含高三尖杉酯碱的药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及含高三尖杉酯碱(HHT)的药物组合物及其应用，具体涉及含高三尖杉酯碱的药物组合物及其在制备治疗白血病药物中的应用。尤其涉及HHT与Bcl-2抑制剂维耐托克(venetoclax)的药物组合物治疗AML或HHT与FLT3抑制剂(米哚妥林(midostaurin)、索拉菲尼(sorafenib)、吉特替尼(gilteritinib)、克莱拉尼(crenolanib)或奎扎替尼(quizartinib))的药物组合物在制备治疗FLT3-ITD突变的AML的药物中的应用。

背景技术

急性髓细胞性白血病(AML)是一种高度异质性的恶性血液疾病。传统化疗药蒽环霉素和阿糖胞苷联合治疗AML，病人完全缓释率>50％，然而，获得完全缓释的病人中，仅有25％-50％长期无病存活。尽管对AML的发病机制、分类、发病基因，预后因子等方面的研究不断取得进展，AML的治疗仍然面临困难。依据分子生物学和遗传学可以将AML分为预后良好和预后不良两种。AML患者具有FLT3-ITD突变属于预后不良组。FDA已批准FLT3-ITD抑制剂非选择性抑制剂米哚妥林、FLT3-ITD和AXL抑制剂吉特替尼用于治疗FLT3-ITD突变的AML。索拉菲尼是多激酶抑制剂，已用于临床，但其适应症不包含AML。奎扎替尼是FLT3-ITD选择性抑制剂，目前正处于临床三期研究，有望获得FDA批准。克莱拉尼是FLT3选择性抑制剂，目前正处于临床试验阶段。这些药物在患者中，具有短暂的病情缓解作用，需要与化疗药物联合。

凋亡耐受是导致AML治疗失败原因。在AML细胞中，Bcl-2和Mcl-1作为主要的抗凋亡蛋白促进细胞存活。针对Bcl-2家族蛋白设计了多种抑制剂，维耐托克是Bcl-2选择性抑制剂。目前，维耐托克已被FDA批准上市，目前被FDA批准与阿扎胞苷、地西他滨或小剂量阿糖胞苷联合治疗不适合大剂量化疗的AML。

我国在20世纪七十年代已对HHT开展临床研究并将其开发成药，目前HHT在临床用于治疗AML。针对AML的治疗，我国研究人员总结出了多种以HHT为基础的化疗方案，如HHT+阿糖胞苷，HHT+阿糖胞苷+阿克拉霉素以及HHT+阿糖胞苷+柔红霉素等方案。HHT通过占据核糖体A位，抑制细胞内蛋白合成。HHT可以诱导白血病细胞凋亡，具体作用机制与下调抗凋亡蛋白Mcl-1相关。但HHT对Bcl-2家族蛋白Bcl-2，Bcl-xL没有直接调控作用。

凋亡蛋白受多个信号通路调节，并且存在信号通路的交互联系。单独用药能作用单一的通路，而其他信号通路的作用仍能维持肿瘤细胞存活。AML细胞的存活依赖多种基因和信号通路，单独用药的作用有限。因此单独用药往往治疗效果不佳。通过联合用药靶向两种或多种抗凋亡蛋白是改善AML治疗的策略。因此AML的治疗需要对现有的药物设计合理的联合用药方案。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供两种含高三尖杉酯碱(HHT)的药物组合物及其在制备治疗AML的药物中的应用，具体为HHT与Bcl-2抑制剂维耐托克的组合物在制备治疗AML，以及HHT和FLT3-ITD抑制剂(米哚妥林、索拉菲尼、吉特替尼、克莱拉尼或奎扎替尼)的药物组合物在制备治疗FLT3-ITD突变的AML中的应用。所述的组合物通过协同诱导AML细胞凋亡，改善AML的治疗现状。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明提供了一种含高三尖杉酯碱的药物组合物。

所述的药物组合物由高三尖杉酯碱和Bcl-2抑制剂维耐托克(venetoclax)组成，两者的摩尔比范围为：1:5-4:1。

所述的药物组合物还可以由高三尖杉酯碱和FLT3-ITD抑制剂组成，两者的摩尔比范围为：1:5-5:1。所述的FLT3-ITD抑制剂为米哚妥林、索拉菲尼、吉特替尼、克莱拉尼或奎扎替尼。

所述的高三尖杉酯碱可以为高三尖杉酯碱或其衍生物，所述高三尖杉酯碱的结构如下：

所述的高三尖杉酯碱的衍生物为三尖杉酯碱，脱氧三尖杉酯碱，异三尖杉酯碱。

所述的Bcl-2抑制剂维耐托克(venetoclax)为式II所示的结构或其类似物：

本发明中，所述的FLT3-ITD抑制剂米哚妥林(midostaurin)为式III所示的化合物：

本发明中，所述的FLT3-ITD抑制剂索拉菲尼(sorafenib)为式IV所示的化合物：

本发明中，所述的FLT3-ITD抑制剂吉特替尼(gilteritinib)为式V所示的化合物：

本发明中，所述的FLT3-ITD抑制剂克莱拉尼(crenolanib)为式VI所示的化合物：

本发明中，所述的FLT3-ITD抑制剂奎扎替尼(quizartinib)为式VII所示的化合物：

本发明所述的药物组合物中，所述组分不限于上述化合物本身，还可以是它们的水合物、类似物、衍生物及其它有机或无机盐。

进一步地，本发明提供了所述含高三尖杉酯碱的药物组合物在制备治疗白血病药物中的应用。

所述的白血病为急性髓细胞性白血病。

所述的HHT与FLT3抑制剂药物组合物应用的急性髓细胞性白血病为FLT3-ITD突变的白血病。

本发明所述的由高三尖杉酯碱和Bcl-2抑制剂维耐托克(venetoclax)组成的药物组合物中，HHT和Bcl-2抑制剂可以含在同一种药物制剂如片剂或胶囊中，也可以将HHT和Bcl-2抑制剂维耐托克(venetoclax)单独给药分别做成制剂，或将上述组合物中的两种成分制成一种控释的制剂，先释放组合物中的一种成分，随后释放组合物中的另一种成分，患者只需服用该控释的组合物制剂；

所述组合物中的HHT和Bcl-2抑制剂可以同时使用或以任意的先后顺序使用，如可以将HHT和Bcl-2抑制剂同时给患者服用；也可以先将HHT给患者服用、然后服用Bcl-2抑制剂，或先服用Bcl-2抑制剂、然后服用HHT。

本发明中，可将本发明HHT和Bcl-2抑制剂采用本领域常规的方法制备成适合于胃肠道给药或非胃肠道给药的药物制剂，本发明优选将Bcl-2抑制剂维耐托克(venetoclax)制成胃肠道给药的药物制剂其制剂形式可以为常规片剂或胶囊、或控释、缓释制剂。

本发明中，药物组合物的制备方法没有特别的限制，HHT和Bcl-2抑制剂两者可以直接进行混合然后制成制剂，或分别和/或相应的辅料混合分别做成制剂，然后再按照本领域常规的方法包装在一起，或分别和相应的辅料混合然后再混合制成制剂。

本发明所述的由高三尖杉酯碱和FLT3-ITD抑制剂组成的药物组合物中，HHT和FLT3抑制剂米哚妥林、索拉菲尼、吉特替尼、克莱拉尼或奎扎替尼中的任一种药物制备成片剂或胶囊，也可以将HHT和米哚妥林、索拉菲尼、吉特替尼、克莱拉尼或奎扎替尼的现有制剂联合，或将FLT3抑制剂米哚妥林、索拉菲尼、吉特替尼、克莱拉尼或奎扎替尼制成一种控释的制剂，与HHT注射剂联合应用。

所述组合物中的HHT和FLT3抑制剂米哚妥林、索拉菲尼、吉特替尼、克莱拉尼或奎扎替尼可以同时使用或以任意的先后顺序使用。

本发明中，药物组合物的制备方法没有特别的限制，HHT和FLT3抑制剂米哚妥林、索拉菲尼、吉特替尼、克莱拉尼或奎扎替尼组合物可以直接进行混合然后制成制剂，或分别和/或相应的辅料混合分别做成制剂，然后再按照本领域常规的方法包装在一起，或分别和相应的辅料混合然后再混合制成制剂。本发明中的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物制剂形式不同进行调整，但以保证该药物组合物在体内能达到有效的血药浓度为前提。

本发明评价了HHT与Bcl-2抑制剂维耐托克(venetoclax)药物组合物诱导AML细胞株U937，THP-1，NB4，HL-60，Molm-13，MV4-11的凋亡；HHT和FLT3-ITD抑制剂米哚妥林(midostaurin)、索拉菲尼(sorafenib)、吉特替尼(gilteritinib)、克莱拉尼(crenolanib)或奎扎替尼(quizartinib)组合物诱导FLT3-ITD突变的AML细胞株Molm-13和MV4-11凋亡，结果表明HHT和维耐托克(venetoclax)组合物治疗AML，HHT和FLT3抑制剂组合物治疗FLT3-ITD突变的AML具有显著的协同作用，提高了药物的疗效，降低了单个药物的用药剂量，降低了毒副作用。

本发明的优点：本发明提供的HHT药物组合物一中含有HHT和Bcl-2抑制剂维耐托克(venetoclax)。HHT和维耐托克(venetoclax)协同诱导AML细胞凋亡。本发明提供的HHT药物组合物二中含有HHT和FLT3抑制剂米哚妥林(midostaurin)、索拉菲尼(sorafenib)、吉特替尼(gilteritinib)、克莱拉尼(crenolanib)或奎扎替尼(quizartinib)，该组合物选择性诱导FLT3-ITD突变的AML细胞凋亡。可以将上述组合物开发成为抗白血病的联合用药方案或制剂。

附图说明

图1为实施HHT和venetoclax联合在MOLM-13异种移植模型中的作用；

图2为实施HHT和quizartinib联合在MOLM-13异种移植模型中的作用。

具体实施方式

下面结合实施实例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。

实施例

试剂和方法：

细胞：AML细胞HL-60，U937，MV4-11，THP-1细胞购自American Type CultureCollection(ATCC)。AML细胞MOLM-13购自DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH(Braunschweig Germany)。NB4细胞由Dr.Waxman提供。

药品：以下实施例中所用药物组合物均按下列方法所述来制备；HHT购自民生制药，储存浓度1.833mM；Venetoclax、midostaurin、sorafenib、gilteritinib、crenolanib及quizartinib均购自Selleck。

方法1：准确称量venetoclax、midostaurin、sorafenib、gilteritinib、crenolanib及quizartinib，分别溶解于二甲基亚砜，各自配成20mM的贮存液，在-20℃下保存，使用时用培养液稀释到适当的浓度。HHT使用时用新鲜的培养基稀释到合适的浓度。所有实验中，严格控制二甲基亚砜的终浓度，以便不影响细胞活性。

细胞于含10％灭活的胎牛血清，10mmol/L L-glutamine，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃、5％CO

将对数生长期细胞，按10

方法2：雄性NOD-SCID小鼠18-22g，腹腔注射环磷酰胺150mg/kg，连续给药两次。随后经尾静脉接种人源的MOLM-13细胞5×10

方法3：雄性NOD-SCID小鼠18-22g，腹腔注射环磷酰胺150mg/kg，连续给药两次。随后经尾静脉接种人源的MOLM-13细胞5×10

实施不同浓度的HHT和venetoclax的组合协同促进U937细胞凋亡实验，见表1。

表1

AML细胞株U937用HHT 20-80nM，与venetoclax 20-100nM联合处理6h。Venetoclax单独诱导凋亡能力很弱，凋亡比例＜5％。HHT可以浓度依赖的诱导U937细胞凋亡，HHT 60nM可以引起36％细胞发生凋亡。Venetoclax的加入明显增强了HHT的诱导凋亡作用，60nM的HHT与100nM venetoclax联合应用，可以诱导＞80％的U937细胞发生凋亡。两种化合物均用最大浓度处理细胞，细胞凋亡比例＞90％。用Compusyn软件计算两药的联合指数。HHT与venetoclax的联合指数均＜0.7，显示两个化合物有强的协同作用。

实施不同浓度的HHT和venetoclax的组合协同促进THP-1细胞凋亡实验，见表2。

表2

AML细胞株THP-1细胞用HHT 15-50nM，与venetoclax 15-50nM联合处理6h。HHT和ABT-199单独诱导凋亡能力很弱，凋亡比例＜7％。Venetoclax的加入明显增强了HHT的诱导凋亡作用，HHT 40nM与venetoclax 50nM联合应用，THP-1细胞凋亡比例达到85％。联合用药可以使THP-1细胞凋亡比例高达89％。用Compusyn软件计算两药的联合指数。HHT与venetoclax的联合指数均＜0.4，且多种浓度条件下＜0.2，显示两个化合物在THP-1细胞中有极强的协同诱导凋亡作用。

实施不同浓度的HHT和venetoclax的组合协同促进NB4细胞凋亡实验，见表3。

表3

AML细胞株NB4细胞用HHT 5-15nM，与venetoclax 5-15nM联合处理6h。HHT和venetoclax单独诱导凋亡能力很弱，凋亡比例＜10％。ABT-199的加入明显增强了HHT的诱导凋亡作用，HHT 15nM与venetoclax 10nM联合应用，NB4细胞凋亡比例达到80％。用Compusyn软件计算两药的联合指数。HHT与venetoclax的联合指数均＜0.6，显示两个化合物在NB4细胞中有强的协同诱导凋亡作用。

实施不同浓度的HHT和venetoclax的组合协同促进HL-60细胞凋亡实验，见表4。

表4

AML细胞株HL-60细胞用HHT 10-20nM，与venetoclax 5-50nM联合处理6h。HHT20nM可以诱导21％的HL-60细胞发生凋亡。Venetoclax单独诱导凋亡能力很弱，凋亡比例均＜10％。venetoclax的加入明显增强了HHT的诱导凋亡作用，20nM的HHT与30nM venetoclax联合应用，HL-60细胞凋亡比例达到80％。用Compusyn软件计算两药的联合指数，联合指数均＜1，说明两个化合物在HL-60细胞中有较强的协同诱导凋亡作用。

实施不同浓度的HHT和venetoclax的组合协同促进Molm-13细胞凋亡实验，见表5。

表5

AML细胞株Molm-13细胞用HHT 5-15nM，与venetoclax 5-12.5nM联合处理6h。HHT单独诱导凋亡能力很弱，单独最强可诱导10％细胞凋亡。12.5nM venetoclax单独可以诱导19.4％的Molm-13细胞发生凋亡。Venetoclax的加入明显增强了HHT的诱导凋亡作用，12.5nM的HHT与10nM venetoclax联合应用，Molm-13细胞凋亡比例达到84.3％。两种化合物最大浓度下，细胞凋亡比例为92.6％。用Compusyn软件计算两药的联合指数。HHT与venetoclax联合指数均＜0.5，且多数浓度条件下＜0.2，提示两个化合物在Molm-13细胞中有非常强的协同诱导凋亡作用。Molm-13是一种具有FLT3-ITD突变的AML细胞株，提示HHT和venetoclax组合物对于该类型的难治型白血病也有一定的疗效。

实施HHT和venetoclax的组合协同促进MV4-11细胞凋亡实验，见表6。

表6

AML细胞株MV4-11细胞用HHT和venetoclax单独处理6h可以引起的凋亡比率分别为23.2％和13.9％，将两种化合物联合应用，可以使凋亡率提高到61.9％，显示两种化合物在该细胞株中有一定的协同作用。MV4-11是一种具有FLT3-ITD突变的AML细胞株，提示HHT和venetoclax组合物对于该类型的难治型白血病也有一定的疗效。

实施HHT和venetoclax联合在MOLM-13异种移植模型中的作用，见图1和表7：

表7

经尾静脉注射人源MOLM-13细胞后，对照组NOD-SCID小鼠的平均存活期为22.63天，venetoclax组动物平均存活期23.13天，显示该剂量下venetoclax没有治疗作用。HHT组动物平均存活期24.88天，也没有治疗作用。HHT和venetoclax联合组动物的平均存活期为35.89天，与对照组相比生存期延长率为58.62％。提示HHT和venetoclax联合在体内有明显的抗AML作用。

实施HHT和Midostaurin的组合协同促进MOLM-13细胞凋亡实验，见表8。

表8

Molm-13细胞是一种具有FLT3-ITD突变的AML细胞株，用HHT 10-20nM，与Midostaurin 10-50nM联合处理24h。HHT在10nM不能引起明显的细胞凋亡，HHT 20nM可诱导22％的细胞凋亡。Midostaurin 10-50nM浓度下单独作用，诱导的细胞凋亡率<20％。Midostaurin的加入明显增强了HHT的诱导凋亡作用，HHT 10nM与Midostaurin 40nM联合应用，MOLM-13细胞凋亡比例达到64％。两种化合物最大浓度下，细胞凋亡比例为75％。用Compusyn软件计算两药的联合指数。HHT与Midostaurin联合指数均＜1，且多数浓度条件下＜0.6，提示两个化合物在MOLM-13细胞中有强的协同诱导凋亡作用。

实施HHT和Sorafenib的组合协同促进MOLM-13细胞凋亡实验，见表9。

表9

Molm-13细胞用HHT 2-10nM，与Sorafenib 2-10nM联合处理24h。HHT在低浓度2-10nM不能引起明显的细胞凋亡，HHT 10nM可诱导10％的细胞凋亡。Sorafenib 2-10nM浓度下单独作用，诱导的细胞凋亡率<10％。Sorafenib的加入明显增强了HHT的诱导凋亡作用，HHT 5nM与Sorafenib 10nM联合应用，MOLM-13细胞凋亡比例达到40％。两种化合物最大浓度下，细胞凋亡比例为55％。用Compusyn软件计算两药的联合指数。HHT与Sorafenib联合指数均＜1，且多数浓度条件下＜0.6，提示两个化合物在MOLM-13细胞中有强的协同诱导凋亡作用。

实施HHT和Gilteritinib的组合协同促进MOLM-13细胞凋亡实验，见表10。

表10

Molm-13细胞用HHT 10-20nM，与Gilteritinib 10-50nM联合处理24h。Gilteritinib 10-20nM浓度下单独作用不能诱导明显的凋亡，40-50nM浓度下诱导的细胞凋亡率约为22％。Gilteritinib的加入明显增强了HHT的诱导凋亡作用，HHT 10nM与Gilteritinib 40nM联合应用，MOLM-13细胞凋亡比例达到75％。两种化合物最大浓度下，细胞凋亡比例为80％。用Compusyn软件计算两药的联合指数。HHT与Gilteritinib联合指数均＜1，且多数浓度条件下＜0.5，提示两个化合物在MOLM-13细胞中有强的协同诱导凋亡作用。

实施HHT和Crenolanib的组合协同促进MOLM-13细胞凋亡实验，见表11。

表11

Molm-13细胞用HHT 5-20nM，与Crenolanib 5-20nM联合处理24h。Crenolanib 5-10nM浓度下单独作用不能诱导明显的凋亡，细胞凋亡率<15％，Crenolanib 20nM引起18％的细胞凋亡。Crenolanib的加入明显增强了HHT的诱导凋亡作用，HHT 10nM与Crenolanib10nM联合应用，MOLM-13细胞凋亡比例达到61％。两种化合物最大浓度下，细胞凋亡比例为78％。用Compusyn软件计算两药的联合指数，联合指数均＜1，提示两个化合物在MOLM-13细胞中有协同诱导凋亡作用。

实施不同浓度的HHT和Quizartinib的组合协同促进Molm-13细胞凋亡实验，见表12。

表12

AML细胞株Molm-13细胞用HHT 1-5nM，与Quizartinib 1-5nM联合处理6h。HHT单独诱导凋亡能力很弱，单独最强可诱导5％细胞凋亡。Quizartinib能有效诱导细胞凋亡，Quizartinib 5nM可以诱导24％的Molm-13细胞发生凋亡。Quizartinib的加入明显增强了高三尖杉酯碱的诱导凋亡作用，HHT 5nM与Quizartinib 5nM联合应用，Molm-13细胞凋亡比例达到83％。用Compusyn软件计算两药的联合指数。HHT与Quizartinib联合指数均＜1，且在高浓度下联合指数＜0.2，提示两个化合物在Molm-13细胞中有非常强的协同诱导凋亡作用。Molm-13是一种具有FLT3-ITD突变的AML细胞株，提示HHT和Quizartinib组合物对于该类型的难治型白血病有很强的疗效。

实施HHT和Quizartinib的组合协同促进MV4-11细胞凋亡实验，见表13。

表13

AML细胞株MV4-11细胞用HHT和Quizartinib单独处理24h可以引起的凋亡比率分别为9.6％和15.6％，将两种化合物联合应用，可以使凋亡率提高到52.7％。在具有FLT3-ITD突变的AML细胞株Molm-13和MV4-11中，HHT和Quizartinib组合物有强的诱导凋亡作用，提示HHT和Quizartinib组合物可以用于FLT3-ITD突变的难治型白血病。

实施HHT和quizartinib联合在MOLM-13异种移植模型中的作用，见图2和表14

表14

对照组平均存活期21.57天，HHT组动物存活期30天，生存率延长39.08％。Quizartinib也有明显的治疗作用，该组动物平均存活期35.86天，生存率延长66.25％。HHT和quizartinib联合使动物的存活期得到延长，平均存活期62.12天，生存期延长率188.02％。提示HHT和quizartinib联合在体内也有很强的抗FLT3-ITD突变的AML作用。

尽管上述实施例已经对本发明的技术方案进行了详细描述，但是本发明的技术方案并不限于上述实施例，在不脱离本发明思想和宗旨的情况下，对本发明技术方案所做的任何改动都将落入本发明的权利要求书所限定的范围。