用于早期诊断口腔肿瘤的体外筛查方法和试剂盒

发明领域

本发明属于口腔肿瘤的早期诊断领域。特别地，本发明涉及用于诊断和/或预测口腔肿瘤发展的风险的方法，该方法包括使用免疫学试验例如ELISA(酶联免疫吸附试验)在细胞提取物中检测口腔肿瘤的某些标志物。本发明还涉及用于诊断和/或预测口腔肿瘤发展的风险的相关试剂盒。

现有技术

口腔癌是世界上最常见的10种肿瘤之一，实际上，每年诊断出的新病例超过500000。在头颈区的肿瘤表现中，口腔的恶性肿瘤可能会影响各种组织：口腔，舌，咽，喉和腭粘膜以及腺上皮。80％的口腔癌是鳞状细胞癌(SSC)，因为目前尚无特异性标志物，由于诊断较晚，因此预后5年的死亡率很高。目前，尚不存在用于预防口腔肿瘤的科学可靠的非侵入性筛查方法。

因此，需要提供一种用于早期诊断口腔肿瘤的方法，该方法使得能够基于组织学采样和解剖病理学确认来识别处于发生病理学风险的对象并进行确定性诊断。

发明详述

本发明的目的是提供一种创新的，快速的，经济的，敏感的和非侵入性的试剂盒，可用于早期诊断筛选以鉴定在症状前阶段的赘生形式。具体地，作者着眼于口腔癌的特定标记物的表达，即上皮生长因子受体(EGFR)和类固醇受体，雄激素受体(AR)和雌激素受体(ER)，本发明的试剂盒能评估这些蛋白，特别是通过ELISA试验进行评估。

在本发明的上下文中，EGFR序列优选对应于NCBI数据库中可用的登录号为NM_005228.3的序列或编码的蛋白质序列。

在本发明的上下文中，AR序列优选对应于NCBI数据库中可用的登录号为NM_000044.4的序列或编码的蛋白质序列。

在本发明的上下文中，ER序列优选对应于NCBI数据库中可用的登录号为XP_495993或NP_001428.1的序列或编码核苷酸序列。

因此，本发明提供了一种非侵入性诊断辅助，用于筛查癌前病灶的可能存在，其有助于支持口腔肿瘤的早期诊断，以进行三级预防。实际上，本发明的方法和试剂盒尤其针对患有可能导致细胞转化的炎症的对象。

本发明属于基于免疫学试验的装置领域，优选地，本发明基于通过ELISA对细胞提取物进行的蛋白质分析。

本发明还涉及实现通过组装还可以从市场上购得的半成品来构建的创新产品。该产品包括可用于对潜在危险细胞进行采样的仪器，以及使专业人员(牙医)进行分析并验证生物标志物是否存在，解释测试结果本身所需的一切。该产品具有极其简单的使用方法。

因此，本发明的目的是一种用于预测对象的口腔肿瘤的发展风险和/或其诊断和/或预后和/或监测其进展和/或筛选其治疗的体外方法，包括以下步骤：

a)在从对象，优选从对象的口腔获得的生物样品中至少检测和/或定量雄激素受体(AR)和雌激素受体(ER)；和

b)与对照样品进行比较。

优选地，从对象获得的样品获自对象的口腔，更优选获自口腔，舌，咽，喉和腭粘膜以及腺上皮。优选地，从对象获得的样品是从舌获得的。

在一个优选的实施方式中，在步骤a)中，还检测和/或定量上皮生长因子受体(EGF-R)。

优选地，AR和/或ER和/或EGF-R的存在，和/或AR和/或ER和/或EGF-R相对于对照样品中的量更高的量指示对象处于发展口腔肿瘤的风险中或正患有口腔肿瘤。

优选地，步骤a)包括：

-使所述生物样品与至少抗AR抗体和/或抗ER抗体和/或抗EGF-R抗体在一定条件下接触和/或孵育，该条件使得如果存在AR和/或ER和/或EGF-R，则AR和/或ER和/或EGF-R与所述抗体结合并且形成抗体-抗原复合物；和

-检测和/或定量与抗体结合的AR和/或ER和/或EGF-R，优选使用所述抗体的检测和/或定量手段。

在另一个优选的实施方式中，对其中已经检测到和/或定量AR和/或ER和/或EGF-R和/或相对抗体的存在的对象进行进一步的口腔肿瘤诊断方法，例如，组织学采样和解剖病理学确认。当前使用的这种诊断方法是昂贵且侵入性的。因此，根据本发明的方法使得能够对可能处于风险中的对象进行有效，快速且非侵入性的第一次筛查。

优选地，所述生物样品来自口腔的发炎区域。同样优选地，所述生物样品是细胞，优选经历细胞裂解的细胞，或组织样品或流体，例如唾液，血液或血清。

优选地，所述口腔肿瘤选自：口腔粘膜肿瘤，舌肿瘤，咽肿瘤，喉肿瘤，腭肿瘤，腺上皮肿瘤，鳞状细胞癌(SSC)，口腔表皮癌，喉癌，舌癌和唇癌。

本发明的另一个目的是一种试剂盒，其包括：

-AR和ER以及任选的EGF-R的检测和/或定量手段；

-任选的对照手段。

在一个优选的实施方式中，试剂盒包括：

(a)至少抗AR抗体和抗ER抗体；

(b)至少AR-抗体复合物和ER-抗体复合物的检测和/或定量手段。

试剂盒优选地任选地包括对照手段。

优选地，试剂盒还包含抗EGF-R抗体和EGF-R-抗体复合物的检测和/或定量手段。

优选地，在根据本发明的试剂盒中，将抗AR抗体和/或抗ER抗体和/或抗EGF-R抗体固定在固体支持物上。

优选地，所述固体支持物是塑料条，优选PVDF(聚偏二氟乙烯)。

在特别优选的实施方式中，试剂盒包含具有两个末端的装置，其中第一末端包含抗AR抗体和/或抗ER抗体和/或抗EGF-R抗体，第二末端包含用于从对象中获取生物样品的刷。优选地，第一末端还包括阳性对照和/或阴性对照。

在另一个优选的实施方式中，试剂盒包括：至少缓冲溶液和/或裂解溶液和/或检测系统。优选地，所述检测系统包括二抗或由其组成，所述二抗设有酶检测物系统和/或用于例如通过比色反应检测所述二抗的底物。

优选地，所述缓冲溶液和/或裂解溶液和/或检测系统设置在不同的孔中，优选放置在单个盒子中。

本发明进一步提供了如上所述的试剂盒在进行如上所述的方法中的用途。

在一个优选的实施方式中，所述用途包括以下步骤：

-将所述生物样品浸入裂解溶液中以获得第一溶液，如果样品中存在AR和/或ER和/或EGF-R，则将其释放；

-将所述抗AR和/或抗ER抗体和任选的抗EGF-R浸入所述第一溶液中以获得第一抗体-抗原复合物；

-将所述第一抗体-抗原复合物浸入包含设有酶检测物系统的二抗的第二溶液中，以获得第二抗体-抗原复合物；

-将所述第二抗体-抗原复合物浸入第三溶液中，所述第三溶液包含用于检测二抗的底物；

-相对于对照样品检测和/或定量AR和/或ER和/或EGF-R。

本发明的另一个目的是用于上述方法的如上所述的试剂盒。

本发明的另一个目的是包括两个末端的装置，其中第一末端包含抗AR抗体和/或抗ER抗体和任选的抗EGF-R抗体，第二末端包含用于从对象中获取生物样品的刷。优选地，第一末端还包括阳性对照和/或阴性对照。优选地，第一末端优选地包括装载有以上定义的抗体的PVDF条。

本发明进一步提供了如上所述的装置在进行如上所述的方法中的用途。

在本发明的上下文中，标志物“AR”，“EF”，“EGF-R”包括各自的基因，mRNA，cDNA或由它们编码的蛋白质，包括片段，衍生物，变体，同种型等。优选地，所述标志物表征为上面定义的NCBI登录号。

在本发明中，表述“蛋白质”优选是指雄激素受体，雌激素受体和/或上皮生长因子受体，优选人类，表述“抗体”优选是指相对抗AR(例如Ab N-20sc 816；圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnologies Inc.))，抗ER(例如抗ERα抗体sc 543；圣克鲁斯生物技术公司)和/或抗EGFR(例如抗体sc-03-G，圣克鲁斯生物技术公司)抗体。

表述“蛋白质”应理解为还包括由对应直系同源或同源基因、功能性突变体、功能性衍生物、功能性片段或其类似物、同种型编码的对应蛋白质。

在本发明的上下文中，术语“多肽”或“蛋白质”包括：

i.完整蛋白质，等位变体及其直向同源物；

ii.任何合成、重组或蛋白酶解功能性片段；

iii.任何功能性等价物，例如合成的或重组的功能类似物。

在本发明中，表述“用于预测发展的风险的方法”，“用于诊断的方法”，“筛查方法”和/或“筛查”优选地包括筛查潜在地处于患有口腔肿瘤或其发展的风险中的对象。

在本发明中，“对照样品”和/或“对照手段”可以是从健康对象或患有另一种疾病的患者或在治疗之前的患有口腔肿瘤的患者，在治疗过程中的患有口腔肿瘤的患者，在疾病过程中的不同时间的患有口腔肿瘤的患者分离的样品。对照手段可用于比较如上相对于适当对照所定义的标记物的存在。例如，参考已知标准，可以由正常个体或正常群体获得对照。

具体地，在本发明中，表述“阳性对照”优选是指包含以上定义的蛋白质和/或编码所述蛋白质的核酸和/或由所述核酸转录的信使RNA或抗-肌动蛋白抗体的样品，而表述“阴性对照”是指不含它们的样品，例如衍生自不同肿瘤的细胞。

对于监测口腔肿瘤的进展的方法，对照样品可以是在开始治疗前的不同时间点，在治疗期间的不同时间点等从同一对象分离的样品。

对于筛选用于治疗口腔肿瘤的治疗方法，对照样品可以是从未经治疗的对象或从用待测物质治疗的对象或从用参考物质治疗的对象中获取的样品。在这种情况下，如果在分离的生物样品中上面定义的标志物的量小于或等于对照值，则被测物质对于治疗肿瘤可能是有效的。

在根据本发明的方法中，当在分离的生物样品中以上定义的标志物的量高于对照值时，这可能表明该对象的预后不良。

如本文所用，术语“对象”包括任何人类或非人类，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物，绵羊，狗，猫，马，牛，鸡，两栖动物，爬行动物等。

在本发明的上下文中，检测手段或检测系统优选地包括能够检测和/或测量上面定义的标记物的量的手段。在检测到蛋白质的情况下，检测手段是例如至少一种对该蛋白质，其功能类似物或其衍生物具有特异性的抗体。在要检测抗原-抗体复合物的情况下，检测手段是例如与酶偶联的二抗，发光底物，包被捕获抗体的磁珠，个性化的冻干抗体混合物和/或带有尺寸滤筒和/或与特异性抗体过滤器(SAF)组合的色谱柱。优选地，所述二抗具有酶检测物系统，并且所述检测系统还包括用于例如通过比色反应检测二抗的底物。

根据本发明的试剂盒还可包含常用助剂，如缓冲液、运载体、染料等和/或使用说明书。优选地，所述试剂盒还包括其中固定有抗体的固体支持物。优选地，本发明的试剂盒优选为用于免疫试验的试剂盒，更优选为ELISA试剂盒。

试剂盒还可包含将标志物的量的提高与合适对照值比较的对照手段。例如，参考已知标准，可以由正常个体或正常群体获得对照值。

在本发明中，关于蛋白质或核酸(DNA或RNA)或相应抗体的表述“检测”是指例如观察，评估或定量指示样品中蛋白质的存在或样品中所述目标蛋白质的绝对或相对量的信号的任何方法，例如通过化学发光，荧光法，分光光度法等。这些方法可以与蛋白质或核酸标记法结合使用以提供信号，例如：免疫组织化学染色，ELISA，细胞悬浮液，细胞学，荧光，放射性，比色法，重量法，X射线衍射或吸附，磁性，酶活性等。在本发明中，可以通过本领域技术人员已知的任何技术来检测由如上定义的核酸或相关蛋白质或抗体转录的信使RNA的存在，例如，使用适当的寡核苷酸引物进行Northern印迹或定量或半定量RT-PCR方法。

如上定义的标志物的检测和/或定量可以对应于标志物的量的测量或对应于量的变化的测量，更具体地对应于其量的增加或减少。检测到增加可能与疾病恶化有关，而减少可能与疾病改善或对象的康复有关。

在一个优选的实施方式中，该方法还包括检测和/或定量至少一种其他标志物，并与适当的对照样品进行比较。

在本发明中，表述“定量”可以理解为测量所述受体或相关抗体的量或浓度，优选半定量或定量。说明书中使用的术语“量”表示但不限于蛋白质或抗体的绝对或相对量，以及任何与后者相关或可从其衍生出的其他值或参数。这样的值或参数包括获得自蛋白质或抗体的物理或化学性质的信号强度值，通过直接测量，例如，免疫分析、质谱或核磁共振中的强度值获得的信号强度值。另外，这些值或参数包括间接测定获得的那些值或参数。

如上定义的抗体包括人和动物单克隆抗体或其片段，单链抗体及其片段和小抗体，双特异性抗体，双抗体，三抗体，或其二聚、寡聚或多聚物。优选地，抗体选自下组：完整免疫球蛋白(或抗体)，Fv，scFv(单链Fv片段)，Fab，F(ab)’

通过参考下图的非限制性实施例阐述本发明：

图1.组件：配有刷(a侧)和塑料支持物上的PVDF条(b侧)和检测盒的装置。

图2.组件：配有刷(a侧)和具有一抗的塑料支持物上的PVDF条(b侧)，以及可用于两名患者的带有20个带有缓冲液，裂解液和检测系统的孔的检测盒的装置。

图3.该装置的操作方案：(A)用刷从口腔粘膜中获取细胞；(B)将刷浸入孔1中。

图4.该装置的使用方案：(A)拔出刷；(B)拔出PVDF条。

图5.将PVDF条浸入孔1中以及随后四次洗涤的方案。

图6.将条浸入孔6中以与二抗反应，浸入孔7、8和9中以进行洗涤，并浸入孔10中以进行底物检测的方案。

图7.相对于结果的比色表达。

图8.制备条的步骤。

图9.(a)和(b)条形成方案和(c)随后的开发。

图10.KB和HEP-2细胞中EGFR的Western印迹。

图11.KB和HEP-2细胞中AR的Western印迹。

图12.KB和HEP-2细胞中ER的Western印迹。

材料和方法

制备PVDF条的方案

制备具有目标一抗的PVDF条的步骤如下：

1)用甲醇将PVDF条(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)目录号LC2002)水化5分钟(图8，组图A)。

2)用水洗涤5分钟(图8，组图B)。

3)用PBS洗涤两次，每次5分钟(图8，组图B)。

4)与来自金黄色葡萄球菌的蛋白A-生物素(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，10μg/mL)在PBS中孵育1小时(图8，组图B)。

5)用PBS洗涤两次(图8，组图B)。

6)用PBS中的3％BSA溶液封闭1小时(图8，组图B)。

7)用PBS洗涤三次，每次5分钟(图8，组图B)。

8)将PVDF固定在BioRad多通道设备上(图8，组图C，D，E)。

9)用每通道约400μL的兔抗体(抗AR抗体：Ab N-20sc 816；加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术有限公司；抗ERα抗体sc 543；加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术有限公司；和抗EGFR抗体sc-03-G，加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术有限公司)溶液在搅拌下孵育过夜(图8，组图F)。

10)每个通道用PBS洗涤三次，每次5分钟(图8，组图F)。

11)用0.2M PBS TEA洗涤过滤器两次(图8，组图F)。

12)用25mM DMP在pH 8.2的0.2M TEA HCl中孵育(图8，组图F，G，H)。

13)用0.2M TEA+20mM乙醇胺孵育(图8，组图F，G，H)。

14)用PBS洗涤两次，每次5分钟(图8，组图F，G，H)。

15)储存在0.02NaN3的PBS中(图8，组图F，G，H)。

16)垂直于加载了一抗抗EGFR，抗AR和抗ER抗体(用于捕获从收集的细胞学样品中释放的相对抗原)的通道切开过滤器(图9a)，以获得约0.4厘米宽的条，并将其固定在装置的支持物上(图9b)。然后用ELISA方法处理该条，以揭示存在于被测细胞学样品中的特异性抗原(图9c)。

源自口腔粘膜的细胞系表达上皮生长因子受体(EGFR)，因此不适合作为基于激素受体表达阳性的筛查的阴性对照。

加载的阴性对照(CTR-)来源于来自乳癌的肿瘤细胞的克隆(MDA-MB-453，ATCCHTB-131)，其特异性特征如下：

i)克隆MDA-MB-453，尽管是上皮肿瘤衍生的，但不表达上皮生长因子受体(EGF-R)；

ii)克隆MDA-MB-453，尽管是乳腺肿瘤细胞衍生的，但不表达雄激素受体(AR)和雌激素受体(ER)(Kristina Subik等，Breast Cancer(Auckl).2010；4：35-41)。

阳性对照(CTR+)是抗肌动蛋白抗体(西格玛奥德里奇公司，A2066)。

口腔细胞中PVDF条的ELISA方案

将来自口腔表皮癌的KB细胞(ATCC CCL-17)和来自喉癌的HEP-2细胞(ATCC CCL-23)在裂解缓冲液中裂解，提取的蛋白质通过SDS-PAGE分离。电泳结束后，将蛋白质在室温下转移到PVDF过滤器上2小时。然后，将过滤器在含有Tween-20pH 7.2(PBST缓冲液，PBS西格玛奥德里奇P5368和0.02％Tween-20西格玛奥德里奇P1379)和3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液中洗涤2小时以封闭非特异性位点。随后将过滤器与特异性抗AR，抗ER和抗EGFR一抗(抗AR抗体：Ab N-20sc 816；加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术有限公司；抗ERα抗体sc 543；加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术有限公司；和抗EGFR抗体sc-03-G，加利福尼亚圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术有限公司)孵育至少两个小时。最后，在用PBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟后，将过滤器与特异性二抗一起孵育，并通过化学发光释放试剂盒(ECL，安玛西亚制药公司(Amersham Pharmacia Inc.))检测信号。通过Scan LKB(安玛西亚制药公司)进行半定量光密度分析。

装置说明

分析仪器及其组成

1)塑料笔状装置，其两个功能末端中一个设有刷和黄色盖(A侧)，另一末端设有具有感兴趣一抗的PVDF条(Immobilon)的支持物，并带有透明盖(B侧)，图1和图2；

2)盒子以10孔的排组织，用LED铝带封闭，其中装有缓冲液以及裂解和检测系统；图1和图2。

使用模式

在存在潜在癌性病灶的情况下，牙医可以使用试剂盒中提供的特定收集工具获取细胞样品，并进行以下操作：

1)采集细胞学样品：用专用刷在可疑粘膜上从口腔获取细胞，该专用刷位于带有黄色盖的装置末端(A侧)；图3a。

2)将刷浸入含有裂解缓冲液的孔1中15分钟，这使得能够在溶液中释放蛋白质，即存在于口腔细胞提取物中的目标抗原，EGFR，AR和ER；图3b。

3)再次关闭装置A侧的盖；图4。

4)打开装置B侧的盖；图4b。

5)将具有PVDF条的支持物的末端(B侧)浸入孔1中5分钟，以使蛋白质(抗原)与粘附至PVDF条的一抗相互作用，从而形成免疫复合物(抗AR抗体：Ab N-20sc 816；加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术有限公司；抗ERα抗体sc 543；加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术有限公司；和抗EGFR抗体sc-03-G，加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术有限公司)；图5。

6)在含有PBST缓冲液的孔中洗涤具有PVDF条的支持物(三次)，以消除非特异性地粘附于免疫复合物的蛋白质；图5。

7)将具有PVDF条的支持物浸入含有配有酶检测系统(碱性磷酸酶，西格玛奥德里奇A2306)的二抗的孔中10分钟；图6。

8)在含有PBST缓冲液的孔中洗涤具有PVDF条的支持物(两次)，以消除过量的二抗；图6。

9)将具有PVDF条的支持物浸入含有比色反应所必需的底物(BCIP/NBT，ROCHE11681451001)的孔中；图6。

10)在含有PBST缓冲液的孔中洗涤(两次)条以消除过量；图6。

11)将在目标蛋白质存在的情况下注意到比色反应；图7。

结果

所提出的发明是作者对上皮肿瘤中EGF与雌二醇(ER)和雄激素(AR)受体之间的串扰进行科学研究的结果。这些研究是制定可用于肿瘤病理早期诊断的仪器的转化前提。这样的使用在结果中发现了合理性，表明EGF的作用需要类固醇受体(AR/ER/Src)的复合物(1.2)。作者的科学论文中报道的ELISA技术的使用使实现该装置的检测物系统成为可能。

在实验室中选择用于验证设想仪器的细胞提取物来自源自口腔表皮癌的KB细胞和源自喉癌的HEP-2细胞。图9c显示了有关在装置的PVDF条上共表达目标蛋白(EGFR，AR和ER)的结果。为了确认使用该装置获得的结果，对细胞提取物进行了单个受体的Western印迹分析，结果如图10、11、12所示。在图10中，在KB和HEP-2细胞中相对于EGFR受体的条带明显可见；样品一式三份上样，并且受体在两种细胞类型中明显可见，而在以MDA-MB-453细胞为代表的阴性对照中则没有明显的受体(Kristina Subik等，Breast Cancer(Auckl).2010；4：35-41)。在图11中，可以看到AR受体在同样的细胞中存在(样品一式两份)，在这种情况下，该条带也仅在口腔细胞中可见(KB和HEP-2)，而不在阴性对照(MDA-MB-453)中可见。最后，图12显示了这种情况下的ER受体(样品一式两份上样)，而且该受体仅在口腔细胞(KB和HEP-2)中显示，而不在阴性对照(MDA-MB-453)中显示。

提出的测试确保了明显较高的可预测性指数，因为这三种受体的同时表达与细胞表型从良性到恶性的变化相关。

参考文献

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