一种抑制RAS系统加州鲈鱼养殖过程中虹彩病毒增殖的方法

技术领域

本发明涉及水产品养殖技术领域，具体涉及一种抑制RAS系统加州鲈鱼养殖过程中虹彩病毒增殖的方法。

背景技术

工厂化循环水养殖(RAS)系统采用集约化高密度养殖模式，使用一系列生物工程手段来处理养殖用水，使之达到可循环使用的目的。所有的养殖用水均在系统内部进行循环利用，日补水系数在5％左右。RAS系统具有水资源消耗小、占地少、对环境污染小、产品优质安全、病害少、密度高、养殖生产不受地域或气候的限制和影响，资源利用率高，是高产出，低风险实现水产养殖业可持续发展的重要途径。但是由于养殖密度大，鱼类病害时有发生，严重降低了经济效益。

虹彩病毒是引起RAS系统中鱼类患病致死的主要微生物之一。虹彩病毒病是一种全身性、系统性感染，病毒对鱼体上皮组织和内皮组织亲嗜性较强，对脾脏、肾脏等鱼类造血器官和组织的破坏尤为严重，从而导致病鱼贫血、多器官衰竭而死亡。传染方式以水平感染为主。近年来在东亚、东南亚和欧洲地区，由该类病毒引起的鱼类疾病已呈明显上升趋势，患病鱼的死亡率从30％(成鱼阶段)到100％(幼苗阶段)不等，给水产养殖业造成重大的经济损失，严重阻碍了鱼类养殖业的健康发展。1992年在台湾澎湖养殖的石斑鱼、真鲷等暴发了一种虹彩病毒病，该病毒可导致养殖石斑鱼、真鲷等大量死亡，死亡率高达60％-100％。1994年广东省养殖鳜鱼暴发性流行病是由虹彩病毒引起，在病鱼脾脏组织中观察到截面呈六角型、直径约150nm的球状病毒。2003年从福建沿海养殖场患病大黄鱼体内分离到一种病毒，通过组织病理和病毒形态学分析，鉴定为大黄鱼虹彩病毒。总的来说，虹彩病毒在东亚和东南亚发现最早、种类最多、流行最为广泛、感染的鱼类品种也最多。

综上所述，现急需一种可以快速有效抑制RAS养殖系统中虹彩病毒增殖的方法，用以提高水产品成活率，提高水产品品质，以降低经济损失。

发明内容

本发明意在提供一种抑制RAS系统加州鲈鱼养殖过程中虹彩病毒增殖的方法，以解决RAS养殖系统中虹彩病毒引起鱼类患病致死的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抑制RAS系统加州鲈鱼养殖过程中虹彩病毒增殖的方法，包括提取物添加步骤：将柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物添加至RAS系统中。

本方案的原理及优点是：将柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物联用，可对虹彩病毒产生较强的抑制作用，从而防止RAS系统中养殖鱼被虹彩病毒感染。

柑橘黄酮主要以糖苷和糖苷配基的形式存在，柑橘黄酮具有抗菌、抗病毒作用，有的柑橘黄酮能有效抑制疱疹单显性病毒和骨髓灰质炎病毒等，有的柑橘黄酮能抑制霉菌、金黄色葡萄球菌和白喉杆菌等微生物。发明人研究发现，柑橘黄酮提取物还能够对虹彩病毒产生抑制作用，进而可应用于水产养殖的实践操作中。花青素是广泛存在于植物中的水溶性天然色素，具有抗病毒和抗蛋白水解酶活性，能用于治疗免疫缺陷病毒(HIV)等。发明人发现了黑枸杞花青素提取物能够对虹彩病毒产生抑制作用，进而可应用于水产养殖的实践操作中。

发明人从柑橘果皮和黑枸杞果实中分别提取获得了柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物，并将两种物质联合在RAS系统中使用。两种物质的连用可产生协同增效的效果，可极大地提高RAS系统抗虹彩病毒侵袭的能力。发明人分析，产生上述协同增效现象的原因在于，柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素可从抗病毒侵染宿主细胞、抗病毒复制和组装等多个方面，全方位抑制了虹彩病毒感染养殖鱼，从而获得了协同增效的效果。另外，柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素的复配同时也可以增加药物本身的稳定性，从而提高药效，增加其抗病毒能力。

综上，本方案在RAS系统中加入了柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物，有利于抑制虹彩病毒、提高水产品的免疫力和种苗成活率、提高水产养殖经济效益，同时提高RAS系统养殖水产品的稳定性和安全性。

进一步，当RAS系统的养殖密度≥2000尾/m

进一步，当1000尾/m

进一步，当600尾/m

进一步，当200尾/m

进一步，当RAS系统的养殖密度＜200尾/m

采用上述技术方案，依照养殖密度来调整药物加入量和频次，可有效防止养殖鱼被病毒感染。幼苗期养殖密度高，鱼苗抗病毒能力差，所以药物投加量和频次较高；成鱼期养殖密度低，成鱼抗病毒能力强，可降低药物投加量和频次。

进一步，先将柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物溶解于35℃-40℃的温水中，获得药物溶液，然后将药物溶液添加至RAS系统中。

采用上述技术方案，由于柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物直接投加在RAS系统中，可能会出现药物溶解性不好的问题，将两种物质事先溶解于35℃-40℃的温水中，再投加在RAS系统中，可提高药物的生物利用度。

进一步，所述柑橘黄酮提取物由如下方法制备：粉碎柑橘皮渣，获得柑橘粉；使用乙醇为提取溶剂，通过超声提取法处理柑橘粉获得柑橘黄酮提取物。

采用上述技术方案，采用超声波-乙醇浸提法处理柑橘，所得提取物是以黄酮为主，同时含有精油、维生素等其他多种成分的混合物。本方案制备柑橘黄酮提取物可有效地预防和防治虹彩病毒。

进一步，所述黑枸杞花青素提取物由如下方法制备：粉碎黑枸杞，获得枸杞粉；使用酸化乙醇为提取溶剂，通过超声提取法处理枸杞粉获得黑枸杞花青素提取物。

采用上述技术方案，超声波-酸化乙醇浸提法处理黑枸杞，所得提取物是以花青素为主，同时含有维生素、矿物质、蛋白质等其他多种成分的混合物。本方案制备黑枸杞花青素提取物可有效地预防和防治虹彩病毒。

进一步，先将柑橘皮渣烘干至含水量小于18.0％，然后粉碎柑橘皮渣至粒径为0.5-0.9cm，获得柑橘粉；先将黑枸杞烘干至含水量小于18.0％，然后粉碎黑枸杞至粒径为0.4-0.6cm，获得枸杞粉。

采用上述技术方案，控制物料含水量，以及提取前将物料粉碎，可提高目的成分的提取效率。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例1：柑橘黄酮提取物的制备

提取柑橘黄酮的大致过程为：以柑橘皮渣为原料(柑橘产自四川盆地，柑橘品种为椪柑)，烘干至含水率小于18.0％，粉碎至粒径0.5-0.9cm，取10.0g粉碎后粉末，萃取剂采用72％-75％的乙醇溶液，料液比1:15-1:20，超声功率310W-350W，提取温度38℃-42℃，提取时间48min-58min，提取完毕过滤获得以黄酮类为主的提取液(柑橘黄酮提取物)。用75％乙醇溶液定容至25mL，测量黄酮得率。提取得率如表1所示。此方法所得提取物可以较好的保护黄酮的结构，并尽可能多的保存柑橘的有益活性成分。在本实施例中，尝试了多种参数设置来进行柑橘黄酮的提取，详见表1。

黄酮得率的测量和计算方法如下：

芦丁标准曲线的绘制：精密称定芦丁对照品12.5mg于25mL量瓶中，加75％的乙醇溶解至刻度，得0.5mg/mL的芦丁对照品溶液。精密量取对照品溶液0、1、1.5、2、2.5、3、4mL，分别置25mL容量瓶中，各加75％乙醇补足至5.0mL，各加5％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，静置6min，再加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀、静置6min，再4％氢氧化钠试液10mL，再加75％乙醇至刻度，摇匀，静置15min。以空白试剂作对照液，用紫外分光光度计在510nm的波长处测定吸光度，以对照品质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标得到标准曲线Y＝13.495X-0.0094(R

黄酮得率＝C×N×V/m×100％ (1)

式中：C为标准曲线上查得黄酮浓度(mg/mL),N为稀释倍数,V为最初定容体积(mL),m为样品质量(mg)。

表1：柑橘黄酮提取物的提取参数设置以及得率

实施例2：黑枸杞花青素提取物的制备

制备黑枸杞花青素提取物的过程为：以黑枸杞为原料(黑枸杞产自青海柴达木盆地，生长地海拔2800米以上)，烘干至含水率小于18.0％，粉碎至粒径0.4cm-0.6cm，萃取剂采用体积浓度58％-63％的乙醇溶液，使用前用1％的盐酸酸化，料液比1:14-1:17，超声功率280W-320W，提取温度46℃-50℃，提取时间30min-40min，以花青素为主的提取物(黑枸杞花青素)，提取得率如表2所示。此方法所得提取物可以较好的保护花青素的氧化能力，并尽可能多的保存黑枸杞中的有益活性成分。在本实施例中，尝试了多种参数设置来进行黑枸杞花青素的提取，详见表2。

花青素得率的测量和计算方法如下：

花青素标准曲线的绘制：准确称取0.004g花青素标准品，用50％酸化乙醇(pH 3)定容至10mL；精确移取0、2、4、6、8和10mL溶液，用50％酸化乙醇(pH 3)定容至10mL，静止10min，分别移1mL于比色皿中，在波长530nm下测定吸光度，以花青素浓度对吸光度进行回归，绘制出花青素浓度与吸光度的标准曲线Y＝0.599X-0.0123(R

花青素得率(％)＝(C×V)/M×100％ (2)

式中：C测得样品溶液中花青素浓度(mg/mL)，V定容之后溶液的体积(mL)，M样品质量(mg)。

表2：黑枸杞花青素提取物的提取参数设置以及得率

实施例3：加州鲈鱼养殖实例

本实施例在RAS系统中添加柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物，以加州鲈鱼为实验对象以验证本养殖方法的功效。柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物的添加量根据加州鲈鱼的密度来确认，详见表3。养殖过程为：在RAS系统中按照表4的用量和频次，添加柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物(再将两种物质添加到RAS系统之前，先将柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物溶解于35℃-40℃的温水中，获得药物溶液，然后将药物溶液添加至RAS系统中)，持续饲养一段时间后，观察加州鲈鱼生长状况，检测加州鲈鱼体表大鲵虹彩病毒基因拷贝数，从而判断是否出现病毒感染。虹彩病毒感染的临床症状一般包括：体表无明显损伤，嗜睡，游泳异常，贫血症状明显，血液稀薄、色淡，凝固性差，鳃外观呈暗灰色，肾脏失血，呈灰白色，腹部膨胀、眼睛突出等临床症状，且检测出加州鲈鱼体表虹彩病毒阳性。根据表4的结果，在RAS系统中添加柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物，具有防止加州鲈鱼被虹彩病毒感染的作用。本方案根据加州鲈鱼成长阶段不同(幼苗期养殖密度高，鱼苗抗病毒能力差；成鱼期养殖密度低，成鱼抗病毒能力强)，柑橘黄酮和黑枸杞花青素需按照表3中的添加次数，每周向RAS养殖池中添加，可有效防止感染。每组养殖试验持续4周(28天)时间。本实施例1中的柑橘黄酮提取物是实施例1表1的序号1中提取制备的，黑枸杞花青素提取物实施例2表2的序号1中提取制备的。

表3：药物投加标准

表4：加州鲈鱼养殖实验参数设置以及养殖结果

对比例1

本对比例是在实施例1的基础上进行了改进，通过AB-8大孔树脂，将提取完毕过滤获得的提取液继续进行了纯化。具体的操作过程为：以柑橘皮渣为原料，烘干至含水率小于18.0％，粉碎至粒径0.5cm，萃取剂采用75％的乙醇溶液，料液比1:15，超声功率310W，提取温度38℃，提取时间48min，提取完毕过滤获得以黄酮类为主的提取物，再加入1％盐酸溶液调节提取物pH至5.4-5.7之间(此处称为提取液)。

在三角瓶中加入100mL提取液和100g AB-8树脂，20℃，120r/min摇床中吸附180min。然后用75％乙醇溶液进行静态解析，获得纯化后黄酮。使用AB-8树脂纯化黄酮提取液，得率在74％-75％之间，所得黄酮纯度高，但对虹彩病毒的抑制效果，远远落后于纯化前黄酮混合物对虹彩病毒的抑制效果，因此，对虹彩病毒的抑制是多种物质联合作用的结果。

实验例：使用柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物处理RAS系统中的虹彩病毒

以大鲵虹彩病毒为检测目标，按照Viral DNA Ki t说明提取病毒总DNA，通过荧光定量PCR方法，建立大鲵虹彩病毒MCP基因序列的定量分析方法。具体如下：

取1μg病毒总DNA，加入10×Taq反应缓冲液5μL,2.5mmol/L dNTPs 4μL、50μmol/LP1、P2引物各1μL、超5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL,补水至50μL,将上述反应体系混匀后进行PCR扩增。反应参数为94℃预变性5min,94℃1min,55℃1min,72℃1min,共30个循环,最后72℃延伸10min。同时设立阴性对照。结束后,取5μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mLEB)进行电泳检测。

PCR扩增产物经胶回收纯化后于16℃与pMD19-T载体连接1h,用连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。从LB琼脂平板上挑取菌落接种于5mL含50μg/mL氨苄青霉素(Amp+)的LB液体培养基中,37℃震荡培养12-14h，提取质粒。对重组质粒用P1/P2引物进PCR鉴定。重组质粒pMD19-T-MCP送往美吉测序公司测序。

引物序列为:

P1:5'-CCAAGCTT ATGTCTTCTGTAACCG-3'(SEQ ID NO.1)

P2:5'-CGGAATTC CCAAGATTGGGAATC-3'(SEQ ID NO.2)

建立标准曲线，将1×10

实际样品反应体系：20μL体系，取重组质粒2μL，依次加入10×Taq反应缓冲液2μL、2.5mmol/L dNTPs 0.4μL、50μmol/L引物GSIV FP/GSIV RP各0.4μL、25μmol/L探针GSIVprobe 0.4μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL补水至20μL，将上述反应体系混匀后进行PCR扩增。

实际样品反应参数:95℃10min；95℃10s,64℃45s,共40个循环。

引物序列以及探针序列为：

GSIV FP:5'-GCGGTTCTCACACGCAGTC-3'(SEQ ID NO.3)

GSIV RP:5'-ACGGGAGTGACGCAGGTGT-3'(SEQ ID NO.4)

GSIV probe:5'-fam-AGCCGACGGAAGGGTGTGTGAC-tamara-3'(SEQ ID NO.5)

探针(GSIV probe)5’端用FAM荧光基团标记,3’端用TAMARA荧光基团标记。

以不同阶段加州鲈鱼养殖系统为目标(系统中检测到虹彩病毒)，在添加柑橘黄酮和黑枸杞花青素之前及添加后24h分别取样，对取得水样进行100倍浓缩，测定大鲵虹彩病毒基因拷贝数，考察柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物对虹彩病毒的抑制效果。按照上述方法提取DNA，并进行荧光定量PCR，对养殖系统中的大鲵虹彩病毒进行定量分析，大鲵虹彩病毒DNA最低检测量为10pg/mL。实验设计和实验结果详见表5，在表5中，序号1-15的实验，柑橘黄酮提取物是实施例1表1的序号1中提取制备的，黑枸杞花青素提取物实施例2表2的序号1中提取制备的；序号16-20的实验，柑橘黄酮提取物(纯化黄酮提取液)是对比例1制备的。

表5：虹彩病毒抑制实验结果

由表3的数据可知，1-5仅使用了柑橘黄酮提取物，6-10仅使用了黑枸杞花青素提取物，病毒的复制扩增略有减少，但并没被有效控制。而11-15中，同时使用了柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物，并且11-15的柑橘黄酮提取物的用量较1-5少，11-15的黑枸杞花青素提取物的用量较6-10的用量少，然而两种物质连用可以有效地控制病毒的复制，将病毒的拷贝数控制在检出限以下。这说明了柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物之间存在协同增效的现象，可更为有效地抑制RAS系统中的虹彩病毒。另外，发明人还发现了柑橘黄酮提取物的制备方式会影响其作用效果，如果将柑橘黄酮完全纯化，其病毒抑制效果被削弱，详见16-20中的实验结果。这说明了，实施例1制备的柑橘黄酮提取物中虽然含有一定的“杂质”(精油、维生素等)，但是这些“杂质”可以保护黄酮类物质结构，并和黄酮类物质一起共同作用，实现对病毒的复制的抑制。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆工商大学

<120> 一种抑制RAS系统中虹彩病毒增殖的方法

<130> 2020.11.18

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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acgggagtga cgcaggtgt 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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