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重组AAV载体及其使用方法

文献发布时间：2023-06-19 09:54:18

本申请对2018年6月11日提交的第62/683,501号美国申请主张优先权，该在先申请通过引用方式被完整纳入本申请。

技术领域

本发明涉及表达人类ND4基因的重组腺相关病毒(AAV)载体、制备表达人类ND4基因的重组AAV载体的方法及其用途。本发明所公开的重组AAV载体有助于治疗莱伯遗传性视神经视网膜病变(LHON)，包括ND4相关LHON。

背景技术

莱伯遗传性视神经视网膜病变(LHON)，亦称为“莱伯遗传性视神经病”或“莱伯遗传性视神经萎缩”，是一种视觉神经功能障碍，其表现为因视网膜神经节细胞退化而导致的双目中央视觉的急性或亚急性丧失。LHON与线粒体DNA(mtDNA)中的点突变有关，是从母亲处遗传而来(Orssaud, C.,

NADH脱氢酶4基因(ND4基因)中的G11778A线粒体DNA点突变导致了折叠错误的蛋白质的生成，折叠错误的蛋白质篡改了线粒体复合物I的活性并降低了氧化磷酸化(Baracca等人, Arch. Neurol., 62, pp. 730-736 (2005))。这降低了ATP的产生而增加了活性氧类的生成，导致视网膜神经元细胞(RGCs)的死亡(Perier等人, Proc Natl AcadSci USA,102, pp. 19126-19131 (2005); Qi等人, Arch. Ophthalmol., 125, pp. 268-272 (2007))。G11778A线粒体DNA点突变表现为严重的视力损害。

LHON自身提供了基因疗法，包括使用病毒载体，例如重组腺相关病毒载体(AAV)，例如血清2型(重组AAV2载体)。在一些案例中，使用重组AAV载体使重组DNA转移至人类中央凹或近中央凹的视网膜神经元细胞内。用于线粒体ND4的cDNA编码的转移实现了定位于线粒体复合物I的ND4蛋白质。

在一些目的并不是为了进行理论约束的案例中，表达ND4基因的重组AAV2载体可借助以下能力发挥生物活性：例如，来(1)通过内化入细胞质(利用内吞作用)以及通过AAV2颗粒与核仁素(核穿梭蛋白)的结合进行的核输入来到达目标细胞细胞核；(2)形成对编码功能性NADH去氢酶4蛋白质的ND4 mRNA转录的核内附加体和(3)借助线粒体靶向序列(MTS)将ND4 mRNA导向线粒体，从而使ND4蛋白质在线粒体中表达(US9,017,999)。

发明内容

在一些方面，本发明涉及以下具体实施方式：

1.一种重组AAV2载体，其包括：

包括SEQ ID No:1的3’UTR Cox10序列；

编码NADH去氢酶4(ND4)多肽、包括SEQ ID No:13的核酸序列；和

编码MTS Cox10多肽、包括SEQ ID No:11的核酸序列。

2.一种重组AAV2载体，其包括：

包括SEQ ID No:1的3’UTR Cox10序列；

编码NADH去氢酶4(ND4)多肽、包括SEQ ID No:13的核酸序列；和

编码MTS Cox10多肽、包括SEQ ID No:12的核酸序列。

3.一种重组AAV2载体，其包括：

包括SEQ ID No:14的3’UTR Cox10序列；

编码NADH去氢酶4(ND4)多肽、包括SEQ ID No:13的核酸序列；和

编码MTS Cox10多肽、包括SEQ ID No:11的核酸序列。

4.一种重组AAV2载体，其包括：

包括SEQ ID No:14的3’UTR Cox10序列；

编码NADH去氢酶4(ND4)多肽、包括SEQ ID No:13的核酸序列；和

编码MTS Cox10多肽、包括SEQ ID No:12的核酸序列。

5.一种重组AAV2载体，其包括：

包括SEQ ID No:1的3’UTR Cox10序列；

编码ND4、包括SEQ ID No:2的序列；和

包括SEQ ID No:3的MTS Cox10序列。

6.一种重组AAV2载体，其包括：

由SEQ ID No:1组成的3’UTR Cox10序列；

编码ND4、由SEQ ID No:2组成的序列；和

由SEQ ID No:3组成的MTS Cox10序列。

7.一种重组AAV2载体，其包括：

包括SEQ ID No:1的3’UTR Cox10序列；

编码ND4、包括SEQ ID No:17的序列；和

包括SEQ ID No:3的MTS Cox10序列。

8.一种重组AAV2载体，其包括：

由SEQ ID No:1组成的3’UTR Cox10序列；

编码ND4、由SEQ ID No:17组成的序列；和

由SEQ ID No:3组成的MTS Cox10序列。

9.一种重组AAV2载体，其包括：

包括SEQ ID No:14的3’UTR Cox10序列；

编码ND4、包括SEQ ID No:15的序列；和

包括SEQ ID No:16的MTS Cox10序列。

10.一种重组AAV2载体，其包括：

由SEQ ID No:14组成的3’UTR Cox10序列；

编码ND4、由SEQ ID No:15组成的序列；和

由SEQ ID No:16组成的MTS Cox10序列。

11.一种重组AAV2载体，其包括：

包括SEQ ID No:14的3’UTR Cox10序列；

编码ND4、包括SEQ ID No:18的序列；和

包括SEQ ID No:16的MTS Cox10序列。

12.一种重组AAV2载体，其包括：

由SEQ ID No:14组成的3’UTR Cox10序列；

编码ND4、由SEQ ID No:18组成的序列；和

由SEQ ID No:16组成的MTS Cox10序列。

13.根据具体实施方式1-2或5-8中任一项所述的重组AAV2载体，进一步包括：

包括SEQ ID No:4的HBB2内含子序列；

包括SEQ ID No:5的CMV启动子序列；

包括SEQ ID No:6的第一ITR序列；和

包括SEQ ID No:7的第二ITR序列。

14.根据具体实施方式1-2或5-8中任一项所述的重组AAV2载体，进一步包括：

由SEQ ID No:4组成的HBB2内含子序列；

由SEQ ID No:5组成的CMV启动子序列；

由SEQ ID No:6组成的第一ITR序列；和

由SEQ ID No:7组成的第二ITR序列。

15.根据具体实施方式3-4或9-12中任一项所述的重组AAV2载体，进一步包括：

包括SEQ ID No:24的HBB2内含子序列；

包括SEQ ID No:25的CMV启动子序列；

包括SEQ ID No:26的第一ITR序列；和

包括SEQ ID No:27的第二ITR序列。

16.根据具体实施方式3-4或9-12中任一项所述的重组AAV2载体，进一步包括：

由SEQ ID No:24组成的HBB2内含子序列；

由SEQ ID No:25组成的CMV启动子序列；

由SEQ ID No:26组成的第一ITR序列；和

由SEQ ID No:27组成的第二ITR序列。

17.一种重组AAV2载体，其包括：

包括SEQ ID No:1的3’UTR Cox10序列；

编码ND4、包括SEQ ID No:17的序列；和

包括SEQ ID No:3的MTS Cox10序列；

由SEQ ID No:4组成的HBB2内含子序列；

由SEQ ID No:5组成的CMV启动子序列；

由SEQ ID No:6组成的第一ITR序列；和

由SEQ ID No:7组成的第二ITR序列。

18.一种重组AAV2载体，其包括：

包括SEQ ID No:14的3’UTR Cox10序列；

编码ND4、包括SEQ ID No:18的序列；和

包括SEQ ID No:16的MTS Cox10序列；

由SEQ ID No:24组成的HBB2内含子序列；

由SEQ ID No:25组成的CMV启动子序列；

由SEQ ID No:26组成的第一ITR序列；和

由SEQ ID No:27组成的第二ITR序列。

19.一种治疗需要治疗的患者的莱伯遗传性视神经视网膜病变的方法，包括对患者施用有效量的根据具体实施方式1-18中任一项所述的重组AAV2载体。

20.一种治疗需要治疗的患者的莱伯遗传性视神经视网膜病变的方法，包括对患者施用有效量的根据具体实施方式1-18中任一项所述的重组载体，其中患者的患病时长短于9个月。

21.一种治疗需要治疗的患者的莱伯遗传性视神经视网膜病变的方法，包括对患者施用有效量的根据具体实施方式1-18中任一项所述的重组AAV2载体，其中患者的患病时长为6-9个月。

22.一种治疗需要治疗的患者的莱伯遗传性视神经视网膜病变的方法，包括对患者施用有效量的根据具体实施方式1-18中任一项所述的重组AAV2载体，其中患者的基线视敏度<约1.6 LogMAR。

23.一种治疗需要治疗的患者的莱伯遗传性视神经视网膜病变的方法，包括对患者施用有效量的根据具体实施方式1-18中任一项所述的重组AAV2载体，其中患者的患病时长短于九个月并且患者的基线视敏度<约1.6 LogMAR。

24.一种治疗需要治疗的患者的莱伯遗传性视神经视网膜病变的方法，包括对患者施用有效量的根据具体实施方式1-18中任一项所述的重组AAV2载体，其中患者的患病时长为六至九个月并且患者的基线视敏度<约1.6 LogMAR。

25.根据具体实施方式19-24中任一项所述的方法，其中所述莱伯遗传性视神经视网膜病变为ND4相关莱伯遗传性视神经视网膜病变。

26.根据具体实施方式19-25中任一项所述的方法，其中所述重组AAV2载体在玻璃体内施用。

27.根据具体实施方式19-26中任一项所述的方法，其中所述重组AAV2载体在玻璃体内施用，施用量为每眼约10

28.根据具体实施方式19-27中任一项所述的方法，其中所述重组AAV2载体在玻璃体内施用，施用量为每眼约10

29.根据具体实施方式19-28中任一项所述的方法，其中所述重组AAV2载体在玻璃体内施用，施用量为每眼约5.0x10

30.根据具体实施方式19-29中任一项所述的方法，其中所述重组AAV2载体在玻璃体内施用，施用量为每眼约9.0x10

31.一种pAAV-ND4转移质粒，其包括：

包括SEQ ID No:1的3’UTR Cox10序列；

包括SEQ ID No:2的ND4编码序列；

包括SEQ ID No:3的MTS Cox10序列；

包括SEQ ID No:4的HBB2内含子序列；

包括SEQ ID No:5的CMV启动子序列；

包括SEQ ID No:6的ITR序列；和

包括SEQ ID No:7的ITR序列。

32.一种pAAV-ND4转移质粒，其包括：

包括SEQ ID No:1的3’UTR Cox10序列；

包括SEQ ID No:17的ND4编码序列；

包括SEQ ID No:3的MTS Cox10序列；

包括SEQ ID No:4的HBB2内含子序列；

包括SEQ ID No:5的CMV启动子序列；

包括SEQ ID No:6的ITR序列；和

包括SEQ ID No:7的ITR序列。

33.根据具体实施方式31或32所述的pAAV-ND4转移质粒，进一步包括：

包括SEQ ID No:8的f1复制起点序列；

包括SEQ ID No:9的抗卡那霉素基因序列；和

包括SEQ ID No:10的ColE1复制起点序列。

34.一种pAAV-ND4转移质粒，其包括：

由SEQ ID No:1组成的3’UTR Cox10序列；

由SEQ ID No:2组成的ND4编码序列；

由SEQ ID No:3组成的MTS Cox10序列；

由SEQ ID No:4组成的HBB2内含子序列；

由SEQ ID No:5组成的CMV启动子序列；

由SEQ ID No:6组成的ITR序列；和

由SEQ ID No:7组成的ITR序列。

35.一种pAAV-ND4转移质粒，其包括：

由SEQ ID No:1组成的3’UTR Cox10序列；

由SEQ ID No:17组成的ND4编码序列；

由SEQ ID No:3组成的MTS Cox10序列；

由SEQ ID No:4组成的HBB2内含子序列；

由SEQ ID No:5组成的CMV启动子序列；

由SEQ ID No:6组成的ITR序列；和

由SEQ ID No:7组成的ITR序列。

36.根据具体实施方式34或35所述的pAAV-ND4转移质粒，进一步包括：

由SEQ ID No:8组成的f1复制起点序列；

由SEQ ID No:9组成的卡那霉素抗药性基因序列；和

由SEQ ID No:10组成的ColE1复制起点序列。

37.一种pAAV-ND4转移质粒，其包括SEQ ID No:22。

38.一种pAAV-ND4转移质粒，其包括SEQ ID No:23。

39.一种制备根据具体实施方式1-18中任一项所述的重组AAV2载体的方法，包括在包装细胞系中对以下对象进行三重转染：

(i) 根据具体实施方式31-38中任一项所述的pAAV-ND4转移质粒；

(ii)rep/cap质粒；和

(iii)腺病毒辅助质粒。

40.根据具体实施方式39所述的方法，其中所述包装细胞系包括人类胚胎肾293(HEK 293)细胞系。

41.根据具体实施方式38或40所述的方法，其中所述rep/cap质粒为pRep2Cap2质粒。

42.根据具体实施方式38-41中任一项所述的方法，其中所述腺病毒辅助质粒为pXX6质粒。

附图说明

附图作为专利说明书的一部分纳入专利说明书中，例举了根据本发明的非限定性具体实施方式，并与说明书一起用于对本发明的原则进行说明。

图1显示了根据本发明的重组AAV2载体的具体实施方式，其包括末端反向重复(ITRs)、含有内含子的表达盒(β球蛋白内含子，HBB2)中的巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、MTS Cox10序列、ND4编码序列和3’UTR Cox10序列。

图2显示了根据本发明的pAAV-ND4质粒的具体实施方式的结构。

图3显示了根据本发明的pRep2Cap2质粒的具体实施方式。

图4显示了根据本发明的腺病毒辅助pXX6质粒的具体实施方式。

图5显示了Pelli-Robson检查表。

图6显示了接受治疗的最佳矫正视力(BCVA)的持续双目改善。

图7显示了在研究过程中对比灵敏度的演变。

具体实施方式

本发明在一些具体实施方式中公开的是表达了编码人类NADH去氢酶4型(ND4)蛋白质ND4的基因(SEQ ID No:13)的重组载体。本发明还公开了通过施用表达人类ND4蛋白的重组AAV2载体来治疗LHON的方法。

“a”“an”或“the”是指文章语法对象的一个或多个。这些词可能指“一个”、“一个或一个以上”、“至少一个”或“一个或超过一个”。举例而言，“an element”意为一个元件或超过一个元件。除非另有说明，否则“或”意为“和/或”。“包括”或“包含”都是非限定性的。

“密码子”是用于指代三个核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)的序列，这三个核苷酸一起构成编码氨基酸的遗传密码单元。“遗传密码”是用于指代活体细胞所使用的密码子和氨基酸之间关系的完整集合。遗传密码在所有有机体中都是高度类似的，本领域的普通技术人员将会理解“通用遗传密码”或“标准遗传密码”是用于指代包括人类在内的许多有机体所使用的最常见的遗传密码。在一些具体实施方式中，通用遗传密码是真核细胞所使用的遗传密码。在一些具体实施方式中，通用遗传密码是用于核基因的遗传密码。“线粒体遗传密码”用于指代线粒体中所使用的密码，为线粒体核酸和蛋白质设定密码。在一些具体实施方式中，线粒体遗传密码是脊椎动物线粒体密码。在一些具体实施方式中，线粒体遗传密码是人类线粒体密码。线粒体中的密码子使用与通用遗传密码已在Lewin的Genes V（牛津大学出版社；纽约1994）中进行了描述，在此通过引用方式将其内容纳入本发明。

人类NADH去氢酶4型(ND4)蛋白质是NADH去氢酶(泛醌)的子单元，其被导向线粒体内膜并且是电子传递链的五种复合物中最大的一种。ND4基因，亦称为被线粒体编码的NADH去氢酶4(MT-ND4),位于人类线粒体DNA中。编码ND4蛋白质的示例性核酸序列包括但不限于NCBI NC_012920.1。在一些具体实施方式中，编码ND4多肽的核酸序列可以为线粒体核酸，或为人类ND4多肽编码的细胞核核酸(nuclear nucleic acid)。在一些具体实施方式中，编码ND4多肽的核酸序列可以为任意编码人类ND4多肽的核酸序列。在一些具体实施方式中，编码人类ND4蛋白质的核酸序列包括SEQ ID NO: 2、15、17或18。用于人类ND4多肽的示例性氨基酸序列包括但不限于Genbank ACF70814.1。在一些具体实施方式中，人类ND4多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:13。

表1：本发明各种具体实施方式的序列

不受理论约束，线粒体基因可使用与核基因所使用的通用遗传密码不同的线粒体遗传密码。当线粒体基因被插入待表达于细胞核中的重组载体中时，线粒体核酸序列可根据通用遗传密码被重新编码，以在线粒体外被正确地表达和/或翻译。在一些具体实施方式中，线粒体编码的基因可被重新编码以构成相同基因的细胞核编码版本。在一些具体实施方式中，细胞核编码版本通过对线粒体核酸进行密码子替换来生成。在一些具体实施方式中，细胞核编码版本通过密码子替换将线粒体遗传密码的密码子替换为通用遗传密码的密码子来生成。线粒体中的密码子使用与通用遗传密码已在Lewin的Genes V（牛津大学出版社；纽约1994）中进行了描述，在此通过引用方式将其内容纳入本发明。示例性密码子替换包括但不限于UGA替换为UGG；AGA替换为UAA、UAG或UGA；AGG替换为UAA、UAG或UGA；AUA替换为AUG、CUG或GUG；AUU替换为AUG、CUG或GUG。在一些具体实施方式中，编码人类ND4多肽的核酸是根据通用遗传密码被重新编码的、自然生成的线粒体核酸的序列。

由于遗传密码的退化，许多氨基酸可被多种同义密码子编码(Grantham等人，Nucleic Acids Res.,8(1):r49-r62(1980))。不受理论约束，同义密码子随着不同有机体中的不同频率自然产生。密码子的选择可能会影响蛋白质表达、结构和功能。当表达重组蛋白质时，人们可选择特定密码子来使选定宿主系统中的表达最优化，因此通过考虑优先密码子使用来重新编码。在一些具体实施方式中，通过考虑优先使用哺乳动物细胞密码子来重新编码。在一些具体实施方式中，通过考虑优先使用人类密码子来重新编码。

在一些具体实施方式中，编码人类ND4蛋白质、根据通用遗传密码重新编码并考虑优先使用人类密码子的核酸序列包括核酸序列SEQ ID NO:2 (3’至5’序列)或其反向互补序列SEQ ID NO:15（5’至3’序列）。

在一些具体实施施方式中，编码人类ND4蛋白质、根据通用遗传密码重新编码并考虑优先使用人类密码子的核酸序列包括核酸序列SEQ ID NO:17 (3’至5’序列)或其反向互补序列SEQ ID NO:18（5’至3’序列）。

“载体”指代任意基因要素，如质粒、噬菌体、转位子、粘粒、染色体、病毒、病毒体等，其在与适当的控制要素相关联时能够复制并可在细胞之间传递基因序列。因此，该术语包括克隆和表达载体以及病毒载体。在一些具体实施方式中，载体为DNA载体。在一些具体实施方式中，载体为环状载体(circular vector)。在一些具体实施方式中，载体为质粒。在一些具体实施方式中，载体为双链型。在一些具体实施方式中，载体为单链型。

在一些具体实施方式中，本发明所公开的重组载体为重组病毒载体。在一些具体实施方式中，病毒载体为腺病毒相关病毒(AAV)载体、嵌合AAV载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、DNA病毒载体、单纯性疱疹病毒载体、杆状病毒载体或其任何突变体或衍生体。在一些具体实施方式中，重组病毒载体是重组腺病毒相关病毒(AAV)载体。在一些具体实施方式中，“AAV载体”是指源自腺病毒相关病毒血清型的载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8和AAV-9。AAV载体可具有一个或一个以上被完整或部分删除的AAV野生型基因，例如rep和/或cap基因，同时保留功能性旁侧末端反向重复(ITR)序列。功能性ITR序列对于拯救、复制和包装AAV病毒子是必要的。因此，AAV载体在本发明中被限定为至少包括顺式实现病毒的复制和包装(例如功能性ITRs)的序列。ITRs无需为野生型核苷酸序列，并可通过插入、删除或替换核苷酸来改变，只要这些序列能实现功能性拯救、复制和包装。“AAV载体”还可指代蛋白质外壳或衣壳，它提供了将载体核酸运送至目标细胞的细胞核的有效运输工具。在一些具体实施方式中，重组病毒载体是重组AAV2载体。在一些具体实施方式中，本发明的重组载体为血清2型重组AAV载体(rAAV2/2)。

在一些具体实施方式中，本发明所公开的重组AAV载体包括编码ND4蛋白质的核酸序列以及通过操作连接的基因调整控制序列，包括但不限于启动子、增强子、终止信号。不受理论约束，巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子可实现通过操作连接的核酸序列在细胞中较高的、持续性表达水平。在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV载体包括巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子。不受理论约束，整合入重组核酸序列或转基因中的内含子序列可稳定mRNA水平并增强通过操作连接的核酸序列的表达。在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV2载体包括源自内含子序列的β球蛋白(HBB2)。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV2载体是重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)，其在含有内含子的表达盒(β球蛋白内含子，HBB2)中在巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子的控制下编码人类NADH去氢酶4(ND4)并进一步包括来自AAV2/2的病毒末端反向重复(ITRs)(图1)。在一些具体实施方式中，CMV启动子包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:25。在一些具体实施方式中，HBB2内含子包括SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:24。在一些具体实施方式中，ITR序列包括SEQ ID NO:6、7、26或27。

表2：根据本发明的各种具体实施方式的序列

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV2载体包括为在人类细胞中更好的表达而优化密码子的人类ND4编码序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV载体为编码人类NADH去氢酶4(ND4)的基因的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

(i)包括SEQ ID No:1的3’UTR Cox10序列；

(ii)包括SEQ ID No:2的ND4编码序列；

(iii)包括SEQ ID No:3的MTS Cox10序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV载体为编码人类NADH去氢酶4(ND4)的基因的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

（i）由SEQ ID No:1组成的3’UTR Cox10序列；

（ii）由SEQ ID No:2组成的ND4编码序列；

（iii）由SEQ ID No:3组成的MTS Cox10序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV载体为编码人类NADH去氢酶4(ND4)的基因的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

(i)包括SEQ ID No:1的3’UTR Cox10序列；

(ii)包括SEQ ID No:17的ND4编码序列；

(iii)包括SEQ ID No:3的MTS Cox10序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV载体为编码人类NADH去氢酶4(ND4)的基因的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

(i)由SEQ ID No:1组成的3’UTR Cox10序列；

(ii)由SEQ ID No:17组成的ND4编码序列；

(iii)由SEQ ID No:3组成的MTS Cox10序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV载体为编码人类NADH去氢酶4(ND4)的基因的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

(i)包括SEQ ID No:14的3’UTR Cox10序列；

(ii)包括SEQ ID No:15的ND4编码序列；

(iii)包括SEQ ID No:16的MTS Cox10序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV载体为编码人类NADH去氢酶4(ND4)的基因的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

(i)由SEQ ID No:14组成的3’UTR Cox10序列；

(ii)由SEQ ID No:15组成的ND4编码序列；

(iii)由SEQ ID No:16组成的MTS Cox10序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV载体为编码人类NADH去氢酶4(ND4)的基因的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

(i)包括SEQ ID No:14的3’UTR Cox10序列；

(ii)包括SEQ ID No:18的ND4编码序列；

(iii)包括SEQ ID No:16的MTS Cox10序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV载体为编码人类NADH去氢酶4(ND4)的基因的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

（i）由SEQ ID No:14组成的3’UTR Cox10序列；

（ii）由SEQ ID No:18组成的ND4编码序列；

（iii）由SEQ ID No:16组成的MTS Cox10序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV载体为编码人类NADH去氢酶4(ND4)的基因的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

(i) 如下的3’UTR Cox10序列：

(ii) 如下的ND4编码序列：

(iii) 如下的MTS Cox10序列：

(iv) 如下的HBB2内含子序列：

(v) 如下的CMV启动子序列：

(vi) 如下的ITR序列：

(vii) 如下的ITR序列：

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV载体为编码人类NADH去氢酶4(ND4)的基因的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

(i)包括SEQ ID No:1的3’UTR Cox10序列；

(ii)包括SEQ ID No:17的ND4编码序列；

(iii)包括SEQ ID No:3的MTS Cox10序列；

(iv)包括SEQ ID No:4的HBB2内含子序列；

(v)包括SEQ ID No:5的CMV启动子序列；

(vi)包括SEQ ID No:6的ITR序列；和

(vii)包括SEQ ID No:7的ITR序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV载体为编码人类NADH去氢酶4(ND4)的基因的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

(i)包括SEQ ID No:14的3’UTR Cox10序列；

(ii)包括SEQ ID No:15的ND4编码序列；

(iii)包括SEQ ID No:16的MTS Cox10序列；

(iv)包括SEQ ID No:24的HBB2内含子序列；

(v)包括SEQ ID No:25的CMV启动子序列；

(vi)包括SEQ ID No:26的ITR序列；和

(vii)包括SEQ ID No:27的ITR序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV载体为编码人类NADH去氢酶4(ND4)的基因的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

(i)包括SEQ ID No:14的3’UTR Cox10序列；

(ii)包括SEQ ID No:18的ND4编码序列；

(iii)包括SEQ ID No:16的MTS Cox10序列；

(iv)包括SEQ ID No:24的HBB2内含子序列；

(v)包括SEQ ID No:25的CMV启动子序列；

(vi)包括SEQ ID No:26的ITR序列；和

(vii)包括SEQ ID No:27的ITR序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组载体进一步包括：

(i)包括SEQ ID NO:4的HBB2内含子序列；

(ii)包括SEQ ID NO:5的CMV启动子序列；

(iii)包括SEQ ID NO:6的ITR序列；和

(iv)包括SEQ ID NO:7的ITR序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组载体进一步包括：

(i)由SEQ ID NO:4组成的HBB2内含子序列；

(ii)由SEQ ID NO:5组成的CMV启动子序列；

(v)由SEQ ID NO:6组成的ITR序列；和

(vi)由SEQ ID NO:7组成的ITR序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组载体进一步包括：

(i)包括SEQ ID NO:24的HBB2内含子序列；

(ii)包括SEQ ID NO:25的CMV启动子序列；

(iii)包括SEQ ID NO:26的ITR序列；和

(iv)包括SEQ ID NO:27的ITR序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组载体进一步包括：

(i)由SEQ ID NO:24组成的HBB2内含子序列；

(ii)由SEQ ID NO:25组成的CMV启动子序列；

(iii)由SEQ ID NO:26组成的ITR序列；和

(iv)由SEQ ID NO:27组成的ITR序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组载体为编码ND4蛋白质的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

- 包括SEQ ID No:14的3’UTR Cox10序列；

- 编码ND4多肽、包括SEQ ID No:13的核酸序列；和

- 编码MTS Cox10多肽序列、包括SEQ ID No:11的核酸序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组载体为编码ND4蛋白质的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

- 包括SEQ ID No:14的3’UTR Cox10序列；

- 编码ND4多肽、包括SEQ ID No:13的核酸序列；和

- 编码MTS Cox10多肽序列、包括SEQ ID No:12的核酸序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组载体为编码ND4蛋白质的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

- 包括SEQ ID No:1的3’UTR Cox10序列；

- 编码ND4多肽、包括SEQ ID No:13的核酸序列；和

- 编码MTS Cox10多肽序列、包括SEQ ID No:11的核酸序列。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组载体为编码ND4蛋白质的重组腺病毒相关病毒(AAV)血清2型(rAAV2/2)并且包括：

- 包括SEQ ID No:1的3’UTR Cox10序列；

- 编码ND4多肽、包括SEQ ID No:13的核酸序列；和

- 编码MTS Cox10多肽序列、包括SEQ ID No:12的核酸序列。

表3根据本发明的各种具体实施方式的序列

如启动子、内含子或ITR的序列对于本领域的普通技术人员是熟知的，这些技术人员可以轻易地将这些序列替换为本领域内已知的其它要素。

根据本发明的重组载体有助于治疗莱伯遗传性视神经视网膜病变(LHON)，包括ND4相关LHON。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组载体通过玻璃体内注射施用至需要治疗的患者。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组载体通过单玻璃体内注射施用至需要治疗的患者。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组病毒载体施用至需要治疗的患者的剂量为每眼一剂或一剂以上的约10

本发明的一个方面涉及可在一些具体实施方式中被用于制备根据本发明的重组AAV2载体的pAAV-ND4转移质粒。

在一些具体实施方式中，根据本发明的pAAV-ND4转移质粒包括以下功能性要素和序列：

3’UTR Cox10：nt 11-605 = 595 bp

编码序列ND4：nt 618-1997 = 1380bp

MTS Cox10：nt 1998-2081 = 84 bp

HBB2内含子：nt 2124-2616 = 493 bp

CMV启动子：nt 2624-3283 = 660bp

ITR：nt 3327-3454 = 128 bp

F1起点：nt 3872-4327 = 456 bp

Kana R基因：nt 4482-5273 = 792 bp

COLE1起点：nt 5488-6102 = 615 bp

ITR：nt 6324-6453 = 130 bp。

表4：pAAV-ND4质粒的一个具体实施方式内的标记区域

在一些具体实施方式中，根据本发明的pAAV-ND4转移质粒包括：

(i)3’UTR Cox10序列：SEQ ID No:1；

(ii)ND4编码序列：SEQ ID No:2；

(iii)MTS Cox10序列：SEQ ID No:3；

(iv)HBB2内含子序列：SEQ ID No:4；

(v)CMV启动子序列：SEQ ID No:5；

(vi)ITR序列：SEQ ID No:6；和

(vii)ITR序列：SEQ ID No:7。

在一些具体实施方式中，根据本发明的pAAV-ND4转移质粒包括：

(i)3’UTR Cox10序列：SEQ ID No:1；

(ii)ND4编码序列：SEQ ID No:17；

(iii)MTS Cox10序列：SEQ ID No:3；

(iv)HBB2内含子序列：SEQ ID No:4；

(v)CMV启动子序列：SEQ ID No:5；

(vi)ITR序列：SEQ ID No:6；和

(vii)ITR序列：SEQ ID No:7。

在一些具体实施方式中，根据本发明的pAAV-ND4转移质粒包括：

(i)3’UTR Cox10序列：SEQ ID No:14；

(ii)ND4编码序列：SEQ ID No:15；

(iii)MTS Cox10序列：SEQ ID No:16；

(iv)HBB2内含子序列：SEQ ID No:24；

(v)CMV启动子序列：SEQ ID No:25；

(vi)ITR序列：SEQ ID No:26；和

(vii)ITR序列：SEQ ID No:27。

在一些具体实施方式中，根据本发明的pAAV-ND4转移质粒包括：

(i)3’UTR Cox10序列：SEQ ID No:14；

(ii)ND4编码序列：SEQ ID No:18；

(iii)MTS Cox10序列：SEQ ID No:16；

(iv)HBB2内含子序列：SEQ ID No:24；

(v)CMV启动子序列：SEQ ID No:25；

(vi)ITR序列：SEQ ID No:26；和

(vii)ITR序列：SEQ ID No:27。

在一些具体实施方式中，根据本发明的pAAV-ND4转移质粒包括：

（SEQ ID NO:22）。

在一些具体实施方式中，根据本发明的pAAV-ND4转移质粒包括以下功能性要素和序列：

3’UTR Cox10：nt 11-605 = 595 bp

编码序列ND4：nt 618-1997 = 1380bp

MTS Cox10：nt 1998-2081 = 84 bp

HBB2内含子：nt 2124-2616 = 493 bp

CMV启动子：nt 2624-3283 = 660bp

ITR：nt 3327-3454 = 128 bp

F1起点：nt 3827-4282 = 456 bp

Kana R基因：nt 4437-5228 = 792 bp

COLE1起点：nt 5443-6057 = 615 bp

ITR：nt 6279-6408 = 130 bp。

表5：pAAV-ND4质粒的一个具体实施方式内的标记区域

在一些具体实施方式中，根据本发明的pAAV-ND4转移质粒包括：

在一些具体实施方式中，根据本发明的pAAV-ND4转移质粒包括用于实现抗生素选择的抗卡那霉素基因。在一些具体实施方式中，根据本发明的pAAV-ND4转移质粒包括用于实现质粒复制的f1复制起点序列。在一些具体实施方式中，根据本发明的pAAV-ND4转移质粒包括用于实现质粒复制的ColE1复制起点序列。

因此，在一些具体实施方式中，根据本发明的pAAV-ND4转移质粒进一步包括：

（i）f1复制起点序列，其包括：

（ii）抗卡那霉素基因序列，其包括：

（iii）ColE1复制起点序列，其包括：

根据本发明的pAAV-ND4转移质粒的生成可利用本领域内已知的合适基因工程技术来实现(参见Green等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第4版，ColdSpring Harbor Press,(2012))。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组AAV载体是通过在暂时性包装细胞系中与以下对象进行三重转染生成：(i)根据本发明的pAAV-ND4转移质粒(例如图2所示的)、(ii)向宿主细胞提供为合成涉及生成AAV2/2颗粒所必需的蛋白质(例如作为非限定性示例的酶和结构性蛋白质)进行编码的遗传物质的rep/cap质粒和(iii)提供辅助功能以诱发rep/cap基因表达的腺病毒辅助质粒。

在一些具体实施方式中，包装细胞系包括人类胚胎肾脏293(HEK 293)细胞系。

在一些具体实施方式中，rep/cap质粒为pRep2Cap2质粒。在一些具体实施方式中，rep/cap质粒为包括以下要素的pRep2Cap2质粒(图3)：

i. 来自AAV2/2血清型的rep序列(nt 281-2212, 1932 bp)；

ii. 来自AAV2/2血清型的cap序列(nt 2163-4370, 2208 bp)；

iii. 抗卡那霉素基因(nt 5712-6506, 互补性；795 bp)；及

iv. 原核复制起点(nt 4896-5496; 601 bp)和噬菌体复制起点f1(nt 6658-7113；456bp)。

在一些具体实施方式中，腺病毒辅助质粒为pXX6质粒。在一些具体实施方式中，腺病毒辅助质粒为包括以下要素的pXX6质粒(图4)：

i. 腺病毒ITRs: (nt 1-85和18638-18732)；

ii. 抗卡那霉素基因(nt 1402-2196,795 bp)；

iii. 原核复制起点(nt 2411-3025; 615 bp)和噬菌体复制起点f1(nt 795-1250；456bp)；及

iv.13 条特异性腺病毒序列(从VA1 RNA序列到E4orf2序列，nt 4259-17916)。

患有LHON并用本发明所公开的重组载体治疗的患者可获得治疗效果，例如视敏度的改善。本发明所用的“治疗”的定义为对有疾病、症状或患病倾向的患者应用或施用治疗剂，以治愈、治疗、减轻、缓解、改变、救治、改进、改善或影响疾病、一种或一种以上症状或患病倾向。只要根据本发明的组合物相较于未接受治疗的症状能够单独或与另一种治疗剂一起治愈、治疗、减轻、缓解、改变、救治、改进、改善或影响被治疗的LHON的至少一种症状，其结果就被视为治疗了相关障碍，无论是否该障碍的所有症状被治愈、治疗、减轻、缓解、改变、救治、改进、改善或影响。可利用“有效量”的治疗剂来实现治疗，这应当被理解为包括部分或完全治疗，例如部分或完全治愈、治疗、减轻、缓解、改变、救治、改进、改善或影响疾病、一种或一种以上症状或患病倾向。“有效量”可以经验为主来确定。类似的，“治疗有效量”为用于达到标称治疗效果所需的浓度或。

在一个具体实施方式中，“治疗”包括向需要治疗的动物(包括人类)施用有效剂量或有效多剂量的包括本发明所公开的核酸、载体、重组病毒或药物组合物的组合物。如果在障碍/疾病发展之前施用制剂，该施用即为预防性的。如果在障碍/疾病发展之后施用制剂，该施用即为治疗性的。在具体实施方式中，有效剂量是可检测地缓解(消除或减少)与被治疗的障碍/疾病状态相关的至少一个症状、减缓或防止进展至障碍/疾病状态、减缓或防止障碍/疾病状态的进展、减轻疾病的程度、导致疾病(部分或全部)退行和/或延长生存的剂量。该术语包括但不要求完全治疗(即治愈)和/或预防。

在一些具体实施方式中，施用的重组载体的滴定量以病毒基因组(vg)来测定。在一些具体实施方式中，施用的重组载体的滴定量通过量化聚合酶链反应(qPCR)来测定。在一些具体实施方式中，施用的重组载体的滴定量通过微滴式数字PCR(ddPCR)来测定。在一些具体实施方式中，重组AAV载体在玻璃体内施用，施用量为每眼约10

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组载体，例如编码人类NADH去氢酶4(ND4)基因的AAV血清2型(rAAV)，包括：

- 包括SEQ ID NO:1的3’UTR Cox10序列；

- 编码ND4多肽、包括SEQ ID NO:13的核酸序列；和

- 编码MTS Cox10多肽、包括SEQ ID NO:11的核酸序列，

以有效剂量被施用给需要治疗的患者。在一些具体实施方式中，患者患有LHON。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组载体，例如编码人类NADH去氢酶4(ND4)基因的AAV血清2型(rAAV)，包括：

- 包括SEQ ID NO:1的3’UTR Cox10序列；

- 编码ND4多肽、包括SEQ ID NO:13的核酸序列；和

- 编码MTS Cox10多肽、包括SEQ ID NO:12的核酸序列，

以有效剂量被施用给需要治疗的患者。在一些具体实施方式中，患者患有LHON。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组载体，例如编码人类NADH去氢酶4(ND4)基因的AAV血清2型(rAAV)，包括：

- 包括SEQ ID NO:14的3’UTR Cox10序列；

- 编码ND4多肽、包括SEQ ID NO:13的核酸序列；和

- 编码MTS Cox10多肽、包括SEQ ID NO:11的核酸序列，

以有效剂量被施用给需要治疗的患者。在一些具体实施方式中，患者患有LHON。

在一些具体实施方式中，根据本发明的重组载体，例如编码人类NADH去氢酶4(ND4)基因的AAV血清2型(rAAV)，包括：

- 包括SEQ ID NO:14的3’UTR Cox10序列；

- 编码ND4多肽、包括SEQ ID NO:13的核酸序列；和

- 编码MTS Cox10多肽、包括SEQ ID NO:12的核酸序列，

以有效剂量被施用给需要治疗的患者。在一些具体实施方式中，患者患有LHON。

LHON的发病可通过存在的症状来确定。在一些具体实施方式中，重组载体被施用至发病短于9个月(例如6-9个月、3-6个月或1-3个月)的患者。在一些具体实施方式中，重组载体被施用至发病超过9个月(例如12个月、2年或3年)的患者。在一些具体实施方式中，患者显示出LHON的一个或一个以上症状，例如视敏度丧失。

测定患者视敏度的标度可被表达为最小分辨角(MAR)的(十进制)对数(BaileyIL, Lovie JE. I，Am. J. Optom. Physiol. Opt., 53(11): 740-745(1976))。LogMAR标度将传统图标的等比序列转化为线性标度。它测定视敏度的丧失：正值表示视力丧失，而负值则代表视敏度正常或较好。在一些具体实施方式中，LHON患者的视敏度以LogMar标度来测定。在一些具体实施方式中，LHON患者的视敏度以斯内伦标度（Snellen Scale）来测定。

另一个常用的视敏度测定方法为早期治疗糖尿病视网膜病变研究(ETDRS)视敏度检查表，其能够将视敏度量化至非常低的视力水平(Ferris等人，Am. J. Opthalmol.,94:91-96(1982))。在一些具体实施方式中，LHON患者的视敏度通过ETDRS检查表来测定。

通过同一视野内的目标和其它目标颜色和亮度的差异来确定对比度。LHON患者可能具有更低的对比敏感度。另一个测定视敏度的标度可以为Pelli-Robson对比敏感度检查表(Pelli等人，Clin. Vision Sci.,2(3),187-199（1988）)。在一些具体实施方式中，LHON患者的视敏度通过Pelli Robson检查表来测定。

在一些具体实施方式中，接受治疗的患者的治疗前视敏度为例如基线值、<2.0LogMAR，例如<1.8、<1.6、<1.4、<1.2、<1.0或<0.8 LogMAR。在一些具体实施方式中，接受治疗的患者的治疗前视敏度为例如基线值、至少3个字母，例如至少4、5、6、7、8、9、10、11或12个字母。

可通过疾病症状的退行或改善来测定疗效或对治疗的应答。在一些具体实施方式中，在施用治疗前测定基线视敏度。在一些具体实施方式中，通过视敏度的提升来测定疗效或对治疗的应答。在一些具体实施方式中，通过治疗后视敏度相较于治疗前基线值的提升来测定疗效或对治疗的应答。在一些具体实施方式中，通过治疗前后ETDRS分数之间的差异来测定疗效或对治疗的应答。在一些具体实施方式中，通过治疗后相较于基线值至少为+5.0的ETDRS分数差异-例如至少+6.0、+7.0、+8.0、+9.0、+10.0、+11.0、+12.0、+13.0、+14.0、+15.0或+16.0的分数差异-来测定疗效或对治疗的应答。在一些具体实施方式中，通过治疗后相较于基线值至少为0.05 logMAR-例如至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0 LogMAR-的差异来测定疗效或对治疗的应答。

如本发明所公开的并且不受理论约束，应答于用根据本发明的重组载体进行治疗的患者(例如观察到视敏度提升的患者)可包括基线患病时长(例如视力丧失)短于9个月(例如6-9个月)并且基线视敏度<1.6 LogMAR的患者。在一些具体实施方式中，标准(例如通过视力丧失测定的基线患病时长为短于9个月和/或基线视敏度为<1.6 LogMAR)可被用于辨别对利用根据本发明的重组载体治疗预期应答较好的患者亚群体(例如可期待视敏度提升的患者群体)。

本发明进一步描述了编码人类NADH去氢酶4(ND4)多肽并包括(i)编码MTS Cox10序列、包括SEQ ID NO:11的核酸序列、(ii)编码NADH去氢酶4(ND 4)多肽、包括SEQ ID NO:13的核酸序列和(iii)包括SEQ ID NO:14(或其反向互补SEQ ID NO:1)的3’UTR Cox10序列的重组载体在治疗(i)基线患病时长短于9个月(例如6-9个月)和/或(ii)基线视敏度小于1.6 LogMAR的患者组的莱伯遗传性视神经视网膜病变(LHON)中的用途。

本发明还描述了治疗(i)基线患病时长短于9个月(例如6-9个月)和/或(ii)基线视敏度小于1.6 LogMAR的LHON患者的方法，该方法包括施用有效量的编码人类NADH去氢酶4(ND4)多肽并包括(i)编码MTS Cox10序列、包括SEQ ID NO:11的核酸序列、(ii)编码NADH去氢酶4(ND 4)多肽、包括SEQ ID NO:13的核酸序列和(iii)包括SEQ ID NO:14(或其反向互补SEQ ID NO:1)的3’UTR Cox10序列的重组载体。

通过以下实施例进一步对本发明进行例举，但这些实施例不应被解释为具有限制性。本申请中引用的所有对比文件、专利和已公开专利申请的内容以及附图在此以引用方式完整纳入本申请用于所有目的。

实施例1

调查了本发明所公开的包括含有人类线粒体ND4基因(rAAV2/2-ND4)的重组腺病毒相关病毒(AAV)载体（血清2型）（“载体A”）在患有莱伯遗传性视神经视网膜病变(LHON)的患者身上的安全性和疗效。

参加研究的患者视力丧失时长大于6个月，不超过一年。参加的受试者在ND4基因中具有已确认的G11778A突变。参加的受试者的基线视力大于或等于数指(CountFingers)。

患者各有一眼被随机选定接受单次注射载体A，而另一只眼接受假手术注射。在第一患者组中，右眼(OD)用载体A治疗，而左眼(OS)则进行假手术处理。在第二患者组中，右眼(OD)进行假手术处理，而左眼(OS)则用载体A治疗。

通过玻璃体内注射含有9x10

对用载体A治疗的眼睛和假手术处理的眼睛之间的源自第48周治疗后患者在ETDRS检查表上读出的字母数量的LogMAR敏锐度在基线(研究前)点到第48周的变化进行对比。在单独的对比模式中，在随机化之前基于视力检测结果在访问1确定每个患者视力更好的眼睛。对接受了载体A的视力更好的眼睛与接受了假手术注射的视力更好的眼睛进行对比。对视力更差的眼睛也进行了类似的分析。如本领域普通技术人员将会理解的那样，ETDRS(早期治疗糖尿病视网膜病变研究)是能够将视敏度量化至非常低视力水平的视敏度测定方法。

如本领域普通技术人员将会理解的那样，MAR指代可识别的最小字母笔划宽度的最小分辨角(以弧分为单位)。MAR的对数(LogMAR)以及作为非限定性实施例的LogMAR检查表被用于确定视敏度(Johnston, A.,Association of Contact Lens ManufacturersYear Book 2011-2016, pp. 38-39(2016))。

基线患者的人口统计特征已列在表6中。

表6

SD：标准偏差，VLD：视力丧失时长。

与患者基线视敏度相关的数据已列在表7中。

表7

在48周中，报告了载体A的有利安全性特性。75%的不利事件(AEs)都是眼部的。50%的眼部AEs与载体A有关，而48%的眼部AEs与过程有关。最常见的眼部AEs包括前房炎症(15%)、玻璃体炎(9%)、点状角膜炎(9%)和眼压增高(8%)。

在48周中，tRNFL(颞侧视网膜神经纤维层)/PM(乳头黄斑)束厚度在受治疗眼睛中得到极大地保留，而在未受治疗眼睛有所减少。从基线到第48周颞侧象限RNFL的变化相关的数据已提供在表8中。

表8

在48周中，GCL(神经节细胞层)体积在受治疗眼睛中得到极大保留，在未受治疗眼睛中则有所减少。至少这些结果表明载体A生物目标被成功接触。与从基线到第48周GCL体积和地形图的变化相关的数据已在表9中提供。

表9

在48周中，观察到双眼的视敏度都有改善(平均为-0.21 LogMAR)。与从基线到第48周LogMAR的变化相关的数据提供在表10中。没有观察到受治疗和未受治疗眼睛之间存在显著的统计学差异。

表10

在48周中，利用Humphrey®视野分析进行视野检测(平均偏差和中央凹阈值)。与视野检测相关的数据提供在表11和表12中。没有观察到受治疗和未受治疗眼睛之间存在差异。

表11

表12

在48周中，利用Pelli-Robson检查表评估对比敏感度(亦见图5)。在基线处，受治疗的眼睛的对比敏感度更差(通过LogMAR视敏度来确定)。在第48周，用载体A治疗的眼睛的对比敏感度的测定值差不多翻倍，而假手术处理的眼睛的对比敏感度的测定值保持稳定。与利用Pelli-Robson检查表评估的对比敏感度相关的数据提供在表13中。

表13

利用Farnsworth-Munsell 100-hue色相测试来检测色觉。在基线处，观察到极差的辨色分数。在第48周，没有观察到受治疗和未受治疗眼睛之间的差异。与测试色觉相关的数据已呈现在表14中。

表14

在第48周利用视觉功能性问卷-25(VFQ-25)来评估生活质量。来自选定的子量表的数据已呈现在表15中。虽然分数之间的分数差异小，对患者视力较差的眼睛的治疗看起来导致了改善的生活质量指标。在问卷的所有选择中都观察到此类趋势。

表15

进一步分析研究数据以辨别对载体A治疗应答特别好的患者群体(例如观察到视敏度提升的患者)。

用载体A治疗的合表视力最好的眼睛以及假手术处理的合表视力最好的眼睛的视敏度相对于基线的变化相关的数据已呈现在表16中。“合表”指代可阅读ETDRS检查表上至少三个字母和/或视敏度低于1.6 LogMAR的受试者。

表16

测定ETDRS相对于基线的变化的差异。如表17所示，合表视力最好的眼睛组的此种差异比所有合表眼睛组的此种差异更大(+6.1对+4.5)。

表17

在第48周测试的视敏度有提升的合表载体A治疗眼睛组中，75%(12/16)的基线患病时长为6-9个月，而25%(4/16)的基线患病时长为9-12个月(参阅表18)。在第48周测试的视敏度有提升的合表假手术处理眼睛中，50%(8/16)的基线患病时长为6-9个月，而50%(8/16)的基线患病时长为9-12个月。

表18

在进一步分析中，“应答”指代合表患者的视敏度的改善为至少0.25 LogMAR(+12.5 ETDRS等效分数)。如表19所示，所有用载体A治疗的合表眼睛中的24%和所有假手术处理的合表眼睛中的14.3%被表征为“应答眼”。

表19

在进一步分析中，“应答”指代合表患者的视力最好的眼睛的视敏度的改善为至少0.25 LogMAR(+12.5 ETDRS等效分数)。如表20所示，所有用载体A治疗的视力最好的合表眼睛中的25.0%和所有假手术处理的视力最好的合表眼睛中的5.6%被表征为“应答眼”。

表20

利用广义估计方程(GEE)模型来进一步分析研究数据以评估载体A治疗在达到20/200视敏度端点的效果。结果显示用载体A治疗的眼睛比假手术处理的眼睛明显更可能达到20/200视敏度端点(

在基线法定失明的眼睛的数量以及在基线时失明的眼睛数量中从法定失明获救的眼睛的数量相关的数据呈现在表21中。在上下文中，法定失明的眼睛被定义为比20/200更差的视敏度。

表21

研究数据的分析表明对载体A治疗应答更好的患者组(例如观察到视敏度提升的患者)包括基线患病时长(例如视力丧失)短于9个月(例如6-9个月)和/或基线视敏度<1.6LogMAR的患者。因此，在一些具体实施方式中，这些标准(基线患病时长(例如视力丧失)短于9个月(例如6-9个月)和/或基线视敏度<1.6 LogMAR)可被用于识别载体A治疗期待应答更好的患者亚群体(例如可期待视敏度提升的患者群体)。

实施例2

试验分析了单次玻璃体内注射载体A(rAAV2/2-ND4)在研究治疗前因11778-ND4莱伯遗传性视神经视网膜病变(LHON)导致视力丧失6-12个月的37名受试者身上的安全性和疗效。第96周是试验安排的资料解析(readouts)的最后一周，在数据披露时标记该时间，提供获取单独患者资料的途径。

在第96周，用载体A治疗的眼睛显示的相对于基线的平均改善为-0.308 LogMAR，等同于ETDRS视力检查表的+15.4 ETDRS字母或3行(图6)。这种有临床意义的视敏度改善水平保持至第72周仍能观察到(+14.7 ETDRS字母等效分数)。如第48周和第72周的资料解析所示的，假手术处理的眼睛的最佳矫正视敏度(BCVA)以相对平行的轨迹延伸，在第96周达到的平均改善为相对于基线-0.259LogMAR，或+12.9 ETDRS字母等效分数的收益。虽然幅度较低，但假手术处理的眼睛的平均BCVA改善与用载体A治疗的眼睛并没有显著的统计学差异。

与自然历史一致，受试者经受了低视敏度的初始点或最低点。该最低点被定义为截至测定周通过logMAR测定的最低治疗后BCVA。试验受试者的眼睛明显恢复。到第96周为止，用载体A治疗的眼睛相对于最低点已经能认出+28以上的字母。

表22：通过在ETDRS字母等效分数、平均值和标准偏差值的从最低点的差异测定的BCVA从最低点的恢复

在第96周，在Pelli-Robson检查表上测定的低对比视敏度显示了对用载体A治疗的眼睛和假手术处理的眼睛相似的改善趋势。假手术处理和用载体A治疗的眼睛的轨迹并没有向BCVA那样追踪彼此。平均对比敏感度显示了在试验过程中更有力的相对于基线的改善(图7)。

在第96周达到相较于基线至少-0.2 LogMAR或+10 ETDRS字母等效分数改善的用载体A治疗的眼睛的比例在统计学上显著高于对应的假手术处理眼睛的比例(65%对46%，p值=0.0348)。用载体A治疗的眼睛还显著地比假手术处理的眼睛更可能达到治疗成功的另一个测定值-在第96周比合表基线敏锐度改善至少15个ETDRS字母或者在第96周避免达到美国法定失明阈值20/200(32%对16%，p=0.0196)。

基于广义估计方程(GEE)模型，用载体A治疗的眼睛达到或高于20/200的可能性是假手术处理的眼睛的2.8倍(p=0.0094)。在只考虑严格高于阈值的眼睛时，优势比提升至3.6(p=0.0032)。

另外，68%的试验对象在第96周至少有一只眼睛达到了自发的“临床相关恢复(CRR)”,其定义为(a)相对于合表视敏度改善至少10个ETDRS字母或(b)从未合表视敏度改善至能够读取至少5个ETDRS字母。用载体A治疗的眼睛显著地比假手术处理的眼睛更可能达到该目标(62%对43%，p=0.0348)。在对比中，在先前的自然历史研究中，具有相同11778A突变的患者仅有15%达到CRR。

谈到生活质量，视觉功能的改善反映在国家眼科研究院视觉功能问卷-25(NEIVFQ-25)调查的分数中，这是一种经过验证的、由试验对象完成的仅与视力相关的生活质量的评估手段。如表23所示，平均综合分数和相关子量表分数的均值继续相对于基线有所改善，特别是进行远近视力活动（near and distance activities）的能力。平均子量表分数相对于基线的提升超过了与其它眼部疾病中BCVA改善15个字母相关的平均子量表分数。

表23：患者报告的生活质量分数的有意义的改善(NEI VFQ-25)-相对于基线的平均变化(绝对分数和百分比)

结构指标表明用GS010治疗的眼睛保持了之前在神经节细胞体积的资料解析中达到的稳定性。差异性的疗效在之前的资料解析中更加明显。

序列表

<110> 珍视生物股份公司(GENSIGHT BIOLOGICS SA)

<120> 重组AAV载体及其使用方法

<130> 12295.0008-00304

<150> 62/683,501

<151> 2018-06-11

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 595

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

aacatgtgga atccccagtc ccagtgcaca gcagccgggt cctagctatt ggtattgtta 60

gaaggactat ggttgagaat gtgtggggtg gggaaaacca aaaatgcagg ccctggctca 120

gtcaccagga agggggtgct ccgaggcctt tgagggacct gagctcacag aactacagac 180

agcagatcat gaggctcaca ctttctggcc accaagtgcc actctgctgg gcatgtggag 240

tgtgcgtgtg gtgtggtggt aaggatggaa ccaaaagagg aagctgtgta tgtgtacccc 300

catgtgagga ggaagaaaca gaatagaggg tggggttgga ggagagatgt ataaagaccc 360

tcaaagggaa aaataattcc ttttttgtat tcactgactg agctgatgca tttcttattt 420

ggggagcatt ttgggtaata tttaaaaaaa aaaaaaactg tcaagtgatc actgggcacc 480

gaattcgttt ataatcttgt tctaaaccca gcaatttctc ttcttgtgtt ccagaattac 540

cacaacatgc tcgcctggca gcggagggaa aggggcggtg ggcgtcccag tgctc 595

<210> 2

<211> 1374

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atgagaaacc agtgataatg tctgggttca gggacagcag caggatggga gacagatgca 60

taaacatcag ggtgttctct ctggtgaatg agggcttcat gttattaatg tggtgagtca 120

gtgagcccca ctgggtagtg gtaaacatgt acaggctgta gagggctgtg accagcatgt 180

tcagtcctgt caggagcagg gtgatgttgc tccaggagaa tgttgtcacc agcactgaca 240

gctctcccag caggttaatt gtagggggca gagccaggtt ggccagacta gccaggagcc 300

accagaaagc catcagtggg agcagggtct ggagcccctg actcaggatc ataattcttg 360

agtgagttct ttcatagttg ctatttgcca ggcagaacag gaggctgctg gtcagcccat 420

gagcaatcat gaggatcact gccccagtaa aggaccaggg tgtctgaatc agaatggcag 480

tcaccaccag tgccatgtgg ctgatggagc tgtaagcaat caggctcttg aggtcagtct 540

gcctgagaca gatggagctg gtcatgatca taccccagag gctcagaacc aggaaagggt 600

aagccatgtg ctttgtcaga gggttcagga tcagggtgag cctcatcata ccataaccac 660

ccagcttcag gaggacagca gccaggacca tggagccagc tattggagct tccacatgag 720

ccttggggag ccagaggtgc aggccataga ggggcatctt caccataaag gccattgtat 780

aagccagcca catcaggttg tttgcccagg agttactcag ctcctgggca gtcagagtca 840

gcaggaggat gttcaggcta cccagtgtgt tgtgggtata gatcagtgca atcagcaggg 900

gcagtgagcc caccagtgta taaaagagaa agtaggtgcc tgcattcagc ctctcaggct 960

gatttcccca cctagtgatg atggccaggg ttgggatgag agtggtctca aagaagatat 1020

agaacatgat cagctcagtg gctgtgaagg tcataatcag gctgatttgc aggctaatga 1080

gcatggacag gtacagcttt ttccttgaca gaggctctga gctgaggtgc ctctgactgg 1140

ccatgatagt cagaggcagc agccatgtgg tcagcatgag caggggggtt gtcaggggat 1200

cagaggaaaa ggtaggggag catgaaaaga ggttattatt aatctggttg aaaaacagca 1260

gtgggatgat gctgataatc aggctgtggg ttgtggtgtt aatccaaatc atgtgctttt 1320

tgctcagcca tgtgagaggc agcagcatga tggttggcac aatcagcttc agca 1374

<210> 3

<211> 84

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

agtcctcctt tccaggtacc acacactccc ccccacacag ccagtcagga gcctggatga 60

cagtgtatgg gggctggcag ccat 84

<210> 4

<211> 398

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

aattctttgc caaagtgatg ggccagcaca cagaccagca cgttgcccag gagctgtggg 60

aggaagataa gaggtatgaa catgattagc aaaagggcct agcttggact cagaataatc 120

cagccttatc ccaaccataa aataaaagca gaatggtagc tggattgtag ctgctattag 180

caatatgaaa cctcttacat cagttacaat ttatatgcag aaatatttat atgcagaaat 240

attgctattg ccttaaccca gaaattatca ctgttattct ttagaatggt gcaaagaggc 300

atgatacatt gtatcattat tgccctgaaa gaaagagatt agggaaagta ttagaaataa 360

gataaacaaa aaagtatatt aaaagaagaa agcatttt 398

<210> 5

<211> 654

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

ggaggctgga tcggtcccgg tgtcttctat ggaggtcaaa acagcgtgga tggcgtctcc 60

aggcgatctg acggttcact aaacgagctc tgcttatata gacctcccac cgtacacgcc 120

taccgcccat ttgcgtcaat ggggcggagt tgttacgaca ttttggaaag tcccgttgat 180

tttggtgcca aaacaaactc ccattgacgt caatggggtg gagacttgga aatccccgtg 240

agtcaaaccg ctatccacgc ccattgatgt actgccaaaa ccgcatcacc atggtaatag 300

cgatgactaa tacgtagatg tactgccaag taggaaagtc ccataaggtc atgtactggg 360

cataatgcca ggcgggccat ttaccgtcat tgacgtcaat agggggcgta cttggcatat 420

gatacacttg atgtactgcc aagtgggcag tttaccgtaa atactccacc cattgacgtc 480

aatggaaagt ccctattggc gttactatgg gaacatacgt cattattgac gtcaatgggc 540

gggggtcgtt gggcggtcag ccaggcgggc catttaccgt aagttatgta acgcggaact 600

ccatatatgg gctatgaact aatgaccccg taattgatta ctattaataa ctag 654

<210> 6

<211> 128

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgc 128

<210> 7

<211> 130

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct 130

<210> 8

<211> 456

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg 60

ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 120

cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 180

gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc 240

catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 300

gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 360

aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 420

acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caattt 456

<210> 9

<211> 792

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc 60

tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg 120

caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa 180

gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc 240

gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat 300

ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg 360

cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc 420

gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag 480

catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc 540

gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc 600

cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata 660

gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc 720

gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac 780

gagttcttct ga 792

<210> 10

<211> 615

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 60

ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 120

gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta 180

ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 240

ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 300

ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 360

gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 420

cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 480

cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 540

cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 600

aacgccagca acgcg 615

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Met Ala Ala Ser Pro His Thr Leu Ser Ser Arg Leu Leu Thr Gly Cys

1 5 10 15

Val Gly Gly Ser

<210> 12

<211> 28

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Met Ala Ala Ser Pro His Thr Leu Ser Ser Arg Leu Leu Thr Gly Cys

1 5 10 15

Val Gly Gly Ser Val Trp Tyr Leu Glu Arg Arg Thr

20 25

<210> 13

<211> 459

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Met Leu Lys Leu Ile Val Pro Thr Ile Met Leu Leu Pro Leu Thr Trp

1 5 10 15

Leu Ser Lys Lys His Met Ile Trp Ile Asn Thr Thr Thr His Ser Leu

20 25 30

Ile Ile Ser Ile Ile Pro Leu Leu Phe Phe Asn Gln Ile Asn Asn Asn

35 40 45

Leu Phe Ser Cys Ser Pro Thr Phe Ser Ser Asp Pro Leu Thr Thr Pro

50 55 60

Leu Leu Met Leu Thr Thr Trp Leu Leu Pro Leu Thr Ile Met Ala Ser

65 70 75 80

Gln Arg His Leu Ser Ser Glu Pro Leu Ser Arg Lys Lys Leu Tyr Leu

85 90 95

Ser Met Leu Ile Ser Leu Gln Ile Ser Leu Ile Met Thr Phe Thr Ala

100 105 110

Thr Glu Leu Ile Met Phe Tyr Ile Phe Phe Glu Thr Thr Leu Ile Pro

115 120 125

Thr Leu Ala Ile Ile Thr Arg Trp Gly Asn Gln Pro Glu Arg Leu Asn

130 135 140

Ala Gly Thr Tyr Phe Leu Phe Tyr Thr Leu Val Gly Ser Leu Pro Leu

145 150 155 160

Leu Ile Ala Leu Ile Tyr Thr His Asn Thr Leu Gly Ser Leu Asn Ile

165 170 175

Leu Leu Leu Thr Leu Thr Ala Gln Glu Leu Ser Asn Ser Trp Ala Asn

180 185 190

Asn Leu Met Trp Leu Ala Tyr Thr Met Ala Phe Met Val Lys Met Pro

195 200 205

Leu Tyr Gly Leu His Leu Trp Leu Pro Lys Ala His Val Glu Ala Pro

210 215 220

Ile Ala Gly Ser Met Val Leu Ala Ala Val Leu Leu Lys Leu Gly Gly

225 230 235 240

Tyr Gly Met Met Arg Leu Thr Leu Ile Leu Asn Pro Leu Thr Lys His

245 250 255

Met Ala Tyr Pro Phe Leu Val Leu Ser Leu Trp Gly Met Ile Met Thr

260 265 270

Ser Ser Ile Cys Leu Arg Gln Thr Asp Leu Lys Ser Leu Ile Ala Tyr

275 280 285

Ser Ser Ile Ser His Met Ala Leu Val Val Thr Ala Ile Leu Ile Gln

290 295 300

Thr Pro Trp Ser Phe Thr Gly Ala Val Ile Leu Met Ile Ala His Gly

305 310 315 320

Leu Thr Ser Ser Leu Leu Phe Cys Leu Ala Asn Ser Asn Tyr Glu Arg

325 330 335

Thr His Ser Arg Ile Met Ile Leu Ser Gln Gly Leu Gln Thr Leu Leu

340 345 350

Pro Leu Met Ala Phe Trp Trp Leu Leu Ala Ser Leu Ala Asn Leu Ala

355 360 365

Leu Pro Pro Thr Ile Asn Leu Leu Gly Glu Leu Ser Val Leu Val Thr

370 375 380

Thr Phe Ser Trp Ser Asn Ile Thr Leu Leu Leu Thr Gly Leu Asn Met

385 390 395 400

Leu Val Thr Ala Leu Tyr Ser Leu Tyr Met Phe Thr Thr Thr Gln Trp

405 410 415

Gly Ser Leu Thr His His Ile Asn Asn Met Lys Pro Ser Phe Thr Arg

420 425 430

Glu Asn Thr Leu Met Phe Met His Leu Ser Pro Ile Leu Leu Leu Ser

435 440 445

Leu Asn Pro Asp Ile Ile Thr Gly Phe Ser Ser

450 455

<210> 14

<211> 595

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

gagcactggg acgcccaccg cccctttccc tccgctgcca ggcgagcatg ttgtggtaat 60

tctggaacac aagaagagaa attgctgggt ttagaacaag attataaacg aattcggtgc 120

ccagtgatca cttgacagtt tttttttttt ttaaatatta cccaaaatgc tccccaaata 180

agaaatgcat cagctcagtc agtgaataca aaaaaggaat tatttttccc tttgagggtc 240

tttatacatc tctcctccaa ccccaccctc tattctgttt cttcctcctc acatgggggt 300

acacatacac agcttcctct tttggttcca tccttaccac cacaccacac gcacactcca 360

catgcccagc agagtggcac ttggtggcca gaaagtgtga gcctcatgat ctgctgtctg 420

tagttctgtg agctcaggtc cctcaaaggc ctcggagcac ccccttcctg gtgactgagc 480

cagggcctgc atttttggtt ttccccaccc cacacattct caaccatagt ccttctaaca 540

ataccaatag ctaggacccg gctgctgtgc actgggactg gggattccac atgtt 595

<210> 15

<211> 1374

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

tgctgaagct gattgtgcca accatcatgc tgctgcctct cacatggctg agcaaaaagc 60

acatgatttg gattaacacc acaacccaca gcctgattat cagcatcatc ccactgctgt 120

ttttcaacca gattaataat aacctctttt catgctcccc taccttttcc tctgatcccc 180

tgacaacccc cctgctcatg ctgaccacat ggctgctgcc tctgactatc atggccagtc 240

agaggcacct cagctcagag cctctgtcaa ggaaaaagct gtacctgtcc atgctcatta 300

gcctgcaaat cagcctgatt atgaccttca cagccactga gctgatcatg ttctatatct 360

tctttgagac cactctcatc ccaaccctgg ccatcatcac taggtgggga aatcagcctg 420

agaggctgaa tgcaggcacc tactttctct tttatacact ggtgggctca ctgcccctgc 480

tgattgcact gatctatacc cacaacacac tgggtagcct gaacatcctc ctgctgactc 540

tgactgccca ggagctgagt aactcctggg caaacaacct gatgtggctg gcttatacaa 600

tggcctttat ggtgaagatg cccctctatg gcctgcacct ctggctcccc aaggctcatg 660

tggaagctcc aatagctggc tccatggtcc tggctgctgt cctcctgaag ctgggtggtt 720

atggtatgat gaggctcacc ctgatcctga accctctgac aaagcacatg gcttaccctt 780

tcctggttct gagcctctgg ggtatgatca tgaccagctc catctgtctc aggcagactg 840

acctcaagag cctgattgct tacagctcca tcagccacat ggcactggtg gtgactgcca 900

ttctgattca gacaccctgg tcctttactg gggcagtgat cctcatgatt gctcatgggc 960

tgaccagcag cctcctgttc tgcctggcaa atagcaacta tgaaagaact cactcaagaa 1020

ttatgatcct gagtcagggg ctccagaccc tgctcccact gatggctttc tggtggctcc 1080

tggctagtct ggccaacctg gctctgcccc ctacaattaa cctgctggga gagctgtcag 1140

tgctggtgac aacattctcc tggagcaaca tcaccctgct cctgacagga ctgaacatgc 1200

tggtcacagc cctctacagc ctgtacatgt ttaccactac ccagtggggc tcactgactc 1260

accacattaa taacatgaag ccctcattca ccagagagaa caccctgatg tttatgcatc 1320

tgtctcccat cctgctgctg tccctgaacc cagacattat cactggtttc tcat 1374

<210> 16

<211> 84

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16

atggctgcca gcccccatac actgtcatcc aggctcctga ctggctgtgt gggggggagt 60

gtgtggtacc tggaaaggag gact 84

<210> 17

<211> 1380

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

tcaggatgag aaaccagtga taatgtctgg gttcagggac agcagcagga tgggagacag 60

atgcataaac atcagggtgt tctctctggt gaatgagggc ttcatgttat taatgtggtg 120

agtcagtgag ccccactggg tagtggtaaa catgtacagg ctgtagaggg ctgtgaccag 180

catgttcagt cctgtcagga gcagggtgat gttgctccag gagaatgttg tcaccagcac 240

tgacagctct cccagcaggt taattgtagg gggcagagcc aggttggcca gactagccag 300

gagccaccag aaagccatca gtgggagcag ggtctggagc ccctgactca ggatcataat 360

tcttgagtga gttctttcat agttgctatt tgccaggcag aacaggaggc tgctggtcag 420

cccatgagca atcatgagga tcactgcccc agtaaaggac cagggtgtct gaatcagaat 480

ggcagtcacc accagtgcca tgtggctgat ggagctgtaa gcaatcaggc tcttgaggtc 540

agtctgcctg agacagatgg agctggtcat gatcataccc cagaggctca gaaccaggaa 600

agggtaagcc atgtgctttg tcagagggtt caggatcagg gtgagcctca tcataccata 660

accacccagc ttcaggagga cagcagccag gaccatggag ccagctattg gagcttccac 720

atgagccttg gggagccaga ggtgcaggcc atagaggggc atcttcacca taaaggccat 780

tgtataagcc agccacatca ggttgtttgc ccaggagtta ctcagctcct gggcagtcag 840

agtcagcagg aggatgttca ggctacccag tgtgttgtgg gtatagatca gtgcaatcag 900

caggggcagt gagcccacca gtgtataaaa gagaaagtag gtgcctgcat tcagcctctc 960

aggctgattt ccccacctag tgatgatggc cagggttggg atgagagtgg tctcaaagaa 1020

gatatagaac atgatcagct cagtggctgt gaaggtcata atcaggctga tttgcaggct 1080

aatgagcatg gacaggtaca gctttttcct tgacagaggc tctgagctga ggtgcctctg 1140

actggccatg atagtcagag gcagcagcca tgtggtcagc atgagcaggg gggttgtcag 1200

gggatcagag gaaaaggtag gggagcatga aaagaggtta ttattaatct ggttgaaaaa 1260

cagcagtggg atgatgctga taatcaggct gtgggttgtg gtgttaatcc aaatcatgtg 1320

ctttttgctc agccatgtga gaggcagcag catgatggtt ggcacaatca gcttcagcat 1380

<210> 18

<211> 1380

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 18

atgctgaagc tgattgtgcc aaccatcatg ctgctgcctc tcacatggct gagcaaaaag 60

cacatgattt ggattaacac cacaacccac agcctgatta tcagcatcat cccactgctg 120

tttttcaacc agattaataa taacctcttt tcatgctccc ctaccttttc ctctgatccc 180

ctgacaaccc ccctgctcat gctgaccaca tggctgctgc ctctgactat catggccagt 240

cagaggcacc tcagctcaga gcctctgtca aggaaaaagc tgtacctgtc catgctcatt 300

agcctgcaaa tcagcctgat tatgaccttc acagccactg agctgatcat gttctatatc 360

ttctttgaga ccactctcat cccaaccctg gccatcatca ctaggtgggg aaatcagcct 420

gagaggctga atgcaggcac ctactttctc ttttatacac tggtgggctc actgcccctg 480

ctgattgcac tgatctatac ccacaacaca ctgggtagcc tgaacatcct cctgctgact 540

ctgactgccc aggagctgag taactcctgg gcaaacaacc tgatgtggct ggcttataca 600

atggccttta tggtgaagat gcccctctat ggcctgcacc tctggctccc caaggctcat 660

gtggaagctc caatagctgg ctccatggtc ctggctgctg tcctcctgaa gctgggtggt 720

tatggtatga tgaggctcac cctgatcctg aaccctctga caaagcacat ggcttaccct 780

ttcctggttc tgagcctctg gggtatgatc atgaccagct ccatctgtct caggcagact 840

gacctcaaga gcctgattgc ttacagctcc atcagccaca tggcactggt ggtgactgcc 900

attctgattc agacaccctg gtcctttact ggggcagtga tcctcatgat tgctcatggg 960

ctgaccagca gcctcctgtt ctgcctggca aatagcaact atgaaagaac tcactcaaga 1020

attatgatcc tgagtcaggg gctccagacc ctgctcccac tgatggcttt ctggtggctc 1080

ctggctagtc tggccaacct ggctctgccc cctacaatta acctgctggg agagctgtca 1140

gtgctggtga caacattctc ctggagcaac atcaccctgc tcctgacagg actgaacatg 1200

ctggtcacag ccctctacag cctgtacatg tttaccacta cccagtgggg ctcactgact 1260

caccacatta ataacatgaa gccctcattc accagagaga acaccctgat gtttatgcat 1320

ctgtctccca tcctgctgct gtccctgaac ccagacatta tcactggttt ctcatcctga 1380

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 19

ctccatcact aggggttcct tg 22

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 20

gtagataagt agcatggc 18

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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tagttaatga ttaaccc 17

<210> 22

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22

gctcggtccg aacatgtgga atccccagtc ccagtgcaca gcagccgggt cctagctatt 60

ggtattgtta gaaggactat ggttgagaat gtgtggggtg gggaaaacca aaaatgcagg 120

ccctggctca gtcaccagga agggggtgct ccgaggcctt tgagggacct gagctcacag 180

aactacagac agcagatcat gaggctcaca ctttctggcc accaagtgcc actctgctgg 240

gcatgtggag tgtgcgtgtg gtgtggtggt aaggatggaa ccaaaagagg aagctgtgta 300

tgtgtacccc catgtgagga ggaagaaaca gaatagaggg tggggttgga ggagagatgt 360

ataaagaccc tcaaagggaa aaataattcc ttttttgtat tcactgactg agctgatgca 420

tttcttattt ggggagcatt ttgggtaata tttaaaaaaa aaaaaaactg tcaagtgatc 480

actgggcacc gaattcgttt ataatcttgt tctaaaccca gcaatttctc ttcttgtgtt 540

ccagaattac cacaacatgc tcgcctggca gcggagggaa aggggcggtg ggcgtcccag 600

tgctcagatc tctcgagtca ggatgagaaa ccagtgataa tgtctgggtt cagggacagc 660

agcaggatgg gagacagatg cataaacatc agggtgttct ctctggtgaa tgagggcttc 720

atgttattaa tgtggtgagt cagtgagccc cactgggtag tggtaaacat gtacaggctg 780

tagagggctg tgaccagcat gttcagtcct gtcaggagca gggtgatgtt gctccaggag 840

aatgttgtca ccagcactga cagctctccc agcaggttaa ttgtaggggg cagagccagg 900

ttggccagac tagccaggag ccaccagaaa gccatcagtg ggagcagggt ctggagcccc 960

tgactcagga tcataattct tgagtgagtt ctttcatagt tgctatttgc caggcagaac 1020

aggaggctgc tggtcagccc atgagcaatc atgaggatca ctgccccagt aaaggaccag 1080

ggtgtctgaa tcagaatggc agtcaccacc agtgccatgt ggctgatgga gctgtaagca 1140

atcaggctct tgaggtcagt ctgcctgaga cagatggagc tggtcatgat cataccccag 1200

aggctcagaa ccaggaaagg gtaagccatg tgctttgtca gagggttcag gatcagggtg 1260

agcctcatca taccataacc acccagcttc aggaggacag cagccaggac catggagcca 1320

gctattggag cttccacatg agccttgggg agccagaggt gcaggccata gaggggcatc 1380

ttcaccataa aggccattgt ataagccagc cacatcaggt tgtttgccca ggagttactc 1440

agctcctggg cagtcagagt cagcaggagg atgttcaggc tacccagtgt gttgtgggta 1500

tagatcagtg caatcagcag gggcagtgag cccaccagtg tataaaagag aaagtaggtg 1560

cctgcattca gcctctcagg ctgatttccc cacctagtga tgatggccag ggttgggatg 1620

agagtggtct caaagaagat atagaacatg atcagctcag tggctgtgaa ggtcataatc 1680

aggctgattt gcaggctaat gagcatggac aggtacagct ttttccttga cagaggctct 1740

gagctgaggt gcctctgact ggccatgata gtcagaggca gcagccatgt ggtcagcatg 1800

agcagggggg ttgtcagggg atcagaggaa aaggtagggg agcatgaaaa gaggttatta 1860

ttaatctggt tgaaaaacag cagtgggatg atgctgataa tcaggctgtg ggttgtggtg 1920

ttaatccaaa tcatgtgctt tttgctcagc catgtgagag gcagcagcat gatggttggc 1980

acaatcagct tcagcatagt cctcctttcc aggtaccaca cactcccccc cacacagcca 2040

gtcaggagcc tggatgacag tgtatggggg ctggcagcca tgtcgactct agaggatccc 2100

cggggaattc aatcgatgtt cgaatcccaa ttctttgcca aagtgatggg ccagcacaca 2160

gaccagcacg ttgcccagga gctgtgggag gaagataaga ggtatgaaca tgattagcaa 2220

aagggcctag cttggactca gaataatcca gccttatccc aaccataaaa taaaagcaga 2280

atggtagctg gattgtagct gctattagca atatgaaacc tcttacatca gttacaattt 2340

atatgcagaa atatttatat gcagaaatat tgctattgcc ttaacccaga aattatcact 2400

gttattcttt agaatggtgc aaagaggcat gatacattgt atcattattg ccctgaaaga 2460

aagagattag ggaaagtatt agaaataaga taaacaaaaa agtatattaa aagaagaaag 2520

cattttttgt gggcctatag actctatagg cggtacttac gtcactcttg gcacggggaa 2580

tccgcgttcc aatgcaccgt tcccggccgg gattcgaatc cgcggaggct ggatcggtcc 2640

cggtgtcttc tatggaggtc aaaacagcgt ggatggcgtc tccaggcgat ctgacggttc 2700

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aatggggcgg agttgttacg acattttgga aagtcccgtt gattttggtg ccaaaacaaa 2820

ctcccattga cgtcaatggg gtggagactt ggaaatcccc gtgagtcaaa ccgctatcca 2880

cgcccattga tgtactgcca aaaccgcatc accatggtaa tagcgatgac taatacgtag 2940

atgtactgcc aagtaggaaa gtcccataag gtcatgtact gggcataatg ccaggcgggc 3000

catttaccgt cattgacgtc aatagggggc gtacttggca tatgatacac ttgatgtact 3060

gccaagtggg cagtttaccg taaatactcc acccattgac gtcaatggaa agtccctatt 3120

ggcgttacta tgggaacata cgtcattatt gacgtcaatg ggcgggggtc gttgggcggt 3180

cagccaggcg ggccatttac cgtaagttat gtaacgcgga actccatata tgggctatga 3240

actaatgacc ccgtaattga ttactattaa taactagacg cgtgcggccg tagataagta 3300

gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 3360

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ttgttctgga tattaccagc aaggccgata gtttgagttc ttctactcag gcaagtgatg 3660

ttattactaa tcaaagaagt attgcgacaa cggttaattt gcgtgatgga cagactcttt 3720

tactcggtgg cctcactgat tataaaaaca cttctcagga ttctggcgta ccgttcctgt 3780

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cgttatacgt gctcgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg 3900

gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct 3960

cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta 4020

aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa 4080

cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct 4140

ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc 4200

aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 4260

ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt 4320

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caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt 4620

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tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag 4980

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atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg 5100

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ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg 5220

ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgaattatta 5280

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atacattcaa atatgtatcc gctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac 5460

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agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg 6300

cgttggccga ttcattaatg cagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa 6360

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