一种脐带血间充质干细胞培养方法

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种脐带血间充质干细胞培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)可以从多种组织中获得，如骨髓、脐带等，它不仅具有多向分化潜能，还可以调节T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等的免疫学活性。近年来各项研究结果表明，脐带血中含有多向分化功能的间充质干细胞，其扩增能力是自体骨髓干细胞的几十倍，并将该细胞命名为脐带血间充质干细胞。人脐带血来源间充质干细胞比来源于骨髓、脐带或其它组织源的干细胞具有优势，其优势包括如下几点：(1)采集脐带血方便，对供者无任何痛苦，非损伤性采集。(2)脐带血中免疫系统处于原始阶段，移植后排斥反应发生率及严重程度较低。(3)脐带血中各种病毒感染机会相对较少。但脐带血中间充质干细胞含量极少，每份脐带血样本中MSCs的出现频率为0-2.3个细胞克隆/10

发明内容

为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种脐血间充质干细胞培养方法的解决方案，具体如下：

一种脐带血间充质干细胞培养方法，包括以下操作步骤：

(1)脐带血的采集：将采集后的脐带血在24小时内放入脐带血保存液中进行保存，保存温度为3-5℃；

(2)脐带血的洗涤：取保存有脐带血的保存液，混合搅拌均匀后离心处理，然后向离心沉淀中加入清洗液，混合搅拌均匀后再次离心处理，得到上清和沉淀；

(3)脐带血富血小板血浆的制备与活化：将步骤(2)得到的上清继续离心后，去掉上部分的血清，中间及底部的沉淀为富血小板血浆，向得到的富血小板血浆中继续加入氯化钙溶液，激活处理后，进行离心，得到活化的富血小板血浆，所述激活处理的操作为36.8-37.2℃孵育处理25-35min或者3-5℃的冰箱中冷冻处理15-17h；

(4)脐带血单个核细胞的分离：将步骤(2)中得到的沉淀中加入杜氏磷酸盐缓冲液，混合均匀后，加入到淋巴细胞分离液中，吸取白膜层细胞即单个核细胞，将单个核细胞吸至另一洁净离心管中，加入杜氏磷酸盐缓冲液重复离心洗涤2-3次，收集底部单个核细胞沉淀，得到脐带血单个核细胞；

(5)预处理后的Transwell小室培养脐带血间充质干细胞：将步骤(4)中得到的脐带血单个核细胞以1×10

(6)脐带血间充质干细胞的纯化及扩增：细胞培养5-7天后更换完全培养基以弃除未贴壁细胞，后每3-4天半量换液一次，8-12天会发现零星的细胞集落，使用完全培养基扩增细胞得到纯化的脐带血间充质干细胞。

具体地，上述步骤(1)中，每100mL的保存液中含有1.8-2.2g的枸橼酸三钠、0.6-1.0g的枸橼酸、2.1-2.6g的葡萄糖、0.2-0.5g的腺嘌呤、2.8-3.4g的磷酸二氢钠，所述保存液在使用前经过灭菌处理。

具体地，上述步骤(2)中，清洗液为含有质量分数为0.5％的人血清白蛋白的生理盐水或者含有质量分数为0.5％的人血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲液。

具体地，上述步骤(2)中，离心处理时，离心力大小为450-550g，离心时间为10min；上述步骤(3)中，第一次离心处理时，离心力大小为1100-1300g，离心时间为9-10min，第二次离心时，离心力大小为2500-3500g离心时间为15-25min。

具体地，上述步骤(3)中，氯化钙溶液中氯化钙的质量分数为3-5％。

具体地，上述步骤(3)中，预处理后的Transwell小室采用以下方法获得：提前24h按照1×10

具体地，所述完全培养基为基础培养基DMEM/F12，其中含有质量分数为4-6％的活化的富血小板血浆。

具体地，上述步骤(5)中，培养脐带血间充质干细胞的环境为37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO

由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：

本发明提供的一种脐带血间充质干细胞培养方法，通过脐带血的采集和验收、脐带血的洗涤、自体脐带血富血小板血浆的制备与活化、脐带血单个核细胞的分离、Transwell小室预处理后培养脐带血间充质干细胞、脐带血间充质干细胞的纯化及扩增步骤，解决了现有技术必须用一定浓度的胎牛血清培养带来的各种弊端，并且用自己储存的富血小板血浆经过活化后培养自己的细胞，效率高、更安全和容易接受，活化的富血小板血浆(activated platelet-rich plasma，aPRP)为自体脐带血提取物，经过梯度离心分离得到的血小板浓缩物，加入激活剂将血小板激活获得活化的aPRP，能够释放多种细胞培养因子，如PDGF、TGF-β、bFGF、EGF、VEGF等，同时利用Transwell小室上、下两室的特点，提前接种脐带间充质干细胞在小室的上层，培养过程中脐带间充质干细胞会不断释放细胞生长因子，便于脐带血间充质干细胞的贴壁生长，进而达到分离纯化的目的。整个过程免去添加各类因子等繁琐步骤，不仅操作简便，而且能够大大节省培养成本。

附图说明

图1为本发明实施例脐带血间充质干细胞培养后的形态图。

图2为本发明实施例培养的脐带血间充质干细胞表面标志。

图3为本发明实施例培养的脐带血间充质干细胞诱导分化的脂肪细胞。

图4为本发明实施例培养的脐带血间充质干细胞诱导分化的成骨细胞。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

实施例

一种脐带血间充质干细胞培养方法，包括以下操作步骤：

(1)脐带血的采集：将采集后的脐带血在24小时内放入脐带血保存液中进行保存，保存温度为3-5℃，其中每100mL的保存液中含有1.8-2.2g的枸橼酸三钠、0.6-1.0g的枸橼酸、2.1-2.6g的葡萄糖、0.2-0.5g的腺嘌呤、2.8-3.4g的磷酸二氢钠，所述保存液在使用前经过灭菌处理；

(2)脐带血的洗涤：取保存有脐带血的保存液，混合搅拌均匀后离心处理，离心力大小为450-550g，离心时间为10min，然后向离心沉淀中加入清洗液，混合搅拌均匀后再次离心处理，得到上清和沉淀，所述清洗液为含有质量分数为0.5％的人血清白蛋白的生理盐水或者含有质量分数为0.5％的人血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲液；

(3)脐带血富血小板血浆的制备与活化：将步骤(2)得到的上清继续离心后，去掉上部分的血清，中间及底部的沉淀为富血小板血浆，向得到的富血小板血浆中继续加入质量分数为3-5％的氯化钙溶液，激活处理后，进行离心，得到活化的富血小板血浆，所述激活处理的操作为36.8-37.2℃孵育处理25-35min或者3-5℃的冰箱中冷冻处理15-17h，本步骤中，第一次离心处理时，离心力大小为1100-1300g，离心时间为9-10min，第二次离心时，离心力大小为2500-3500g离心时间为15-25min；

(4)脐带血单个核细胞的分离：将步骤(2)中得到的沉淀中加入杜氏磷酸盐缓冲液，混合均匀后，加入到淋巴细胞分离液中，吸取白膜层细胞即单个核细胞，将单个核细胞吸至另一洁净离心管中，加入杜氏磷酸盐缓冲液重复离心洗涤2-3次，收集底部单个核细胞沉淀，得到脐带血单个核细胞；

(5)预处理后的Transwell小室培养脐带血间充质干细胞：将步骤(4)中得到的脐带血单个核细胞以1×10

(6)脐带血间充质干细胞的纯化及扩增：细胞培养5-7天后更换完全培养基以弃除未贴壁细胞，后每3-4天半量换液一次，8-12天会发现零星的细胞集落，使用完全培养基扩增细胞得到纯化的脐带血间充质干细胞。

将上述实施例培养的脐带血源间充质干细胞进行鉴定，鉴定结果如下：

一、形态特征

如图1所示，将培养的脐带血源间充质干细胞置于倒置显微镜下观察，细胞形态为短梭形，大小均一，细胞生长态势良好。

二、脐带血间充质干细胞表面标志

如图2所示，培养的第二代脐带血间充质干细胞(P2-MSCs)采用流式细胞法进行表型分析，FITC标记的anti-CD44、anti-CD45，PE标记的anti-CD34、anti-CD105和anti-HLA-DR与细胞表面标志性Marker结合，结果如图2所示，这种梭形细胞表达间充质干细胞的表面标志CD105、CD44，不表达CD34、CD45、HLA-DR，分离获得的细胞确定为脐带血间充质干细胞，具有干细胞特性。

三、脐带血间充质干细胞向脂肪细胞分化功能鉴定

如图3所示，培养的第二代脐带血间充质干细胞(P2-MSCs)用胰酶消化，以10

四、脐带血间充质干细胞成骨分化功能鉴定

如图4所示，培养的第二代脐带血间充质干细胞(P2-MSCs)用胰酶消化，以10

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改变、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。