一种牛油果提取物及其制备方法和在抗衰老化妆品中的应用

技术领域

本发明涉及天然植物提取技术领域，特别涉及一种牛油果提取物及其制备方法和在抗衰老化妆品中的应用。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(NMN)是生物细胞内存在的一种生化物质，是烟酰胺磷酸核糖转移酶反应的产物，是NAD+的关键前体之一。烟酰胺单核苷酸作为NAD+补救途径中的中间体，具有抗氧化、减少氧化应激的作用，具有很好的抗衰老、抗氧化的作用，能够增强能量代谢，减缓生物体的生理衰退。目前主要应用在如脑卒中、阿尔茨海默氏病、帕金森病、视网膜退行性疾病、2型糖尿病的治疗中，还没有应用在相关化妆品/护肤品领域中。鉴于烟酰胺单核苷酸是人体内源性物质，安全性较高，且热稳定性较好，因此烟酰胺单核苷酸作为活性物质应用在化妆品/护肤品领域中，具有广阔的前景。

目前，烟酰胺单核苷酸可以通过微生物发酵、化学合成或体外酶催化制备而得。化学合成工艺存在着成本高、收率低、难以规模化生产等缺点，而微生物发酵和体外酶催化虽然可以避免溶剂残留，但是分别存在着工艺复杂和酶催化剂容易失活等缺点。与上述三种制备方法相比，从天然果蔬中提取烟酰胺单核苷酸具有成本低、收率高、生物活性高等优点。烟酰胺单核苷酸广泛存在于天然食物中，比如牛油果、西兰花、卷心菜、毛豆、黄瓜、蘑菇、生牛肉和虾等。牛油果是一种营养价值很高的水果，含多种维生素、丰富的脂肪酸、微量元素等，因此在牛油果中提取烟酰胺单核苷酸并应用于化妆品或护肤品技术领域可以解决现有技术中烟酰胺单核苷酸合成困难的问题。一般而言，提取工艺不同，提取得到的最终产物也不同，如果提取得到的提取物成分过于复杂，在应用于化妆品或护肤品上可能会导致皮肤过敏等不良症状的发生。因此，通过改进提取工艺，提供一种高效、低致敏性的抗氧化、抗衰老提取物就显得非常有必要。

发明内容

为了克服现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种高收率、低致敏性的牛油果提取物的制备方法，以解决上述缺陷。

本发明提供了一种牛油果提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、取牛油果去核去皮，将果肉切块，干燥，粉碎，筛网过筛后得牛油果粉；

S2、取步骤S1所述的牛油果粉，加水进行超声辅助提取，冷却，离心，将离心后得到的混合物进行减压过滤和滤膜超滤，收集所述滤膜超滤后的滤液；

S3、用乙酸乙酯对步骤S2所述的滤液进行萃取，分层后取下层液；

S4、将步骤S3所述的下层液真空冷冻干燥，得固形物或固体。

进一步地，所述步骤S1中筛网的目数为28～200目。

进一步地，所述牛油果粉的质量与水的体积的比值为1～25g:100mL。

进一步地，所述超声辅助提取的温度为45～80℃，所述超声辅助提取的时间为30～120min，所述超声辅助提取的功率为100～400W。

进一步地，所述减压过滤中滤纸的孔径为10～25μm，所述滤膜超滤中超滤膜的截留分子量为1000～5000D。

进一步地，还包括步骤S5：将在真空冷冻干燥机冷冻后的固形物或固体放入氮气密封干燥箱中干燥30～60min，密封储存。

进一步地，所述步骤S4中真空冷冻干燥的条件为：真空压力为50～150Pa，升华干燥阶段进行三段梯度温度控制，第一段温度设置为－35～－25℃，保持1～2h，第二段温度设置为－20～－10℃，保持0.5～2h，第三段温度设置为－10～－5℃，保持3～5h，解析干燥阶段的温度设置为30～60℃，保持7～12h。

进一步地，本发明还提供了一种按照上述制备方法制备得到的牛油果提取物。

进一步地，本发明还提供了一种按照上述制备方法制备得到的牛油果提取物在抗衰老美容护肤品中的应用，按重量百分比计，所述牛油果提取物的用量为0.05～99％。

进一步地，所述抗衰老美容护肤品为水剂、精华、原液、乳液、面霜、面膜、片剂、口红中的一种或多种。

牛油果作为一种天然食物，其化学成分相当复杂。申请人在实验过程中意外地发现，超声辅助提取牛油果提取物中含有少量的γ-谷甾醇，而γ-谷甾醇会有增加皮肤产生变应性接触性皮炎等过敏反应的作用。

为此，申请人在提取工艺中采用乙酸乙酯对超声辅助提取得到的滤液进行萃取，由于烟酰胺单核苷酸易溶于水，γ-谷甾醇微溶于水，因此通过萃取操作把滤液中少量的γ-谷甾醇除去，进而使得后续真空冷冻干燥得到的牛油果提取物不含有γ-谷甾醇，保证了牛油果提取物用于化妆品或护肤品领域的安全性。

其次，申请人在实验过程也中发现，在真空干燥的升华干燥阶段通过梯度温度控制干燥，得到的牛油果提取物中烟酰胺单核苷酸的含量更高，这可能是因为梯度温度控制可以使得滤液中的相关化学成分不会因为环境的突然改变而发生转化。此外，在真空干燥后对牛油果提取物放入氮气密封干燥箱干燥一定的时间，可以更好地保证提取物中的烟酰胺单核苷酸的稳定性，这是申请人意料不到的，这可能是因为真空干燥后的产物表面积增大，进而容易吸附水分和微生物，进而导致化学成分的转化和改变。

因此，本发明的制备方法与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)本发明利用超声辅助水提取法，将烟酰胺单核苷酸从牛油果中提取出来，耗时短、成本低、实现了工厂化大规模生产，同时不存在有机溶剂残留，使用溶剂为水，安全性高，在制备方法中采用真空冷冻干燥对进行下层产物进行处理，在真空干燥的升华干燥阶段进行三段梯度温控干燥，可以更好地防止牛油果肉中有效成分烟酰胺单核苷酸活性的丧失，进而提高了牛油果提取物中烟酰胺单核苷酸的收率。

(2)本发明首次将牛油果提取物应用于抗衰老化妆品中，除了烟酰胺单核苷酸以外，提取物中还含有黄酮、多糖、多肽等多种活性成分，这些活性成分具有很好的抗衰老效果，可以有效地防止皮肤粗糙老化，减少皮肤皱纹出现，保持皮肤光鲜有弹性。

(3)在本发明牛油果提取物的制备方法中，通过将超声辅助提取后得到的滤液用乙酸乙酯进行萃取，静置分层后取下层清液再进行真空干燥，可以提高牛油果提取物中烟酰胺单核苷酸的纯度，把牛油果提取物中含有的γ-谷甾醇除去，提高了提取物在后续使用在化妆品过程中的生物安全性，大大减少过敏反应的产生。

(4)在本发明牛油果提取物的制备方法中，通过将在真空冷冻干燥机冷冻后的牛油果提取物放入氮气密封干燥箱干燥一定的时间，然后再密封储存，可以更好地保证提取物中的烟酰胺单核苷酸能够存放更长的时间，在一定时间内活性稳定，避免因低温冻干干燥导致牛油果提取物表面积增大、吸湿性增强，进而导致提取物的活性不稳定，容易氧化腐败。

附图说明

图1为本发明中烟酰胺单核苷酸的标准工作曲线。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1

实施例1的一种牛油果提取物的制备方法如下：

S1、取牛油果去核去皮，将果肉切块，切成1cm×1cm的小块，在45℃下干燥至恒重，粉碎，过28目筛网；

S2、精密称取步骤S1所述的牛油果粉2.5kg，加10L水，在温度为45℃、超声功率为100W的条件下超声辅助提取120min，室温放置使其自然冷却，然后在转速为4500rmp下离心20分钟，用孔径为10μm的滤纸减压过滤，再用截留分子量为1000D的滤膜进行超滤，收集滤液；

S3、取乙酸乙酯对步骤S2所述的滤液进行萃取，静止分层后取下层液；

S4、将所述下层液进行真空冷冻干燥，设置真空压力为150Pa，在升华干燥阶段进行三段梯度温控，第一段温度设置为—35℃，保持1h，第二段温度设置为—20℃，保持2h，第三段温度设置为—10℃，保持3h，解析干燥阶段的温度设置为30℃，恒温12h，得固形物或固体，即为得到的牛油果提取物。

实施例2

实施例2的一种牛油果提取物的制备方法如下：

S1、取牛油果去核去皮，将果肉切块，切成0.5cm×0.5cm的小块，在60℃下干燥至恒重，粉碎，过200目筛网；

S2、精密称取步骤S1所述的牛油果粉0.1kg，加10L水，在温度为80℃、超声功率为400W的条件下超声辅助提取30min，室温放置使其自然冷却，然后在转速为4500rmp下离心20分钟，用孔径为25μm的滤纸减压过滤，再用截留分子量为5000D的滤膜进行超滤，收集滤液；

S3、取乙酸乙酯对步骤S2所述的滤液进行萃取，静止分层后取下层液；

S4、将所述下层液进行真空冷冻干燥，设置真空压力为50Pa，在升华干燥阶段进行三段梯度温控，第一段温度设置为—25℃，保持2h，第二段温度设置为—10℃，保持0.5h，第三段温度设置为—5℃，保持5h，解析干燥阶段的温度设置为60℃，恒温7h，得固形物或固体，即为得到的牛油果提取物。

实施例3

实施例3的一种牛油果提取物的制备方法如下：

S1、取牛油果去核去皮，将果肉切块，切成1cm×1cm的小块，在45℃下干燥至恒重，粉碎，过28目筛网，得到粒径小于250μm的牛油果粉；

S2、精密称取步骤S1所述的牛油果粉2.5kg，加10L水，在温度为45℃、超声功率为100W的条件下超声辅助提取120min，室温放置使其自然冷却，然后在转速为4500rmp下离心20分钟，用孔径为10μm的滤纸减压过滤，再用截留分子量为1000D的滤膜进行超滤，收集滤液；

S3、取乙酸乙酯对步骤S2所述的滤液进行萃取，静止分层后取下层液；

S4、将所述下层液进行真空冷冻干燥，设置真空压力为150Pa，在升华干燥阶段进行三段梯度温控，第一段温度设置为—35℃，保持1h，第二段温度设置为—20℃，保持2h，第三段温度设置为—10℃，保持3h，解析干燥阶段的温度设置为30℃，恒温12h，得固形物或固体；

S5、将真空冷冻干燥后的固形物或固体放入氮气密封干燥箱干燥30min，密封储存，即为得到的牛油果提取物。

实施例4

实施例4的一种牛油果提取物的制备方法如下：

S1、取牛油果去核去皮，将果肉切块，切成0.5cm×0.5cm的小块，在60℃下干燥至恒重，粉碎，过200目筛网；

S2、精密称取步骤S1所述的牛油果粉0.1kg，加10L水，在温度为80℃、超声功率为400W的条件下超声辅助提取30min，室温放置使其自然冷却，然后在转速为4500rmp下离心20分钟，用孔径为25μm的滤纸减压过滤，再用截留分子量为5000D的滤膜进行超滤，收集滤液；

S3、取乙酸乙酯对步骤S2所述的滤液进行萃取，静止分层后取下层液；

S4、将所述下层液进行真空冷冻干燥，设置真空压力为50Pa，在升华干燥阶段进行三段梯度温控，第一段温度设置为—25℃，保持2h，第二段温度设置为—10℃，保持0.5h，第三段温度设置为—5℃，保持5h，解析干燥阶段的温度设置为60℃，恒温7h，得固形物或固体；

S5、将真空冷冻干燥后的固形物或固体放入氮气密封干燥箱干燥60min，密封储存，即为得到的牛油果提取物。

实施例5

实施例5的一种牛油果提取物的制备方法如下：

S1、取牛油果去核去皮，将果肉切块，切成0.5cm×0.5cm的小块，在50℃下干燥至恒重，粉碎，过100目筛网，得到粒径小于400μm的牛油果粉；

S2、精密称取步骤S1所述的牛油果粉1kg，加10L水，在温度为55℃、超声功率为200W的条件下超声辅助提取60min，室温放置使其自然冷却，然后在转速为4500rmp下离心20分钟，用孔径为20μm的滤纸减压过滤，再用截留分子量为3000D的滤膜进行超滤，收集滤液；

S3、取乙酸乙酯对步骤S2所述的滤液进行萃取，静止分层后取下层液；

S4、将所述下层液进行真空冷冻干燥，设置真空压力为100Pa，在升华干燥阶段进行三段梯度温控，第一段温度设置为—30℃，保持1.5h，第二段温度设置为—15℃，保持1h，第三段温度设置为—8℃，保持3h，解析干燥阶段的温度设置为45℃，恒温10h，得固形物或固体；

S5、将真空冷冻干燥后的放入氮气密封干燥箱干燥45min，密封储存，即为得到的牛油果提取物。

对比例1

与实施例5相比，将步骤S2中超声辅助提取温度设置为90℃，其它步骤及其操作条件与实施例5一致。

对比例2

与实施例5相比，步骤S4真空冷冻干燥中的升华干燥阶段中不采用三段梯度温控干燥，直接将温度设置—8℃，保持5.5h，其它步骤及其操作条件与实施例5一致。

对比例3

与实施例5相比，不进行乙酸乙酯萃取操作，将步骤S2中滤得的滤液直接进行真空冷冻干燥，其它步骤及其操作条件与实施例5一致。

试验例1、高效液相色谱测定烟酰胺单核苷酸和γ-谷甾醇的含量

分别取实施例1～5以及对比例1～3制备得到的牛油果提取物进行试验。

1.1烟酰胺单核苷酸含量的测定

1.1.1、样品前处理

称取实施例1～5以及对比例1～3的牛油果提取物试样各约0.2g，精确到1mg，加入10ml纯水溶解，在超声波清洗器中超声20min，然后用纯水定容至20mL，混匀。取部分溶液放入离心管中，4500r/min离心30min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，备用，同一实施例或对比例的试验进行两次平行试验，两次平行试验测定结果相对偏差要求不大于5％。

1.1.2、色谱条件

色谱柱：Agilent XDB C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；

进样量：20μL；柱温：25℃；测定波长：260nm。

流动相：乙腈-pH为6的磷酸盐缓冲液，梯度洗脱条件为(体积比)：

表1烟酰胺单核苷酸测定的梯度洗脱条件

1.1.3、烟酰胺单核苷酸标准曲线的配制

用纯水配制1mg/mL的烟酰胺单核苷酸储备液，用纯水准确稀释至5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL的待测液，按照1.1.2的色谱条件注入液相色谱仪，通过色谱图得到烟酰胺单核苷酸的保留时间为2.539min，以烟酰胺单核苷酸浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，制备得到烟酰胺单核苷酸的标准工作曲线，如图1所示。

1.1.4、样品测试

将牛油果提取物测试样品按照1.1.2的色谱条件注入液相色谱仪，记录每个实施例/对比例的两个平行样品在2.539min下色谱峰的峰面积，通过烟酰胺单核苷酸的标准曲线算出牛油果测试样品中烟酰胺单核苷酸的含量，两次测试结果取平均值作为最终测试结果，各样品中烟酰胺单核苷酸的含量如表2所示。

1.2.1γ-谷甾醇含量的测定

1.2.1、样品前处理

称取实施例5和对比例3的牛油果提取物试样各约0.2g，精确到1mg，加入10ml95％的乙醇的溶解，在超声波清洗器中超声20min，冷却至室温后用95％的乙醇定容至20mL，混匀。取部分溶液放入离心管中，4500r/min离心30min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，备用，同一实施例或对比例的试验进行两次平行试验，两次平行试验测定结果相对偏差要求不大于5％。

1.2.2、色谱条件

色谱柱：Agilent XDB C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；

进样量：20μL；柱温：30℃；测定波长：210nm。

流动相：乙腈-异丙醇，体积比为75∶25；进行等梯度洗脱。

1.2.3、γ-谷甾醇标准曲线的配制

用纯水配制1mg/mL的γ-谷甾醇储备液，用95％的乙醇准确稀释至5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、100μg/mL的待测液，按照1.2.2的色谱条件注入液相色谱仪，以γ-谷甾醇浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，制备得到γ-谷甾醇的标准工作曲线，其中，γ-谷甾醇的保留时间为16.157min。

1.2.4、样品测试

将1.2.1的测试样品按照1.2.2的色谱条件注入液相色谱仪，记录每个实施例/对比例的两个平行样品在16.157min下色谱峰的峰面积，通过γ-谷甾醇的标曲线算出牛油果测试样品中γ-谷甾醇的含量，两次测试结果取平均值作为最终测试结果。

表2不同提取方法得到的牛油果提取物中烟酰胺单核苷酸的含量

从表2可知，使用本发明制备方法得到的牛油果提取物中烟酰胺单核苷酸的含量在8.026～8.828μg/mg之间，其中实施例5为本发明的最佳实施例；

对比例1是将步骤S2中超声辅助提取温度设置为90℃，虽然其余步骤和是实施例5一致，但是可以明显看出其牛油果提取物中烟酰胺单核苷酸的含量大幅降低，与实施例5相比，损失了将近27.8％，这说明提取温度对牛油果提取物中烟酰胺单核苷酸的含量有显著的影响；

对比例2是在步骤S4真空冷冻干燥的升华干燥阶段中不采用三段梯度温控干燥，直接将温度设置—8℃，保持5.5h，与实施例5相比，牛油果提取物中的烟酰胺单核苷酸的含量也有所降低，即三段梯度温控干燥操作可以使得牛油果提取物避免烟酰胺单核苷酸的生物活性受到影响，进而提高提取过程中产物的收率；

对比例3是与实施例5相比，其烟酰胺单核苷酸的含量接近，说明萃取操作不会导致其含量的降低，通过高效液相色谱仪测试得出实施例5与对比例3中γ-谷甾醇的含量分别为7.9ug/mg和0.84ug/mg，通过对滤液进行萃取操作，降低了γ-谷甾醇的含量，避免了其用于化妆品或护肤品中可能导致的过敏症状。

试验例2、抗氧化与抗老化性能测试

2.1、DPPH清除实验测试

DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。

配制0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液；配制200mg/mL浓度的待测样品溶液；以维生素C作为阳性对照样品。

分别吸取2mL样品溶液和2mLDPPH溶液于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A1；分别吸取2mL样品溶液和2mL甲醇于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A2；分别吸取2mL的DPPH溶液和2mL甲醇于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A0；每个样品做3个平行样，记录牛油果提取物的DPPH清除率，最终结果取三个平行样的平均值。

2.2、晚期糖基化终产物清除实验测试

非酶糖基化是一系列复杂的非酶促反应，蛋白质和葡萄糖在体内发生非酶促反应形成Schiff碱和Amadori产物等早期糖基化产物，进而经过氧化、重排、交联等过程，形成不可逆的非酶糖基化终产物(advanced glycosylation endproducts，AGEs)。该反应在生物体内广泛而缓慢地进行着，它可导致蛋白质功能降低和老化，进而使机体组织发生衰老和病变，因此能够有效清除AGEs的物质可以作为提示该物质具有抗衰老的作用。

分别配制以下试剂：①0.1mol/L NaOH溶液；②0.05mol/L的PBS磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)；③10mg/ml牛血清白蛋白溶液；④45mg/ml葡萄糖溶液；⑤0.25mmol/L盐酸氨基胍溶液；⑥200mg/mL牛油果提取物待测样品溶液。将0.05mol/L的PBS磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)、10mg/ml牛血清白蛋白溶液和45mg/ml葡萄糖溶液放置于恒温恒湿培养箱中，然后将牛油果提取物待测样品溶液与0.25mmol/L盐酸氨基胍溶液添加进去，在60℃条件下孵育40h(相当于30℃条件下孵育60天)。40h后取出各样品，用酶标仪对其进行检测，记录荧光激发/发射波长为370/440nm处的荧光吸收值。每个样品做3个平行样，记录牛油果提取物的AEGs的抑制率，最终结果取三个平行样的平均值。AEGs的抑制率如下式所示，其中，A

表3不同制备方法得到的牛油果提取物的抗氧化与抗老化性能测试

如表3实施例1～5所示，本发明制备方法制备得到的牛油果提取物的DPPH清除率和AEGs抑制率分别在86.58％～88.99％和85.38％～89.83％的范围内，而对比例1的DPPH清除率和AEGs抑制率分别为71.26％和68.79％，显示DPPH清除率和AEGs抑制率与烟酰胺单核苷酸的含量呈现正相关的趋势。表2的实验数据提示本发明制备方法制备得到的牛油果提取物具有很好的抗氧化和抗衰老效果。

试验例3、不同制备方法得到的牛油果提取物的稳定性测试

测试方法：取实施例1、2、5和对比例3的制备方法得到的牛油果提取物进行试验，将各试样分别密封存放14、28、56天后，对其用液相色谱仪测试提取物中烟酰胺单核苷酸的含量，色谱条件以及测试方法和试验例1一致。

具体实验结果如表4所示：

表4不同制备方法得到的牛油果提取物中烟酰胺单核苷酸的稳定性测试

如表4所示，实施例1和实施例2的牛油果提取物在14～56天后烟酰胺单核苷酸的含量均有所降低，随着存放时间增加，烟酰胺单核苷酸的含量越来越低，而实施例5和对比例3的牛油果提取物在14～56天后，烟酰胺单核苷酸的含量并没有太大的变化，证明将真空冷冻干燥机冷冻后的产品放入氮气密封干燥箱中干燥再封存可以提高牛油果提取物中烟酰胺单核苷酸的稳定性。

本行业的技术人员应该了解，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。