一种核酸片段的连接方法、测序文库的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种核酸片段的连接方法、测序文库的构建方法及其应用。

背景技术

随着测序技术的发展，测序文库运用越来广泛。在基因工程技术中，常需要将两个或两个以上的核酸片段链接，例如在DNA分子上连接接头，接头一般为一段短的平末端或粘性末端的人工合成核苷酸片段。接头和核苷酸的连接效率直接影响测序文库构建的质量。

发明内容

本发明提供了一种操作简便、连接效率高的核酸片段的连接方法，本发明还提供了一种测序文库的构建方法及其在测序中的应用。

本发明一方面提供了一种核酸片段的连接方法，包括将第一核酸片段和第二核酸片段于混合酶反应体系中进行所述连接，所述混合酶反应体系包括DNA连接酶和RNA连接酶，所述第一核酸片段为双链DNA。

在一个实施方式中，所述RNA连接酶为T4 RNA连接酶；和/或

所述DNA连接酶为可催化粘端或平端双链DNA的连接，例如T4 DNA连接酶和/或Blunt/TA连接酶。

在一个实施方式中，第一核酸片段为磷酸化处理后的核酸片段。

在一个实施方式中，利用多核苷酸激酶进行所述磷酸化处理。

在一个实施方式中，所述多核苷酸激酶为T4多核苷酸激酶。

在一个实施方式中，所述混合酶反应体系还包括多核苷酸激酶。

在一个实施方式中，所述多核苷酸激酶为T4多核苷酸激酶。

在一个实施方式中，所述的第二核酸片段为双链核酸片段。

在一个实施方式中，所述的第一核酸片段与第二核酸片段的摩尔比为1∶8～20。

在一个实施方式中，所述的第一核酸片段与第二核酸片段的摩尔比为1∶10。

在一个实施方式中，所述的RNA连接酶在连接反应体系中的终浓度为0.15U/μL～1U/μL；和/或

所述的多核苷酸激酶在磷酸化处理体系中的终浓度为0.3U/μL～1UμL。

本发明另一方面提供了一种测序文库的构建方法，包括利用上述的连接方法获得连接产物，以得到所述测序文库，所述第一核酸片段来自待测样本。

本发明第三方面提供了一种测序文库，利用上述的构建方法获得。

本发明第四方面提供了一种测序方法，包括将上述测序文库进行测序。

本发明第五方面提供了一种用试剂盒，所述的试剂盒以实现上述方法。

有益效果：

RNA连接酶是用于RNA连接的一种酶，本发明提供了一种核酸片段的连接方法，在反应体系中同时包含DNA连接酶和RNA连接酶，出乎意料的，DNA的连接效率得到显著提高。实验结果表明，在无RNA连接酶的的连接条件下，采用DNA连接酶(DNA Ligase)将双链DNA片段进行连接反应，连接效率只有38.14％～77.5％。；而加入了常用于RNA和RNA 之间的连接的RNA连接酶(RNA Ligase)，使得DNA片段的连接效率达到85％以上。利用此连接方法构建测序文库，有效文库的得率显著提高。

附图说明

图1为实施例1中用Labchip鉴定连接产物片段大小的结果图；

图2为实施例2中用Labchip鉴定连接产物片段大小的结果图；

图3为实施例3中用Labchip鉴定连接产物片段大小的结果图；

图4为实施例4中用Labchip鉴定连接产物片段大小的结果图；

图5为实施例5中用Labchip鉴定连接产物片段大小的结果图；

图6为实施例6中用Labchip鉴定连接产物片段大小的结果图；

图7为实施例7中用Labchip鉴定连接产物片段大小的结果图；

图8为实施例8中用Labchip鉴定连接产物片段大小的结果图；

图9为实施例9中用Labchip鉴定连接产物片段大小的结果图；

图10为实施例10中用Labchip鉴定连接产物片段大小的结果图；

图11为对比例1中用Labchip鉴定连接产物片段大小的结果图；

图12为对比例1中用Labchip鉴定连接产物片段大小的结果图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。下面描述的实施例为示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明一方面提供了一种核酸片段的连接方法，包括将第一核酸片段和第二核酸片段于混合酶反应体系中进行连接，混合酶反应体系包括DNA连接酶和RNA连接酶，其中，第一核酸片段为双链DNA。

具体的，第一核酸片段可以为cf DNA、基因组DNA和/或者PCR产物等来源的DNA片段，所述的片段可经过末端补平或者未经过末端补平处理。

进一步地，第一核酸片段为磷酸化处理后的核酸片段。

具体地，利用多核苷酸激酶对第一核酸片段进行磷酸化处理。

进一步地，多核苷酸激酶为T4多核苷酸激酶。

在一个实施方式中，混合酶反应体系还包括多核苷酸激酶。多核苷酸激酶在混合酶体系中，在连接反应地过程中对第一核酸片段进行磷酸化处理，简化操作流程，提高效率。

具体地，混合酶反应体系中的多核苷酸激酶为T4多核苷酸激酶。T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)能够对双链DNA片段末端进行磷酸化修饰，形成5′端为磷酸基团的片段。

具体地，第二核酸片段为已知序列的双链核酸片段，例如可以为接头等。所述的接头为含有已知序列的核苷酸片段。

进一步地，接头包含正义链和反义链，正义链的5′端具有氨基修饰、3′端具有羟基修饰，反义链的5′端具有磷酸化修饰、3′端标记有荧光标记物。所述反义链指的是该核苷酸链的5’端可与第一核酸片段连接，所述的正义链与反义链形成双链接头。

进一步地，所述的接头可为平末端接头、粘性末端的接头等。

具体地，荧光标记物可以为CY3、TRITC或TAMRA等可检测荧光标记。

在一个实施方式中，RNA连接酶为T4 RNA连接酶。T4 RNA连接酶(T4 RNA Ligase)一般常用于RNA和RNA之间的连接，发明人将T4 RNA Ligase用于到双链DNA与接头的连接中，意外的发现，将T4 PNK、T4 DNA Ligase以及T4 RNA Ligase配合使用，能够使得双链DNA片段与接头的连接效率达到85％以上，得到的有效文库比率高。

进一步地，DNA连接酶为T4 DNA连接酶和/或Blunt/TA ligase等，用以连接平末端或粘末端的DNA。

本实施方式中，DNA连接酶为T4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase)能够催化双链DNA上相邻的3′羟基和5′磷酸末端形成磷酸二脂键，促进双链DNA片段与接头连接。

在一个实施方式中，第一核酸片段为磷酸化处理后的核酸片段。

在一个实施方式中，利用多核苷酸激酶进行磷酸化处理。

在一个实施方式中，第一核酸片段与第二核酸片段的摩尔比为1∶8～20。第一核酸片段与第二核酸片段的摩尔比适宜，能够有效减少第二核酸片段的残留。

进一步地，第一核酸片段与第二核酸片段的摩尔比为1∶10。

在一个实施方式中，RNA连接酶在连接反应体系中的终浓度为0.15U/μL～1U/μL；和/或

进一步地，多核苷酸激酶在磷酸化处理体系中的终浓度为0.3U/μL～1UμL。

本实施方式中，将双链DNA与接头的连接，具体包括如下步骤：将双链DNA片段在混合酶反应体系中进行连接反应，混合酶反应体系包括T4多聚核苷酸激酶(T4polynucleotide kinase，T4 PNK)、T4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase)以及T4 RNA连接酶(T4RNA Ligase)，将双链DNA片段与接头混合进行连接反应，得到连接产物。

具体地，可通过限制性内切酶、机械打断等方式片段化处理DNA，以形成适宜长度的 DNA片段，以便于DNA片段与接头连接。当然，若双链DNA本身的长度在适宜长度范围内或者比适宜长度小，双链DNA不需再进行片段化处理。所述的适宜长度基于不同测序平台而言可能会不同。对于随机片段化的DNA片段进行接头连接前，通常会进行末端补平处理或者在DNA连接酶作用下末端补平和连接反应同时进行，而对于本发明而言，该反应体系适用随机打断的DNA片段不进行补平过程的连接反应。优选地，使用的T4 RNA连接酶(T4 RNALigase)具体为T4 RNA连接酶I(T4 RNA Ligase I)。

在一个实施方式中，采用两步法进行连接反应，具体步骤如下：将双链DNA片段在T4 多聚核苷酸激酶以及T4 DNA连接酶缓冲液形成的混合酶体系中反应，在35℃～40℃条件下反应20min～40min，得到中间产物。通过T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)对双链DNA片段末端进行磷酸化修饰。然后将所述中间产物与接头在T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶以及T4DNA连接酶缓冲液形成的混合酶体系中反应，在10℃～20℃条件下反应20min～40min，得到连接产物。

在另一个实施方式中，采用一步法进行连接反应，具体步骤如下：将双链DNA片段、接头、T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶以及T4 DNA连接酶缓冲液混合形成反应体系，在10℃～20℃条件下反应20min～40min，得到连接产物。一步法连接效率与两步法相近，且反应操作简单。

具体地，双链DNA片段与接头的摩尔比为1∶8～20。双链DNA片段与接头的摩尔比适宜，能够有效减少接头残留。

进一步地，双链DNA片段与接头的摩尔比为1∶10。此时，接头残留最少。

上述连接方法，加入了常用于RNA和RNA之间的连接的RNA连接酶(RNA Ligase)。通过DNA连接酶(DNA Ligase)以及RNA连接酶(RNA Ligase)配合作用，使得双链DNA 片段的连接效率高。利用此连接方法进行测序文库的构建，有效文库得率高。

本发明另一方面提供了一种测序文库的构建方法，包括利用上述的连接方法获得连接产物，以得到所述测序文库，所述第一核酸片段来自待测样本。

该测序文库的构建方法，步骤简便，成本低，构建的有效文库得率高。

本发明第三方面提供了一种测序文库，利用上述的构建方法获得。

本发明第四方面提供了一种测序方法，包括利用上述的测序文库进行测序。

本发明第五方面提供了一种试剂盒，试剂盒可以实现上述方法。

例如，该试剂盒包含DNA连接酶、RNA连接酶，及包含连接方法的试剂盒使用说明书。

在一个实施例中，该试剂盒包含的DNA连接酶和RNA连接酶以混合酶形式保存。

在一个实施例中，该试剂盒还包含接头。

利用本发明中的试剂盒可以实现对DNA片段的高效连接。

下面为具体实施例部分。

以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例中：

T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)购自NEB公司，货号M0201S，10000U/ml。

T4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase)购自NEB公司，货号M0202。T4 RNA连接酶I(T4 RNALigase I)购自NEB公司，货号NEB M0204，10000U/ml。当然，在其他的例子中也可选择其他品牌的连接酶，如诺唯赞的Blunt/TA ligase mix进行连接操作。

设计合成的序列如下：

TCCTTGATACCTGCGACCATCCAGTTCCACTCAGATGTGTATAAGAGACAG

(SEQ ID No.1)；

CTGTCTCTTATACACATCTGAGTGGAACTGGATGGTCGCAGGTATCAAGGA

(SEQ ID No.2)；

CTCAGATCCTACAACGACGCTCTACCGATGAAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID No.3)；

CTGTCTCTTATACACATCTTCATCGGTAGAGCGTCGTTGTAGGATCTGAG(SEQ ID No.4)

D9接头：

D9-S1(正义链)：SEQ ID No.1所示的序列的5’端有一个氨基(-NH2)修饰后的序列；

D9-S2(反义链1)：SEQ ID No.2所示的序列的5’端有一个磷酸基团(PHO-)修饰，3’有一个氨基(-NH

D9-S2-CY3(反义链2)：SEQ ID No.2所示的序列的5’端有一个磷酸基团(PHO-)修饰，3’有一个荧光基团(-CY3)修饰后的序列；

D9-1接头：序列D9-S1(正义链)与D9-S2-CY3(反义链2)形成的双链核苷酸；

D9-2接头：序列D9-S1(正义链)与D9-S2-CY3(反义链1)形成的双链核苷酸。

D7接头：

D7-S1(正义链)：SEQ ID No.3所示的序列的5’端有一个氨基(-NH

D7-S2(反义链1)：为SEQ ID No.4所示的序列的5’端有一个磷酸基团(PHO-)修饰，3’有一个氨基(-NH

D7-S2(反义链2)：为SEQ ID No.4所示的序列的5’端有一个磷酸基团(PHO-)修饰，3’有一个荧光基团(-CY3)修饰后的序列；

D7-1接头：D7-S1(正义链)和D7-S2(反义链2)形成的双链核苷酸；

D7-2接头：D7-S1(正义链)和D7-S2(反义链1)形成的双链核苷酸。

adapter mix(接头)：是D7-1接头和D9-1接头按照1∶1的摩尔量混合。

CY3：CY3荧光染料

DNA与接头摩尔比为：DNA与adapter mix(接头)的摩尔总量之比，在实施例中DNA指的PCR产物。

D7-2接头和D9-2接头：用Labchip鉴定连接产物时的对照物。

接头比例的计算方式：

根据以下公式(I)算出DNA的摩尔数：

m：体系中加入的DNA片段的质量，单位为ng；

L：体系中加入的DNA片段的长度，单位为bp。

根据下列公式(II)计算接头的摩尔数：

pmols＝C*V (II)

C：接头的摩尔浓度，单位为μM

V：所用接头的体积，单位为μL。

根据公式(I)和公式(II)计算得到的摩尔数相比，即可得到DNA与接头的比例。连接效率计算方式为：用Labchip仪器对反应产物进行毛细管电泳，通过DNA片段长度来区分接头，底物和连接产物，用连上接头的DNA皮摩尔数除以未连上接头的DNA皮摩尔数加连上接头的DNA皮摩尔数的总和，乘以百分百，即可得到连接效率。

本实施例的连接方法如下，采用两步法连接：

取15ng 200bp的PCR产物于200μL PCR管中，加入2.5μL浓度为10μM的ATP、1μL 10×T4Ligase buffer(含有10mMATP)以及1μL T4 PNK，加水补足至10μL，混匀；37℃下反应30min，得到中间产物。然后在中间产物中加入1μL10×T4 Ligase buffer、2μL 1μMadapter mix(接头)，DNA与接头摩尔比为1∶17.6、1μL T4 RNase Ligase I以及2μL T4 DNAligase，加水补足至20μL，混匀，T4 RNase Ligase I的终浓度为0.5U/μL，16℃下反应30min，得到连接产物。

用0.8×Ampure XP beads纯化，用Labchip鉴定连接产物片段大小。结果如表1和图1所示。

表1

本实施例的连接方法如下，采用一步法连接：

取15ng 200bp的PCR产物于200μL PCR管中，加入2μL 10×T4Ligase buffer、2μL1μM adapter mix(接头)，DNA与接头摩尔比为1∶17.6、1μL T4 PNK、1μL T4 RNase Ligase I以及2μL T4 DNA ligase，加水补足至20μL，混匀，T4 RNase Ligase I的终浓度为0.5U/μL，16℃下反应1h，得到连接产物。

用0.8×Ampure XP beads纯化，用Labchip鉴定连接产物片段大小。结果如表2和图2所示。

表2

本实施例的连接方法如下，采用一步法连接：

取15ng 200bp的PCR产物于200μL PCR管中，加入2μL 10×T4 Ligase buffer、2μL1μM adapter mix(接头)，DNA与接头摩尔比为1∶17.6、1μL T4 PNK、1μL T4 RNase LigaseI以及2μL T4 DNA ligase，加水补足至20μL，混匀，T4 RNase Ligase I的终浓度为0.5U/μL，16℃下反应1h，得到连接产物。

用0.8×Ampure XP beads纯化，用Labchip鉴定连接产物片段大小。结果如表3和图3所示。

表3

本实施例的连接方法如下，采用一步法连接：

按实施例3的方法准备反应体系，不同的是，本实施例在反应体系中加入的1μMadapter mix为1.7μL(接头)，DNA与接头摩尔比为1∶15。其余与实施例3一致。

用0.8×Ampure XP beads纯化，用Labchip鉴定连接产物片段大小。结果如表4和图4所示。

表4

本实施例的连接方法如下，采用一步法连接：

按实施例3的方法准备反应体系，不同的是，本实施例在反应体系中加入的1μMadapter mix为1.36μL(接头)，DNA与接头摩尔比为1∶12。其余与实施例3一致。

用0.8×Ampure XP beads纯化，用Labchip鉴定连接产物片段大小。结果如表5和图5所示。

表5

本实施例的连接方法如下，采用一步法连接：

按实施例3的方法准备反应体系，不同的是，本实施例在反应体系中加入的1μMadapter mix为1.14μL(接头)，DNA与接头摩尔比为1∶10。其余与实施例3一致。

用0.8×Ampure XP beads纯化，用Labchip鉴定连接产物片段大小。结果如表6和图6所示。

表6

本实施例的连接方法如下，采用一步法连接：

取15ng 200bp的PCR产物于200μL PCR管中，加入2μL 10×T4 Ligase buffer、1.14μL 1μM adapter mix(接头)，DNA与接头摩尔比为1∶10、1μL T4 PNK、1μL T4 RNaseLigase I以及2μL T4 DNA ligase，加水补足至20μL，混匀，T4 RNase Ligase I的终浓度为0.5U/μL，16℃下反应30min，得到连接产物。

用0.8×Ampure XP beads纯化，用Labchip鉴定连接产物片段大小。结果如表7和图7所示。

表7

本实施例的连接方法如下，采用一步法连接：

按实施例7的方法准备反应体系，不同的是，本实施例在反应体系中加入的T4RNase Ligase I为1μL，加入的T4 DNA ligase为1μL。其余与实施例7一致。

用0.8×Ampure XP beads纯化，用Labchip鉴定连接产物片段大小。结果如表8和图8所示。

表8

本实施例的连接方法如下，采用一步法连接：

按实施例7的方法准备反应体系，不同的是，本实施例在反应体系中加入的T4RNase Ligase I为0.5μL，加入的T4 DNA ligase为0.5μL，T4 RNase Ligase I的终浓度为0.25U/μL。。其余与实施例7一致。

用0.8×Ampure XP beads纯化，用Labchip鉴定连接产物片段大小。结果如表9和图9所示。

表9

本实施例的连接方法如下，采用一步法连接：

取15ng 200bp的PCR产物于200μL PCR管中，加入3μL 10×T4 Ligase buffer、1.14μL 1μM adapter mix(接头)，DNA与接头摩尔比为1∶10、1μL T4 PNK、0.5μL T4 RNaseLigase I以及 0.5μL T4 DNA ligase，加水补足至30μL，混匀，T4 RNase Ligase I的终浓度为0.17U/μL。16℃下反应15min，得到连接产物。

用0.8×Ampure XP beads纯化，用Labchip鉴定连接产物片段大小。结果如表10和图10 所示。

表10

本实施例的连接方法如下，采用两步法连接：

取15ng 200bp的PCR产物于200μL PCR管中，加入2.5μL浓度为10μM的ATP、1μL 10×T4 Ligase buffer以及1μL T4 PNK，加水补足至10μL，混匀；37℃下反应30min，得到中间产物。然后在中间产物中加入1μL 10×T4 Ligase buffer、2μL 1μM adapter mix(接头)，DNA 与接头摩尔比为1∶17.6、2μL T4 DNA ligase，加水补足至20μL，混匀，16℃下反应30min，得到连接产物。

用0.8×Ampure XP beads纯化，用Labchip鉴定连接产物片段大小。结果如表11和图11 所示。

表11

本实施例的连接方法如下，采用一步法连接：

取15ng 200bp的PCR产物于200μL PCR管中，加入2μL 10×T4Ligase buffer、2μL1μM adapter mix(接头)，DNA与接头摩尔比为1∶17.6、1μL T4 PNK以及2μL T4 DNAligase，加水补足至20μL，混匀，16℃下反应1h，得到连接产物。

用0.8×Ampure XP beads纯化，用Labchip鉴定连接产物片段大小。结果如表2和图2所示。

用0.8×Ampure XP beads纯化，用Labchip鉴定连接产物片段大小。结果如表12和图12 所示。

表12

以上结果表明，实施例1～10的方法，在双链DNA与接头的连接中，加入了常用于RNA 和RNA之间的连接的T4 RNA连接酶I(T4 RNA Ligase I)，使得双链DNA片段与接头的连接效率达到85％以上，得到的有效文库比率高，且上述连接方法无需进行PCR步骤，步骤简便，成本低。

实施例2～10采用一步法连接，操作简单，且效率与实施例1的两步法相近。

实施例6与实施例1～5相比较，DNA∶adapter的摩尔比为1∶10时，接头残留少。

实施例7～9的结果表明，将T4 RNA Ligase I及T4 DNA ligase降低后连接效率与未降低相当，实验所用酶的少，成本低。

实施例10的结果表明，为了适应样本浓度，将体系增大，本申请的连接方法反应效率没有明显降低。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳市瀚海基因生物科技有限公司

<120> 一种核酸片段的连接方法、测序文库的构建方法及其应用

<130> 1

<140> 1

<141> 2018-08-07

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccttgatac ctgcgaccat ccagttccac tcagatgtgt ataagagaca g 51

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgtctctta tacacatctg agtggaactg gatggtcgca ggtatcaagg a 51

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcagatcct acaacgacgc tctaccgatg aagatgtgta taagagacag 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgtctctta tacacatctt catcggtaga gcgtcgttgt aggatctgag 50