结合使用IL-10药剂与嵌合抗原受体细胞疗法的组合物和方法

发明领域

本发明涉及使用IL-10药剂与嵌合抗原受体细胞疗法的组合以调节免疫应答以治疗或预防疾病、病症和病况的方法。具体而言，本公开描述了结合使用IL-10药剂与嵌合抗原受体-T细胞(CAR-T细胞)疗法。

白介素-10 (IL-10)是通过对T细胞、B细胞、巨噬细胞以及抗原呈递细胞(APC)的作用来调节多种免疫应答的多效性细胞因子。由于其多效性活性，IL-10已与广泛范围的疾病、病症和病况联系起来，所述疾病、病症和病况包括炎性病况、免疫相关病症、纤维变性病症、代谢病症以及癌症。针对许多此类疾病、病症和病况用IL-10进行的临床和临床前评估已经表明其在各种人治疗应用中的治疗潜能。已经产生天然存在的和合成的各种IL-10衍生物、变体和类似物，其保留IL-10活性。人IL-10 (hIL-10)是两个IL-10多肽的同型二聚体，其中每个单体包含178个氨基酸，其中前18个包含信号肽，所述信号肽在细胞表达期间被切除，并且不形成成熟IL-10分子的一部分。IL-10多肽非共价缔合以形成二聚的IL-10分子。具体而言，已经显示IL-10的PEG化形式具有提高的活性、延长的半衰期和在某些治疗环境中的效用。

CAR-T细胞疗法代表了一种新出现的癌症疗法，尤其是在B和T细胞淋巴瘤的治疗中。CAR-T细胞疗法包括使用过继细胞转移(ACT)，一种采用受试者自身的T细胞的方法，所述T细胞使用重组DNA技术进行修饰，以表达称为嵌合抗原受体(或“CAR”)的合成的T细胞受体(“TCR”)，其改变T细胞的先天向性，以便指导工程改造T细胞结合靶标细胞。CAR通常是工程改造的融合多蛋白，其提供合成的T细胞受体，使得当CAR接触其经工程改造以与之相互作用的配体时，CAR-T细胞变得被活化。所述嵌合抗原受体通常是包含多个功能结构域的单个多肽，所述功能结构域通常是靶向胞外结构域，其在用编码CAR的表达载体转化的T细胞的外表面上表达。CAR进一步包含跨越细胞膜的跨膜结构域和介导化学反应的细胞质内胞内结构域，所述化学反应在胞外结构域与其靶标结合后提供细胞内信号传导。例如，CAR的胞外结构域可以对靶标细胞上存在的已知抗原是特异性的。通常，CAR被工程改造为结合肿瘤细胞的表面上表达的标志物。

在CAR-T细胞疗法的典型实践中，通过单采血液分离术从受试者分离T细胞，并通过用编码CAR的重组载体离体转染分离的T细胞进行遗传改造以表达CAR，导致产生重组修饰的CAR-T细胞的群体。CAR-T细胞经常使用患者来源的经重组修饰以表达CAR的记忆CD8+T细胞重组生成。离体扩增后，通常将CAR-T细胞回输至患者中，在此处CAR-T细胞循环，直至CAR的胞外结构域遇到其靶标结合配体，导致对靶标细胞群体的选择性免疫应答。

如下文中进一步讨论，CAR-T细胞疗法已经部分受到靶向表达靶标抗原的正常组织的CAR-T细胞对抗原特异性毒性的诱导和CAR-T细胞治疗的极端功效限制。已经观察到这些毒性导致威胁生命的细胞因子释放综合征。具体而言，已经观察到具有显著抗原负荷的高亲和力T细胞受体相互作用可以导致活化诱导的细胞死亡。本发明提供了组合物和方法，其提供了工程改造的CAR-T细胞的增强的活性，促进使用较低剂量的CAR-T细胞，由此使与CAR-T细胞疗法相关的不良事件最小化。

本公开考虑与IL-10药剂结合使用CAR-T细胞疗法以调节受试者中的T细胞介导的对靶标细胞群体的免疫应答的组合物和方法。

在本公开的某些实施方案中，本公开提供了调节受试者中的T细胞介导的对靶标细胞群体的免疫应答的方法，所述方法包括：

(a)从受试者获得多个T细胞；

(b)使分离的多个T细胞与重组载体接触，所述重组载体包含与在所述T细胞中有功能的表达控制序列可操作连接的编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，所述接触是所述多个T细胞对所述核酸序列的条件允许的摄取；

(c)从所述多个T细胞分离与表达编码嵌合抗原受体的核酸序列的重组载体接触的那些T细胞(CAR-T细胞)；

(d)向所述受试者施用治疗量的步骤(c)的分离的CAR-T细胞与治疗有效量的IL-10药剂的组合。

在本公开的某些实施方案中，本公开提供了调节受试者中的T细胞介导的对靶标细胞群体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者组合施用：

(a)治疗有效量的表达CAR的CAR T细胞，所述CAR的抗原识别结构域能够结合靶标细胞群体；和

(b)治疗有效量的IL-10药剂。

在某些实施方案中，本公开提供了用治疗有效量的IL-10药剂治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法，其中在施用治疗有效量的CAR-T细胞之前、同时或之后向所述受试者施用所述IL-10药剂，所述CAR-T细胞的CAR的抗原识别结构域能够结合所述疾病、病症或病况特征性的细胞的靶标群体的细胞表面分子。

在某些实施方案中，本公开提供了治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞的CAR的抗原识别结构域能够结合所述疾病、病症或病况特征性的细胞的靶标群体的细胞表面分子，所述方法包括以下步骤：(a)使所述CAR-T细胞与IL-10药剂离体接触一定时间段，和(b)向所述受试者施用治疗有效量的步骤(a)的CAR-T细胞。

在某些实施方案中，本公开提供了治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞的CAR的抗原识别结构域能够结合所述疾病、病症或病况特征性的细胞的靶标群体的细胞表面分子，所述方法包括以下步骤：(a)使所述CAR-T细胞与IL-10药剂离体接触一定时间段，和(b)向所述受试者施用治疗有效量的步骤(a)的CAR-T细胞与IL-10药剂的组合(施用于所述受试者的IL-10药剂与用于在施用前处理CAR-T细胞的IL-10药剂相同或不同)。

在某些实施方案中，本公开提供了增强CAR-T细胞的群体的细胞毒性活性的方法，其中使所述CAR-T细胞与IL-10药剂离体接触。

在某些实施方案中，本公开提供了增强CAR-T细胞的群体的免疫调节活性的方法，其中使所述CAR-T细胞与IL-10药剂离体接触。

在某些实施方案中，本公开提供了用CAR-T细胞疗法治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法，其中所述CAR-T细胞在将其施用于受试者之前用IL-10药剂离体处理。

在某些实施方案中，本公开提供了用CAR-T细胞疗法治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法，其中所述CAR-T细胞在将其施用于受试者之前用IL-10药剂离体处理，随后将IL-10处理的CAR-T细胞与IL-10药剂组合施用于所述受试者(施用于所述受试者的IL-10药剂与用于在施用前处理CAR-T细胞的IL-10药剂相同或不同)。

在某些实施方案中，本公开提供了用CAR-T细胞疗法治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法，其中所述CAR-T细胞在将其施用于受试者之前用IL-10药剂离体处理，其中用编码CAR和IL-10药剂的重组载体转染CAR-T细胞，其中载体编码的IL-10药剂与用于在施用前离体处理细胞的IL-10药剂相同或不同。

在某些实施方案中，本公开提供了用CAR-T细胞疗法治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法，其中所述CAR包含特异性识别和结合肿瘤细胞上存在的癌抗原的抗原特异性结构域(ASD)。

在某些实施方案中，本公开提供了用与IL-10药剂的施用组合的CAR-T细胞疗法治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法，其中所述IL-10药剂增强活化的记忆CD8+ T细胞的功能。

在某些实施方案中，本公开提供了用与IL-10药剂的施用组合的CAR-T细胞疗法治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法，其中将所述IL-10药剂以足以增强CAR-T细胞的细胞毒性功能的量施用于所述受试者。

在某些实施方案中，本公开提供了用与IL-10药剂的施用组合的CAR-T细胞疗法治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法，其中将所述IL-10药剂施用于所述受试者，以足以在一定时间段内维持至少1 ng/ml的IL-10血清谷浓度。

在某些实施方案中，本公开提供了用与IL-10药剂的施用组合的CAR-T细胞疗法治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法，其中将所述IL-10药剂皮下施用于所述受试者。

在某些实施方案中，本公开提供了用与IL-10药剂的施用组合的CAR-T细胞疗法治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法，其中结合向受试者引入经基因修饰以表达IL-10药剂的细胞，将所述IL-10药剂施用于所述受试者用于治疗或预防所述受试者中的疾病、病症或病况(例如，癌症相关的病症)。

在某些实施方案中，本公开提供了用与IL-10药剂的施用组合的CAR-T细胞疗法治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法，其中所述施用调节受试者中的T细胞介导的对靶标细胞群体的免疫应答，所述方法包括向所述受试者引入治疗有效的多个细胞，所述细胞经基因修饰以表达：a)嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够结合靶标细胞群体的抗原特异性靶向区域；和b)治疗有效量的IL-10药剂。

在其中所述CAR-T细胞经修饰以表达IL-10药剂的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体和所述IL-10药剂由同一载体表达，而在其他实施方案中，所述嵌合抗原受体和所述IL-10药剂由不同载体表达。

在具体实施方案中，将治疗有效的多个细胞用表达治疗有效量的IL-10药剂的载体转染，其中所述治疗有效量是足以增强CAR-T细胞的细胞毒性功能的量。所述载体可以是例如质粒或病毒载体。在具体实施方案中，所述IL-10药剂的表达由表达控制元件调节。在具体实施方案中，IL-10药剂的表达由表达控制元件调节以维持IL-10药剂的血清谷浓度在或高于近似0.1 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、1.5 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、5 ng/ml，或所述IL-10药剂的EC50。

在具体实施方案中，所述多个细胞获得自受试者并离体基因修饰。可以通过单采血液分离术从受试者获得多个细胞。在一些实施方案中，所述多个细胞是记忆CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述多个细胞包含受试者来源的CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞并不源自待施用的受试者。

在某些实施方案中，本公开提供了用与IL-10药剂的施用组合的CAR-T细胞疗法治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者引入：a)治疗有效的经基因修饰以表达嵌合抗原受体的第一多个细胞，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够结合靶标细胞群体的抗原特异性靶向区域；和b)经基因修饰以表达和任选地分泌治疗有效量的IL-10药剂的第二多个细胞。在具体实施方案中，第二治疗有效的多个细胞用表达足以增强CAR-T细胞的细胞毒性功能的量的IL-10药剂的载体转染。在具体实施方案中，治疗有效的第二多个细胞包含用表达所述IL-10药剂的载体转染的患者来源的CD8+ T细胞。

在具体实施方案中，所述第一多个细胞获得自受试者并离体基因修饰，而在其他实施方案中，所述第二多个细胞获得自受试者并离体基因修饰。本公开考虑这样的实施方案，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞通过单采血液分离术方法从受试者获得。在一些实施方案中，所述第一多个细胞是记忆CD8+ T细胞，且所述第二多个细胞是幼稚的CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞是自体肿瘤细胞。

本公开还考虑CAR-T细胞疗法用于与IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)的施用或表达IL-10药剂的载体的引入组合治疗或预防受试者中的疾病、病症或病况(例如，癌症相关的病症)的用途。

一个具体实施方案包括治疗具有癌症相关的疾病、病症或病况(例如，肿瘤)的受试者的方法，其包括：a)向所述受试者引入治疗有效的经基因修饰以表达嵌合抗原受体的多个细胞，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够特异性结合靶标细胞群体的靶标细胞的表面上存在的抗原的抗原特异性结构域；和b)向所述受试者施用治疗有效量的IL-10药剂。

在本公开的某些实施方案中，此类方法用于治疗方案中用于预防受试者中的癌症相关的疾病、病症或病况，而在其他实施方案中，此类方法用于治疗方案中用于预防免疫相关的病症。本文其他地方描述了上述方法的另外方面，包括IL-10药剂的给药参数和方案以及此类药剂的示例性类型。

在某些实施方案中，本公开提供了包含编码CAR和IL-10药剂的核酸序列的重组载体及其使用方法。在一些实施方案中，所述CAR针对肿瘤抗原，且所述IL-10药剂是hIL-10。在一些实施方案中，所述载体包含编码CAR的第一核酸序列和编码IL-10药剂的第二核酸序列，其中所述第一和第二核酸序列分别可操作连接至第一和第二表达控制元件，所述第一和第二表达控制元件是相同或不同的。

在某些实施方案中，本公开提供了包含编码CAR和IL-10药剂的核酸序列的重组载体，所述载体包含多顺反子核酸，所述多顺反子核酸包含编码CAR的第一核酸序列和编码IL-10药剂的第二核酸序列，其中所述多顺反子核酸序列可操作连接至表达控制元件，所述多顺反子核酸任选地提供增强所述第二核酸序列的表达的间插序列(例如IRES或FMVD2A序列)。在某些实施方案中，所述载体是病毒载体。在某些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。

在某些实施方案中，本公开提供了包含编码CAR和IL-7药剂的核酸序列的重组载体及其使用方法。

在某些实施方案中，本公开提供了包含编码CAR和IL-12药剂的核酸序列的重组载体及其使用方法。

在某些实施方案中，本公开提供了包含编码CAR和IL-15药剂的核酸序列的重组载体及其使用方法。

在某些实施方案中，本公开提供了包含编码CAR和IL-18药剂的核酸序列的重组载体及其使用方法。

在某些实施方案中，本公开提供了包含编码CAR和ITIM抑制剂的核酸序列的重组载体及其使用方法。

在某些实施方案中，本公开提供了包含编码CAR和IL-7受体的核酸序列的重组载体及其使用方法。

在某些实施方案中，本公开提供了包含编码CAR和IL-10受体的核酸序列的重组载体及其使用方法。

在某些实施方案中，本公开提供了包含编码CAR和IL-12受体的核酸序列的重组载体及其使用方法。

在某些实施方案中，本公开提供了包含编码CAR和IL-15受体的核酸序列的重组载体及其使用方法。

在某些实施方案中，本公开提供了包含编码CAR和IL-18受体的核酸序列的重组载体及其使用方法。

本公开的额外实施方案考虑治疗具有癌症相关的疾病、病症或病况的受试者的方法，其包括向所述受试者引入治疗有效的多个细胞，所述细胞经基因修饰以表达：a)嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够结合靶标细胞群体的抗原特异性靶向区域，和b) IL-10药剂。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体和所述IL-10药剂由同一载体表达，而在其他实施方案中，所述嵌合抗原受体和所述IL-10药剂由不同载体表达。

在具体实施方案中，治疗有效的多个细胞用表达足以增强T细胞的细胞毒性功能的量的IL-10药剂的载体转染。所述载体可以是例如非病毒或病毒载体。本公开还考虑使用表达IL-10药剂的任何其他方式。在具体实施方案中，所述IL-10药剂的表达由表达控制元件调节。在具体实施方案中，所述表达控制元件是可调节的启动子。在具体实施方案中，所述表达控制元件是组织特异性启动子。

在上述实施方案中，所述多个细胞可以获得自受试者并离体基因修饰。根据本公开的一些实施方案，通过单采血液分离术方法从受试者获得多个细胞，其在扩增后和在施用前一定时间段用至少一种IL-10药剂处理，所述时间段是在施用于所述受试者前少于约48小时、少于约36小时、少于约24小时、少于约18小时、少于约12小时、少于约6小时、少于约4小时、少于约2小时或少于约1小时。所述多个细胞在具体实施方案中包含记忆CD8+ T细胞，并且在其他实施方案中包含自体肿瘤细胞。

本公开的又进一步实施方案考虑治疗具有癌症相关的疾病、病症或病况的受试者的方法，其包括向所述受试者引入：a)治疗有效的经基因修饰以表达嵌合抗原受体的第一多个细胞，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够结合靶标细胞群体的抗原特异性靶向区域，和b)治疗有效的经基因修饰以表达IL-10药剂的第二多个细胞。

在某些实施方案中，上述方法用于治疗方案中用于预防受试者中的疾病、病症或病况，包括癌症或免疫相关的疾病、病症或病况。

在具体实施方案中，治疗有效的第一多个细胞用表达足以增强细胞毒性功能的量的IL-10药剂的载体转染。在还有其他实施方案中，治疗有效的第二多个细胞包含用表达所述IL-10药剂的载体转染的CD8+ T细胞。

在具体实施方案中，所述第一多个细胞获得自受试者并离体基因修饰，而在其他实施方案中，所述第二多个细胞获得自受试者并离体基因修饰。本公开考虑这样的实施方案，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞通过单采血液分离术方法从受试者获得。在一些实施方案中，所述第一多个细胞是记忆CD8+ T细胞，且所述第二多个细胞是幼稚的CD8+ T细胞。在还有其他实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞是自体肿瘤细胞。

在前述实施方案各自中，所述靶标细胞群体可以包含肿瘤抗原，其实例在本文其他地方描述。

本公开考虑编码本文所述的IL-10药剂的核酸分子。在某些实施方案中，将编码IL-10药剂的核酸分子可操作连接至表达控制元件，所述表达控制元件使编码IL-10药剂的核酸分子在用DNA分子转化的细胞中表达。在一些实施方案中，载体(例如，质粒或病毒载体)包含核酸分子。本文还考虑表达IL-10药剂的转化细胞或宿主细胞。

本公开考虑将前述药剂和方法与额外治疗方式组合使用，所述额外治疗方式包括但不限于施用额外化学治疗剂，免疫调节分子，包括免疫检查点调节剂，细胞因子药剂，细胞因子变体药剂，细胞因子类似物药剂和修饰的细胞因子药剂，特别包括此类细胞因子药剂的融合蛋白及其PEG化形式。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有肿瘤疾病的哺乳动物受试者的方法，所述方法包括：

a. 获得源自患者的T细胞的样品；

b. 用载体转导样品中的T细胞的级分，所述载体包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，所述核酸序列与一个或多个控制元件可操作缔合以实现编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列在T细胞中的转录和翻译，以便生成表达CAR的T细胞的群体；

c. 分离表达CAR的T细胞(CAR-T细胞)；

d. 在IL-10药剂存在的情况下离体培养所述CAR-T细胞；和

e. 将来自步骤(d)的CAR-T细胞施用于所述哺乳动物受试者。

在一个实施方案中，本发明提供了另外的步骤：(f)向所述受试者施用包含治疗有效量的IL-10药剂的药物制剂。在一个实施方案中，步骤(d)的IL-10药剂和步骤(f)的药物制剂的IL-10药剂是相同的IL-10药剂。在一个实施方案中，步骤(d)的IL-10药剂和步骤(f)的药物制剂的IL-10药剂是不同的IL-10药剂。在一个实施方案中，步骤(d)的IL-10药剂是rhIL-10，且步骤(f)的IL-10药剂的药物制剂包含PEG化的IL-10药剂。在一个实施方案中，所述药物制剂包含单-PEG化的IL-10药剂。在一个实施方案中，所述药物制剂包含单-PEG化的IL-10药剂和二PEG化的IL-10药剂的混合物。在一个实施方案中，包含IL-10药剂的药物制剂的施用足以在至少72小时的时段内维持至少0.01ng/ml的受试者中的IL-10药剂的血清谷浓度，或者在至少72小时的时段内维持至少0.05ng/ml的受试者中的IL-10药剂的血清谷浓度，或者在至少72小时的时段内维持至少0.1ng/ml的受试者中的IL-10药剂的血清谷浓度，或者在至少72小时的时段内维持至少0.5ng/ml的受试者中的IL-10药剂的血清谷浓度。

在一个实施方案中，本公开提供了调节受试者中的T细胞介导的对靶标细胞群体的免疫应答的方法，其包括：

a)向所述受试者引入治疗有效的经基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的多个细胞，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够结合靶标细胞群体的抗原特异性靶向区域；和

b)向所述受试者施用治疗有效量的IL-10药剂，其中所述IL-10药剂的施用导致至少0.01 ng/ml的血清谷水平。在一些实施方案中，所述IL-10药剂是单-PEG化的IL-10药剂或单-PEG化的IL-10药剂和二PEG化的IL-10药剂的混合物。在一些实施方案中，向所述受试者施用IL-10药剂足以在至少72小时的时段内维持至少0.03 ng/ml、或者至少0.06 ng/ml、或者至少0.1 ng/ml、或者至少0.5 ng/ml、或者至少1 ng/ml、或者至少2 ng/ml、或者至少5ng/ml的受试者中的IL-10药剂的血清谷浓度。

本公开进一步提供了调节受试者中的T细胞介导的对靶标细胞群体的免疫应答的方法，其包括向所述受试者引入治疗有效的多个细胞，所述细胞经基因修饰以表达：

a)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够结合靶标细胞群体的抗原特异性靶向区域，和

b) IL-10药剂，

由此调节T细胞介导的免疫应答。

在另一个实施方案中，本公开提供了调节受试者中的T细胞介导的对靶标细胞群体的免疫应答的方法，其包括向所述受试者引入：

a)治疗有效的经基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的第一多个细胞，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够结合靶标细胞群体的抗原特异性靶向区域；和

b)治疗有效的经基因修饰以表达IL-10药剂的第二多个细胞。

在一些实施方案中，基因修饰的细胞对IL-10药剂的表达提供了至少0.005 ng/ml、或者至少0.01 ng/ml、或者至少0.05 ng/ml、或者至少0.1 ng/ml、或者至少0.2 ng/ml、或者至少0.5 ng/ml、或者至少1 ng/ml或者至少2 ng/ml的靶标细胞微环境中的局部IL-10药剂浓度。

在另一个实施方案中，本公开提供了通过使T细胞与有效量的IL-10药剂接触来抑制CAR-T细胞中的凋亡的方法。在一些实施方案中，所述方法离体实施，且在缓冲溶液中提供了一定量的IL-10药剂，其具有大于约0.005 ng/ml、或者至少0.01 ng/ml、或者至少0.05ng/ml、或者至少0.1 ng/ml、或者至少0.2 ng/ml、或者至少0.5 ng/ml、或者至少1 ng/ml、或者至少2 ng/ml的IL-10药剂的浓度。在一些实施方案中，所述方法在受试者中体内实施，且向所述受试者施用的IL-10药剂的量足以在至少72小时的时段内维持至少0.03 ng/ml、或者至少0.06 ng/ml、或者至少0.1 ng/ml、或者至少0.5 ng/ml、或者至少1 ng/ml、或者至少2 ng/ml、或者至少5 ng/ml的受试者中的IL-10药剂的血清谷浓度。

在一些实施方案中，采用的CAR-T细胞提供抗原识别结构域(ARD)，其中所述CAR的ARD是特异性结合以下的多肽：HER2、MUC1、端粒酶、PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、T1、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3 TCR、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(FRa)、血小板衍生的生长因子受体A或Wnt1抗原。在一些实施方案中，所述CAR的抗原识别结构域选自：抗CD19 scFv、抗PSA scFv、抗CD19 scFv、抗HER2 scFv、抗CEA scFv、抗EGFR scFv、抗MUC1 scFv、抗HER2-neu scFv、抗VEGF-R2 scFv、抗T1 scFv、抗CD22 scFv、抗ROR1 scFv、抗间皮素scFv、抗CD33/IL3RascFv、抗c-Met scFv、抗PSMA scFv、抗糖脂F77 scFv、抗FAP scFv、抗EGFRvIII scFv、抗GD-2 scFv、抗NY-ESO-1 scFv、抗MAGE scFv、抗A3 scFv、抗5T4 scFv、抗WT1 scFv或抗Wnt1scFv。

在一些实施方案中，如本文所述采用的CAR-T细胞提供了细胞内信号传导结构域，其包含源自CD27、CD28、CD137、CD278、CD134、FcεR1γ和β链、MB1 (Igα)链、B29 (Igβ)链、人CD3ζ链、CD3、syk家族酪氨酸激酶、src家族酪氨酸激酶、CD2、CD5或CD28的细胞质结构域的氨基酸序列。在一个实施方案中，对于在该方法的实践中使用的CAR-T细胞，提供了细胞内信号传导结构域，其包含源自CD28、CD137 (4-1BB)、CD134 (OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30和CD40的细胞质结构域的氨基酸序列。前述方法可以与向所述受试者施用一种或多种补充剂组合，所述补充剂包括化学治疗剂、免疫检查点调节剂、IL-2药剂、IL-7药剂、IL-12药剂、IL-15药剂和IL-18药剂，尤其是其中选自以下的免疫检查点调节剂：PD1调节剂、PDL1调节剂、CTLA4调节剂、LAG-3调节剂、TIM-3调节剂、ICOS调节剂、OX40调节剂、cd-27调节剂、CD-137调节剂、HVEM调节剂、CD28调节剂、CD226调节剂、GITR调节剂、BTLA调节剂、A2A调节剂、IDO调节剂和VISTA调节剂。

在一个实施方案中，本公开提供了重组载体，其包含编码IL-10药剂、CAR和细胞因子的核酸序列，所述核酸序列可操作连接至表达控制序列。在一些实施方案中，所述重组载体编码特异性结合以下的多肽：HER2、MUC1、端粒酶、PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、T1、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(FRa)、血小板衍生的生长因子受体A或Wnt1抗原，尤其是其中所述CAR的抗原识别结构域选自：抗CD19 scFv、抗PSA scFv、抗CD19scFv、抗HER2 scFv、抗CEA scFv、抗EGFR scFv、抗MUC1 scFv、抗HER2-neu scFv、抗VEGF-R2scFv、抗T1 scFv、抗CD22 scFv、抗ROR1 scFv、抗间皮素scFv、抗CD33/IL3Ra scFv、抗c-MetscFv、抗PSMA scFv、抗糖脂F77 scFv、抗FAP scFv、抗EGFRvIII scFv、抗GD-2 scFv、抗NY-ESO-1 scFv、抗MAGE scFv、抗A3 scFv、抗5T4 scFv、抗WT1 scFv或抗Wnt1 scFv。在其他实施方案中，所述重组载体编码CAR，其中所述CAR的细胞内信号传导结构域包含源自CD27、CD28、CD137、CD278、CD134、FcεR1γ和β链、MB1 (Igα)链、B29 (Igβ)链、人CD3ζ链、CD3、syk家族酪氨酸激酶、src家族酪氨酸激酶、CD2、CD5或CD28的细胞质结构域的氨基酸序列，且任选地或另外，包含源自一个或多个共刺激结构域的氨基酸序列的多肽，所述共刺激结构域源自CD28、CD137 (4-1BB)、CD134 (OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30和CD40的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，由所述载体编码的细胞因子选自IL-7、IL-12、IL-15和IL18及其变体。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体，包括慢病毒载体。

本公开进一步提供了用前述载体转化的修饰的T细胞。

本公开进一步提供了包含CAR-T细胞和IL-10药剂的药物制剂，包括其中IL-10药剂被PEG化的情况。

基于本公开的教导，其他实施方案对于技术人员将是显而易见的。尽管一般在使用CAR-T细胞疗法用于治疗癌症的背景下描述本公开，但应当理解，这种疗法不限于此。

在进一步描述本公开之前，应理解本公开不限于本文阐述的具体实施方案，并且还应理解本文所使用的术语仅是出于描述具体实施方案的目的，而不意在限制性。

在提供数值范围的情况下，应理解在该范围的上下限和在该规定范围的任何其他规定或中间值之间的各个中间值(除非上下文另外明确地规定，否则至下限的单位的十分之一)都涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，受限于所述规定范围内任何明确排除的限值。当规定的范围包括一个或两个限值时，排除那些包括的限值中的任一个或两个限值的范围也包括在本发明中。

必须注意，如在本文中和在所附权利要求中所使用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物，除非上下文另外清楚地指出。应进一步注意，所述权利要求可以经拟订以排除任何任选的要素。因此，本声明意图充当与权利要求要素的叙述相关的此类排除性术语诸如“只是”、“仅仅”等的使用或“否定”限制的使用的前提基础。

除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度以摄氏度(℃)计并且压力是大气压或接近大气压。使用标准缩写，包括以下：bp = 碱基对；kb = 千碱基；pl =皮升；s或sec = 秒；min = 分钟；h或hr = 小时；aa = 氨基酸；kb = 千碱基；nt = 核苷酸；pg = 皮克；ng = 纳克；μg = 微克；mg = 毫克；g = 克；kg = 千克；dl或dL = 分升；μl或μL= 微升；ml或mL = 毫升；l或L = 升；μM = 微摩尔；mM = 毫摩尔；M = 摩尔；kDa = 千道尔顿；i.m. =肌肉内(地)；i.p. = 腹膜内(地)；SC或SQ = 皮下(地)；QD = 每天；BID = 每天两次；QW = 每周；QM = 每月；HPLC = 高效液相色谱法；BW = 体重；U = 单位；ns = 非统计学显著的；PBS = 磷酸盐缓冲盐水；PCR = 聚合酶链式反应；NHS = N-羟基琥珀酰亚胺；HSA= 人血清白蛋白；MSA = 小鼠血清白蛋白；DMEM = Eagle氏培养基的Dulbeco氏改良；GC =基因组拷贝；EDTA = 乙二胺四乙酸。

分子生物学中的标准方法被描述于科学文献(参见，例如，Sambrook和Russell(2001) Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor，N.Y.；以及Ausubel等人，(2001) Current Protocols in MolecularBiology, 第1-4卷，John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y.，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷))。所述科学文献描述了用于蛋白纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱法、电泳、离心和结晶，以及化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生以及蛋白的糖基化(参见，例如，Coligan等人，(2000) Current Protocols in ProteinScience，第1-2卷，John Wiley and Sons, Inc., NY)。

将理解，贯穿本公开，根据单字母或三字母代码来参考氨基酸。为了读者方便，以下提供了单字母和三字母氨基酸代码：

除非另外指明，否则以下术语意图具有下文阐述的含义。在整个说明书的其他地方定义了其他术语。除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语应被解释为具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

PD-1中的氨基酸残基的编号是指SEQ ID NO:58中所示的全长多肽。SEQ ID NO:58的氨基酸1-20定义信号序列，其在翻译处理期间被除去，导致产生包含SEQ ID NO:58的氨基酸21-288的“成熟PD1”分子。SEQ ID NO:58的氨基酸171-191定义跨膜结构域，且残基192-288定义细胞质结构域。术语PD-1包括天然存在的变体，包括在位置215处的丙氨酸被取代为缬氨酸的天然存在的变体。氨基酸21 -170定义具有以下氨基酸序列的PD-1的150个氨基酸的细胞外结构域：

所述细胞外结构域在残基49、58、74和116处具有四个糖基化位点，并且在残基54和123之间存在二硫键。

术语“IL-10药剂”应当广泛地解释并且包括例如人和非人IL-10相关多肽，包括同源物、变体(包括突变蛋白)及其片段、以及具有例如前导序列(例如，信号肽)的IL-10多肽和前述部分的修饰形式。在另外的具体实施方案中，IL-10、IL-10多肽和IL-10药剂是激动剂。

术语“IL10多肽”包括包含保守氨基酸取代的IL-10多肽。术语“保守氨基酸取代”是指通过如下保留蛋白的活性的取代：将蛋白中的氨基酸置换为侧链具有与所述侧链相似的酸度、碱度、电荷、极性或大小的侧链的氨基酸。保守氨基酸取代通常要求在以下组内的氨基酸残基的取代：(a) L、I、M、V、F；(b) R、K；(c) F、Y、H、W、R；(d) G、A、T、S；(e) Q、N；和/或(f) D、E。取代、插入或缺失的指导可以基于来自不同物种的不同的变体蛋白或蛋白的氨基酸序列的比对。因此，除了任何天然存在的IL-10多肽以外，本公开涵盖具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代、插入或缺失的IL-10多肽。在一些实施方案中，所述IL-10多肽具有少于20、10或5个氨基酸取代、插入或缺失，其中所述取代通常是保守氨基酸取代。

在一些情况下，IL-10多肽除了肽键以外还包括一个或多个键，例如，至少两个邻近氨基酸经由除了酰胺键以外的键连接，以减少或消除不期望的蛋白水解或其他降解方式，和/或增加血清稳定性，和/或限制或增加构象柔性，可以取代IL-10的主链内的一个或多个酰胺键。IL-10多肽中的一个或多个酰胺键(-CO-NH-)可以由作为酰胺键的电子等排体的键置换，所述键诸如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH

术语“IL-10多肽”包括这样的IL-10多肽，其包含一个或多个氨基酸取代，包括但不限于：a) 烷基取代的疏水性氨基酸的取代，所述烷基取代的疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、正亮氨酸、(S)-2-氨基丁酸、(S)-环己基丙氨酸或由来自C

术语“IL-10多肽”包括这样的IL-10多肽，其包含一个或多个天然存在的非基因编码的L-氨基酸、合成L-氨基酸、或氨基酸的D-对映异构体。例如，IL-10可以仅包含D-氨基酸。例如，IL-10多肽可以包含以下残基中的一种或多种：羟脯氨酸、β-丙氨酸、邻-氨基苯甲酸、间-氨基苯甲酸、对-氨基苯甲酸、间-氨基甲基苯甲酸、2,3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、鸟氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩基丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、2,4-二氨基丁酸、ρ-氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、ε-氨基己酸、ω-氨基己酸、ω-氨基庚酸、ω-氨基辛酸、ω-氨基癸酸、ω-氨基十四烷酸、环己基丙氨酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、δ-氨基戊酸以及2,3-二氨基丁酸。

术语“IL10多肽”包括这样的IL-10多肽，其包含一个或多个另外的半胱氨酸残基或半胱氨酸类似物，以促进IL-10多肽经由二硫键与另一多肽的连接或提供IL-10多肽的环化。引入半胱氨酸或半胱氨酸类似物的方法是本领域中已知的；参见，例如，美国专利号8,067,532。

术语“IL10多肽”包括环化的多肽。环化键可以用氨基酸(或用氨基酸和-(CH2)

术语“IL-10多肽”包括另外的修饰，包括例如N-烷基(或芳基)取代(ψ[CONR])，或用于构建内酰胺和其他环状结构的主链交联。其他衍生物包括C-末端羟甲基衍生物、o-修饰的衍生物(例如，C-末端羟甲基二苯醚)、N-末端修饰的衍生物，包括取代的酰胺，诸如烷基酰胺和酰肼。

术语“IL-10多肽”包括逆向反转类似物(参见，例如，Sela和Zisman (1997) FASEBJ. 11:449)。逆向反转肽类似物是线性多肽的异构体，其中氨基酸序列的方向被逆转(retro)，并且其中一个或多个氨基酸的手性D-或L-被反转(inverso)，例如，使用D-氨基酸而不是L-氨基酸。[参见，例如，Jameson等人，(1994) Nature 368:744；以及Brady等人，(1994) Nature 368:692]。

术语“IL-10多肽”包括修饰以包括“蛋白转导结构域”(PTD)。术语“蛋白转导结构域”是指促进横穿脂质双层、胶束、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、多核苷酸、碳水化合物或者有机分子或无机分子。附接至另一个分子的PTD促进分子横穿膜，例如从细胞外空隙进入细胞内空隙或从细胞溶质进入细胞器内。在一些实施方案中，PTD共价地连接至IL-10多肽的氨基末端，而在其他实施方案中，PTD共价地连接至IL-10多肽的羧基末端。示例性蛋白转导结构域包括但不限于最小的十一肽蛋白转导结构域(对应于包含YGRKKRRQRRR的HIV-1 TAT的残基47-57；SEQ ID NO:1)；包含足以直接进入细胞中的许多精氨酸残基(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或10-50个精氨酸)的多精氨酸序列；VP22结构域(Zender等人，(2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96)；果蝇触角蛋白转导结构域(Noguchi等人，(2003) Diabetes 52(7):1732-1737)；截短的人降钙素肽(Trehin等人，(2004) Pharm.Research 21:1248-1256)；多赖氨酸(Wender等人，(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA97:13003-13008)；RRQRRTSKLMKR (SEQ ID NO:2)；运输蛋白GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:3)；KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA(SEQ ID NO:4)；和RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:5)。示例性PTD包括但不限于YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:6)，RKKRRQRRR (SEQ ID NO:7)；具有3个精氨酸残基至50个精氨酸残基的精氨酸均聚物；示例性PTD结构域氨基酸序列包括但不限于以下的任一种：YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:8)；RKKRRQRR (SEQ ID NO:9)；YARAAARQARA (SEQ ID NO:10)；THRLPRRRRRR (SEQ ID NO:11)；和GGRRARRRRRR (SEQ ID NO:12)。

IL-10多肽的C-末端处的氨基酸的羧基COR

IL-10多肽的N-末端处的氨基酸NR1R2的氨基可以游离形式(R1 = H和R2 = H)存在，或者以生理上耐受的盐诸如例如氯化物或乙酸盐的形式存在。氨基也可以用酸来乙酰化，使得R1 = H并且R2 =乙酰基、三氟乙酰基或金刚烷基。氨基可以以受肽化学中常规使用的氨基保护基团(诸如上文提供的那些(例如，Fmoc、苯氧基-羰基(Z)、Boc和Alloc))保护的形式存在。氨基可以是N-烷基化的，其中R

术语“IL10多肽”包括IL-10多肽的活性片段。术语“活性IL-10多肽片段”是指这样的IL-10多肽，其是天然存在的IL-10种类的片段(例如，子序列)，其包含衍生自天然存在的IL-10种类的连续氨基酸残基，其能够与另一个IL-10多肽二聚化，这种二聚体具有IL-10活性。肽或多肽子序列的连续氨基酸残基的长度根据衍生所述子序列的特定的天然存在的氨基酸序列而变化。通常，肽和多肽可以为约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸直至全长肽或多肽。术语“IL-10多肽的活性片段”包括这样的IL-10多肽，其包括从成熟(即不包括信号肽序列) IL-10多肽的N-末端缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸。术语“IL-10多肽的活性片段”包括这样的IL-10多肽，其包括从成熟(即不包括信号肽序列) IL-10多肽的C-末端缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸。

此外，IL-10多肽在限定长度的连续氨基酸(例如，“比较窗口”)内与参考序列相比可以具有限定的序列同一性。比对用于比较的序列的方法是本领域中众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下方式来实施：例如Smith & Waterman, (1981) Adv.Appl. Math. 2:482的局部同源性算法；Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443的同源性比对算法；Pearson & Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444的相似性方法的搜索；这些算法的计算机化实施方式(Wisconsin Genetics SoftwarePackage, Madison, Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或人工比对和视觉检查(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人编，1995增刊))。用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白折叠、功能结构域、糖基化位点以及序列比对的软件包和数据库是可用的(参见，例如GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego,CA)；以及DeCypher™ (TimeLogic Corp., Crystal Bay, NV)。

作为一个实例，合适的IL-10多肽可以包含一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸直至全长肽或多肽的连续延伸段具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%或至少约99%的氨基酸序列同一性。

如下文进一步论述，IL-10多肽可以从天然来源(例如，除了其天然存在的环境以外的环境)分离并且也可以重组制得(例如，在基因修饰的宿主细胞诸如细菌、酵母、毕赤酵母属、昆虫细胞等中)，其中基因修饰的宿主细胞用包含编码多肽的核苷酸序列的核酸来修饰。IL-10多肽也可以是合成产生的(例如，通过不含细胞的化学合成)。

本公开考虑由从各种哺乳动物和非哺乳动物来源获得的IL-10多肽(包括直系同源物及其修饰形式)构成的IL-10药剂。除了人多肽和编码所述人多肽的核酸分子以外，本公开还考虑来自其他物种的IL-10多肽和相应的核酸分子，所述其他物种包括鼠、大鼠(登录号NP_036986.2；GI 148747382)；牛(登录号NP_776513.1；GI 41386772)；绵羊(登录号NP_001009327.1；GI 57164347)；狗(登录号ABY86619.1；GI 166244598)；和兔(登录号AAC23839.1；GI 3242896)。源自非哺乳动物来源的IL-10药剂的实例包括源自以下的病毒IL-10：疱疹病毒科疱疹病毒亚科，巨细胞病毒属，包括人巨细胞病毒(Genbank登录号AAR31656和ACR49217)，绿猴巨细胞病毒(Genbank登录号AEV80459)，猕猴巨细胞病毒(Genbank登录号AAF59907)，狒狒巨细胞病毒(Genbank登录号AAF63436)，枭猴巨细胞病毒(Genbank登录号AEV80800)和松鼠猴巨细胞病毒(Genbank登录号AEV80955)；伽马疱疹病毒科，淋巴隐病毒属Epstein-Barr病毒(Genbank登录号CAD53385)，倭黑猩猩疱疹病毒(Genbank登录号XP_003804206.1)，猕猴淋巴隐病毒(Genbank登录号AAK95412)，狒狒淋巴隐病毒(Genbank登录号AAF23949)；马卡病毒属，包括绵羊疱疹病毒2(Genbank登录号AAX58040)；percavirus属，包括马疱疹病毒2(Genbank登录号AAC13857)；异疱疹病毒科(alloherpesviridea)，cyprinivirus属，包括鲤疱疹病毒3(Genbank登录号ABG429610)，鳗疱疹病毒1(Genbank登录号AFK25321)；痘病毒科，chodopoxvirinae亚科，副痘病毒属，包括orf病毒(Genbank登录号AAR98352)，牛丘疹性口炎病毒(Genbank登录号AAR98483)，假牛痘病毒(Genbank登录号ADC53770)；羊痘病毒属，包括块状皮肤病病毒(Genbank登录号AAK84966)，绵羊痘病毒(Genbank登录号NP_659579)，山羊痘病毒(Genbank登录号YP_00129319)和禽痘病毒，包括金丝雀痘病毒(Genbank登录号NP_955041)。

在一个实施方案中，所述IL-10多肽是人IL-10多肽。如本文所用，术语“人IL-10”或“hIL10”是指由两个人iIL-10多肽构成的IL10药剂。在一个实施方案中，人IL-10多肽是具有以下氨基酸序列(氨基至羧基末端)的160个氨基酸的多肽：

在一个实施方案中，人IL-10多肽是具有以下氨基酸序列(氨基至羧基末端)的161个氨基酸的多肽：

在一个实施方案中，人IL-10多肽是具有以下氨基酸序列(氨基至羧基末端)的161个氨基酸的多肽：

N-甲酰基

应注意，结合本公开的多肽和核酸分子对“人”的任何提及并不意图对多肽或核酸获得的方式或来源作出限制，而是仅对序列作出参考，因为所述序列可以对应于天然存在的人多肽或核酸分子的序列。

术语“IL-10活性”是指IL-10药剂通常通过结合IL-10受体而发挥其作用。IL-10受体，II型细胞因子受体，由α和β亚基组成，也分别称为R1和R2。受体活化需要结合α和β两者。二聚IL-10的一个IL-10单体结合α，而IL-10的另一IL-10单体结合β。IL-10活性可以通过本领域中众所周知的测定法来评价。例如，可以通过使用TNF-α抑制测定法、MC9增殖测定法、CD8 T细胞IFNγ分泌测定法或在如下提供的肿瘤模型和肿瘤分析中测定IL-10药剂的IL-10活性。然而，技术人员理解，以下测定是测定IL-10活性的代表性测定法，而不是排他性的。技术人员将理解，可以单独或组合使用任何本领域公认的测量IL-10活性的测定法或方法来评估本文所述的IL-10药剂的活性。

IL-10药剂的IL-10活性可以基本上根据以下TNFα抑制测定法来评价。简而言之，U937细胞(可得自Sigma-Aldrich (#85011440)；St. Louis, MO的来自肺的淋巴母细胞人细胞系)的PMA-刺激引起细胞分泌TNFα，并且随后用具有IL-10活性的测试剂处理这些TNFα分泌细胞将导致TNFα分泌以剂量依赖性方式减少。示例性TNFα抑制测定可以使用以下方案来进行。在含有10% FBS/FCS和抗生素的RMPI中培养U937细胞之后，将1 x 10

IL-10药剂的IL-10活性可以基本上根据以下MC/9细胞增殖测定法来评价。简而言之，将具有IL-10活性的化合物施用于MC/9细胞引起细胞增殖以剂量依赖性方式增加。MC/9是可得自Cell Signaling Technology; Danvers, MA的鼠细胞系，其具有肥大细胞的特征。Thompson-Snipes, L.等人((1991) J. Exp. Med. 173:507-10)描述了标准测定方案，其中MC/9细胞补充有IL3 + IL10和IL3 + IL4 + IL10。本领域普通技术人员将能够修改Thompson-Snipes, L.等人中描述的标准测定方案，使得细胞仅补充有IL-10。

IL-10药剂的IL-10活性可以基本上根据以下CD8 T细胞IFNγ分泌测定法来评价。简而言之，活化的原代人CD8 T细胞在用具有IL-10活性的化合物处理且然后用抗CD3抗体处理时分泌IFNγ。以下方案提供了示例性CD8 T细胞IFNγ分泌测定。人原代外周血单核细胞(PBMC)可以根据任何标准方案来分离(参见，例如，Fuss等人，(2009) CurrentProtocols in Immunology，第7.1单元，John Wiley, Inc., NY)。在任何标准组织培养物处理的6孔板(BD; Franklin Lakes, NJ)中，每孔可以用含有以下物质的完全RPMI来培养2.5 mL PBMC (细胞密度为1千万个细胞/mL)：RPMI (Life Technologies; Carlsbad,CA)、10 mM HEPES (Life Technologies; Carlsbad, CA)、10%胎小牛血清(HycloneThermo Fisher Scientific; Waltham, MA)以及青霉素/链霉素混合物(LifeTechnologies; Carlsbad, CA)。然后以100 ng/mL的最终浓度向孔中添加IL-10药剂；还可以添加最终浓度为10 µg/mL的阻断抑制性/检查点受体的功能的抗体，使其与IL-10药剂组合。可以在具有5% CO

肿瘤模型可用于评估IL-10药剂对各种肿瘤的活性。下文描述的肿瘤模型和肿瘤分析代表可以被利用的那些。每次肿瘤接种以10

IL-10多肽可以从天然来源(例如，除了其天然存在的环境以外的环境)分离并且也可以重组制得(例如，在基因修饰的宿主细胞诸如细菌、酵母、毕赤酵母属、昆虫细胞等中)，其中基因修饰的宿主细胞用包含编码多肽的核苷酸序列的核酸来修饰。IL-10多肽也可以是合成产生的(例如，通过不含细胞的或固相的化学合成)。

在IL-10多肽是化学合成的情况下，合成可以经由液相或固相来进行。固相肽合成(SPPS)允许并入非天然氨基酸和/或肽/蛋白主链修饰。各种形式的SPPS诸如9-芴甲氧基羰基(Fmoc)和叔丁氧基羰基(Boc)可用于合成本公开的多肽。化学合成的细节是本领域中已知的(例如，Ganesan A. (2006) Mini Rev. Med. Chem. 6:3-10; 和Camarero J.A.等人,(2005) Protein Pept Lett. 12:723-8)。

固相肽合成可以如下文所述进行。α官能团(Nα)和任何反应性侧链用酸不稳定或碱不稳定基团保护。保护基团在用于连接酰胺键的条件下是稳定的，但可以在不损坏已形成的肽链的情况下容易地裂解。用于α-氨基官能团的合适的保护基团包括但不限于以下：Boc、苄氧基羰基(Z)、O-氯苄氧基羰基、二-苯基异丙基氧基羰基、叔戊氧基羰基(Amoc)、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基-苄氧基羰基、o-硝基氧硫基、2-氰基-叔丁氧基-羰基、Fmoc、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-基亚基)乙基(Dde)等。

合适的侧链保护基团包括但不限于：乙酰基、烯丙基(All)、烯丙氧基羰基(Alloc)、苄基(Bzl)、苄氧基羰基(Z)、叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基甲基(Bom)、o-溴苄氧基羰基、叔丁基(tBu)、叔丁基二甲基甲硅烷基、2-氯苄基、2-氯苄氧基羰基、2,6-二氯苄基、环己基、环戊基、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-基亚基)乙基(Dde)、异丙基、4-甲氧基-2,3-6-三甲基苄基磺酰基(Mtr)、2,3,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)、新戊酰基、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰基(Tos)、2,4,6-三甲氧基苄基、三甲基甲硅烷基以及三苯甲基(Trt)。

在固相合成中，C-末端氨基酸偶联至合适的支持材料。合适的支持材料是对于合成过程的逐步缩合和裂解反应的试剂和反应条件而言是惰性的并且不溶解于所使用的反应介质中的那些。商业可得的支持材料的实例包括苯乙烯/二乙烯苯共聚物，其已用反应性基团和/或聚乙二醇修饰；氯甲基化苯乙烯/二乙烯苯共聚物；羟甲基化或氨基甲基化的苯乙烯/二乙烯苯共聚物；等。当期望制备肽核酸时，可以使用聚苯乙烯(1%)-二乙烯苯或用4-苄氧基苄基-醇(Wang-锚定物)或2-氯三苯甲基氯衍生的TentaGel®。在肽酰胺的情况下，可以使用聚苯乙烯(1%)二乙烯苯或用5-(4'-氨基甲基)-3',5'-二甲氧基苯氧基)戊酸(PAL-锚定物)或对-(2,4-二甲氧基苯基-氨基甲基)-苯氧基(Rink酰胺锚定物)衍生的TentaGel®。

与聚合支持物的连接可以通过以下方式实现：通过在室温或高温(例如，在40℃和60℃之间)下，以及在例如2至72小时的反应时间下将活化试剂添加于乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮或类似溶剂中使C-末端Fmoc保护的氨基酸与支持材料反应。

Nα-保护的氨基酸(例如，Fmoc氨基酸)与PAL、Wang或Rink锚定物的偶联可以例如在1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三唑存在或不存在的情况下，借助于偶联剂(诸如N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或其他碳二亚胺、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)或其他脲盐、O-酰基脲、苯并三唑-1-基-三-吡咯烷-膦六氟磷酸盐(PyBOP)或其他磷盐，N-羟基琥珀酰亚胺、其他N-羟基酰亚胺或肟)，例如借助于TBTU，伴随添加HOBt，添加或不添加碱诸如例如二异丙基乙胺(DIEA)、三乙胺或N-甲基吗啉，例如二异丙基乙胺来实施，其中反应时间是2至72小时(例如，在1.5至3倍过量氨基酸和偶联剂中(例如，在2倍过量中)，以及在约10℃和50℃之间例如25℃的温度下在溶剂诸如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷，例如二甲基甲酰胺中持续3小时)。

代替偶联剂，在上述条件下，还可能使用活性酯(例如，五氟苯基、对-硝基苯基等)，Nα-Fmoc-氨基酸的对称酸酐，其酰基氯或酰基氟。

Nα-保护的氨基酸(例如，Fmoc氨基酸)可以在添加DIEA的二氯甲烷中偶联至2-氯三苯甲基树脂，并且具有10至120分钟、例如20分钟的反应时间，但不限于该溶剂和该碱的使用。

受保护的氨基酸的成功偶联可以根据肽合成中的常规方法，通常在自动化肽合成仪中实施。通过用例如哌啶(10%至50%)在二甲基甲酰胺中处理5至20分钟，例如用50%哌啶在DMF中处理2 x 2分钟并用20%哌啶在DMF中处理1 x 15分钟进行固相上的偶联的氨基酸的Nα-Fmoc保护基团的裂解之后，3至10倍过量、例如10倍过量的下一受保护的氨基酸在惰性的非水性极性溶剂、诸如二氯甲烷、DMF或两者的混合物中以及在约10℃和50℃之间、例如25℃的温度下偶联至先前的氨基酸。前述用于将第一Nα-Fmoc氨基酸偶联至PAL、Wang或Rink锚定物的试剂适合用作偶联剂。受保护的氨基酸的活性酯、或氯化物或氟化物或其对称酸酐也可以用作替代物。

在固相合成结束时，从支持材料裂解肽，同时裂解侧链保护基团。裂解可以在存在三氟乙酸或其他强酸性介质的情况下，通过添加5%-20% V/V清除剂诸如二甲基硫醚、乙基甲基硫醚、苯甲硫醚、甲苯硫酚、间甲苯酚、苯甲醚、乙二硫醇、苯酚或水，例如，15% v/v二甲基硫醚/乙二硫醇/间甲苯酚1:1:1来在0.5至3小时、例如2小时内实施。具有完全保护侧链的肽通过用冰醋酸/三氟乙醇/二氯甲烷2:2:6裂解2-氯三苯甲基锚定物来获得。受保护的肽可以通过在硅胶上进行色谱法来纯化。如果肽经由Wang锚定物连接至固相并且如果意图获得具有C-末端烷基酰胺化的肽，则裂解可以通过用烷基胺或氟代烷基胺进行氨解来实施。氨解在约-10℃和50℃之间(例如，约25℃)的温度，以及约12和24小时之间(例如，约18小时)的反应时间下实施。此外，可以通过例如用甲醇进行再次酯化来从支持物裂解肽。

获得的酸性溶液可以与3至20倍量的冷乙醚或正己烷，例如10倍过量的二乙醚混合，以便将肽沉淀并且因此分离残留在乙醚中的清除剂和裂解的保护基团。进一步纯化可以通过使肽从冰醋酸再沉淀几次来实施。获得的沉淀物可以溶解在水或叔丁醇或两种溶剂的混合物(例如，1:1叔丁醇/水的混合物)中，并且进行冷冻干燥。

获得的肽可以通过各种色谱方法来纯化，包括用乙酸盐形式的弱碱性树脂上的离子交换；非衍生化的聚苯乙烯/二乙烯苯共聚物(例如，Amberlite® XAD)上的疏水性吸附色谱法；硅胶上的吸附色谱法；例如羧甲基纤维素上的离子交换色谱法；例如在Sephadex®G-25上的分配色谱法；逆流分配色谱法；或高效液相色谱法(HPLC)，例如在辛基或十八烷基硅烷硅胶(ODS)相上的反相HPLC。

描述制备人和小鼠IL-10的方法可见于例如美国专利号5,231,012，所述专利教导了用于产生具有IL-10活性的蛋白的方法，包括重组技术和其他合成技术。IL-10可以是病毒来源的，并且Moore等人，(1990) Science 248:1230中公开了来自Epstein-Barr病毒(BCRF1蛋白)的病毒IL-10的克隆和表达。IL-10可以使用本领域中已知的标准技术诸如本文描述的那些以多种方式来获得。重组人IL-10还可商业得自例如PeproTech, Inc.,Rocky Hill, N.J。

本公开考虑编码IL-10药剂的核酸分子，包括其天然存在的和非天然存在的同种型、等位基因变体和剪接变体。本公开还考虑核酸序列，由于遗传密码的简并性，所述核酸序列与天然存在的DNA序列相比存在一个或多个碱基的变化，但仍翻译成对应于IL-10多肽的氨基酸序列。

在多肽使用重组技术产生的情况下，多肽可以使用任何合适的构建体和任何合适的宿主细胞分别产生作为细胞内蛋白或作为分泌性蛋白，所述构建体和宿主细胞可以是原核生物或真核生物细胞诸如细菌(例如，大肠杆菌)或酵母宿主细胞。可以用作宿主细胞的真核细胞的其他实例包括昆虫细胞、哺乳动物细胞和/或植物细胞。在使用哺乳动物宿主细胞的情况下，它们可以包括人细胞(例如，HeLa、293、H9和Jurkat细胞)；小鼠细胞(例如，NIH3T3、L细胞和C127细胞)；灵长类动物细胞(例如，Cos 1、Cos 7和CV1)；以及仓鼠细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。

适合于表达多肽的各种宿主-载体系统可以根据本领域中已知的标准程序来采用。参见，例如，Sambrook等人，1989 Current Protocols in Molecular Biology ColdSpring Harbor Press，New York；以及Ausubel等人，(1995) Current Protocols inMolecular Biology, Wiley and Sons编。用于将遗传物质引入宿主细胞中的方法包括例如转化、电穿孔、缀合、磷酸钙方法等。可以选择转移方法以便提供对引入的多肽编码核酸的稳定表达。多肽编码核酸可以提供为可遗传的附加体元件(例如，质粒)或可以是基因组整合的。用于产生目标多肽的各种适当的载体是商业可得的。

载体可以在宿主细胞中提供染色体外维持或可以提供用于整合至宿主细胞基因组中。表达载体提供转录和翻译调节序列，并且可以提供诱导型或组成型表达，其中在转录起始区的转录控制下可操作连接编码区、以及转录和翻译终止区。通常，转录和翻译调节序列可以包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化子序列。启动子可以是组成型的或诱导型的，并且可以是强组成型启动子(例如，T7)。

表达构建体通常具有位于启动子序列附近的便利的限制性位点以提供插入编码目标蛋白的核酸序列。在表达宿主中可操作的可选择标志物可以存在来促进含有载体的细胞的选择。此外，表达构建体可以包括另外的元件。例如，表达载体可以具有一个或两个复制系统，因此允许所述表达载体能够维持在生物体中，例如维持在哺乳动物或昆虫细胞中以用于表达并且维持在原核宿主中以用于克隆和扩增。此外，表达构建体可以含有可选择标志物基因以允许选择转化的宿主细胞。可选择基因是本领域中众所周知的，并且将随着所使用的宿主细胞而变化。

蛋白的分离和纯化是根据本领域中已知的方法来完成。例如，蛋白可以从细胞裂解物分离，所述细胞经基因修饰来组成型地和/或在诱导后表达蛋白；或通过免疫亲和纯化从合成反应混合物分离，这通常涉及使样品与抗蛋白抗体接触，洗涤以除去非特异性结合的物质并且洗脱特异性结合的蛋白。分离的蛋白可以进一步通过透析和蛋白纯化中通常采用的其他方法来纯化。在一个实施方案中，蛋白可以使用金属螯合色谱方法来分离。蛋白可以含有修饰以促进分离。

多肽可以基本上纯的或分离(例如，不含其他多肽)的形式制备。多肽可以存在于相对于可能存在的其他组分(例如，其他多肽或其他宿主细胞组分)而言富集所述多肽的组合物中。例如，可以提供纯化的多肽，使得所述多肽存在于基本上不含其他表达的蛋白，例如，小于约90%、小于约60%、小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约20%、小于约10%、小于约5%或小于约1%的组合物中。

IL-10多肽可以使用重组技术以操纵本领域中已知的不同IL-10相关核酸，以提供能够编码IL-10多肽的构建体来产生。将了解，在提供具体氨基酸序列时，普通技术人员鉴于其在例如分子生物学方面的背景和经验将认识到编码这种氨基酸序列的各种不同的核酸分子。

在一个实施方案中，修饰的IL-10药剂是PEG-IL10药剂。IL-10药剂的PEG化导致某些特性的改进，包括药代动力学参数(例如血清半衰期)、活性的增强、提高的物理和热稳定性、针对对酶促降解的容易性的保护、增加的溶解度、更长的体内循环半衰期和降低的清除率、减少的免疫原性和抗原性以及减少的毒性。除了PEG化对药代动力学参数的有益作用以外，PEG化自身可以增强活性。例如，已显示PEG-IL-10比非PEG化的IL-10针对某些癌症更有效(参见，例如，EP 206636A2)。

在某些实施方案中，本公开中使用的PEG-IL-10药剂是单-PEG-IL-10药剂，其中1至9个PEG分子经由接头共价地附接至IL-10二聚体的一个IL-10多肽的N-末端处的氨基酸残基的α-氨基。一个IL-10多肽的单PEG化通常由于亚基改组而产生非PEG化、单PEG化和二PEG化的IL-10多肽的非均匀混合物。本公开的具体实施方案包括施用通过本文描述的方法产生的单PEG化和二PEG化的IL-10药剂的混合物。在具体实施方案中，单和二PEG化的IL-10的混合物是基本上根据2014年4月8日发布的Blaisdell等人美国专利号8,691,205B2(其完整教导通过引用并入本文)和Blaisdell，欧洲专利2379115B1(在2017年10月25日授权)的教导制备的近似1:1比率的单和二PEG化的rhIL-10。

PEG-IL-10药剂的生物活性通常可以通过受试者血清中的炎性细胞因子(例如，TNF-α或IFN-γ)的水平来评价，所述受试者用细菌抗原(脂多糖(LPS))攻击并且用PEG-IL-10治疗，如美国专利号7,052,686中所述。

尽管PEG与IL-10的附接的方法或位点不是至关重要的，但在某些实施方案中，PEG化并不改变或仅最小程度改变IL-10药剂的活性。在某些实施方案中，半衰期的增加大于生物活性的任何降低。

适合于与IL-10多肽序列缀合的PEG在室温下通常可溶于水中，并且具有通式R(O-CH

本公开考虑支链PEG衍生物，“星状-PEG”和多臂PEG。

本公开中使用的PEG的分子量不限于任何具体范围。PEG-IL-10药剂的PEG组分可以具有大于约5kDa、大于约10kDa、大于约15kDa、大于约20kDa、大于约30kDa、大于约40kDa或大于约50kDa的分子量。在一些实施方案中，分子量是约5kDa至约10kDa、约5kDa至约15kDa、约5kDa至约20kDa、约10kDa至约15kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约25kDa或约10kDa至约30kDa。

本公开还考虑缀合物的组合物，其中PEG具有不同的n值，并且因此各种不同的PEG以特定比率存在。例如，一些组合物包含缀合物的混合物，其中n=1、2、3和4。在一些组合物中，在n=1时，缀合物的百分比是18%-25%；在n=2时，缀合物的百分比是50%-66%；在n=3时，缀合物的百分比是12%-16%；并且在n=4时，缀合物的百分比最多达5%。此类组合物可以通过本领域中已知的反应条件和纯化方法来产生。色谱法可以用于解析缀合物级分，并且然后鉴定含有例如附接有期望数目的PEG的缀合物的级分，将所述级分纯化使其不含未修饰的蛋白序列并且不含附接有其他数目的PEG的缀合物。

适合于与多肽序列缀合的PEG在室温下通常可溶于水中，并且具有通式R(O-CH

两种广泛使用的第一代活化单甲氧基PEG (mPEG)是琥珀酰亚胺碳酸酯PEG(SC-PEG；参见，例如，Zalipsky等人(1992) Biotehnol. Appl. Biochem 15:100-114；以及Miron和Wilcheck (1993) Bio-conjug. Chem. 4:568-569)；以及苯并三唑碳酸酯PEG(BTC-PEG；参见，例如，Dolence等人，美国专利号5,650,234)，其优先与赖氨酸残基反应以形成氨基甲酸酯键，但也已知与组氨酸和酪氨酸残基反应。已显示与某些分子(例如，IFNα)上的组氨酸残基的键是水解不稳定的咪唑氨基甲酸酯键(参见，例如，Lee和McNemar，美国专利号5,985,263)。第二代PEG化技术已被设计来避免这些不稳定的键以及残基反应性的选择性的缺乏。PEG-醛接头的使用通过还原氨化靶向多肽的N-末端上的单一位点。

缀合至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。本公开考虑支链PEG衍生物，“星状-PEG”和多臂PEG。可用于实施本发明的PEG的具体实施方案包括10kDa线性PEG-醛(例如，Sunbright® ME-100AL, NOF America Corporation, One North Broadway, WhitePlains, NY 10601 USA)，10kDa线性PEG-NHS酯(例如，Sunbright® ME-100CS, Sunbright® ME-100AS, Sunbright® ME-100GS, Sunbright® ME-100HS, NOF)，20kDa线性PEG-醛(例如，Sunbright® ME-200AL, NOF)，20kDa线性PEG-酯(例如，Sunbright® ME-200CS,Sunbright® ME-200AS, Sunbright® ME-200GS, Sunbright® ME-200HS, NOF)，20kDa2-臂支链PEG-醛，包含两个10kDA线性PEG分子的20kDA PEG-醛((例如，Sunbright® GL2-200AL3, NOF)，20kDa 2-臂支链PEG-NHS酯，包含两个10kDA线性PEG分子的20 kDA PEG-NHS酯(例如，Sunbright® GL2-200TS, Sunbright® GL200GS2, NOF)，40kDa 2-臂支链PEG-醛，包含两个20kDA线性PEG分子的40 kDA PEG-醛(例如，Sunbright® GL2-400AL3)，40kDa2-臂支链PEG-NHS酯，包含两个20kDA线性PEG分子的40 kDA PEG-NHS酯(例如，Sunbright®GL2-400AL3, Sunbright® GL2-400GS2, NOF)，线性30kDa PEG-醛(例如，Sunbright®ME-300AL)和线性30kDa PEG-NHS酯。

PEG化最常发生于多肽的N-末端处的α-氨基、赖氨酸残基的侧链上的ε-氨基以及组氨酸残基的侧链上的咪唑基处。由于大多数重组多肽具有单个α以及多个ε-氨基和咪唑基，许多位置异构体可以根据接头化学性质来生成。本文可以应用本领域中已知的一般PEG化策略。

PEG可以经由末端反应性基团(“间隔基”)结合至本公开的IL-10多肽，所述末端反应性基团在多肽序列中的一个或多个的游离氨基或羧基和聚乙二醇之间介导键合。具有间隔基的可以结合至游离氨基的PEG包括N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇，其可以通过用N-羟基琥珀酰亚胺活化聚乙二醇的琥珀酸酯来制备。可以结合至游离氨基酸的另一种活化的聚乙二醇是2,4-双(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪，其可以通过使聚乙二醇单甲醚与氰尿酰氯反应来制备。结合至游离羧基的活化的聚乙二醇包括聚氧乙烯二胺。

本公开的IL-10多肽序列中的一个或多个与具有间隔基的PEG的缀合可以通过各种常规方法来实施。例如，缀合反应可以在pH为5至10的溶液中、在4℃至室温的温度下利用4:1至30:1的试剂与蛋白的摩尔比来实施30分钟至20小时。可以选择反应条件来将反应朝向主要产生期望取代程度引导。通常，低温、低pH (例如，pH=5)和短反应时间倾向于减少附接的PEG的数目，而高温、中性至高pH (例如，pH≥7)和较长反应时间倾向于增加附接的PEG的数目。本领域中已知的各种方式可以用于终止反应。在一些实施方案中，所述反应通过将反应混合物酸化并在例如-20℃下冷冻来终止。例如在美国专利号5,252,714、5,643,575、5,919,455、5,932,462以及5,985,263中论述了各种分子的PEG化。例如在美国专利号7,052,686中描述了PEG-IL-10。考虑用于本文中使用的具体反应条件陈述于实验部分。

PEG化最常发生于多肽的N-末端处的α氨基、赖氨酸残基的侧链上的ε-氨基以及组氨酸残基的侧链上的咪唑基处。由于大多数重组多肽具有单个α以及多个ε-氨基和咪唑基，许多位置异构体可以根据接头化学性质来生成。本文可以应用本领域中已知的一般PEG化策略。

本公开的多肽序列中的一个或多个与具有间隔基的PEG的缀合可以通过各种常规方法来实施。例如，缀合反应可以在pH为5至10的溶液中、在4℃至室温的温度下利用4:1至30:1的药剂与蛋白的摩尔比来实施30分钟至20小时。可以选择反应条件来将反应朝向主要产生期望的取代程度引导。通常，低温、低pH (例如，pH=5)和短反应时间倾向于减少附接的PEG的数目，而高温、中性到高pH (例如，pH≥7)和较长反应时间倾向于增加附接的PEG的数目。本领域中已知的各种方式可以用于终止反应。在一些实施方案中，所述反应通过将反应混合物酸化并在例如-20℃下冷冻来终止。例如在美国专利号5,252,714、5,643,575、5,919,455、5,932,462以及5,985,263中论述了各种分子的PEG化。例如在美国专利号7,052,686中描述了PEG-IL-10。

尽管本公开考虑通过技术人员已知的任何方式合成PEG化的IL-10，以下提供的用于产生单-PEG-IL-10和单-/二-PEG-IL-10的混合物的几种替代合成方案意图仅是说明性的。尽管单-PEG-IL-10和单-/二-PEG-IL-10的混合物两者具有许多相当的特性，但选择性PEG化的单-和二-PEG-IL-10的混合物提高最终PEG化产物的产率(参见，例如，美国专利号7,052,686和美国专利公开号2011/0250163)。除了在适合于实施本公开的PEG (以及其他药物递送技术)的产生和使用中利用其自身的技能，技术人员还熟悉许多PEG相关技术(以及其他药物递送技术)的商业供应商。通过实例的方式，NOF America Corp (Irvine, CA)供应单-官能线性PEG、双官能PEG、多臂PEG、支链PEG、杂官能PEG、分叉PEG以及可释放的PEG；并且Parchem (New Rochelle, NY)是PEG产品和其他特殊原材料的全球分销商。

在一些实施方案中，所述PEG-IL-10药剂是AM-0010。术语AM0010是指重组人白介素10 (rHuIL-10)，其包含单和双PEG化的rhIL-10多肽的近似1:1混合物，并采用经由接头附接至IL-10多肽的N-末端的5 kDa聚乙二醇(PEG)。AM0010是非糖基化的同二聚蛋白，其由两个非共价缔合的rHuIL-10多肽单体构成，其中每个单体由161个氨基酸构成，包括由直接表达重组细菌产生导致的天然人IL-10多肽中不存在的N-末端甲硫氨酸，每个单体包含两个分子内二硫键，第一个在161个氨基酸的rHuIL-10多肽的位置13和109处的半胱氨酸之间，且第二个在161个氨基酸的rHuIL-10多肽的位置63和115处的半胱氨酸之间(对应于天然存在的hIL-10多肽的位置12和108以及位置62和114处的半胱氨酸)。AM0010已经在多项临床试验中进行评估，并且已经显示其作为单一药剂在最高达20微克/kg的每日皮下剂量下被良好耐受，在所述剂量下，观察到在肾细胞癌(RCC，25% ORR)、葡萄膜黑色素瘤中的客观应答，和皮肤T细胞淋巴瘤中的CR(应答持续时间最长达2.5年)，以及CRC和PDAC中的延长稳定疾病。

在本发明的一个实施方案中，修饰的IL-10药剂是糖基化的IL-10。出于本公开的目的，“糖基化”意图广泛地是指将聚糖附接至蛋白、脂质或其他有机分子的酶促过程。结合本公开使用的术语“糖基化”通常意指添加或缺失一个或多个碳水化合物部分(通过除去潜在的糖基化位点或通过经由化学和/或酶促方式缺失糖基化)，和/或添加在天然序列中可能存在或不存在的一个或多个糖基化位点。此外，所述短语包括天然蛋白的糖基化中的性质变化，其涉及存在的各种碳水化物部分在性质和比例上的变化。糖基化可以急剧影响多肽诸如IL-10的物理特性(例如，溶解度)并且对于蛋白稳定性、分泌和亚细胞定位来说可能也是重要的。糖基化的多肽还可以表现出增强的稳定性或者可以改进一种或多种药代动力学特性、诸如半衰期。此外，溶解度改进可以例如使得能够生成与包含非PEG化的多肽的制剂相比更适合于药物施用的制剂。

糖基化位点的添加可以通过改变IL-10多肽的氨基酸序列来完成。对IL-10多肽的改变可以例如通过添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(针对O-连接的糖基化位点)或天冬酰胺残基(针对N-连接的糖基化位点)或用其取代来进行。N-连接和O-连接的寡糖以及在每种类型中存在的糖残基的结构可以是不同的。在两者中都常见的一种类型的糖是N-乙酰神经氨酸(下文称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接和O-连接的寡糖两者的末端残基，并且凭借其负电荷，可以为糖蛋白赋予酸性特性。本公开的一个具体实施方案包括N-糖基化变体的生成和使用。包含修饰的氨基酸序列以并入糖基化位点的IL-10多肽的实例提供于，例如，2016年3月10日公开的Van Vlasselaer, 等人

在本发明的一个实施方案中，修饰的IL-10药剂是多唾液酸化的IL-10。术语“多唾液酸化”是指多肽缀合至天然存在的、生物可降解的α-(2→8)连接的唾液酸(“PSA”)以便改进多肽的稳定性和体内药代动力学。PSA是生物可降解的、无毒的天然聚合物，其是高度亲水的，这赋予其在血液中的增加其血清半衰期的高表观分子量。此外，一系列肽和蛋白治疗剂的多唾液酸化已导致蛋白水解的显著减少、体内活性的保留以及免疫原性和抗原性的降低(参见，例如，G. Gregoriadis等人，Int. J. Pharmaceutics 300(1-2):125-30)。各种用于位点特异性多唾液酸化的技术是可用的(参见，例如，T. Lindhout, 等人 (2011) PNAS108(18)7397-7402。

在本发明的一个实施方案中，将修饰的IL-10药剂缀合至白蛋白，在本文中称为“IL-10白蛋白融合体”。在IL-10白蛋白融合体的背景下所用的术语“白蛋白”包括白蛋白诸如人血清白蛋白(HSA)、猕猴血清白蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。根据本公开，白蛋白可以在羧基末端、氨基末端、羧基末端和氨基末端两者以及内部缀合至IL-10多肽(例如，本文描述的多肽) (参见，例如，USP 5,876,969和USP 7,056,701)。在本公开所涵盖的HSA-IL-10多肽缀合物中，可以使用各种形式的白蛋白，诸如白蛋白分泌前序列及其变体、片段及其变体以及HSA变体。此类形式通常具有一种或多种期望的白蛋白活性。在另外的实施方案中，本公开涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含直接或间接地融合至白蛋白、白蛋白片段和白蛋白变体等的IL-10多肽，其中融合蛋白具有比非融合的药物分子更高的血浆稳定性和/或融合蛋白保留非融合的药物分子的治疗活性。在一些实施方案中，间接融合通过接头诸如肽接头或其修饰形式来完成。

或者，IL-10白蛋白融合体包含IL-10多肽，其为包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和IL-10多肽的融合蛋白。如上所述，包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和IL-10多肽的融合蛋白可以例如通过遗传操纵、使得编码HSA或其片段的核酸接合至编码一个或多个IL-10多肽序列的核酸来实现。

用于缀合至IL-10药剂的另外合适的组分和分子包括例如甲状球蛋白；破伤风类毒素；白喉类毒素；聚氨基酸诸如聚(D-赖氨酸:D-谷氨酸)；轮状病毒的VP6多肽；流感病毒血凝素、流感病毒核蛋白；钥孔䗩血蓝蛋白(KLH)；以及乙型肝炎病毒核心蛋白和表面抗原；或前述的任何组合。

本公开考虑一种或多种另外的组分或分子在多肽序列的N-末端和/或C-末端处的缀合，所述组分或分子诸如另一种多肽(例如，具有与本多肽异源的氨基酸序列的多肽)或载体分子。因此，示例性多肽序列可以提供为与另一种组分或分子缀合的缀合物。

IL-10多肽还可以缀合至大的代谢缓慢的大分子诸如蛋白；多糖，诸如琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素或纤维素珠粒；多聚氨基酸，诸如聚谷氨酸或聚赖氨酸；氨基酸共聚物；灭活病毒颗粒；灭活细菌毒素，诸如来自白喉、破伤风、霍乱或白细胞毒素分子的毒素；灭活细菌；以及树突细胞。此类缀合形式(如果期望)可以用于产生针对本公开的多肽的抗体。

另外用于缀合的候选组分和分子包括适合于分离或纯化的那些。具体的非限制性实例包括结合分子，诸如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对)、抗体、受体、配体、凝集素或包含固体支持物的分子，所述固体支持物包括例如塑料或聚苯乙烯珠粒、板或珠粒、磁珠、测试条和膜。

在某些实施方案中，本公开的IL-10多肽序列的氨基末端或羧基末端可以与免疫球蛋白Fc区(例如，人Fc)融合以形成融合缀合物(或融合分子)。已显示Fc融合缀合物增加生物药剂的系统半衰期，并且因此生物药剂产品可以要求较低频率的施用。Fc结合内衬在血管内的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn)，并且在结合后，Fc融合分子被保护免于降解和再释放至循环中，将分子更长久地保持在循环中。这种Fc结合据信是内源性IgG保留其长血浆半衰期的机制。与传统的Fc-融合缀合物相比，更近来的Fc-融合技术将生物药剂的单一拷贝连接至抗体的Fc区以优化生物药剂的药代动力学和药效学特性。

本公开考虑使用IL-10药剂的其他修饰以改进一种或多种特性。实例包括羟乙基淀粉化，其各个方面被描述于例如美国专利申请号2007/0134197和2006/0258607中；以及包含作为融合标签的SUMO的IL10多肽融合分子(LifeSensors, Inc.; Malvern, PA)。

本公开还考虑IL-10药剂，其中所述IL-10多肽是IL-10多肽和一个或多个PEG模拟物的融合蛋白。已经开发了保留PEG的属性(例如，增强的血清半衰期)、同时赋予几种另外的有利特性的多肽PEG模拟物。通过实例的方式，可以重组地产生能够形成与PEG类似的延展构象、已融合至目标肽或蛋白药物的简单的多肽链(包含例如Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Thr) (例如，Amunix’ XTEN技术；Mountain View, CA)。可以通过重组方式通过表达编码该融合蛋白的核酸序列来生成包含此类多肽序列的融合蛋白的IL-10药剂，而在制造过程期间无需另外的缀合步骤。此外，确立的分子生物学技术使得能够控制多肽链的侧链组成，允许优化免疫原性和制造特性。

上文已描述了接头及其使用。用于修饰本公开的多肽序列的前述组分和分子中的任一种可以任选地经由接头来缀合至IL-10药剂或IL-10多肽。合适的接头包括“柔性接头”，所述柔性接头通常具有足够的长度以允许在修饰的多肽序列和连接的组分和分子之间的一些移动。接头分子通常是约6-50个原子长。接头分子还可以是例如芳基乙炔基、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。可以容易地选择合适的接头，并且所述合适的接头可以具有任何合适的长度，诸如1个氨基酸(例如，Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50或多于50个氨基酸。

柔性接头的实例包括甘氨酸聚合物(G)

柔性接头的另外的实例包括甘氨酸聚合物(G)

另外的柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)

根据本领域中众所周知的原理制备可用于实施本发明的CAR。参见例如，2010年6月22日发布的Eshhaar等人美国专利号7,741,465 B1; Sadelain, 等人 (2013) CancerDiscovery 3(4):388-398 (

CAR-T细胞疗法产品在美国已经被美国食品和药物管理局批准用于商业用途，其易于根据本公开的教导使用。可以与本文所述的方法和组合物结合使用的商业可得的CAR-T细胞产品的实例包括axicabtagene ciloleucel (作为Yescarta®销售，其从GileadPharmaceuticals商业得到)和tisagenlecleucel (作为Kymriah®销售，其从Novartis商业得到)。

(a)

本发明的CAR包含信号肽，以促进ARD的表面展示(参见下文)。在本发明的实践中，可以采用任何真核信号肽序列。所述信号肽可以源自表面表达的蛋白的天然信号肽。在本发明的一个实施方案中，CAR的信号肽是选自以下的信号肽：人血清白蛋白信号肽、催乳素白蛋白信号肽、人IL2信号肽、人胰蛋白酶原-2、人CD-5、人免疫球蛋白κ轻链、人天青杀素、高斯荧光素酶及其功能衍生物。使用信号肽来增加分泌效率的特定氨基酸取代描述于Stern, 等人 (2007) Trends in Cell and Molecular Biology 2:1-17和Kober, 等人(2013) Biotechnol Bioeng. 1110(4):1164-73。或者，所述信号肽可以是根据确立的原理制备的合成序列。参见例如Nielsen, 等人(1997) Protein Engineering 10(1):1-6(

(b)

本发明的CAR进一步包含特异性结合靶标细胞的表面上表达的抗原的细胞外抗原识别结构域(“ARD”)。ARD可以是特异性结合靶标细胞的表面上表达的抗原的任何单链多肽。在靶标细胞的表面上表达的抗原的选择将决定ARD的设计和选择。在某些实施方案中，靶标细胞群体可以包含肿瘤抗原。Vigneron, N.等人 ((15 July 2013) Cancer Immunity13:15)描述了T细胞限定的人肿瘤抗原的数据库，其含有超过400种肿瘤抗原肽。可以被CAR的ARD靶向的肿瘤抗原的实例包括一种或多种选自以下的抗原，包括但不限于HER2、MUC1、端粒酶、PSA、CEA、VEGF、VEGF-R2、T1、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR、5T4、WT1、KG2D配体(包括MICA/B和ULBP-1、-2、-3和-4)、叶酸受体(FRa)、血小板衍生的生长因子受体A(也称为PDGFRα)和Wnt1抗原。

在一个实施方案中，所述ARD是单链Fv (ScFv)。ScFv是由通过肽接头共价连接的抗体的免疫球蛋白重链和轻链的可变区构成的多肽(Bird

在另一个实施方案中，所述ARD是通过用靶标细胞来源的抗原免疫骆驼或美洲驼而获得的单结构域抗体。参见例如Muyldermans, S. (2001) Reviews in MolecularBiotechnology 74: 277-302。

或者，所述ARD可以通过如下完整地合成生成：生成肽文库并分离具有期望的靶标细胞抗原结合特性的化合物。此类技术是科学文献中众所周知的。参见例如1999年11月12日发布的Wigler等人，美国专利号6303313 B1；2004年2月24日发布的Knappik等人，美国专利号6,696,248 B1，Binz, 等人 (2005) Nature Biotechnology 23:1257-1268;Bradbury

除了对靶标细胞表达的抗原具有亲和力的ARD以外，所述ARD还可以对额外分子具有亲和力。例如，本发明的ARD可以是双特异性的，即能够提供与第一靶标细胞表达的抗原和第二靶标细胞表达的抗原的特异性结合。二价单链多肽的实例是本领域中已知的。参见例如Thirion

在一个替代实施方案中，CAR或ARD的CAR可以源自响应于免疫疗法而诱导的克隆的TCR。用于鉴定新型肿瘤特异性TCR序列并将此类序列并入包含这些序列的CAR T细胞的产生中的方法描述于2017年7月20日作为WO2017/123557A1公开的Mumm等人，PCT/US2017/012882，其整个教导通过引用并入本文。简而言之，在将IL-10药剂施用于患者之后，IL-10药剂疗法导致将疾病抗原特异性CD8+ T细胞诱导进入患者的外周。在患者已经接受IL-10药剂疗法一定时间段之后，可以通过常规程序、诸如白细胞分离术从患者收集含有淋巴细胞的组织样品，例如含有外周血淋巴细胞(PBL)的外周血样品。在收集组织样品后，通过测序分析样品中的核酸，以获得TCR序列(例如，编码可变的α (Vα) TCR多肽和/或编码可变的β(Vβ) TCR多肽的核酸)。可以分析测序读数以获得样品中的CD8+ T细胞上表达的、即功能性存在于抗原特异性T细胞的细胞表面上的TCR的编码Vα TCR多肽的核酸和/或编码Vβ TCR多肽的核酸的丰度的估计值。通过将样品中的CD8+ T细胞上表达的TCR的编码Vα TCR多肽的核酸和/或编码Vβ TCR多肽的核酸的丰度与在IL-10药剂疗法期间的较早时间点的参考样品中的编码Vα TCR多肽的核酸和/或编码Vβ TCR多肽的核酸的丰度进行比较，可能鉴定表达抗原特异性TCR(由α链和β链TCR对序列定义)的特定T细胞群体，其已经克隆扩增、克隆收缩或已经响应于IL-10药剂疗法新生成。在对编码在CD8+ T细胞(例如分离的CD8+ T细胞)的表面上表达的TCR的成对的α和β链的核酸进行测序之后，可以确定α和β链的氨基酸序列，包括每条链的CDR区。这些TCR对氨基酸序列可用于通过转导编码全长α链和β链TCR对氨基酸序列或含有α链和β链TCR对氨基酸序列的可变区的嵌合抗原受体的核酸构建体来生成重组疾病抗原特异性CAR-T细胞。然后可以将此类疾病抗原特异性CAR-T细胞施用于需要治疗疾病的合适患者，包括从其中分离新型TCR序列的患者，因为由于针对该受试者的肿瘤细胞的活性而特别选择该CAR-T细胞。用于分离新抗原诱导的T细胞的方法描述于Cohen, 等人(2015) Journal of Clinical Investigation 125(10):3981-3991。此类患者来源的序列在本发明的实施中特别有用，因为响应于免疫疗法、特别是IL-10疗法而诱导的这些新型T细胞克隆包含对于受试者中存在的肿瘤细胞群体具有选择的亲和力的TCR，且因此相对于“一般”肿瘤抗原，预期其将提供增强的特异性和靶向效率。

(c)

可用于实施本发明的CAR进一步提供了跨膜跨越结构域，其将抗靶向抗原ARD(或间隔区，如果包括的话)连接至CAR的细胞内结构域。跨膜跨越结构域由在真核细胞膜中热力学稳定的任何序列构成。可用于构建可用于实施本发明的CAR的跨膜跨越结构域由近似20个氨基酸构成，所述近似20个氨基酸有利于形成具有α-螺旋二级结构。所述跨膜跨越结构域可以源自天然存在的跨膜蛋白的跨膜结构域。或者，所述跨膜结构域可以是合成的。在设计合成跨膜结构域时，优选有利于α-螺旋结构的氨基酸。有利于形成α-螺旋的氨基酸是本领域中众所周知的。参见例如，Pace

(d)

所述CAR的细胞内结构域包含一个或多个细胞内信号转导结构域(例如，CD3ζ-链)。在一实施方案中，所述细胞内信号结构域包含在抗原受体接合后起始信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列及其功能衍生物和亚片段。另外地或可替代地，所述CAR的细胞质结构域可以包含一个或多个细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域的实例包括但不限于CD27、CD28的细胞质结构域，CD137 (也称为4-1BB和TNFRSF9)的细胞质结构域，CD278(也称为ICOS)的细胞质结构域，PI3激酶的p110α、β或δ催化亚基)，CD3 ζ链，CD134(也称为OX40和TNFRSF4)的细胞质结构域。FcεR1γ和β链、MB1(Igα)链、B29(Igβ)链等)、人CD3ζ链、CD3多肽(δ，Δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和参与T细胞转导的其他分子、诸如CD2、CD5和CD28。在本发明的一个实施方案中，所述CAR的细胞内信号转导结构域是CD3 ζ-链。在本发明的另一个实施方案中，所述CAR的细胞内信号转导结构域包含CD3 ζ-链和CD28的细胞质结构域。在本发明的另一个实施方案中，所述CAR的细胞内信号转导结构域是三聚结构，其包含CD3 ζ-链、CD28和OX40的细胞质结构域S。在一个实施方案中，所述细胞内信号转导结构域包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方案中，所述细胞内信号转导结构域包含CD3 ζ的信号传导结构域和CD137的信号传导结构域。在另一个实施方案中，所述细胞质结构域包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28和CD137的信号传导结构域。除了一个信号传导结构域以外，所述细胞内结构域还可以提供一个或多个“共刺激结构域”(CSD)。所述共刺激结构域是指CAR的一部分，其增强记忆细胞的增殖、存活或发育。在本公开的一些实施方案中，所述CSD包含TNFR超家族的一个或多个成员，CD28、CD137 (4-1BB)、CD134 (OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其组合。普通技术人员意识到可以与本公开的教导结合使用的其他共刺激结构域。

CAR-T细胞疗法的进展相对快速(一般参见美国专利申请公开号20150038684)，其中许多已经聚焦于细胞内信号传导结构域的性质。所谓的“第一代CAR”涉及将抗原识别结构域与T细胞受体(TCR)复合物的CD3ζ活化链融合。尽管这些第一代CAR在体外诱导T细胞效应子功能，但体内效力在很大程度上受到其不良的抗肿瘤效力的限制。CAR技术的进化产生“第二代CAR”，其包括与一个CSD串联的CD3ζ活化链，所述CSD的实例包括来自CD28或各种TNF受体家族分子、诸如4-1BB (41BB，CD137)和OX40 (CD134)的细胞内结构域。已经开发了“第三代CAR”，除了CD3ζ活化链以外，其还包括两个共刺激信号，CSD最通常来自CD28和4-1BB。第二代和第三代CAR急剧提高抗肿瘤效力。第二代和第三代CAR的功效增加，以及CAR-T细胞的抗原靶标也在非靶标细胞上表达的可能性，也已经导致严重毒性的风险增加(参见例如Carpenito 等人 (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106(9):3360-65; Grupp 等人(2013) N Engl J Med 368(16):1509-18)，且因此，应当以比通常与第一代CAR-T相关的剂量更低的那些评估使用此类第二代和第三代CAR-T。

在本发明的一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含以以下顺序从氨基至羧基排列的以下结构域的多肽：

(e)

可用于实施本发明的CAR可以任选地包括一个或多个多肽间隔区，其连接CAR的结构域，特别是ARD与CAR的跨膜跨越结构域之间的连接。尽管不是CAR结构的必要元件，但通常认为包括间隔区结构域对于促进ARD对抗原的识别是期望的。Moritz和Groner (1995)Gene Therapy 2(8)539-546。当与本文所述的CAR-T细胞技术结合使用时，术语“接头”、“接头结构域”和“接头区域”是指长度为约1至100个氨基酸的寡肽或多肽区域，其将本公开的CAR的任何结构域/区域连接在一起。接头可以由柔性残基、如甘氨酸和丝氨酸构成，使得相邻的蛋白结构域相对于彼此自由移动。当期望确保两个相邻的结构域不空间干扰彼此时，某些实施方案包括使用更长长度的接头。在一些实施方案中，所述接头是不可切割的，而在其他中，它们是可切割的(例如，2A接头(例如T2A))、2A样接头或其功能等同物以及前述的组合。实现间隔区功能并不必需特定的氨基酸序列，但间隔区的典型特性是灵活性，以使得ARD能够自由运动，以促进靶向抗原识别。类似地，已经发现在保留CAR功能的同时，间隔区长度相当宽大。Jensen和Riddell (2014) Immunol. Review 257(1) 127-144。在构建可用于实施本发明的CAR中可用作间隔区的序列包括但不限于IgG1的铰链区，免疫球蛋白1CH2-CH3区域、IgG4铰链-CH2-CH3、IgG4铰链-CH3和IgG4铰链。铰链和跨膜结构域可以源自同一分子，诸如CD8-α的铰链和跨膜结构域。Imai, 等人(2004)Leukemia 18(4):676-684。考虑本公开的实施方案，其中所述接头包括微小核糖核酸病毒2A样接头，猪破伤风病毒(P2A)的CHYSEL序列，thosea asigna病毒(T2A)或其组合，其变体和功能等同物。在又进一步实施方案中，所述接头序列包含Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly

在本发明的一些实施方案中，CAR是包含如下从氨基至羧基末端排列的以下功能结构域的多肽，其可以提供间插或间隔区序列：

通过用包含编码上述CAR多蛋白的核酸序列的表达载体转化分离的T细胞，实现可用于实施本发明的CAR T细胞的制备。

用于在T细胞中表达CAR的表达载体可以是病毒载体或非病毒载体。术语“非病毒载体”是指在能够影响编码序列在靶标细胞中表达的非选择性条件下自主复制的染色体外环状DNA分子，其不同于正常基因组并且对于细胞存活不是必需的。质粒是非病毒载体的实例。为了促进靶标细胞的转染，可以在促进非病毒载体的摄取的条件下，用非病毒载体直接暴露靶标细胞。促进哺乳动物细胞摄取外来核酸的条件的实例是本领域中众所周知的，并且包括但不限于化学方式(诸如，Lipofectamine®, Thermo-Fisher Scientific)、高盐、磁场(电穿孔)。

在一个实施方案中，可以在非病毒递送系统中提供非病毒载体。非病毒递送系统通常是复合物，以促进用核酸货物转导靶标细胞，其中核酸与试剂、诸如阳离子脂质(DOTAP、DOTMA)、表面活性剂、生物制剂(明胶、壳聚糖)、金属(金、磁铁)和合成聚合物(PLG、PEI、PAMAM)复合。非病毒递送系统的许多实施方案是本领域中众所周知的，包括脂质载体系统(Lee 等人 (1997) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 14:173-206)；聚合物包被的脂质体(1993年5月25日发布的Marin等人

在另一个实施方案中，所述表达载体可以是病毒载体。如本文所用，术语病毒载体在其常规意义上用于指没有蛋白合成或能量生成机制的任何专性细胞内寄生虫，并且通常是指通常用于将外源转基因递送给哺乳动物细胞的任何有包膜或无包膜动物病毒。病毒载体可以有复制能力(例如，基本上是野生型)，条件地复制(重组工程改造以在某些条件下复制)或复制缺陷的(在能够补充病毒的缺失功能的细胞系不存在的情况下基本上不能复制)。所述病毒载体可以具有某些修饰以使其“选择性复制”，即，其在某些细胞类型或表型细胞状态(例如癌性)中优先复制。可用于实施本发明的病毒载体系统包括例如天然存在的或重组的病毒载体系统。可用于实施本发明的病毒的实例包括重组修饰的有包膜或无包膜DNA和RNA病毒。例如，病毒载体可以衍生自人或牛腺病毒、牛痘病毒、慢病毒、疱疹病毒、腺相关病毒、人免疫缺陷病毒、辛德毕斯病毒和逆转录病毒(包括但不限于劳斯肉瘤病毒)和乙型肝炎病毒的基因组。通常，将目标基因插入此类载体中，以允许通常与伴随的病毒基因组序列一起包装基因构建体，随后感染敏感的宿主细胞，导致目标基因(例如靶向抗原)的表达。另外，编码抗靶向抗原CAR的表达载体也可以是mRNA载体。当将病毒载体系统用于转染时，逆转录病毒或慢病毒表达载体优选用于转染T细胞，这是由于使用这些系统增强基因向T细胞的转移的效力，导致培养大量T细胞用于临床应用的时间减少。具体而言，γ逆转录病毒对于临床级T细胞的基因修饰是特别优选的，并且已经显示其具有治疗作用。Pule

所述CAR的表达载体可以编码除了靶向抗原以外的一个或多个多肽。当如本发明的实践中表达多个多肽时，每个多肽可以可操作连接至表达控制序列(单顺反子)，或者多个多肽可以由多顺反子构建体编码，其中多个核酸序列可操作连接至单个表达控制序列，任选地提供间插序列(例如IRES元件。

在一个实施方案中，编码靶向抗原的表达载体可以任选地进一步编码一种或多种免疫调节剂。可用于实施本发明的免疫调节剂的实例包括但不限于细胞因子。此类细胞因子的实例是白介素，包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-18、TNF-α、干扰素α、干扰素α-2b、干扰素-β、干扰素-γ、GM-CSF、MIP1-α、MIP1-β、MIP3-α、TGF-β以及能够调节免疫应答的其他细胞因子中的一种或多种。表达的细胞因子可以直接用于细胞内表达或与用于细胞外呈递或分泌的信号序列一起表达。

IL-12：在一个实施方案中，所述载体进一步包含编码多肽IL-12药剂的核酸序列，在一个实施方案中，通过提供生成IL-12四聚体所必需的IL-12A(p35)和IL-12B(p40)编码序列而实现，所述IL-12四聚体据报道在CAR-T细胞疗法的背景下提供增强的抗肿瘤效力(参见例如，Pegram等人 (2012) Blood 119(18):4133-4141; Yeku, 等人 (2017)Sc

IL15药剂：在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码多肽IL-15药剂的核酸序列。术语多肽IL-15药剂包括人IL-15分子的变体、类似物。在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码具有以下序列的前-原-人IL-15多肽(hIL15)的核酸序列：

在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码具有以下序列的前-人IL-15多肽(hIL15)的核酸序列：

在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码具有以下序列的原-人IL-15多肽(hIL15)的核酸序列：

当在没有前导序列的情况下直接表达时，其任选地提供N-末端甲硫氨酰基残基。在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码具有以下序列的成熟人IL-15多肽(hIL15)的核酸序列：

当在没有前导序列的情况下直接表达时，其任选地提供N-末端甲硫氨酰基残基。在本发明的优选实践中，所述IL-15药剂保留在半胱氨酸残基83-133和90-136之间的二硫键和/或在位置127处为N-连接的糖基化的GlcNAc。

获得编码前述多肽IL-15药剂的核酸序列是本领域技术人员众所周知的。参见例如，Grabstein, 等人 (1994)

IL-2药剂：在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码多肽IL-2药剂的核酸序列。术语多肽IL-2药剂包括人IL-2分子的变体、类似物。在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码具有以下序列的前-人IL-2多肽(hIL2)的核酸序列：

在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码具有以下序列的成熟hIL-2多肽的核酸序列：

当在没有前导序列的情况下直接表达时，其任选地提供N-末端甲硫氨酰基残基。在本发明的优选实践中，所述IL-2药剂保留半胱氨酸残基78-125之间的二硫键和/或在位置23处被糖基化。

获得编码前述IL-2药剂的核酸序列是本领域技术人员众所周知的。参见例如Taniguchi, 等人 (1983) Nature 302:315-310; Devos, 等人 (1983) Nucleic AcidsResearch 11:4307-4323; 或Fujita, 等人 (1983) PNAS(USA) 80: 7347-7441。

IL-7药剂：在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码多肽IL-7药剂的核酸序列。术语多肽IL-7药剂包括人IL-7分子的变体、类似物。在一个实施方案中，所述载体进一步包含编码具有以下序列的前-人IL-7多肽(hIL7)的核酸序列：

在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码具有以下序列的成熟hIL-7多肽的核酸序列：

当在没有前导序列的情况下直接表达时，其任选地提供N-末端甲硫氨酰基残基。在本发明的优选实践中，所述IL-7药剂保留半胱氨酸残基27-166、59-154和72-117之间的二硫键和/或在位置95、116和/或141中的一个或多个处被糖基化。获得编码前述多肽IL-7药剂的核酸序列是本领域技术人员众所周知的。

IL-18药剂：在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码多肽IL-18药剂的核酸序列。术语多肽IL-18药剂包括人IL-18分子的变体、类似物。在一个实施方案中，所述多肽IL-18药剂是具有以下氨基酸序列的具有信号序列的hIL-18的同种型1的前体：

在另一个实施方案中，所述载体进一步包含编码具有以下序列的成熟hIL-18同种型1多肽的核酸序列：

在一个实施方案中，所述多肽IL-18药剂是具有以下氨基酸序列的具有信号序列的hIL-18的同种型2(典范序列的Δ27-30)的前体：

获得编码前述多肽IL-18药剂的核酸序列是本领域技术人员众所周知的。

在一个实施方案中，除了用于靶向抗原的表达盒以外，所述表达载体进一步包含表达盒，所述表达盒包含编码IL-10多肽、特别是包含分泌前导序列的IL-10肽的核酸序列。作为使用多个表达盒的替代方案，编码CAR和IL-10多肽的核酸序列可以由多顺反子构建体编码，所述表达盒包含CAR和IL-10多肽的核酸序列，其采用促进所述多顺反子构建体的下游编码序列的表达的序列，包括但不限于内部核糖体进入位点(IRES)元件、EF1a核心启动子或口蹄疫病毒蛋白2A (FMVD2A)的核酸序列，以促进在靶标细胞中的共表达。

所述表达载体可以任选地提供包含编码“拯救”基因的核酸序列的额外的表达盒。“拯救基因”是核酸序列，其表达使得细胞易于受到外部因素的杀伤或在细胞中引起毒性条件，使得杀死细胞。提供拯救基因使得能够选择性细胞杀死转导的细胞。因此，当将构建体并入哺乳动物受试者的细胞中以防止转导细胞的不期望的扩散或能够复制的载体系统的作用时，拯救基因提供了额外的安全预防措施。在一个实施方案中，所述拯救基因是胸苷激酶(TK)基因(参见例如1997年5月20日发布的Woo等人，美国专利号5,631,236和1997年2月11日发布的Freeman等人，美国专利号5,601,818)，其中表达TK基因产物的细胞易于通过施用更昔洛韦而选择性杀死。或者，所述拯救基因可以编码已知的细胞表面抗原(例如CD20或EGFR)，使得能够通过施用靶向此类细胞的分子(例如，用于选择性清除表达CD20的细胞的利妥昔单抗(Rituxan®)，或用于选择性消除表达EGFR的细胞的西妥昔单抗(Erbitux®))来选择性杀死CAR-T细胞。

在一个实施方案中，所述表达载体可以任选地提供额外的表达盒，其包含编码针对ITIM的结合分子的核酸序列。在一个实施方案中，所述表达载体可以任选地提供额外的表达盒，其包含编码分子的核酸序列，所述分子结合抑制其活性的免疫系统的抑制受体的细胞质结构域上的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。ITIM是通常为序列S/I/V/LxYxxI/V/L的氨基酸的保守序列。当具有ITIM的抑制性受体与其配体相互作用时，其ITIM基序被Src激酶家族酶磷酸化，从而促进其募集其他酶、诸如磷酸酪氨酸磷酸酶SHP-1和/或SHP-2或称为SHIP的SHIP肌醇磷酸酶的能力。这些磷酸酶下调参与细胞信号转导的分子的活性。结合此类ITIM基序的分子的实例是本领域中已知的，并且可以例如用于设计结合分子(例如ScFv)，其能够从CAR表达载体进行细胞内表达，以便抑制由磷酸酪氨酸磷酸酶或肌醇磷酸酶(包括但不限于SHP-1、SHP-2和SHIP中的一种或多种)介导的免疫功能的下调。

在一个替代实施方案中，所述表达载体可以任选地提供额外的表达盒，其包含编码受体和/或受体亚基的核酸序列，特别是在异源多聚受体(例如IL-12)的情况下。在具体实施方案中，由所述载体编码的受体是选自以下的受体中的一种或多种：IL2受体、IL7受体、IL10受体、IL12受体、IL17受体、IL18受体及其功能类似物。在一些实施方案中，所述载体进一步包含编码前述受体中的一种或多种的核酸序列，所述受体具有分泌前导序列以促进载体在CAR T细胞的表面上的展示。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是已经通过基本上根据上述教导用编码CAR的表达载体转导而重组修饰的T细胞。用编码抗靶向抗原CAR的表达载体转化T细胞的前提条件是获得多个T细胞。可用于制备本文考虑的CAR-T细胞的T细胞包括幼稚T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或其组合。

在一个实施方案中，通过本领域中可用的任何多种T细胞系由受试者自身的(自体的)T细胞制备CAR-T细胞(例如，Snook和Waldman (2013) Discovery Medicine 15(81):120-25)。通常从待治疗的哺乳动物受试者获得用于转化的T细胞。T细胞可以获得自哺乳动物受试者的许多来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、脾组织和肿瘤。在一个实施方案中，通过单采血液分离术程序、诸如白细胞分离术获得T细胞。白细胞分离术是本领域技术人员众所周知的方法，并且可以通过使用商业可得的设备、包括但不限于Haemonetics® Cell Saver® 5+, (商业可得自Haemonetics Corporation, 400Wood Road, Braintree MA 02184)或COBE® 2991细胞处理器(商业可得自TerumoBCT,Inc. 10811 West Collins Avenue, Lakewood CO 80215)基本上根据由制造商提供的说明来实现。在一个替代实施方案中，所述CAR-T细胞可以是同种异体的(参见例如，Gouble,等人, (2014)

在实施方案中，从外周血分离T细胞，并且可以通过本领域中众所周知的选择技术(诸如与抗CD3/抗CD28缀合珠粒孵育)分离特定T细胞(诸如CD3

基本上根据上述程序制备的处理的T细胞可用于进一步处理或冷冻保存。

用CAR表达载体转导T细胞可以使用本领域中众所周知的技术完成，所述技术包括但不限于与宿主T细胞和病毒载体共孵育、电穿孔和/或化学增强的递送。参见，例如，Naldini, 等人 (1996)

在转化后，T细胞通常可以使用如例如以下中所述的方法活化和扩增：美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号2006/0121005。通常，通过培养与表面接触的细胞来扩增本发明的T细胞，所述表面提供刺激CD3 TCR复合物相关信号的试剂(例如，抗CD3抗体)和刺激T细胞的表面上的共刺激分子的试剂(例如抗CD28抗体)。适合于T细胞培养的条件是本领域中众所周知的。Lin, 等人 (2009) Cytotherapy 11(7):912-922 (Optimization andvalidation of a robust human T-cell culture method for monitoring phenotypicand polyfunctional antigen-specific CD4 and CD8 T-cell responses); Smith, 等人(2015) Clinical & Translational Immunology 4:e31 2015年1月16日在线公开 (“Exvivo expansion of human T-cells for adoptive immunotherapy using the novelXeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement”)。将靶标细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和大气(例如空气加5% CO

本发明进一步提供了补充有IL-10药剂的用于培养CAR-T细胞的培养基。在一个实施方案中，本发明的培养基是完全培养基，其补充有IL-10药剂，以达到至少0.1 ng/ml、至少0.2 ng/ml、至少0.5 ng/ml、至少1 ng/ml、至少2 ng/ml、至少3 ng/ml、至少4 ng/ml、至少5 ng/ml、至少10 ng/ml、至少50 ng/ml、至少100 ng/ml、至少200 ng/ml、至少400 ng/ml、至少500 ng/ml、至少1000 ng/ml、至少1500 ng/ml的IL-10药剂的浓度。

培养基中的IL-10的水平应当维持的水平低于IL-10对T细胞有毒性的水平，任选毒性IL-10药剂浓度的小于50%，任选地毒性IL-10药剂浓度的小于30%，任选地毒性IL-10药剂浓度的小于20%，或任选地毒性IL-10药剂浓度的小于10%。

可用于培养和繁殖T细胞的培养基是本领域中众所周知的。在培养T细胞的技术的一般实践中，为完全培养基。用于培养白细胞、诸如T细胞的典型的完全培养基是如Moore,G.E., 等人(1967) J.A.M.A., 199:519中所述的RPMI培养基以及如Moore, G.E.和Woods,L.K., "Culture media for human cells RPMI 1603, RPMI 1634, RPMI 1640 and GEM1717." Tissue Culture Association Manual, v. 3, 503-508 (1976)中所述的其变体。RPMI培养基的示例性制剂是可作为目录号11875获得自ThermoFisher Scientific(Carlsbad, CA)的RPMI 1640培养基，其在水溶液中具有以下配方：

本公开考虑本文所述的IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)用于增强CAR-T细胞疗法的治疗效果的用途。更具体地，IL-10药剂用于涉及调节受试者中的T细胞介导的对靶标细胞群体的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者引入治疗有效的经基因修饰以表达嵌合抗原受体的多种细胞和IL-10药剂的组合，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够结合靶标细胞群体的抗原特异性靶向区域，所述IL-10药剂增强CAR-T细胞疗法的细胞毒性作用。

本发明的组合物和方法可用于治疗肿瘤，包括良性和恶性肿瘤，以及肿瘤性疾病。适于使用本发明的组合物和方法治疗的良性肿瘤的实例包括但不限于腺瘤、纤维瘤、血管瘤和脂肪瘤。适于使用本发明的组合物和方法治疗的恶性前肿瘤的实例包括但不限于增生、非异性、化生和发育不良。适于使用本发明的组合物和方法治疗的恶性肿瘤的实例包括但不限于癌(源自上皮组织、诸如皮肤或内衬内脏器官的组织的癌)，白血病，淋巴瘤和通常源自骨骼脂肪、肌肉、血管或结缔组织的肉瘤)。术语肿瘤中还包括病毒诱导的肿瘤，诸如疣和EBV诱导的疾病(即，感染性单核细胞增多症)，疤痕形成，过度增生的血管疾病，包括内膜平滑肌细胞增生，再狭窄和血管闭塞等。

术语“肿瘤疾病”包括特征在于实体瘤和非实体瘤的癌症，包括但不限于乳腺癌；肉瘤(包括但不限于骨肉瘤和血管肉瘤)和纤维肉瘤)，白血病，淋巴瘤，泌尿生殖系统癌症(包括但不限于卵巢癌、尿道癌、膀胱癌和前列腺癌)；胃肠道癌(包括但不限于结肠食道癌和胃癌)；肺癌；骨髓瘤；胰腺癌；肝癌；肾癌；内分泌癌；皮肤癌；以及脑或中枢和外周神经(CNS)系统肿瘤(恶性或良性)，包括神经胶质瘤和神经母细胞瘤，星形细胞瘤，骨髓增生病症；宫颈原位癌；肠息肉病；口腔黏膜白斑病；组织细胞增多病、过度增生性瘢痕，包括瘢瘤性疤痕，血管瘤；过度增生性动脉狭窄，牛皮癣，炎性关节炎；角化过度和丘疹鳞屑性爆发，包括关节炎。在一些实施方案中，将CAR的ARD设计为与和非癌性炎性和过度增殖性病况相关的细胞表面标志物相互作用，包括但不限于CAR-T细胞组合物及其使用的相关方法，包括用于治疗例如阿尔茨海默氏病的抗Aβ CAR-T细胞，用于治疗例如关节炎的抗TNF CAR-T细胞，用于治疗例如斑块状银屑病的抗IL17RA CAR-T细胞，用于治疗例如前列腺癌和良性前列腺增生的抗PSMA CAR-T细胞，用于治疗例如皮炎的抗IL4RA CAR-T细胞，例如治疗高胆固醇血症的抗PCSK9 CAR-T细胞，用于治疗例如年龄相关的黄斑变性的抗VEGFR1 CAR-T细胞，用于治疗例如年龄相关的黄斑变性的抗VEGFR2 CAR-T细胞，用于治疗例如类风湿性关节炎的抗IL- 6R CAR-T细胞，用于治疗例如牛皮癣、关节炎和克罗恩氏病的抗IL-23 CAR-T细胞，以及用于治疗例如HIV感染的抗CD4 CAR-T细胞。

术语“肿瘤疾病”包括骨髓瘤和淋巴瘤。每个类别含有不同类型的具有定义的形态学、病理学、治疗和/或预后特征的造血细胞癌。正确的分类连同可能影响预后或对化学治疗的应答的另外的因子的鉴定对于允许最佳治疗而言是必要的。骨髓瘤包括但不限于骨髓增殖性肿瘤、嗜酸粒细胞增多的骨髓细胞和淋巴细胞病症、骨髓增殖/骨髓增殖异常肿瘤、骨髓增殖异常综合征、急性髓细胞性白血病和相关前体肿瘤以及谱系未定的急性白血病。淋巴瘤包括但不限于前体淋巴瘤、成熟B细胞瘤、成熟T细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤以及免疫缺陷相关的淋巴组织增殖性病症。造血系统的其他癌症包括但不限于组织细胞和树突细胞肿瘤。

确定治疗癌症的临床效力通常与获得一种或多种本领域公认的参数相关，所述参数诸如病变的减少，尤其是减少转移性病变的减少，转移的减少，肿瘤体积的减小，ECOG评分的改善等。确定对治疗的应答可以通过测量生物标志物来评价，所述生物标志物可以提供可用于IL-10或免疫途径调节的任何方面中的可复制信息，包括受试者对这种疗法的应答的存在和程度以及由这种治疗引起的不利作用的存在和程度。通过实例的方式，但不限制，生物标志物包括IFNγ的增强以及颗粒酶A、颗粒酶B和穿孔素的上调；CD8+ T细胞数目和功能的增加；IFNγ的增强，CD8+ T细胞上ICOS表达的增加；表达IL-10的T

另外的实施方案包括用于确定组合中的药剂的最佳量的方法或模型。最佳量可以是例如在受试者或受试者群体中实现最佳效果的量，或实现治疗效果，同时最小化或消除与所述药剂中的一种或多种相关的副作用的量。在一些实施方案中，已知或已确定IL-10和CAT-T细胞自身的组合的要素有效治疗或预防受试者(例如，人)或受试者群体中的本文描述的疾病、病症或病况(例如，癌性病况)，并且一种药剂的量是逐步增加的，而另一种药剂的量保持恒定。通过以此方式操纵药剂的量，临床医师能够确定对于例如治疗特定疾病、病症或病况，或者消除副作用或者减少副作用而言最有效的药剂的比率，使得所述药剂在所述环境下是可接受的。

在具体实施方案中，将治疗有效量的IL-10药剂(例如，皮下)和治疗有效的多个CAR-T细胞(例如，静脉内)肠胃外施用于受试者。在其他实施方案中，通过静脉内输注将治疗有效的经基因修饰以表达嵌合抗原受体和IL-10药剂的多个细胞引入受试者。在其他实施方案中，通过肿瘤内注射将治疗有效的经基因修饰以表达嵌合抗原受体和IL-10药剂的多个细胞引入受试者。在其他实施方案中，通过局部区域输注将将治疗有效的经基因修饰以表达嵌合抗原受体和IL-10药剂的多个细胞引入受试者。在又进一步实施方案中，通过经基因修饰以表达IL-10药剂的细胞的方式将足以预防或限制活化诱导的细胞死亡的治疗有效量的IL-10药剂引入受试者，其中在与表达CAR的细胞不同的细胞中存在表达构建体。

在其中CAR-T细胞也表达IL-10药剂的那些实施方案中，由于其直接和局部作用，实现治疗有效量所必需的IL-10药剂的量可能显著低于通过IL-10药剂的全身施用而实现治疗效果所需的量。如本文所述，IL-10的表达水平可以在促进原位调节IL-10的表达水平的可调节启动子的控制下。

通常，治疗剂的给药参数指示剂量的量应小于可能对受试者产生不可逆的毒性的量(即，最大耐受剂量，“MTD”)并且不小于产生对受试者的可测量效果所要求的量。考虑施用途径和其他因素，此类量通过例如与ADME相关的药代动力学和药效学参数来确定。

“有效剂量(ED)”是药剂在服用所述药剂的受试者的某一部分中产生治疗应答或期望效果的剂量或量。药剂的“中值有效剂量”或ED50是药剂在施用所述药剂的50%的群体中产生治疗应答或期望效果的剂量或量。尽管ED50通常用作药剂的效果的合理预期的量度，但它不一定是临床医师可能在考虑所有相关因素的情况下认为适当的剂量。因此，在一些情况下，有效量可以大于计算的ED50；在其他情况下，有效量可以小于计算的ED50；并且在还有其他情况下，有效量可以与计算的ED50相同。

本公开的治疗剂(例如IL-10药剂和CAR-T细胞)可以一定量向受试者施用，所述量取决于例如施用目标(例如，期望的消退(resolution)程度)；受试者的年龄、重量、性别以及健康和身体状况；所施用制剂；和施用途径。治疗有效量和剂量方案可以从例如安全性和剂量递增试验、体内研究(例如，动物模型)以及技术人员已知的其他方法确定。

1.IL-10药剂的施用/给药：

在一个实施方案中，在一定时间段内维持用IL-10药剂和其他药剂的治疗。在另一个实施方案中，减少或终止用至少一种其他药剂的治疗(例如，当受试者稳定时)，而用本公开的IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)的治疗维持恒定的给药方案。在一个进一步实施方案中，减少或终止用其他药剂的治疗(例如，当受试者稳定时)，而减少用本公开的IL-10药剂的治疗(例如，更低剂量、更低频率给药或更短的治疗方案)。在又另一个实施方案中，减少或终止用其他药剂的治疗(例如，当受试者稳定时)，并且增加用本公开的IL-10药剂的治疗(例如，更高剂量、更频繁给药或更长的治疗方案)。在又另一个实施方案中，维持用其他药剂的治疗，并且减少或终止用本公开的IL-10药剂的治疗(例如，更低剂量、更低频率给药或更短的治疗方案)。在又另一个实施方案中，减少或终止用其他药剂的治疗和用本公开的IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)的治疗(例如，更低剂量、更低频率给药)。

本文描述的方法中的IL-10的血浆水平可以几种方式表征，包括：(1)高于某一指定水平或处于水平范围内的平均IL-10血清谷浓度；(2)持续一定量时间高于某一指定水平的平均IL-10血清谷浓度；(3)高于或低于某一指定水平或处于水平范围内的稳态IL-10血清浓度水平；或者(4)高于或低于某一指定水平或处于某一水平范围内的浓度概况的C

在一些实施方案中，将IL-10血清谷浓度在一定时间段内维持在大于约0.1 ng/mL、大于约0.2 ng/mL、大于约0.3 ng/mL、大于约0.4 ng/mL、大于约0.5 ng/mL、大于约0.6ng/mL、大于约0.7 ng/mL、大于约0.8 ng/mL、大于约0.9 ng/mL、大于约1.0 ng/mL、大于约1.5 ng/mL、大于约2.0 ng/mL、大于约2.5 ng/mL、大于约3.0 ng/mL、大于约3.5 ng/mL、大于约4.0 ng/mL、大于约4.5 ng/mL、大于约5.0 ng/mL、大于约5.5 ng/mL、大于约6.0 ng/mL、大于约6.5 ng/mL、大于约7.0 ng/mL、大于约7.5 ng/mL、大于约8.0 ng/mL、大于约8.5ng/mL、大于约9.0 ng/mL、大于约9.5 ng/mL或大于约10.0 ng/mL的水平。

在本公开的具体实施方案中，平均IL-10血清谷浓度在0.1 ng/mL至10.0 ng/mL的范围内。在还有其他实施方案中，所述平均IL-10血清谷浓度在1.0 ng/mL至1 ng/mL的范围内。通过实例的方式，在一个实施方案中，所述平均血清IL-10浓度可以在0.5 ng/mL至5ng/mL的范围内。通过进一步实例的方式，本公开的具体实施方案包括在以下范围内的平均IL-10血清谷浓度：约0.5 ng/mL至约10.5 ng/mL，约1.0 ng/mL至约10.0 ng/mL，约1.0 ng/mL至约9.0 ng/mL，约1.0 ng/mL至约8.0 ng/mL，约1.0 ng/mL至约7.0 ng/mL，约1.5 ng/mL至约10.0 ng/mL，约1.5 ng/mL至约9.0 ng/mL，约1.5 ng/mL至约8.0 ng/mL，约1.5 ng/mL至约7.0 ng/mL，约2.0 ng/mL至约10.0 ng/mL，约2.0 ng/mL至约9.0 ng/mL，约2.0 ng/mL至约8.0 ng/mL，和约2.0 ng/mL至约7.0 ng/mL。

在具体实施方案中，在治疗的持续期间内维持1-2 ng/mL的平均IL-10血清谷浓度。本公开还考虑其中在治疗的持续时间内平均IL-10血清峰浓度小于或等于约10.0 ng/mL的实施方案。

本公开考虑导致在一定时间段内维持上文阐述的任何IL-10血清谷浓度的任何剂量和给药方案的施用。通过实例的方式，但不限制，当受试者是人时，非PEG化的hIL-10可以以下剂量施用：大于0.5 µg/kg/天、大于1.0 µg/kg/天、大于2.5 µg/kg/天、大于5 µg/kg/天、大于7.5 µg/kg、大于10.0 µg/kg、大于12.5 µg/kg、大于15 µg/kg/天、大于17.5 µg/kg/天、大于20 µg/kg/天、大于22.5 µg/kg/天、大于25 µg/kg/天、大于30 µg/kg/天或大于35 µg/kg/天。另外，通过实例而非限制的方式，当受试者是人时，可以以以下剂量施用包含相对小PEG的PEG化的hIL-10 (例如，5kDa单-二-PEG-hIL-10)：大于0.5 µg/kg/天、大于0.75 µg/kg/天、大于1.0 µg/kg/天、大于1.25 µg/kg/天、大于1.5 µg/kg/天、大于1.75 µg/kg/天、大于2.0 µg/kg/天、大于2.25 µg/kg/天、大于2.5 µg/kg/天、大于2.75 µg/kg/天、大于3.0 µg/kg/天、大于3.25 µg/kg/天、大于3.5 µg/kg/天、大于3.75 µg/kg/天、大于4.0 µg/kg/天、大于4.25 µg/kg/天、大于4.5 µg/kg/天、大于4.75 µg/kg/天或大于5.0 µg/kg/天。

在进一步实施方案中，前述维持IL-10药剂的血清谷水平的时间段为至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少6周、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少9个月或大于12个月。

在本公开的具体实施方案中，平均IL-10血清谷浓度维持所述时间段的至少85%，所述时间段的至少90%、至少96%、至少98%、至少99%或100%。

尽管前面关于IL-10血清浓度、达到特定IL-10血清浓度所必需的剂量和治疗方案等的讨论涉及用IL-10药剂(例如PEG-IL-10)的单一疗法，但当将IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)与一种或多种额外疗法组合施用时，技术人员(例如，药理学家)能够确定最佳的给药方案。

如先前所讨论，使用患者自身的T细胞作为编码CAR-T融合蛋白的重组载体的宿主，制备CAR-T药剂。因此，待施用于受试者的细胞群体必然是可变的。此外，由于CAR-T细胞药剂是可变的，所以对此类药剂的应答可能不同，且因此涉及不断监测和管控疗法相关的毒性。

基于小鼠中的动物模型，每个疗程每只动物500万个细胞的剂量表明显著的抗肿瘤应答。当针对人按比例缩放时，该剂量近似等于约0.5x10

在本发明的实践中的CAR-T细胞施用的典型范围范围为每个CAR-T细胞疗程每kg受试者体重约1x10

用CAR-T细胞药剂的疗程可以是单剂量或一定时间段内的多剂量。在一些实施方案中，所述CAR-T细胞以单一剂量施用。在一些实施方案中，所述CAR-T细胞以在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、30、60、90或120天的时段内施用的两次或更多次分开剂量施用。在此类分开给药方案中施用的细胞的量在每次施用中可以相同或可以提供不同的水平。例如，在多天的三剂量分开给药方案中提供的疗程可以提供这样的施用：在第1天施用10%，在第2天施用30%，且在第3天施用60%；或者，在第1天施用10%，在第2天施用40%，且在第3天施用50%；或者，在第1天施用25%，在第2天施用25%，且在第3天施用50%；或者，在第1天施用50%，在第14天施用50%；或者，在第1天施用50%，在第7天施用50%；或者，在第1天施用50%，在第30天施用50%；或者，在第1天施用25%，在第14天施用25%，且在第30天施用50%；或者，在第1天施用50%，在第14天施用25%，且在第30天施用25%；或者，在第1天施用60%，在第14天施用30%，且在第30天施用10%；或者，在第1天施用50%，在第30天施用25%，且在第60天施用25%。

如先前所讨论，可以使用患者自身的T细胞作为编码CAR-T融合蛋白的重组载体的宿主来制备CAR-T药剂。因此，待施用于受试者的细胞群体必然是高度可变的。因此，与CAR-T细胞疗法的施用相关的剂量也是可变的，并且经常与毒性管控相关。一种毒性形式与过度免疫应答(包括细胞因子释放综合征)中的同种异体或自体T细胞输注相关，其用药理学免疫抑制或B细胞耗竭的过程进行管控。此类免疫抑制方案的实例包括全身性皮质类固醇(例如，甲基泼尼松龙)。B细胞耗竭的疗法包括通过建立的临床给药指南的静脉内免疫球蛋白(IVIG)，以恢复血清免疫球蛋白水平的正常水平。

在一些实施方案中，在施用本发明的CAR-T细胞疗法之前，可以任选地对受试者进行淋巴耗竭方案。这种淋巴耗竭方案的一个实例由以下组成：向受试者施用氟达拉滨(每天30 mg/m

如本文所示，CAR-T细胞与IL-10药剂(和任选地额外的免疫调节剂和治疗剂)的组合施用增强CAR-T细胞的细胞毒性和免疫调节特性。因此，当与IL-10药剂组合时，可以降低通常用于治疗给定疾病、病症或病况的CAR-T细胞的水平，以实现可能由CAR-T细胞疗法鉴定的副作用的减少。因此，本发明考虑通过与IL-10药剂组合施用CAR-T细胞药剂来减轻与CAR-T细胞疗法相关的副作用的方法。可以通过采用本发明的组合物和方法减轻的副作用的实例包括但不限于细胞因子释放综合征、脱靶反应性、免疫抑制和炎症。

结合本文描述的CAR-T细胞和IL-10药剂组合疗法，本公开考虑向CAR-T细胞和IL-10药剂组合疗法中添加一种或多种活性剂(“补充剂”)。此类进一步的组合被称为“补充组合”、“补充组合治疗”，并且被添加至CAR-T细胞和IL-10药剂组合疗法的药剂被称为“补充剂”。

如本文所用，“补充组合”意在包括可以分开施用或引入、例如、分开配制用于分开施用(例如，如可以在试剂盒中提供)的那些组合，以及可以一起施用或引入的疗法。在某些实施方案中，依次施用或应用所述CAR-T细胞和IL-10药剂组合疗法和补充剂，例如其中一种药剂在一种或多种其他药剂之前施用。在其他实施方案中，同时施用所述CAR-T细胞/IL-10药剂组合疗法和补充剂，例如，其中在同时或约同时施用两种或更多种药剂；两种或更多种药剂可以存在于两种或更多种分开的制剂中或组合于单一制剂(即，共制剂)中。不管药剂是依次施用还是同时施用，出于本公开的目的，它们被认为组合施用。

在一个实施方案中，所述补充剂是化学治疗剂。术语“化学治疗剂”包括但不限于烷化剂，诸如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸酯，诸如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，诸如苯柔多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、甲基多巴(meturedopa)和普力多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酸胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸二氯甲基二乙胺氧化物、马法兰、新氮芥(novembichin)、苯芥胆固醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥末；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福替目丁(fotemustine)、洛莫司汀、嘧啶亚硝脲(nimustine)、雷莫司汀(rani mustine)；抗生素，诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、蒽霉素(authramycin)、重氮乙酰丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素(cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢剂，诸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧旋(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、亚叶酸；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、氮杂胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺(aldophosphamide)葡糖苷；氨基乙酰丙酸；安丫啶(amsacrine)；贝曲布索(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；迪氟法迈(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾氟米辛(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidamine)；丙酮双脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)，吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙基肼；甲基苄肼；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三乙撑亚胺苯醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；聚胺酯(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴脱氧己六醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；嘉胞苷(gacytosine)；阿糖胞苷("Ara-C")；环磷酰胺；塞替派；紫杉醇，例如紫杉醇、nab-紫杉醇和多西他赛、苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲蝶呤；铂和铂配位络合物，诸如顺铂、奥沙利铂(oxaplatin)和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；柔红霉素；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT11；拓扑异构酶抑制剂；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；埃斯波霉素(esperamicin)；卡培他滨；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。术语“化学治疗剂”还包括起作用以调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛西芬(keoxifene)、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；以及抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，所述补充剂可以是本领域中鉴定为可用于治疗肿瘤疾病的一种或多种化学或生物学药剂，包括但不限于细胞因子或细胞因子拮抗剂诸如IL-12、INFα或抗表皮生长因子受体，放射疗法，伊立替康；四氢叶酸抗代谢物，诸如培美曲塞；针对肿瘤抗原的抗体，单克隆抗体和毒素的复合物，T细胞佐剂，骨髓移植或抗原呈递细胞(例如，树突细胞疗法)，抗肿瘤疫苗，能够复制的病毒，信号转导抑制剂(例如，Gleevec®或Herceptin®)或实现肿瘤生长的累加或协同抑制的免疫调节剂，非甾体抗炎药(NSAID)，环氧合酶-2(COX-2)抑制剂，甾体，TNF拮抗剂(例如，Remicade®和Enbrel®)，干扰素-β1a(Avonex®)和干扰素-β1b (Betaseron®)以及在已知化学治疗方案(包括但不限于TAC、FOLFOX、TPC、FEC、ADE、FOLFOX-6、EPOCH、CHOP、CMF、CVP、BEP、OFF、FLOX、CVD、TC、FOLFIRI、PCV、FOLFOXIRI、ICE-V、XELOX和本领域中熟练的临床医生容易理解的其他)中实践的前述中的一种或多种的组合。

在一个实施方案中，所述补充剂是一种或多种非药理学形式(例如，局部放射疗法或全身放射疗法)。通过实例的方式，本公开考虑这样的治疗方案，其中放射阶段之前或之后用一种或多种额外的如本文所述的疗法(例如，CAR-T细胞疗法和IL-10药剂的施用)或药剂进行治疗。在一些实施方案中，本公开进一步考虑使用CAR-T细胞疗法和IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)与骨髓移植、外周血干细胞移植或其他类型的移植疗法的组合。

在本发明的一个实施方案中，在施用CAR-T细胞之前，所述受试者经历“化学引发”以消除现有的T细胞。在典型的实践中，化学引发通过施用一种或多种导致T细胞减少或消融的治疗方式来实现，所述治疗方式包括但不限于环磷酰胺化学治疗方案，诸如环磷酰胺和氟达卡宾的组合施用，基于铂的化学治疗方案，紫杉烷类，替莫唑胺。

在另一个实施方案中，“补充剂”是用于治疗和/或预防受试者中的肿瘤疾病以及与肿瘤疾病相关的疾病、病症或病况的免疫检查点调节剂。术语“免疫检查点途径”是指通过抗原呈递细胞(APC)上表达的第一分子(例如，蛋白诸如PD1)与免疫细胞(例如T细胞)上表达的第二分子(例如，蛋白诸如PDL1)的结合而触发的生物应答，所述免疫细胞(例如T细胞)通过免疫应答的刺激(例如，T细胞活性的上调)或抑制(例如，T细胞活性的下调)来调节免疫应答。参与调节免疫应答的结合对的形成的分子通常称为“免疫检查点”。通过此类免疫检查点途径调节的生物应答由细胞内信号传导途径介导，所述细胞内信号传导途径导致下游免疫效应子途径，诸如细胞活化、细胞因子产生、细胞迁移、细胞毒性因子分泌和抗体产生。免疫检查点途径通常由第一细胞表面表达的分子与和免疫检查点途径相关的第二细胞表面分子的结合(例如，PD1与PDL1的结合，CTLA4与CD28的结合等)触发。免疫检查点途径的活化可以导致免疫应答的刺激或抑制。

其活化导致免疫应答的抑制或下调的免疫检查点在本文中称为“阴性免疫检查点途径”。由阴性免疫检查点的活化导致的免疫应答的抑制减弱宿主免疫系统识别外源抗原诸如肿瘤相关抗原的能力。术语阴性免疫检查点途径包括，但不限于，通过PD1与PDL1、PD1与PDL2和CTLA4与CDCD80/86的结合调节的生物途径。此类阴性免疫检查点拮抗剂的实例包括但不限于这样的拮抗剂(例如拮抗剂抗体)，其结合T细胞抑制受体，包括但不限于PD1(也称为CD279)，TIM3(T细胞膜蛋白3；也称为HAVcr2)，BTLA(B和T淋巴细胞弱化子；也称为CD272)，VISTA (B7-H5)受体，LAG3(淋巴细胞活化基因3；也称为CD233)和CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 ；也称为CD152)。

在一个实施方案中，其活化导致免疫应答的刺激的免疫检查点途径在本文中称为“阳性免疫检查点途径”。术语阳性免疫检查点途径包括，但不限于，通过ICOSL与ICOS(CD278)、B7-H6与NKp30、CD155与CD96、OX40L与OX40、CD70与CD27、CD40与CD40L和GITRL与GITR的结合介导的生物途径。激动阳性免疫检查点的分子(诸如刺激免疫应答的结合对的组分的天然或合成配体)可用于上调免疫应答。此类阳性免疫检查点激动剂的实例包括但不限于这样的激动剂抗体，其结合T细胞活化受体，诸如ICOS (诸如JTX-2011, JounceTherapeutics)，OX40 (诸如MEDI6383, Medimmune)，CD27 (诸如varlilumab, CelldexTherapeutics)，CD40 (诸如dacetuzmumab CP-870,893, Roche, Chi Lob 7/4)，HVEM,，CD28，CD137 4-1BB，CD226和GITR (诸如MEDI1873, Medimmune; INCAGN1876, Agenus)。

如本文所用，术语“免疫检查点途径调节剂”是指在生物系统(包括免疫活性哺乳动物)中抑制或刺激免疫检查点途径的活性的分子。免疫检查点途径调节剂可以通过结合免疫检查点蛋白(诸如在抗原呈递细胞(APC)诸如癌细胞和/或免疫T效应子细胞的表面上表达的那些免疫检查点蛋白)而发挥作用，或者可以发挥其对免疫检查点途径中的上游和/或下游反应的作用。例如，免疫检查点途径调节剂可以调节SHP2(一种参与PD-1和CTLA-4信号传导的酪氨酸磷酸酶)的活性。术语“免疫检查点途径调节剂”涵盖能够至少部分下调抑制性免疫检查点的功能的免疫检查点途径调节剂(本文中称为“免疫检查点途径抑制剂”或“免疫检查点途径拮抗剂”)和能够至少部分上调刺激性免疫检查点的功能的免疫检查点途径调节剂(本文中称为“免疫检查点途径效应子”或“免疫检查点途径激动剂”)两者。

通过免疫检查点途径介导的免疫应答不限于T细胞介导的免疫应答。例如，NK细胞的KIR受体调节由NK细胞介导的对肿瘤细胞的免疫应答。肿瘤细胞表达被称为HLA-C的分子，其抑制NK细胞的KIR受体，导致缩减(dimunition)或抗肿瘤免疫应答。拮抗HLA-C与KIR受体的结合的药剂(诸如抗KIR3单抗(例如lirilumab，BMS))的施用抑制HLA-C结合NK细胞抑制受体(KIR)的能力，由此恢复NK细胞来检测和攻击癌细胞的能力。因此，由HLA-C与KIR受体的结合介导的免疫应答是阴性免疫检查点途径的实例，其抑制导致非T细胞介导的免疫应答的活化。

在一个实施方案中，所述免疫检查点途径调节剂是阴性免疫检查点途径抑制剂/拮抗剂。在另一个实施方案中，与IL-10药剂组合采用的免疫检查点途径调节剂是阳性免疫检查点途径激动剂。在另一个实施方案中，与CAR-T细胞和/或IL-10药剂组合采用的免疫检查点途径调节剂是免疫检查点途径拮抗剂。

如先前所论述，“阴性免疫检查点途径抑制剂”是指这样的免疫检查点途径调节剂，其干扰阴性免疫检查点途径的活化，导致免疫应答的上调或增强。示例性阴性免疫检查点途径抑制剂包括但不限于程序性死亡-1(PD1)途径抑制剂，程序性死亡配体-1(PDL1)途径抑制剂，TIM3途径抑制剂和抗细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4)途径抑制剂。

在一个实施方案中，所述免疫检查点途径调节剂是抑制PD1与PDL1和/或PDL2的结合的阴性免疫检查点途径的拮抗剂(“PD1途径抑制剂”)。PD1途径抑制剂导致刺激一系列有利的免疫应答，诸如T细胞耗竭的逆转，细胞因子产生的恢复以及抗原依赖性T细胞的扩增。PD1途径抑制剂已被认为是来自USFDA的有效的各种癌症接收批准，用于治疗各种癌症，包括黑色素瘤、肺癌、肾癌、霍奇金氏淋巴瘤、头颈癌、膀胱癌和尿路上皮癌。

术语PD1途径抑制剂包括干扰PD1与PDL1和/或PDL2的结合的单克隆抗体。抗体PD1途径抑制剂是本领域中众所周知的。干扰PD1与PDL1和/或PDL2的结合的作为单克隆抗体的市售的PD1途径抑制剂的实例包括尼沃单抗(Opdivo®, BMS-936558, MDX1106, 由BristolMyers Squibb, Princeton NJ市售)，派姆单抗(Keytruda® MK-3475,lambrolizumab, 由Merck and Company, Kenilworth NJ市售)和阿特珠单抗(Tecentriq®, Genentech/Roche, South San Francisco CA)。另外的PD1途径抑制剂抗体正在临床开发中，包括但不限于度伐单抗 (MEDI4736, Medimmune/AstraZeneca)，pidilizumab(CT-011, CureTech), PDR001 (Novartis)，BMS-936559 (MDX1105, BristolMyersSquibb)和阿维单抗(MSB0010718C, Merck Serono/Pfizer)和SHR-1210 (Incyte)。另外的抗体PD1途径抑制剂描述于在2012年7月10日发布的美国专利号8,217,149 (Genentech，Inc)；在2012年5月1日发布的美国专利号8,168,757 (Merck Sharp and Dohme Corp.)，在2011年8月30日发布的美国专利号8,008,449 (Medarex)，在2011年5月17日发布的美国专利号7,943,743 (Medarex, Inc)。

在本发明的一个实施方案中，所述PD1免疫检查点途径调节剂是包含下表3中提供的CDR序列的抗体：

在本发明的一个实施方案中，所述PD1免疫检查点途径抑制剂是包含下表4中提供的可变结构域序列(SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57)的抗体：

在本发明的一个实施方案中，所述PD1-拮抗剂抗体是AM0001：具有λ2轻链和在位置228处具有丝氨酸至脯氨酸取代(S228P)以提供“铰链-稳定的”重链的IgG4的单克隆抗体，其特征在于具有对应于如上文表3中所示的SEQ ID NO:50-55的氨基酸序列的VL和VHCDR，特征在于SEQ ID NO:56的序列的轻链可变区和特征在于SEQ ID NO:57的氨基酸序列的重链可变区。AM0001抗体的特征在于在25℃下对于人和食蟹猴PD-1的结合亲和力(K

下面提供了AM0001的重链和轻链的全长氨基酸序列。

PD-1途径抑制剂抗体可以通过重组方式产生。本发明包括编码SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO. 52、SEQ ID NO. 53、SEQ ID NO. 54、SEQ ID NO. 5、SEQ IDNO. 56、SEQ ID NO. 57、SEQ ID NO. 60和SEQ ID NO. 61的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了当所述PD1-拮抗剂抗体是AM0001时的核酸序列，编码AM0001的重链和轻链(SEQ ID NO.60和SEQ ID NO.61)的核酸序列在下面分别示为SEQ ID NO. 62和SEQ ID NO. 63。

术语PD1途径抑制剂不限于拮抗剂抗体。非抗体生物PD1途径抑制剂也在临床开发中，包括AMP-224(PD-L2 IgG2a融合蛋白)和AMP-514(PDL2融合蛋白)(其在Amplimmune和Glaxo SmithKline的临床开发中)。适体化合物也在文献中被描述为可用作PD1途径抑制剂(Wang, 等人 Selection of PD1/PD-L1 X-Aptamers, Biochimie, 印刷中; 2017年9月11日在线提供，因特网地址：https://doi.org/10.1016/j.biochi.2017.09.006。

术语PD1途径抑制剂包括肽基PD1途径抑制剂，诸如在2016年8月23日发布的Sasikumar等人，美国专利号9,422,339和在2014年12月9日发布的Sasilkumar等人，美国专利号8,907,053中描述的那些。CA-170 (AUPM-170，Aurigene/Curis)据报道是口服生物可利用的小分子，其靶向免疫检查点PDL1和VISTA。Pottayil Sasikumar, 等人

术语PD1途径抑制剂包括小分子PD1途径抑制剂。可用于实施本发明的小分子PD1途径抑制剂的实例描述于本领域中，包括Sasikumar, 等人

和

Chupak LS和Zheng X.

本公开的CAR-T细胞和/或IL-10药剂组合物和方法特别适合于治疗肿瘤病况，对于所述肿瘤病况，PD1途径抑制剂已经通过FDA批准用于治疗该疾病或在临床试验中证明临床效力而在人类中证明临床效果，所述肿瘤病况包括但不限于黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、肾细胞癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫宫颈癌、子宫肉瘤、胃癌、食道癌、 DNA错配修复缺陷的结肠癌、DNA错配修复缺陷的子宫内膜癌、肝细胞癌、乳腺癌、默克尔细胞癌、甲状腺癌、霍奇金氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、外周性T细胞淋巴瘤。

也许已经用抗PD1单克隆抗体派姆单抗(Keytruda®)和尼沃单抗获得了最充分研究的具有最丰富临床经验的免疫疗法。这些产品已证明显著的有效性，并且现在目前享有用于各种各样癌症的多项批准。用这些药剂的临床经验已经证明指向最大成功机会的一系列参数。抗PD1疗法已经证明在其中存在高水平的PDL1表达(Garon, 等人 NEJM 2014)、其中所述肿瘤具有肿瘤突变负荷(Rizvi 等人, Science 2015; Carbone 等人 NEJM 2017)、其中肿瘤中存在高水平的CD8+ T细胞(Tumeh, 等人, Nature 2014)、与IFNγ相关的免疫活化特征(Prat, 等人, Cancer Res. 2017; Ayers 等人 JCI 2017)以及缺乏转移性疾病、尤其是肝转移(Tumeh 等人 Cancer Imm. Res. 2017; Pillai, 等人 ASCO 2017)的那些肿瘤中的最高水平的有效性。这些因素将PD1疗法的有效性限于相对小范围的肿瘤。各种各样的肿瘤具有低的新抗原负荷与稀有的新抗原特异性CD8+ T细胞，且具有高的新抗原负荷的肿瘤已经最终逃避ICI。在其他情况下，肿瘤微环境中存在免疫沙漠，在那里，T细胞已耗竭并凋亡，T细胞表达的缺乏导致肿瘤中的颗粒酶和IFNγ表达水平低。IL-10单一疗法解决了这些参数中的许多。已经观察到IL-10增加肿瘤内CD8+ T细胞的活性，增加颗粒酶、FasL和IFNγ的水平。Mumm, 等人

在一个实施方案中，所述免疫检查点途径调节剂是抑制CTLA4与CD28的结合的阴性免疫检查点途径的拮抗剂(“CTLA4途径抑制剂”)。免疫检查点受体CTLA4属于受体的免疫球蛋白超家族，其还包括PD1；BTLA；淋巴细胞衰减因子；TIM3以及T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制剂。CD80 (也称为B7.1)和CD86 (也称为B7.2)已被鉴定为CTLA4受体配体。对待临床靶向的第一免疫检查点受体CTLA4排他地在T细胞上表达，其中CTLA4主要调节T细胞活化的早期阶段的幅度。已显示CTLA4对抗T细胞共刺激性受体CD28的活性。

在抗原识别后，CD28信号传导使T细胞受体信号传导强烈扩增以活化T细胞。[参见，例如，Riley等人, (2002) Proc. Natl Acad. Sci. USA 99:11790-95]。CTLA4在T细胞活化后被转录性地诱导。尽管CTLA4由活化的CD8+效应T细胞表达，但其主要生理学作用据信通过对CD4+ T细胞的两个主要子集的不同作用而显现：i)下调辅助T细胞活性，以及ii)增强调节T细胞免疫抑制活性。具体地，CTLA4阻断导致依赖于辅助T细胞的免疫应答增强，而调节T细胞的CTLA4接合增加其抑制功能。[参见，例如，Fontenot等人, (2003) Nat.Immunol. Proc. 4:330-36]。CTLA4途径抑制剂的实例是本领域中众所周知的(参见，例如，在2004年1月27日发布的美国专利号6,682,736 (Abgenix)；在2007年5月29日发布的美国专利号6,984,720 (Medarex, Inc.)；在2009年10月20日发布的美国专利号7,605,238(Medarex, Inc.)。

目前，CTLA4途径抑制剂抗体治疗方法并不是没有缺点。通过实例的方式，已报道用人源化的抗CTLA4拮抗性抗体治疗转移性黑色素瘤引起某些自身免疫毒性(例如，肠炎和皮炎)，提示要求确定耐受的治疗窗口(Wu等人, (2012) Int. J. Biol. Sci. 8:1420-30)。CTLA4途径抑制剂(例如，抗体，诸如伊匹木单抗)与IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)的组合的增强的治疗效力提供了在维持治疗效力的同时减少剂量的潜能。

在一个实施方案中，所述免疫检查点途径调节剂是抑制BTLA与HVEM的结合的阴性免疫检查点途径的拮抗剂(“BTLA途径抑制剂”)。BTLA是结构上和功能上与CTLA-4和PD-1相关的共抑制性分子。尽管BTLA在病毒特异性人CD8+ T细胞上表达，但BTLA在其从幼稚表型分化为效应子表型之后逐渐下调(Paulos 等人, (Jan. 2010) J. Clin. Invest. 120(1):76-80)。在某些肿瘤细胞类型(例如，黑色素瘤)和肿瘤相关内皮细胞上表达的疱疹病毒进入介体(HVEM；也称为TNFRSF14)已被鉴定为BTLA配体。由于BTLA和HVEM之间的相互作用是复杂的，BTLA的治疗抑制策略不如其他免疫检查点途径抑制性受体和配体的治疗抑制策略那么直接。[Pardoll, (April 2012) Nature Rev. Cancer 12:252-64]。已经评估了使用抗BTLA抗体和拮抗性HVEM-Ig靶向BTLA/HVEM途径的多种方法，并且此类方法已表明在包括移植、感染、肿瘤和自身免疫性疾病的许多疾病、病症和病况中有希望的效用(Wu等人，(2012) Int. J. Biol. Sci. 8:1420-30)。

在一个实施方案中，所述免疫检查点途径调节剂是抑制TIM3结合TIM3-活化配体的能力的阴性免疫检查点途径的拮抗剂(“TIM3途径抑制剂”)。TIM3抑制T辅助1 (TH1)细胞应答，并且已显示抗TIM3抗体增强抗肿瘤免疫。半乳凝素9，参与TIM3途径的调节的分子，在包括乳腺癌的各种类型的癌症中被上调。已报道TIM3与PD1在肿瘤特异性CD8+ T细胞上共表达。当受到睾丸癌抗原NY-ESO-1刺激时，两种分子的双重抑制显著增强人T细胞的体外增殖和细胞因子产生。此外，在动物模型中，报道PD1和TIM3的协作阻断在其中仅观察到来自每个单独分子的阻断的适度作用的情况下增强抗肿瘤免疫应答。[参见，例如，Pardoll,(April 2012) Nature Rev. Cancer 12:252-64; Zhu 等人, (2005) Nature Immunol.6:1245-52; Ngiow 等人, (2011) Cancer Res. 71:3540-51)]。TIM3途径抑制剂的实例是本领域中已知的，并且代表性的非限制性实例描述于2016年9月15日公开的美国专利公开号PCT/US2016/021005；2016年9月8日公开的Lifke, 等人，美国专利公开号US20160257749 A1 (F. Hoffman-LaRoche), 2017年4月27日发布的Karunsky, 美国专利号9,631,026；2014年9月23日发布的Karunsky, Sabatos-Peyton, 等人，美国专利号8,841,418；美国专利号9,605,070；2013年10月8日发布的Takayanagi, 等人，美国专利号8552156。

已显示LAG3在增强调节T (T

LAG3是在T

A2aR通过刺激CD4+ T细胞朝向T

IDO (吲哚胺2,3-双加氧酶)是在肿瘤细胞和活化免疫细胞中正常表达的免疫调节酶。IDO下调通过色氨酸的氧化介导的免疫应答。这导致T细胞活化的抑制和T细胞凋亡的诱导，产生肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞在其中变得不具有功能活性或不再能够攻击受试者的癌症细胞的环境。Indoximod (NewLink Genetics)是在转移性乳腺癌中被评估的IDO抑制剂。

描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(例如，Harlow和Lane (1999)Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY)；用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可用的(参见，例如，Coligan等人，(2001)Current Protocols in Immunology，第4卷，John Wiley, Inc., NY)；流式细胞术的方法，包括荧光活化细胞分选法(FACS)，是可用的(参见，例如，Shapiro (2003) Practical FlowCytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ)；并且适合于修饰包括核酸引物和探针的核酸、多肽以及抗体的例如用作诊断试剂的荧光试剂是可用的(Molecular Probes(2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.; Sigma-Aldrich (2003)Catalogue, St. Louis, MO.)。

如前所述，本发明提供了通过施用CAR-T细胞和/或IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)与调节至少一种免疫检查点途径的药剂(包括调节两种、三种或更多种免疫检查点途径的免疫检查点途径调节剂)的组合来治疗哺乳动物受试者中的肿瘤疾病(例如，癌症)的方法。

在一个实施方案中，可以通过施用多功能分子来调节多种免疫检查点途径，所述多功能分子能够充当多种免疫检查点途径的调节剂。此类多种免疫检查点途径调节剂的实例包括但不限于双特异性或多特异性抗体。能够充当多种免疫检查点途径的调节剂的多特异性抗体的实例是本领域中已知的。例如，美国专利公开号2013/0156774描述了用于靶向共表达PD1和TIM3的细胞的双特异性和多特异性药剂(例如，抗体)，以及其使用方法。此外，已显示BTLA和PD1的双重阻断增强抗肿瘤免疫(Pardoll, (April 2012) Nature Rev.Cancer 12:252-64)。本公开考虑使用IL-10药剂与靶向多种免疫检查点途径的免疫检查点途径调节剂(包括但不限于结合PD1和LAG3两者的双特异性抗体)的组合。因此，可以在多个水平增强抗肿瘤免疫力，并且可以基于各种机理考量来产生组合策略。

其他实施方案考虑施用IL-10药剂与多种检查点途径调节剂的组合，并且又进一步的实施方案考虑施用IL-10药剂与三种或更多种免疫检查点途径调节剂的组合。CAR-T细胞和/或IL-10药剂与多种免疫检查点途径调节剂的此类组合可以是有利的，因为免疫检查点途径可以具有不同的作用机制，这提供了从多个独特的治疗角度攻击潜在的疾病、病症或病况的机会。可以与IL-10药剂的施用组合的免疫检查点途径调节剂的代表性组合(其中一些在临床试验中如下鉴定)包括但不限于：

(a) PD1/PDL1途径抑制剂(包括但不限于尼沃单抗、派姆单抗、PDR001；MEDI4736、阿特珠单抗和度伐单抗)与LAG3拮抗剂抗体(例如BMS-986016，临床试验识别码NCT01968109)、CTLA4拮抗剂抗体(伊匹木单抗)、B7-H3拮抗剂抗体(例如依诺单抗，例如临床试验识别码NCT01968109)、KIR拮抗剂抗体(例如lirilumab，例如临床试验识别码NCT01714739)；

(b) PD1/PDL1途径抑制剂(包括但不限于尼沃单抗、派姆单抗、PDR001；MEDI4736、阿特珠单抗和度伐单抗)与阳性免疫检查点激动剂抗体，诸如针对4-1BB的激动剂抗体(relumab，临床试验识别码NCT02253992)，针对ICOS的激动剂抗体(例如JTX-2011，例如临床试验识别码NCT02904226)，针对CD27的激动剂抗体(例如varlilumab，例如临床试验识别码NCT02335918)，针对GITR的激动剂抗体(例如GWN323，例如临床试验识别码NCT02740270)和针对OX40的激动剂抗体(例如MEDI6383，例如临床试验识别号NCT02221960)。

(c) CTLA4途径抑制剂(包括但不限于伊匹木单抗)与LAG3拮抗剂抗体(例如BMS-986016)；TIM3拮抗剂抗体。

其他代表性的可以通过添加IL-10药剂而补充的具有PD1/PDL1途径抑制剂的组合疗法包括PD1/PDL1途径抑制剂与以下的组合：BRAF/MEK抑制剂，激酶抑制剂诸如舒尼替尼(NCT02484404)，PARP抑制剂诸如奥拉帕尼(NCT02484404)，EGFR抑制剂诸如奥希替尼(

应当注意，对免疫检查点途径抑制剂的治疗应答经常比对传统化学治疗、诸如酪氨酸激酶抑制剂的应答迟很多来表现自身。在一些情况下，在用免疫检查点途径抑制剂开始治疗之后，可能花六个月或更多个月才能观察到治疗应答的客观指标。此外，在涉及抗CTLA4抗体疗法的一些情况下，转移性病变在后续消退之前通过计算机断层成像(CT)或磁共振成像(MRI)扫描发现大小实际上是增加的[参见，例如，Pardoll, (April 2012)Nature Rev. Cancer 12:252-64]。因此，关于是否用免疫检查点途径抑制剂与本公开的CAR-T细胞和/或IL-10药剂的组合进行治疗的确定必须在往往比常规化学治疗剂更长的进展时间内作出。期望的应答可以是在所述情况下被认为有利的任何结果。在一些实施方案中，期望的应答是疾病、病症或病况的进展的预防，而在其他实施方案中，期望的应答是疾病、病症或病况的一种或多种特征的消退或稳定(例如，肿瘤大小的减小)。在还有其他实施方案中，期望的应答是与所述组合的一种或多种药剂相关的一种或多种副作用的减少或消除。

作为在CAR载体上共表达的替代方案，可以将细胞因子、诸如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL18以及其类似物和变体作为辅助剂与CAR-T细胞疗法一起施用。额外补充剂的实例包括但不限于IL-7药剂、修饰的多肽IL-10药剂、修饰的多肽IL-12药剂、修饰的多肽IL-7药剂、修饰的多肽IL-15药剂、PEG化的IL-2药剂和修饰的多肽IL-18药剂，具体包括PEG化的IL-7药剂、PEG化的IL-12药剂、PEG化的IL-7药剂、PEG化的IL-15药剂(特别是2017年6月29日公开的McCauley等人, PCT申请号PCT/US2016/067042、国际公开WO 2017/112528中公开的那些)、PEG化的IL-2药剂(包括但不限于NKTR-214，Nektar Therapeutics，Inc.)、PEG化的IL-18药剂、IL-7变体、IL-10变体、IL-12变体、IL-7变体、IL-15变体、IL-2变体、IL-18变体、IL-7类似物、IL-10类似物、IL-12类似物、IL-7类似物、IL-15类似物、IL-2类似物和IL-18类似物。

在一些实施方案中，PEG化的IL-15分子具有以下结构：

其中w、x和z是PEG分子，且x、w和z各自的MW是相同的，x、w和z中的至少一个的MW是不同的，x和z各自的MW是相同的，且其中x和z各自的MW是不同的。本公开考虑这样的实施方案，其中PEG的MW是7.5 kDa至80 kDa，15 kDa至45 kDa，15 kDa至60 kDa，15 kDa至80 kDa，20 kDa至30 kDa，20 kDa至40 kDa，20 kDa至60 kDa，20 kDa至80 kDa，30 kDa至40 kDa，30kDa至50 kDa，30 kDa至60 kDa，30 kDa至80 kDa，40 kDa至60 kDa，或40 kDa至80 kDa。在具体实施方案中，x和z各自的MW是20 kDa，且w的MW是10kDa。

其中x和z是PEG分子，其中x和z代表PEG的组分，且IL-15经由接头w共价附接至PEG，所述接头w也可以是PEG分子。在某些实施方案中，PEG x或z PEG的MW是约20 kDa、约30kDa、约40 kDa、约50 kDa、约60 kDa、约70 kDa或约80 kDa或更大。考虑具体实施方案，其中x和z各自的MW是10 kDa、20 kDa、30 kDa或40 kDa。

针对特定靶标抗原的基因修饰的T细胞(诸如car T细胞)的输注具有几种潜在益处，包括长期疾病控制、与细胞毒性化学疗法或靶向疗法的作用类似的作用的快速起效，以及规避T细胞库的免疫耐受和MHC限制两者。然而，用CAR-T细胞疗法治疗某些癌症(例如，非B细胞恶性肿瘤)已经部分受到靶向表达靶标抗原的正常组织的抗原特异性毒性的诱导和CAR-T细胞治疗的极端功效(有时导致威胁生命的细胞因子释放综合征)的限制(Magee(Nov. 2014) Discov Med 18(100):265-71)。具体而言，已经观察到高亲和力T细胞受体与显著抗原负荷的相互作用可以导致活化诱导的细胞死亡(Song等人 (2012) Blood 119(3):696-706; Hombach等人 (2013) Mol Ther 21(12):2268-77)。

活化诱导的细胞死亡(AICD)，由Fas受体(例如，Fas、CD95)与Fas配体(例如，FasL、CD95配体)的相互作用导致的程序性细胞死亡，有助于维持外周免疫耐受性。AICD效应细胞表达FasL，并且在表达Fas受体的细胞中诱导凋亡。活化诱导的细胞死亡是活化的T淋巴细胞的负调节剂，其由重复刺激其T细胞受体导致。该过程的改变可以导致自身免疫性疾病(Zhang J, 等人 (2004) Cell Mol Immunol. 1(3):186-92)。

在机制上，Fas配体与Fas受体的结合触发Fas受体的三聚化，所述Fas受体的细胞质结构域然后能够结合衔接蛋白FADD(具有死亡结构域的Fas相关蛋白)的死亡结构域。胱天蛋白酶原8结合FADD的死亡效应结构域，并且蛋白水解地自活化胱天蛋白酶8。Fas、FADD和胱天蛋白酶原8一起形成诱导死亡的信号传导复合物。活化的胱天蛋白酶8被释放至胞质溶胶中，在此处其活化起始凋亡的胱天蛋白酶级联(Nagata S. (1997) Cell. 88(3):355-65s。

基本上，活化诱导的car T细胞的细胞死亡是一个防止长期维持CAR T细胞疗法的效果的问题。

活化诱导的效应细胞的增殖和死亡之间的平衡是T细胞的体内稳态扩增中的关键点。尽管静息的T细胞易受凋亡的影响，但在细胞因子(例如，IL-2、IL-4、IL-7和IL-12)存在的情况下通过TCR/CD3刺激T细胞导致克隆扩增。有趣的是，这些分子在T细胞的体内稳态中的作用有时是矛盾的。通过实例的方式，IL-2对于CD4+ T细胞的增殖和存活是必需的，但它也是活化诱导的细胞死亡的前提条件。此外，已显示IL-18促进活化的CD8+ T细胞的扩增和存活。在暴露于刺激后，IL-18可能通过调节具有特定功能的CD8+ T细胞群体的大小来影响免疫/炎性应答。活化的T细胞的增殖和活化诱导的细胞死亡的调节与免疫/炎性应答密切相关(Li, W., 等人 (July 2007) J Leukocyte Bio 82(1):142-51)。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供了通过如下来抑制CAR-T细胞凋亡的方法和组合物：使CAR-T细胞与IL-10药剂接触，在施用CAR-T细胞疗法之前、期间或之后向经历CAR-T细胞疗法的受试者施用IL-10药剂(包括PEG化的IL-10药剂)，其中所述施用与CAR-T细胞药剂的施用是同时的或在与CAR-T细胞疗法相关的治疗窗内。另外，在本发明的一个实施方案中，本发明提供了通过修饰CAR-T细胞以表达多肽IL-10药剂来抑制CAR-T细胞凋亡的方法和组合物，所述修饰通过引入包含能够指导IL-10多肽在CAR-T细胞中的表达的核酸序列的载体来实现。在一个实施方案中，本发明提供了通过使CAR-T细胞与IL-10药剂接触而离体抑制CAR-T细胞中的凋亡的方法。在一个实施方案中，本发明提供了通过将CAR-T细胞悬浮于含有IL-10药剂的溶液中来离体延长CAR-T细胞的寿命的组合物和方法。

IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)的特征在本文其他地方描述。作为抗炎和免疫抑制分子，IL-10抑制抗原呈递、CD4+ T细胞功能、CD8+ T细胞病原体特异性功能(Biswas 等人(2007) J Immunol 179(7):4520-28)、病毒表位-特异性CD8+ T细胞IFNγ应答(Liu 等人(2003) J Immunol 171(9):4765-72)和抗LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)CD8+ T细胞应答(Brooks 等人 (2008) PNAS USA 105(51):20428-433)。

尽管已经在增强活化诱导的细胞死亡的背景下讨论了IL-10 (Georgescu 等人(1997) J Clin Invest 100(10):2622-33)，但本文呈现的体外和体内数据表明IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)可以与CAR-T细胞疗法组合，以预防或限制活化诱导的细胞死亡，同时增强CD8+ T细胞功能和存活。

通过实例的方式，实验部分的实施例1中呈现的发现表明，PEG-IL-10施用介导CD8+ T细胞免疫活化。如实施例1中所述，比较在肿瘤患者中用PEG-rHuIL-10治疗之前和之后表达PD-1和LAG3的CD8+ T细胞的数目(参见实施例1)。PD-1和LAG3两者均为CD8+ T细胞活化和细胞毒性功能的标志物。表达PD-1的外周CD8+ T细胞的数目增加~2倍，并且表达LAG3的外周CD8+ T细胞的数目增加~4倍。总的来说，这些数据表明PEG-IL-10施用介导CD8+ T细胞免疫活化。

还观察到PEG-IL-10的施用增强活化的记忆CD8+ T细胞的功能(参见实施例2)。记忆T细胞(也称为经历抗原的T细胞)是已经先前遇到并且在先前的感染、暴露于癌症或先前的接种疫苗期间对其同源抗原应答的T淋巴细胞的子集(例如，辅助T细胞(CD4+)和细胞毒性T细胞(CD8+))。相反，幼稚的T细胞在外周内没有遇到其同源抗原；它们通常特征在于不存在活化标志物CD25、CD44或CD69，以及不存在记忆CD45RO同种型。与幼稚的T细胞相比，通常为CD45RO+的记忆T细胞能够重现并产生更快且更强的免疫应答。

如所讨论，CAR-T细胞频繁地衍生自记忆CD8+ T细胞，在体外评价PEG-IL-10对记忆CD8+ T细胞的作用。实施例2中呈现的数据与PEG-IL-10增强活化的记忆CD8+ T细胞的功能的作用一致。

为了评估施用IL-10药剂与CAR-T细胞的组合的作用，进行了一项体外研究，以评价IL-10药剂对暴露于靶标肿瘤细胞的CAR-T细胞中的细胞毒性、IFNγ释放和颗粒酶B诱导的影响，如下文实施例中更充分描述。如所示，在这些实验中采用的IL-10药剂是AM0010，单PEG化和二PEG化的重组人IL-10的近似50/50混合物。这些实验中使用的CAR-T细胞是用编码抗CD-19 CD28-CD3z嵌合抗原受体(CAR)的重组慢病毒载体转导的CD8+ T细胞。靶标细胞是CD19+ HeLa人宫颈癌细胞。将近似10,000个CD19/HeLa靶标细胞添加至E-板微量滴定板(从ACEA Biosciences商业可得)的每个孔中。允许细胞并使其扩增近似24小时的时段以达到汇合。使用从血库获得的人PBMC制备抗CD-19 CD28-CD3z CAR-T细胞，然后将其用表达编码抗CD-19 CD28-CD3z嵌合抗原受体的核酸构建体的重组慢病毒载体转染。将抗CD-19CD28-CD3z CAR-T细胞以以下量以各种抗CD19 CAR-T效应子细胞与CD19/HeLa靶标细胞的效应子:靶标(E:T)比率添加至每个孔(以一式三份)：(a) 100,000个CAR-T细胞(10:1 E:T比率)；(b) 50,000个CAR-T细胞(5:1 E:T比率)；(c) 20,000个CAR-T细胞(2:1 E:T比率)；和(e) 10,000个CAR-T细胞(1:1 E:T比率)。在HeLa细胞暴露于抗CD19 CAR-T细胞的过程期间，就每种E:T比率而言，将IL-10药剂AM0010以四种浓度(1000 ng/ml、100 ng/ml、10 ng/ml、1 ng/ml)添加至每个孔中，对照孔没有AM-0010。还评估在IL-10药剂AM0010不存在的情况下，CAR-T细胞对细胞毒性、IFNγ诱导和颗粒酶B释放的影响。作为对照，还以两种E:T比率(2:1和10:1)，在IL-10药剂AM0010存在和不存在的情况下，评估对未转导的T细胞的细胞毒性、IFNγ诱导和颗粒酶B释放的影响。

当观察在没有用IL-10预处理的情况下在各种浓度的AM-0010存在的情况下靶标CD19-HeLa细胞响应于各种E:T比率的抗CD19 CD28-CD3z CAR-T细胞的颗粒酶B诱导应答时，在IL-10存在的情况下的靶标CD19-HeLa细胞的暴露导致颗粒酶B的分泌以IL-10剂量依赖性的方式增加。在添加CAR-T细胞后8和24小时，使用商业可得的夹心ELISA测定试剂盒目录号DY2906-05(从R&D Systems, 614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413商业得到)，基本上根据由制造商提供的说明，测量颗粒酶B。

在添加CAR-T细胞后8和24小时，使用常规的夹心ELISA测定试剂盒目录#KHC4012(从ThermoFisher Scientific 168 Third Avenue Waltham, MA USA 02451商业得到)，基本上根据由制造商提供的说明，测量IFNγ，免疫活化和抗肿瘤免疫应答的相关物的标志。由如实施例中更充分描述的没有用IL-10预处理的情况下在各种浓度的AM-0010存在的情况下靶标CD19-HeLa细胞响应于各种E:T比率的抗CD19 CD28-CD3z CAR-T细胞的干扰素-γ诱导应答的体外分析导致的数据举例说明在IL-10存在的情况下靶标CD19-HeLa细胞的暴露导致IFNγ(T细胞活化的标志)表达分泌以IL-10剂量依赖性方式增加。

使用ACEA xCelligence®实时细胞分析(RTCA)系统(ACEA Biosciences, Inc.,San Diego CA)，在施用CAR-T细胞后近似25小时的时段内，近似每五分钟评估细胞毒性。在该系统中，将粘附的靶标细胞接种至提供金微电极的阵列的多孔电子微量滴定板(“E-板”)的孔中。随着细胞跨表面增殖，跨电极阵列的电阻抗增加。当细胞死亡并从板升高时，引起电阻抗的降低。因此，通过测量跨阵列的电子流的阻抗，能够实时地测量细胞的活力。由粘附细胞引起的电子流的阻抗被报告为细胞指数(CI)，无单位参数，其计算为：细胞指数(CI)=(在时间点n的阻抗 – 在细胞不存在的情况下的阻抗)/标称阻抗值。随着粘附细胞跨板的表面增殖，CI上升，反映电阻抗的增加。当CI平稳时，推测细胞在板上汇合。当粘附的靶标细胞死亡时，它们从电子微量滴定孔表面升高，导致电阻抗的降低(电导率增加)，其可以针对每块板进行测量，使得能够随时间连续评估细胞毒性。在实验过程期间每5分钟收集电阻抗数据，并使用与xCELLigence®系统一起提供的软件分析数据。使用相同的软件将来自每个一式三份孔的数据合并并取平均值。

从该研究获得的结果表明，向CAR-T细胞添加IL-10药剂以IL-10药剂剂量依赖性方式介导CAR-T细胞毒性的特异性增强。具体而言，数据的比较表明在IL-10药剂存在的情况下靶标细胞的细胞毒性显著增强。具体而言，甚至在非常低的IL-10浓度(0.1ng/ml)下也观察到CAR-T细胞针对靶标肿瘤细胞的增强的细胞毒性作用。因此，施用IL-10药剂以达到小于约0.1 ng/ml、或者小于约0.08 ng/ml、或者小于约0.06 ng/ml、或者小于约0.05 ng/ml、或者小于约0.03 ng/ml、或者小于约0.01 ng/ml的血清谷浓度可用于增强CAR-T细胞疗法的治疗效果(或降低其毒性)。如前所讨论，一些CAR-T细胞疗法已经与人受试者的治疗中的重大不良事件相关。该数据还表明，CAR-T细胞疗法(特别是具有严重副作用(包括“黑匣子”警告)的CAR-T细胞疗法)与IL-10药剂的组合促进施用较低剂量(施用较低数目的细胞，以较低的E:T比率施用)的CAR-T细胞，由此实现与CAR-T细胞疗法相关的不良事件、尤其是严重的不良事件的减少，同时为受试者提供与在较高CAR-T细胞剂量下观察到的治疗益处相当的治疗益处。具体而言，甚至在非常低的IL-10浓度(0.1ng/ml)下也观察到CAR-T细胞针对靶标肿瘤细胞的增强的细胞毒性作用。因此，施用IL-10药剂以达到小于约0.1 ng/ml、或者小于约0.08 ng/ml、或者小于约0.06 ng/ml、或者小于约0.05 ng/ml、或者小于约0.03ng/ml、或者小于约0.01 ng/ml的IL-10药剂的血清谷浓度可用于增强CAR-T细胞疗法的治疗效果(和/或降低其毒性)。

将从前述实验获得的细胞毒性数据重新绘制为柱状图，表明通过添加所示的各种浓度(0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml和1000 ng/ml)的IL-10药剂(AM0010)以及各种量的抗CD-19 CAR-T细胞，对10,000个CD19/HeLa细胞的培养物的增强的细胞毒性作用。在所有测试浓度的AM-0010下，在所有抗CD-19 CAR-T对CD19/HeLa细胞的比率下，AM0010的添加增强抗CD-19 CAR-T细胞对CD19/HeLa细胞的细胞毒性作用。

进行了进一步的研究，以评估在植入受试者中之前用IL-10药剂离体预处理CAR T细胞的效果。如上所述，在施用CAR-T细胞后8和24小时在各种浓度的AM-0010存在的情况下，响应于各种E:T比率的抗CD19 CD28-CD3z CAR-T细胞，评估CAR-T细胞对CD19-HeLa靶标肿瘤细胞的细胞毒性，其中在暴露于靶标细胞之前将CAR-T细胞与IL-10预孵育，如实施例中更充分描述。在IL-10存在的情况下靶标CD19-HeLa细胞的暴露导致在8小时时间点CAR-T细胞的细胞毒性以IL-10剂量依赖性方式增加。此外，在IL-10存在的情况下靶标CD19-HeLa细胞的暴露导致CAR-T细胞的细胞毒性以IL-10剂量依赖性方式增加。在IL-10存在的情况下靶标CD19-HeLa细胞的暴露导致IFNγ(T细胞活化和抗肿瘤作用的标志)表达以IL-10剂量依赖性方式增加。

除了前述体外研究以外，进行一项额外的体内研究，以评估IL-10药剂(AM-0010)与抗肿瘤CAR-T细胞疗法的组合在小鼠中的肿瘤性疾病的体内肿瘤模型中的作用。简而言之，向5只雌性NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NOD/scid IL2RGnull)小鼠的群组腹膜内接种0.5 × 10

从如实施例、特别是实施例17中更充分描述的小鼠癌症模型中的CAR-T细胞活性的体内分析的结果来看，对照(无疗法)导致快速死亡，所有小鼠到研究的第21天死亡，表明该疾病在动物中的迅速发展。单独的AM-0010、没有AM-0010或有AM-0010的未转导(即非CAR) T细胞的作用提供了一些抗肿瘤作用，但仍具有显著的死亡率，其中到研究的第35天发生多例动物死亡。全身生物发光成像数据表明，肿瘤(暗区)在整个动物中迅速扩散，导致群组中所有动物的发病和死亡，导致死亡，其中到研究的第35天发生多例动物死亡。

500万个CAR-T细胞的施用表明一定的治疗益处，其中所有5只动物都存活至研究的第35天。然而，将小鼠暴露于0.5 mg/kg AM-0010以及500万个CAR-T细胞的施用的结果表明，与单独的CAR-T细胞疗法相比，在IL-10药剂存在的情况下施用时CAR-T细胞疗法的显著改善，该组合表明在大多数动物中的显著肿瘤减少。在向小鼠施用或不施用0.5 mg/kg AM-0010的情况下，用较少量(250万) CAR-T细胞进行类似实验。小鼠暴露于250万个CAR-T细胞表现出一定的治疗益处，其中所有5只动物都存活至研究的第35天。然而，将这些数据与结合施用IL-10药剂的治疗效果进行对比表明，与单独的CAR-T细胞疗法相比，当在IL-10药剂存在的情况下施用时，CAR-T细胞疗法的显著改善，该组合表明在大多数动物中的显著肿瘤减少。

这些结果由全身生物发光数据证实。与500万个CAR-T细胞的施用相关生成的生物发光数据表明一定的治疗益处，其中所有5只动物都存活至研究的第35天。由用0.5 mg/kgAM-0010与500万个CAR-T细胞治疗导致生成的全身生物发光数据提供了，与单独的CAR-T细胞疗法相比，当在IL-10药剂存在的情况下施用时，对CAR-T细胞疗法的显著的治疗改善，该组合表明在第35天显著的肿瘤减少，且在5只动物中的3只中明显没有肿瘤。

由用250万个CAR-T细胞治疗导致的全身生物发光数据表现出一定的治疗益处，其中所有5只动物都存活至研究的第35天。与0.5 mg/kg AM-0010和250万个CAR-T细胞的组合治疗方案相关的全身生物发光数据表明组合治疗相比于单独的CAR-T细胞疗法的显著益处。

前述体内数据表明，在本领域公认的肿瘤模型中，通过将CAR-T细胞疗法与IL-10药剂的施用组合提供的增强的抗肿瘤作用。

当将CAR-T细胞和/或IL-10药剂施用于受试者时，本公开考虑使用适合于将此类药剂施用于受试者的任何形式的组合物。通常，此类组合物是包含CAR-T细胞和/或IL-10药剂和一种或多种药学上可接受的或生理上可接受的稀释剂、载体或赋形剂以及任选地补充治疗剂的“药物组合物”。所述药物组合物可以用于本公开的方法中；因此，例如，所述药物组合物可以向受试者离体或体内施用以便实施本文描述的治疗性和预防性方法以及用途。

可以将本公开的药物组合物配制为与预期的施用方法或途径相容；本文阐述了示例性的施用途径。此外，所述药物组合物可以与如本文所述的其他治疗活性剂或化合物组合使用，以治疗或预防本公开考虑的疾病、病症和病况。

所述药物组合物通常包含治疗有效量的本公开考虑的IL-10多肽和一种或多种药学上和生理上可接受的制剂药剂。合适的药学上可接受的或生理上可接受的稀释剂、载体或赋形剂包括但不限于抗氧化剂(例如，抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如，苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯)、乳化剂、助悬剂、分散剂、溶剂、填料、膨化剂、去垢剂、缓冲剂、媒介物、稀释剂和/或佐剂。例如，合适的媒介物可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水，其可能补充有在用于肠胃外施用的药物组合物中常用的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。

本领域技术人员将容易识别可以用于本文考虑的药物组合物和剂型中的各种缓冲剂。典型的缓冲剂包括但不限于药学上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。作为一个实例，缓冲剂组分可以是水溶性材料，诸如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、醋酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸以及其盐。可接受的缓冲剂包括例如Tris缓冲剂、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸) (HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)以及N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)。

在已配制药物组合物之后，其可以作为溶液、混悬液、凝胶、乳液、固体或者脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。此类制剂可以以即用形式、在使用前要求重构的冻干形式、在使用前要求稀释的液体形式或其他可接受的形式来储存。在一些实施方案中，药物组合物提供在一次性容器(例如，一次性小瓶、安瓿、注射器或自动注射器 (类似于例如EpiPen®))中，而在其他实施方案中提供多次使用性容器(例如，多次使用性小瓶)。任何药物递送设备可以用于递送IL-10，包括植入物(例如，可植入泵)和导管系统、缓慢注射泵以及装置，其全部对于技术人员而言都是众所周知的。通常皮下或肌肉内施用的积存注射剂也可以用于在限定时间段内释放本文公开的多肽。积存注射剂通常是基于固体的或基于油的，并且通常包含本文阐述的制剂组分中的至少一种。本领域普通技术人员熟悉积存注射剂的可能的制剂和用途。

药物组合物可以呈无菌可注射水性或油性混悬液的形式。可以根据已知的技术使用本文提及的那些合适的分散剂或湿润剂以及助悬剂来配制这种混悬液。无菌可注射制剂也可能是无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如，作为1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的稀释剂、溶剂和分散介质包括水，林格氏溶液，等渗氯化钠溶液、Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，乙醇，多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)以及其合适的混合物。此外，无菌、不挥发性油通常用作为溶剂或混悬介质。出于这个目的，可以采用任何温和不挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。另外，脂肪酸诸如油酸发现可用于可注射制剂中。特定可注射制剂的延长吸收可以通过包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝或明胶)来实现。

含有活性成分的药物组合物可以呈适合于口服使用的形式，例如作为片剂、胶囊、糖锭、锭剂、水性或油性混悬液、可分散粉剂或颗粒剂、乳剂、硬质或软质胶囊或糖浆、溶液、微珠粒或酏剂。在具体实施方案中，与本文描述的IL-10药剂共同施用的药剂的活性成分呈适合于口服施用的形式。意图用于口服使用的药物组合物可以根据本领域中已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且此类组合物可以含有一种或多种试剂，诸如例如增甜剂、调味剂、着色剂以及防腐剂，以便提供药学上优良且适口的制剂。片剂、胶囊等含有与无毒、药学上可接受的赋形剂混合的活性成分，所述赋形剂适于片剂的制造。这些赋形剂可以是例如稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

水性混悬液含有与适于制造水性混悬液的赋形剂混合的活性材料。此类赋形剂可以是助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶以及阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七元环氧乙基十六醇)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚乙烯山梨聚糖单油酸酯)。水性混悬液还可以含有一种或多种防腐剂。

油性混悬液可以通过使活性成分混悬于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(诸如液体石蜡)中来配制。油性混悬液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六醇。可以添加增甜剂(诸如以上列出的那些)和调味剂以提供适口的口服制剂。

适合于通过添加水来制备水性混悬液的可分散粉剂和颗粒剂提供了与分散剂或润湿剂、混悬剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。本文中例举了合适的分散剂或润湿剂和助悬剂。

本公开的药物组合物也可以呈水包油乳剂的形式。油相可以是植物油(例如，橄榄油或花生油)或矿物油(例如，液体石蜡)或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂以及衍生自脂肪酸的酯或偏酯；己糖醇酐(例如，脱水山梨糖醇单油酸酯)；以及偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。

制剂还可以包括用于保护组合物免于从身体快速降解或消除的载体，诸如控释制剂，包括植入物、脂质体、水凝胶、前药以及微囊化的递送系统。例如，可以单独或与蜡组合采用延时材料诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

本公开考虑施用呈用于直肠施用的栓剂的形式的IL-10多肽。栓剂可以通过将药物与合适的无刺激赋形剂混合来制备，所述无刺激赋形剂在常温下为固体但是在直肠温度下为液体，并且因此将在直肠中熔融以释放药物。此类材料包括但不限于可可脂和聚乙二醇。

本公开考虑的CAR-T细胞和IL-19药剂(例如，PEG-IL-10)和其他药剂可以呈目前已知的或将来开发的任何其他合适的药物组合物(例如，鼻用或吸入使用的喷雾)的形式。

制剂中的多肽(例如，IL-10)或其片段的浓度可以广泛变化(例如，按重量计，从小于约0.1%，通常为或至少约2%至多达20%至50%或更高)，并且将通常主要根据例如所选的特定施用模式，基于体液体积、粘度和基于受试者的因素进行选择。

本公开的IL-10药剂和CAR-T细胞(以及与IL-10/CAR-T细胞疗法组合施用的补充剂)可以呈适合于施用于受试者的组合物的形式。通常，此类组合物是包含IL-10和/或CAR-T细胞和一种或多种药学上可接受的或生理上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的“药物组合物”。在某些实施方案中，所述IL-10药剂和CAR-T细胞各自以治疗上可接受的量存在。在本发明的那些实施方案中，在将CAR-T细胞与IL-10药剂离体预孵育的情况下，可以将CAR-T细胞与预孵育IL-10药剂组合施用而无需在施用前从CAR-T细胞除去IL-10药剂。药物组合物可以用于本公开的方法中；因此，例如，药物组合物可以向受试者离体或体内施用以便实施本文描述的治疗性和预防性方法以及用途。

在一个实施方案中，本发明提供了包含IL-10药剂和CAR-T细胞的药学上可接受的制剂。在一个实施方案中，含有包含IL-10药剂和CAR-T细胞的药学上可接受的制剂的药学上可接受的制剂是冷冻的。在一个实施方案中，通过解冻一定量的CAR-T细胞并使解冻的CAR-T细胞与包含IL-10药剂的药学上可接受的制剂接触来制备药学上可接受的制剂。在一个实施方案中，在施用于受试者之前24小时内，任选地在施用于受试者之前12小时内，任选地在施用于受试者之前8小时内，任选地在施用于受试者之前6小时内，任选地在施用于受试者之前4小时内，任选地在施用于受试者之前2小时内，任选地在施用于受试者之前1小时内，或任选地在施用于受试者之前30分钟内，制备含有包含IL-10药剂和CAR-T细胞的药学上可接受的制剂的可接受的制剂。在本发明的一个实施方案中，本发明提供了通过施用包含CAR-T细胞和IL-10药剂的药物制剂来治疗疾病、病症或病况的方法。在本发明的一个实施方案中，本发明提供了通过施用包含CAR-T细胞和IL-10药剂的药物制剂来治疗疾病、病症或病况的方法，其中在施用于受试者之前24小时内，任选地在施用于受试者之前12小时内，任选地在施用于受试者之前8小时内，任选地在施用于受试者之前6小时内，任选地在施用于受试者之前4小时内，任选地在施用于受试者之前2小时内，任选地在施用于受试者之前1小时内，或任选地在施用于受试者之前30分钟内，制备包含IL-10药剂和CAR-T细胞的药学上可接受的制剂。在一个实施方案中，待治疗的疾病、病症或病况选自肿瘤性、炎性或过度增殖性疾病、病症或病况。

本公开考虑以任何适当的方式施用CAR-T细胞和IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)及其组合物。合适的施用途径包括肠胃外(例如，肌肉内、静脉内、皮下(例如，注射或植入)、腹膜内、脑池内、关节内、腹膜内、脑内(实质内)和脑室内)、经口、经鼻、阴道、舌下、眼内、直肠、局部(例如，经皮)、舌下和吸入。通常皮下或肌肉内施用的积存注射剂也可以用于在限定时间段内释放本文公开的IL-10药剂。

在本公开的一些具体实施方案中，肠胃外施用所述CAR-T细胞和IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)，并且在进一步具体实施方案中，所述肠胃外施用是皮下的。在一些实施方案中，静脉内提供所述CAR-T细胞，并且皮下施用所述IL-10药剂。

关于CAR-T细胞疗法，本文描述了用于向受试者引入治疗有效的经基因修饰以表达嵌合抗原受体的多种细胞的替代方式，其中所述嵌合抗原受体包含至少一个能够结合靶标细胞群体的抗原特异性靶向区域，并且其中嵌合抗原受体靶向区域与靶标细胞群体的结合能够引发活化诱导的细胞死亡。

本公开还考虑包含CAR-T细胞和IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)及其药物组合物的试剂盒。试剂盒通常呈如下所述容纳各种组分的物理结构的形式，并且可以例如用于实施上文描述的方法。试剂盒可以包括本文公开的CAR-T细胞和IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)(例如在无菌容器中提供)，其可以呈适合于施用于受试者的药物组合物的形式。所述CAR-T细胞和IL-10药剂(例如，PEG-IL-10) IL-10药剂可以可立即使用的形式或在施用前要求例如解冻、重构或稀释的形式提供。在所述CAR-T细胞和/或IL-10药剂呈需要由使用者重构的形式时，试剂盒还可以包括与IL-10药剂一起或分开包装的缓冲液、药学上可接受的赋形剂等。试剂盒还可以含有IL-10药剂和/或待使用的特定CAR-T细胞疗法的组合两者；试剂盒可以单独地含有几种试剂或者它们可以已经组合在试剂盒中。本公开的试剂盒可以针对适当地维持其中容纳的组分所必需的条件(例如，冷藏或冷冻)而进行设计。

试剂盒可以含有标签或包装插页，包括其中的组分的鉴定信息及其使用说明书(例如，给药参数；活性成分的临床药理学，包括作用机制、药代动力学和药效学；副作用；禁忌症等)。试剂盒的每种组分可以包封在单个容器中，并且所有各种容器可以在单一包装内。标签或插页可以包括制造商信息，诸如批号和失效日期。标签或包装插页可以例如整合至容纳组分的物理结构中，分开包含在物理结构内或附于试剂盒的部件(例如，安瓿瓶、注射器或小瓶)。

标签或插页可以另外包括或并入计算机可读介质，诸如盘(例如，硬盘、卡、存储盘)，光盘诸如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁带或电存储介质诸如RAM和ROM或者这些的杂合物，诸如磁/光存储介质、FLASH介质或存储器型卡。在一些实施方案中，试剂盒中不存在实际的说明书，但提供了例如经由互联网站点(包括通过经由提供密码(或IL-10或CAR-T细胞的容器上的可扫描的代码，诸如条形码或QR代码)以符合政府法规(例如HIPAA)来进行安全访问)从远程来源获得说明书的方式。

实施例

提出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供关于如何制作和使用本发明的完整公开和描述，并且不意欲限制发明人认为是其发明的范围，它们也不意欲代表进行以下实验，并且是可以进行的所有实验。应当理解，不必进行以当前时态书写的示例性描述，而是可以进行描述以生成其中描述的数据等。已经尽力确保关于所使用的数字(例如，数量、温度等)的准确性，但应当考虑一些实验误差和偏差。

除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度以摄氏度(℃)计并且压力是大气压或接近大气压。使用标准缩写，包括以下：s或sec = 秒；min = 分钟；h或hr= 小时；aa = 氨基酸；bp = 碱基对；kb = 千碱基；nt = 核苷酸；ng = 纳克；μg = 微克；mg= 毫克；g = 克；kg = 千克；dl或dL = 分升；μl或μL = 微升；ml或mL = 毫升；l或L = 升；nM = 纳摩尔；μM = 微摩尔；mM = 毫摩尔；M = 摩尔；kDa = 千道尔顿；i.m. =肌肉内(地)；i.p. = 腹膜内(地)；SC或SQ = 皮下(地)；HPLC = 高效液相色谱法；BW = 体重；U = 单位；ns = 非统计学显著的；PMA = 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯；PBS = 磷酸盐缓冲盐水；DMEM = Eagle氏培养基的Dulbeco氏改良；PBMC = 原代外周血单核细胞；FBS = 胎牛血清；FCS = 胎小牛血清；HEPES = 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；LPS = 脂多糖；RPMI =罗斯威尔公园纪念学院培养基；APC = 抗原呈递细胞；FACS = 荧光活化细胞分选。

在指出的情况下使用以下通用材料和方法，或者可以在以下实施例中使用：

在含有10% FBS/FCS和抗生素的RMPI中培养U937细胞之后，将1 x 10

可以根据任何标准方案分离人PBMC(参见，例如，Fuss等人 (2009) CurrentProtocols in Immunology, Unit 7.1, John Wiley, Inc., NY)。可以使用MiltenyiBiotec的抗CD45RO MACS珠粒和MACS细胞分离技术根据制造商的方案(Miltenyi BiotecInc; Auburn, CA)分离CD8+T细胞(CD45RO+)。为了活化细胞，可以将1 mL分离的细胞(密度为3 x 10

在用PEG-rHuIL-10治疗29天之前和之后，在癌症患者中确定表达PD-1和LAG3的CD8+ T细胞的数量的变化。对疗法应答且具有持续部分应答的两个患者在血液中具有PD1+CD8 T细胞的增加。第一个患者(肾细胞癌)每天SC接受20 µg/kg PEG-rHuIL-10，并且在22周后经历总肿瘤负荷的71%降低。第二个患者(黑色素瘤)每天SC接受40 µg/kg PEG-rHuIL-10，并且22周后经历总肿瘤负荷的57%降低。

在治疗前和治疗时段期间从每个患者的外周分离外周血单核细胞(PBMC)，并进行FACS分析。表达PD-1的外周CD8+ T细胞的数目在29天内增加~2倍，并且在治疗时段期间继续增加，并且表达LAG3的外周CD8+ T细胞的数目在29天内增加~4倍。PD-1和LAG3两者均为CD8+ T细胞活化和细胞毒性功能的标志物。这些发现表明PEG-rHuIL-10施用介导CD8+ T细胞免疫活化。

记忆T细胞(也称为经历抗原的T细胞)是已经先前遇到并在先前的感染、暴露于癌症或先前接种疫苗期间对其同源抗原应答的T淋巴细胞的子集(例如，辅助T细胞(CD4+)和细胞毒性T细胞(CD8+))。相反，幼稚的T细胞在外周内没有遇到它们的同源抗原；它们的特征通常在于不存在活化标志物CD25、CD44或CD69，以及不存在记忆CD45RO同种型。与幼稚的T细胞相比，通常为CD45RO+的记忆T细胞能够重现并产生更快且更强的免疫应答。

鉴于CAR-T细胞衍生自记忆CD8+ T细胞，使用标准方法(其实例在本文描述)在体外评价PEG-IL-10对记忆CD8+ T细胞的作用。PEG-IL-10优先增强记忆CD8+T细胞(CD45RO+)、而不是幼稚CD8+T细胞中的IFNγ产生。这些数据与PEG-IL-10增强活化的记忆CD8+ T细胞的功能的作用一致。

如本文所述，CAR-T细胞疗法衍生自记忆CD8+ T细胞。为了有效，输注的记忆CD8+T细胞不仅必须表现出细胞毒性，而且还必须持续存在(Curran KJ, Brentjens RJ. (20Apr 2015) J Clin Oncol pii: JCO.2014.60.3449; Berger 等人, (Jan 2008) J ClinInvest 118(1):294-305)。然而，T细胞的重复活化导致活化诱导的细胞死亡，其减少细胞数量，且因此降低总体治疗效力。

使用本文所述的程序，确定在有和没有用PEG-IL-10处理的情况下来自两个供体的人CD45RO+记忆CD8+ T细胞的活化诱导的细胞死亡。在两轮TCR和共同刺激–诱导的活化后用PEG-IL-10处理人CD45RO+记忆CD8+ T细胞产生大量活细胞。这些数据表明PEG-IL-10能够限制活化诱导的细胞死亡，因此导致更大量的活化的记忆T细胞持续存在。这些观察表明，PEG-IL-10与CAR-T细胞疗法组合使用提供了额外的临床益处。

基本上根据制造商的说明，通过使用人IL-2 ELISA试剂盒(作为目录号EH2IL2商业可得, ThermoFisher Scientific 168 Third Avenue Waltham, MA USA 02451)测定分泌的IL-2的水平。

基本上根据制造商的说明，通过使用人IFN-g ELISA试剂盒(目录号KHC4012,ThermoFisher Scientific 168 Third Avenue Waltham, MA USA 02451)测定分泌的干扰素γ的水平。

基本上根据制造商的说明，通过使用DuoSet人颗粒酶B ELISA试剂盒(目录号DY2906-05, R&D Systems 614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA)测定颗粒酶B的水平。

将细胞洗涤并悬浮于FACS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)加0.1%叠氮化钠和0.4%BSA)中。将细胞分成1x10

将细胞在4℃下孵育25分钟，并用FACS缓冲液洗涤一次。将细胞重悬浮于FACS缓冲液中，并通过向每个管中添加100 µl 1:1000稀释的正常小鼠IgG来用正常小鼠IgG(Invitrogen)封闭，并在冰上孵育10 min。将细胞用FACS缓冲液洗涤，并重悬浮于100 µlFACs缓冲液中。然后将细胞用藻红蛋白(PE)-标记的链霉抗生物素蛋白(BD Pharmingen,San Diego, CA)和别藻蓝蛋白(APC)-标记的CD3 (eBi℃ience, San Diego, CA)染色。将1.0 µl PE和APC各自添加至管2和3。

用BD FacsCalibur (BD Biosciences)进行流式细胞术采集，并用FlowJo(Treestar, Inc. Ashland, OR)进行分析。

将全血从单独或混合供体(取决于所需的血液量)收集于10 mL肝素真空容器(Becton Dickinson)中。将近似10 ml的抗凝全血与无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS pH 7/4，不含Ca2+/Mg2+))缓冲液混合，以在50 ml锥形离心管中达到20 ml的最终体积。在无菌的50mL锥形离心管中提供15 mL Ficoll-Paque PLUS® (GE Healthcare, 目录号17-1440-03)，并将20 mL体积的血液/PBS铺层至Ficoll®的表面上，并且在室温下以400 xg离心30-40分钟。小心移取血浆/Ficoll界面处的含有外周血单核细胞(PBMC)的细胞层。将PBMC用总体积为40 ml的PBS洗涤两次，并在室温下以200 x g离心10分钟，并用血细胞计数器计数细胞。

如果立即使用洗涤的PBMC，则将细胞用CAR-T培养基洗涤一次。CAR-T培养基是AIMV-AlbuMAX®培养基(作为目录号31035025从ThermoFisher Scientific商业得到)，其补充有5% AB血清和1.25 ug/mL两性霉素B、100 U/mL青霉素和100 ug/mL链霉素。

如果不立即使用洗涤的PBMC，则将细胞重悬浮，洗涤并转移至隔离的小瓶中，并在-80℃下冷藏24小时，然后储存于液氮中。

基本上根据上述实施例__的教导制备PBMC。如果使用新鲜分离的PBMC，则将分离的细胞(用不含Ca

将抗人CD28和CD3抗体缀合的磁珠(Invitrogen)用1 mL无菌PBS (pH7.4)洗涤3次，使用磁架从溶液分离磁珠，并在补充有300 IU/mL huIL-2的CAR-T培养基中重悬浮至4x10

将PBMC细胞和CD28和CD3抗体缀合的磁珠以1:1的珠粒:细胞比率混合。

将等分试样转移至12孔低附着或未处理的细胞培养板的单孔中，并在病毒转导前在CO

制备包含编码与CD8铰链、4-1-BB共刺激结构域和CD3ζ活化结构域连接的抗CD19单链抗体(如Nicholson, 等人 (1997)

为了制备表达CAR和hIL-10两者的CAR-T细胞，基本上根据以上实施例10的教导制备嵌合抗原受体(CAR)慢病毒质粒PMC 303，其中在具有间插EF1a核心启动子序列的CAR编码序列的下游插入核酸序列，以促进IL-10编码序列的表达。

为了产生慢病毒颗粒，通常需要三种组分：1)慢病毒载体，2)含有所有必需的病毒结构蛋白的包装载体，3)表达水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白(G)的包膜载体。基本上根据制造商的说明，使用SuperLenti

根据本文实施例8和9制备的活化的PBMC在37℃、5% CO

在体外，通过使用xCELLigence®实时细胞分析(RTCA)程序，使用iCELLigence®系统和软件(从Acea Biosciences, Inc., 6779 Mesa Ridge Road, #100, San Diego CA92121商业得到)，基本上根据由制造商提供的说明，通过细胞阻抗测定评价汇合和细胞毒性。xCELLigence系统使用“E-板”，其为多孔板，每个孔的底部提供浸渍有电极阵列的表面。随着细胞跨表面增殖，跨电极阵列的电阻抗增加。当细胞死亡并从板升高时，引起电阻抗的降低。因此，通过测量跨阵列的电子流的阻抗，能够实时地频繁地测量细胞的活力。由粘附细胞引起的电子流的阻抗被报告为细胞指数(CI)，无单位参数，其计算为：

细胞指数(CI)=

标称阻抗值。

随着粘附细胞跨板的表面增殖，CI上升，反映电阻抗的增加。当CI平稳时，推测细胞在板上汇合。

数据表明，向CAR-T细胞添加IL-10药剂以IL-10药剂剂量依赖性方式介导CAR-T细胞毒性的特异性增强。具体而言，数据表明在IL-10药剂存在的情况下靶标细胞的细胞毒性的显著增强。具体而言，甚至在非常低浓度的IL-10 (0.1ng/ml)下，也观察到CAR-T细胞针对靶标肿瘤细胞的增强的细胞毒性作用。该数据举例说明施用IL-10药剂以达到小于约0.1ng/ml、或者小于约0.08 ng/ml、或者小于约0.06 ng/ml、或者小于约0.05 ng/ml、或者小于约0.03 ng/ml、或者小于约0.01 ng/ml的血清谷浓度可用于增强CAR-T细胞疗法在人受试者中的治疗效果(或降低其毒性)。

为了评估IL-10的预处理对CAR-T细胞的细胞毒性的影响，将抗CD19 CAR-T细胞洗涤，并在37℃、5% CO

与CAR-T细胞的孵育时段平行，使每孔一式三份用CD19稳定转染的HeLa细胞(ATCCCCL-2)(“CD19/HeLa细胞”)粘附至xCELLigence E-板(ACEA Bioscience, San Diego CA)，其中每孔具有近似10,000个细胞。使细胞粘附，直至CI值平稳，反映细胞已经达到汇合(近似18-20小时)。

然后将如上所述制备的抗CD19 CAR-T细胞以以下浓度的各种抗CD19 CAR-T细胞对CD19/HeLa细胞的效应子:靶标(E:T)比率(E:T比率)添加至CD19/HeLa细胞板(一式三份)：(a) 100,000个CAR-T细胞(10:1E:T比率)；(b) 50,000个CAR-T细胞(5:1 E:T比率)；(c) 20,000个CAR-T细胞(2:1 E:T比率)；(e) 10,000个CAR-T细胞(1:1 E:T比率)。

将IL-10药剂AM0010添加至每个孔中，以在将HeLa细胞暴露于抗CD19 CAR-T细胞的过程期间就每种E:T比率而言维持IL-10药剂的先前孵育水平(即，1000 ng/ml，100 ng/ml，10 ng/ml，1 ng/ml和0 ng/ml)。抗CD19 CAR-T细胞对Hela细胞的细胞毒性通过电阻抗的降低来评评价，因为CAR-T细胞杀死从板脱离的Hela细胞。在实验的过程期间，每2分钟收集电阻抗数据，并使用与iCELLigence®系统一起提供的软件分析数据。使用相同的软件将来自每个一式三份孔的数据组合并取平均值。

观察到的在添加抗CD19 CAR-T细胞的时间点后近似1小时的时段内的阻抗的增加归因于抗CD19 CAR-T细胞粘附至板和增加阻抗(如通过xCELLigence系统测量)的结果。然而，从添加抗CD19 CAR-T细胞后近似1小时的时间点起，观察到CI的稳定下降，表明抗CD19CAR-T细胞对CD19/HeLa细胞的有效杀死，并且在评估的所有IL-10药剂水平下，细胞毒性作用显著增强。该数据表明IL-10的添加增强CAR-T细胞针对肿瘤细胞的细胞毒性。

将从前述实验获得的数据重新绘制为柱状图，表明通过添加所示的各种浓度(0ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml和1000 ng/ml)的IL-10药剂(AM0010)以及各种量的抗CD-19 CAR-T细胞，对10,000个CD19/HeLa细胞的培养物的增强的细胞毒性作用。在所有测试浓度的AM-0010下，在所有抗CD-19 CAR-T对CD19/HeLa细胞的比率下，AM0010的添加增强抗CD-19 CAR-T细胞对CD19/HeLa细胞的细胞毒性作用。

另外，响应于对IL-10药剂的暴露的T细胞活化的标志是IFN-γ的表达增强。向处理中添加IL-10以IL-10剂量依赖性方式导致CAR-T细胞中的IFN-γ产生的显著上调。

进行了一项研究，以评估IL-10药剂(AM-0010)与抗肿瘤CAR-T细胞疗法的组合在小鼠中的肿瘤性疾病的体内肿瘤模型中的作用。

简而言之，向来自Jackson Lab的5只雌性NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ(NOD/scid IL2RGnull)小鼠的群组腹膜内接种0.5 × 10

基本上根据上文实施例XXX的教导制备CAR-T细胞。概述研究设计处理组和施用的测试剂提供于下表6中。

在研究第0天，通过静脉内注射以100微升的体积向每只小鼠施用50万个Raji-luc肿瘤细胞。在开始疗法前的同一天对小鼠成像。

在研究第0天，开始用AM-0010处理。在研究的第1-8天每天腹膜内施用AM0010，并在第9天及以后改为皮下施用。

在研究第2天和第9天，在接受CAR-T细胞或T细胞(模拟物)的那些动物中，根据表6以100微升的体积施用CAR-T或T细胞。

基本上根据制造商的说明，使用IVIS®® Spectrum体内成像系统(从PerkinElmer, 940 Winter St. Waltham MA 02451商业得到)在研究第0、7、14、21、28和35天对小鼠成像。

如所示，两组中的癌症均快速进展，使得每组中的所有动物到实验的第21天都死亡。

由于基本上停滞进一步的肿瘤生长，所以存在单独的T细胞和CAR-T细胞的作用。处理组2中的5只动物中的2只到第21天死亡，并且处理组3中的第三只动物到第35天死亡。

对于第4组和第5组，在用与CAR-T药剂组合的IL-10药剂治疗的组中，在IL-10药剂AM0010存在的情况下施用500万个CAR-T细胞的效果表明肿瘤减少的明显改善。在研究的第35天，每个治疗组中的所有动物都活着。

对于第6组和第7组，数据表明，与如上所讨论提供的数据相比，在CAR-T细胞的该较低剂量下，用与CAR-T药剂组合的IL-10药剂治疗的组中的肿瘤减少的明显改善。在研究的第35天，每个处理组中的所有动物都活着。

前述数据表明，在本领域公认的肿瘤模型中，通过将CAR-T细胞疗法与IL-10药剂的施用组合提供的增强的抗肿瘤作用。

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