90μL细胞悬液。每个孔细胞数为10×10

根据不同细胞对不同药物的敏感性，选择合适的起始最高浓度，按1:3比例系列稀释得到7个系列浓度，2个受试物各加入5μL/孔，每个孔的药物最终测试浓度见图1横坐标。培养板于37℃，5％CO

培养结束时，将96孔板及其内容物从培养箱中取出，在室温下平衡至室温后，每孔加入30μL的CellTiter-

使用Biotek synergy H1酶标仪检测发光信号。使用2个复孔的平均荧光信号值，通过下列公式计算细胞存活率百分比：

细胞存活率百分比(％)＝(测试孔荧光信号值-空白对照孔荧光信号值)/(细胞对照孔荧光信号值-空白对照孔荧光信号值)×100％

【实验结果】

结果显示，与化合物6和HHT单独用药的曲线相比，联合用药的曲线左移，提示化合物6在测试的所有AML/MDS细胞系中的抗增殖作用均增强。联合用药作用分析表明在多个联合用药浓度下联合指数(CI值)小于0.1，说明化合物6与HHT联合用药在测试的所有AML/MDS细胞系中均具有协同的抗增殖作用。具体CI值及化合物6与HHT联合作用的原始量效生长抑制曲线详见图1。实施例2：化合物6与高三尖杉酯碱联合用药的协同诱导细胞凋亡作用

【实验方法】：流式细胞仪分析

在化合物6单药、HHT单药，或两药联合作用细胞24小时后收集细胞，并用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗一次。使用Annexin-V和PI对细胞进行染色，并使用Attune NxT流式细胞仪进行分析。通过每个实验条件下分析20000个细胞获得凋亡图谱。

根据制造商说明书使用Annexin V-PI(碘化丙啶)染色试剂盒检测细胞凋亡。在MV-4-11、OCI-AML-3和SKM-1细胞中，用10nM化合物6及10nM或30nM HHT单独用药或联合用药处理细胞24小时后，收集细胞，并用PBS清洗一次。使用Annenix V-FITC和PI对细胞进行双色染色。染色结束后使用Attune NxT流式细胞仪进行分析。通过每个实验条件下分析20000个细胞获得的细胞凋亡图谱。

【实验结果】

结果如图2所示，与溶媒对照DMSO比较，化合物6和HHT单独用药在所测试的AML细胞系中均可以诱导一定比例的细胞凋亡，但联合用药可显著增加细胞凋亡的比例。例如，在OCI-AML-3细胞中，化合物6(10nM)和HHT(30nM)单独用药可分别诱导12.1％和25.0％的细胞凋亡，而两药联合可诱导80.1％的细胞凋亡，与DMSO组及各自单独用药组比较均具有统计学显著性差异。在MV-4-11和SKM-1细胞中的检测结果也显示化合物6和HHT联合用药可显著的诱导细胞凋亡，与溶媒对照组和各自单药组比较均具有统计学显著性差异。细胞凋亡图谱和图谱数据统计结果详见图2。

实施例3：化合物6与高三尖杉酯碱联合用药显著减少原癌蛋白MYC和MCL-1水平并增强细胞凋亡标志物的表达

【实验方法】：免疫印迹实验(Western blot方法)

将处于对数生长期的细胞用化合物6、HHT各自单药或联合用药处理4小时后进行免疫印迹实验。

10nM化合物6联合10nM或30nM HHT共同作用细胞4小时后，收集细胞，并用预冷的PBS清洗一次。使用含有1％PMSF及1％蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞沉淀。采用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。采用4-20％SDS-PAGE分离细胞裂解物(20-50μg)。将分离的蛋白质转移到PVDF膜。PVDF膜使用1％BSA(牛血清白蛋白)缓冲液室温封闭1小时后，使用含1％BSA的1×TBST(Tris-Buffered Saline Tween-20)稀释的一抗4℃摇床上孵育过夜。1×TBST洗膜3次，每次10分钟。使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(羊抗兔-HRP(Yeasen,Cat.#33101ES60)和羊抗鼠–HRP(Yeasen,Cat.#33201ES60)，根据制造商说明书进行稀释)室温孵育膜1小时。1×TBST洗膜3次，每次10分钟。将HRP底物加至PVDF膜上。使用ECL超敏试剂(增强型ECL化学发光检测试剂盒)产生信号。信号强度直接反映蛋白表达水平。

【实验结果】

Western blot检测结果如图3所示，在MV-4-11、OCI-AML-3和SKM-1三种细胞系中，HHT单独用药组和化合物6与HHT联合用药组中，抗凋亡蛋白MCL-1表达量均减少，且尤其在MV-4-11中显示显著差异；在化合物6与HHT联合用药组中，剪切型Caspase 3(CL-Caspase)及剪切型PARP-1(CL-PARP)的表达明显增强，这表明，二者的联合协同诱导细胞凋亡的发生。同时，在三种细胞系中，化合物6与HHT联合组中，原癌蛋白MYC也明显减少。

实施例4：化合物6与高三尖杉酯碱联合用药干扰BCL-2:BIM、MCL-1:BIM、MCL-1:BAK和MCL-1:PUMA复合物

【实验方法】：MSD(Meso Scale Discovery)方法

将处于对数生长期的细胞用化合物6、HHT各自单药或联合用药处理4小时后，采用MSD电化学发光法检测细胞凋亡相关蛋白复合物。

采用MSD方法检测BCL-2:BIM、MCL-1:BIM、MCL-1:PUMA和MCL-1:BAK蛋白复合物。将AML/MDS细胞系经化合物6或HHT联合用药处理4小时后收集细胞，并用弱蛋白裂解液(RIPA裂解液，Beyotime,P0013D)提取蛋白并调整浓度至1mg/mL备用。用150μL封闭液(MesoScaleDiscovery，R93AA-2)过夜封闭链霉亲和素包被的96孔平板。抗BCL-2抗体与抗MCL-1蛋白用Sulfo-tag(Sulfo-Tag NHS ester,MesoScale Discovery，R91AO-1)标记；抗BIM抗体、抗PUMA抗体及抗BAK抗体用生物素标记。将50μL(1μg/mL)生物素标记的抗BIM抗体、抗PUMA抗体或抗BAK抗体加至链霉亲和素标记的平板，孵育1小时后用含0.5％吐温-20的PBS清洗平板三次。然后加入50μg细胞裂解液孵育1小时。孵育结束后用含0.5％吐温-20的PBS清洗平板三次。然后用Sulfo-tag标记的MCL-1或BCL-2(4μg/mL)检测抗体孵育60分钟。在MesoScale Discovery Sector S 600上检测电发光信号强度。

【实验结果】

MSD检测结果如图4所示，细胞经化合物6处理后，BCL-2:BIM复合物表达量减少，证实化合物6可拮抗BCL-2与BIM的结合，抑制BCL-2的抗凋亡功能，释放促凋亡蛋白BIM。化合物6与HHT联合处理组中MCL-1:BIM复合物与化合物6单独用药处理组相比显著减少，证实化合物6与HHT联合可以同时减少BCL-2:BIM和MCL-1:BIM复合物，从而释放促凋亡蛋白BIM(图4A和图4B)。

如图4C所示，化合物6与HHT联合用药组中MCL:BAK复合物与对照组及化合物6单独用药组相比显著减少，这提示着化合物6与HHT联合后释放了促凋亡蛋白BAK。如图4D所示，化合物6与HHT联合用药组中，MCL-1:PUMA复合物与对照组及单独用药组相比也有一定减少，这提示着化合物6与HHT联合后释放了促凋亡蛋白PUMA。

综上所述，化合物6与HHT联合可释放更多的促凋亡蛋白BIM、BAK及PUMA。

实施例5：化合物6与HHT联合用药在人源MV-4-11AML小鼠异种移植瘤模型中的协同抗肿瘤作用

在体外细胞实验中，MV-4-11细胞是对化合物6处理中度敏感的人AML细胞系之一。因此，本研究首先使用人MV-4-11细胞建立小鼠异种移植瘤模型，评估化合物6与HHT联合用药的抗肿瘤作用。

【实验方法】:

在无菌条件下，通过给雌性BALB/c Nude小鼠(供应商：上海灵畅生物科技有限公司SCXK(沪)2018-0003；合格证号：20180003004157)右侧背部皮下注射MV-4-11肿瘤细胞(密度为10×10

【实验结果】

利用所测定的相对肿瘤体积(RTV)，按照以下公式计算相对肿瘤增殖率T/C(％)：T/C＝T

结果如图5A-5B所示，化合物6(50mg/kg)和ABT-199(50mg/kg)在该MV-4-11异种移植瘤模型中显示没有抗肿瘤活性，T/C值分别为62.76％(与溶媒对照组比较p>0.05)和88.27％(与溶媒对照组比较p>0.05)；HHT(1mg/kg)在该模型中展现出中等的抗肿瘤作用，T/C值为32.43％(与溶媒对照组比较p>0.05，3/5SD)。化合物6与HHT联合用药显示了显著的协同抗AML作用，T/C值为3.31％(与溶媒对照组比较，p<0.05；与化合物6单药组比较，p<0.01)；协同因子为6.14；肿瘤缓解率为100％(6/6PR)。平行比较中，另一FDA批准的BCL-2抑制剂ABT-199(venetoclax，50mg/kg)与HHT(1mg/kg)联合用药也显示了显著的协同抗AML作用，T/C值为2.59％(与溶媒对照组比较，p<0.05；与ABT-199单药组比较，p<0.01)；协同因子为11.07；肿瘤缓解率为100％(6/6PR)；相比之下，在化合物6和ABT-199单药组，未见CR或PR。这些结果证明，化合物6联合HHT具有显著的协同抗AML作用，且联合作用效果与ABT-199与HHT的联合效果相当。各给药组动物均未见显著的体重下降(图5B)，说明动物对以上给药方案耐受性良好。

表3

以上结果证明：化合物6与HHT联合用药具有显著的协同抗AML作用，预示这一联合用药方案可以为AML患者带来临床获益。

实施例6：化合物6与HHT联合用药在人源OCI-AML-3AML小鼠异种移植瘤模型中的协同抗肿瘤作用

研究表明，高表达抗凋亡蛋白MCL-1的肿瘤细胞，如OCI-AML-3细胞，对BCL-2选择性抑制剂(ABT-199)的治疗具有原发性抗性(Pan R等人,Cancer cell.32(6),748-760e746.7)。因此，本实验进一步使用OCI-AML-3细胞建立小鼠皮下异种移植瘤模型，探索化合物6与HHT联合用药是否可克服由MCL-1高表达所引起的AML对化合物6的原发性抗性。

【实验方法】:

在无菌条件下，通过给雌性NOD SCID小鼠(供应商：北京维通利华实验动物技术有限公司，SCXK(京)2016-0006；合格证号：1100111911056971)右侧背部皮下注射OCI-AML-3肿瘤细胞(密度为1×10

【实验结果】

如实施例5所述计算相对肿瘤增殖率T/C(％)。

结果如图6A和6B所示，OCI-AML-3表现为一种快速生长的异种移植瘤，在给药后第15天，溶媒对照组动物因肿瘤体积超过动物福利允许范围被处以安乐死，本次实验因此在第15天终止。在15天的治疗中，与预期一致，化合物6单药(50mg/kg)在该模型中未表现出显著的抗肿瘤活性，T/C值为61.36％。HHT单药(0.75mg/kg)在该模型中也未展现出显著的抗肿瘤活性，T/C值为66.77％。重要的是，化合物6与HHT联合用药具有显著的协同抗AML作用，T/C值达到33.02％(与溶媒对照组比较，p<0.05)；协同因子为1.24。各组动物体重在给药期间未见显著的下降(图6B)，说明动物对以上给药方案耐受性良好。

表4

这些结果证明，化合物6与HHT联合用药具有协同抗肿瘤作用，使得抗药性模型对细胞杀伤敏感，提供了一种对AML患者更为有效的新的组合治疗策略。