MIR-92A或MIR-145在治疗安格曼综合征中的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年6月14日提交的美国临时申请第62/684,774号的权益和优先权，该美国临时申请通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开内容大体上涉及负调节SNHG14基因活性的微小RNA的表达用于治疗安格曼综合征的用途。用于治疗安格曼综合征(Angelman)的此类微小RNA包括例如MIR-92a和/或MIR-145以及其类似物和变体。更具体地，本公开内容涉及表达载体诸如例如AAV载体的用途，该表达载体可以用于转导细胞以将MIR-92a和/或MIR-145引入到靶组织以治疗安格曼综合征。

背景

安格曼综合征(AS)是一种神经发育障碍，其特征是严重的发育迟缓或智力残疾、严重的言语障碍、步态共济失调和/或肢体震颤、癫痫发作、小头畸形以及具有包括频繁发笑、亲水(affinity for water)、微笑和兴奋性的不恰当的快乐举止的独特行为。小头畸形和癫痫发作也是常见的。发育迟缓在约六个月大时首次被注意到；然而，安格曼综合征的独特临床特征直到一岁以后才显现出来，并且在正确的临床诊断明显之前可能历时若干年。

安格曼综合征的许多特有的特征由被称为UBE3A的基因的功能丧失引起，该基因编码泛素蛋白连接酶E3A(UBE3A)基因。(Kishino,T.等人.Nat Genet(1997)12:385-395)。人们通常从父母每人继承UBE3A基因的一个拷贝。该基因的两个拷贝在许多身体的组织中是开启的(活跃的)，然而，在脑的某些区域中，仅从人的母亲继承的拷贝(母本拷贝)是活跃的。这种亲本特异性基因激活是由被称为基因组印记的现象引起的。UBE3A被母体印记在脑中，使得它几乎专由母本染色体表达，而父本染色体在表观遗传上是沉默的。(Albrecht,U.等人,Nat Genet(1997)17:75-78)。如果UBE3A基因的母本拷贝由于染色体变化或基因突变而丢失，则人在脑的一些部分中将不具有该基因的活跃拷贝。

若干种不同的遗传机制可以使UBE3A基因的母本拷贝失活或缺失。安格曼综合征的大多数病例(约70百分比)发生在含有该基因的母本15号染色体片段缺失时。在其他病例(约11％)中，安格曼综合征是由UBE3A基因的母本拷贝的突变引起的。

小核仁RNA宿主基因14(SNHG14)，或者称为UBE3A-ATS，将反义地延伸到UBE3A基因中，并且因此在抑制父本UBE3A表达和印记中起潜在作用。关于UBE3A的蛋白产物的不足如何导致在安格曼综合征中观察到的神经发育缺陷仍然有许多待理解。因此，对于用于治疗被诊断为患有安格曼综合征的受试者的改善的和/或另外的疗法仍然存在需求。

概述

提供了治疗有相应需要的患者中的安格曼综合征(AS)的方法，该方法包括向患者递送有效量的组合物，该组合物负调节SNHG14基因的活性。这样的治疗方法包括向患者递送有效量的组合物，该组合物增加患者的中枢神经系统中的微小RNA-145和/或微小RNA-92a分子的水平。本文公开的方法被设计成负调节SNHG14基因的活性。

提供了治疗有相应需要的患者中的安格曼综合征的方法，该方法包括向患者递送有效量的组合物，该组合物增加患者的中枢神经系统的细胞中微小RNA-145和/或微小RNA-92a分子的水平。提供了治疗有相应需要的患者中的安格曼综合征的方法，该方法包括向患者施用编码微小RNA-145、初级miRNA145或前体miRNA145的载体。提供了治疗有相应需要的患者中的安格曼综合征的方法，该方法包括施用编码微小RNA-92a、初级miR92a或前体miRNA92a的载体。在实施方案中，微小RNA-145或微小RNA-92a的增加的水平引起安格曼综合征的一种或更多种症状的改善。

在实施方案中，编码微小RNA-145、初级miR145或前体miR145的载体在患有安格曼综合征的患者中引起微小RNA-145的水平增加并且与该紊乱的症状减轻相关。在实施方案中，编码微小RNA-92a、初级miR92a或前体miR92a的载体在患有安格曼综合征的患者中引起微小RNA-92a的增加的水平，并且与该紊乱的症状减轻相关。

在某些方面中，包含编码微小RNA-145、初级miR145或前体miR145的核酸的载体包括可操作地连接至编码微小RNA-145、初级miR145或前体miR145的核酸的启动子。在实施方案中，载体包括土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。在实施方案中，载体包括牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGHpA)。在实施方案中，载体包括荧光报告盒。在实施方案中，载体是腺相关病毒。在实施方案中，载体是慢病毒。在实施方案中，包含编码微小RNA-92a、初级miR92a或前体miR92a的核酸的载体包括可操作地连接至编码微小RNA-92a、初级miR92a或前体miR92a的核酸的启动子。在实施方案中，编码微小RNA-92a的核酸是微小RNA-92a-3p。在实施方案中，载体包括土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。在实施方案中，载体包括牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGHpA)。在实施方案中，载体包括荧光报告盒。在实施方案中，载体是腺相关病毒。在实施方案中，载体是慢病毒。在实施方案中，载体是AAV载体。

在实施方案中，载体被递送至患者的中枢神经系统中的靶位置。在实施方案中，靶位置是患者的脑。在实施方案中，载体的施用途径是口服、含服、舌下、直肠、局部、鼻内、阴道或肠胃外。在实施方案中，载体被直接施用至靶位置。

在实施方案中，对患者的脑中的靶位置应用超声以增强靶位置处患者的血脑屏障的渗透性，其中微小RNA-145或微小RNA-92a被递送至靶位置。

详细描述

本文描述了用于治疗安格曼综合征的方法和组合物，该方法包括施用负调节SNGH14基因的活性的组合物。对于患有安格曼综合征的患者，这样的组合物包括例如微小RNA-145、初级miR145或前体miR145。本文还描述了用于治疗安格曼综合征的方法和组合物，该方法包括向患有安格曼综合征的患者施用微小RNA-92a、初级miR92a或前体miR92a。

在实施方案中，提供了编码微小RNA-145,初级miR145或前体miR145的载体。在实施方案中，编码微小RNA-145、初级miR145或前体miR145的载体被施用至患有安格曼综合征的患者，其中该患者表现出该紊乱的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，提供了编码微小RNA-92a、初级miR92a或前体miR92a的载体。在实施方案中，编码微小RNA-92a、初级miR92a或前体miR92a的载体被施用至患有安格曼综合征的患者，其中该患者表现出该紊乱的一种或更多种症状的改善。

微小RNA-145、初级miR145、前体miR145、微小RNA-92a、初级miR92a和/或前体miR92a在本文中被统称为微小RNA(microRNA或microRNAs)。向患者施用微小RNA-145、初级miR145、前体miR145、微小RNA-92a、初级miR92a和/或前体miR92a在本文中被统称为微小RNA治疗。微小RNA治疗增加细胞中相应的活性微小RNA分子的水平。该增加可以通过向细胞直接提供微小RNA来产生，或者可以通过向细胞间接提供微小RNA诸如通过载体来产生。微小RNA可以包括RNA或DNA分子，该RNA或DNA分子还包括另外的序列。CNS，例如患者的脑的细胞中相应的活性微小RNA分子的水平的增加与安格曼综合征的一种或更多种症状的改善相关。

一种或更多种初级miRNA可用于本文描述的组合物和方法中。可以使用任何合适形式的初级mRNA。初级mRNA可以在细胞内被加工并且起作用以获得miRNA的功能，例如，可被转化为前体miRNA并且然后被转化为成熟形式。可选择地，miRNA最初可以是miRNA前体。在实施方案中，组合物和方法包括前体miRNA，该前体miRNA经历被称为Dicer的双链核酸内切酶，III型RNA酶的裂解，产生大小为约20-25个核苷酸的不完全的miRNA:miRNA*双链体。这种双链体包含成熟miRNA链及其相对的互补miRNA*链。一种或更多种前体miRNA可以被用于本文描述的组合物和方法中。前体miRNA可以起作用以获得miRNA的功能。可以使用任何合适形式的前体miRNA。还预期了本文描述的组合物和方法的miRNA可以是成熟的miRNA。

微小RNA可以以非表达载体方式或表达载体方式被递送至细胞。表达载体和载体在本文中可互换地使用。在实施方案中，微小RNA可以在用于随后的步骤之前被分离或纯化。微小RNA可以在引入到细胞中之前被分离或纯化。“引入”到细胞中包括已知的转染、转导、感染的方法以及用于将表达载体或异源核酸引入到细胞中的其他方法。模板核酸或扩增引物可以在其被转录或扩增之前被分离或纯化。分离或纯化可以通过本领域技术人员对于核酸已知的许多方法来进行。微小RNA的递送可以通过若干形式进行，诸如通过将化学修饰的RNA部分或通过将未修饰的RNA部分封装在病毒或非病毒递送容器(vessel)中。非表达载体递送方式包括可以被靶向到脑细胞的纳米颗粒、微米颗粒、脂质体、聚合物、微球等。微小RNA还可以作为基于质粒或微型载体的表达系统被递送，其中然后它可以被细胞中的RNAi机器表达和加工以形成成熟的微小RNA。

可以通过重组产生用于miRNA表达的核酸构建体。本文提供了这样的表达载体。表达载体是核酸运载体(carrier nucleic acid)，核酸序列可以插入到该核酸运载体中以便被引入到细胞中，在细胞中该核酸序列可以被复制。表达载体包括质粒，粘粒，重组病毒诸如腺相关病毒(AAV)、腺病毒、逆转录病毒、痘病毒和本领域中其他已知的病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)，以及人工染色体(例如YAC)。本领域普通技术人员具备良好的技术来通过标准重组技术构建表达载体。在实施方案中，具有微小RNA的表达载体被递送至患者的细胞。核酸分子以它们可以被吸收并且被有利地表达的形式被递送至患者的细胞，使得可以达到治疗有效水平。

用于本文公开的载体的核酸分子包括编码哺乳动物微小RNA-145、初级miR145、前体miR145、微小RNA-92a、初级miR92a或前体miR92a的核酸分子。这样的核酸在本领域中是熟知的，并且是公众可获得的。在本发明的实施方案中，人类微小RNA-145、初级miR145、前体miR145、微小RNA-92a、初级miR92a或前体miR92a序列被用于载体中。人类微小RNA-92a，也被称为微小RNA-92a-3p的成熟序列是：

(SEQ ID NO:1)5'-UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU-3’，

人类微小RNA-145，也被称为微小RNA-145-5p的成熟序列是：(SEQ ID NO:2)5’GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’。

除了编码野生型微小RNA-145和微小RNA-92a的核酸之外，所述核酸的变体也可以用于本发明的方法中。例如，这样的变体可以影响微小RNA在细胞内的定位。这样的变体可以导致随着细胞质定位的增加，微小RNA的核定位减少。在本发明的方面中，微小RNA-145和微小RNA-92a模拟物还可以用于治疗安格曼综合征。这样的模拟物是可商购的(参见例如Sigma Aldrich)。

本领域技术人员已知的任何合适的表达载体可用于将本文的微小RNA递送至中枢神经系统的细胞中的靶位置。在这样的递送后，靶位置中的细胞被微小RNA转染，从而增加患者的脑中这些微小RNA的水平。转导性病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺相关病毒)载体可以用于体细胞基因疗法，特别是由于它们的高感染效率以及稳定的整合和表达。

在实施方案中，表达载体可以是稳定的整合载体或稳定的非整合载体。合适的载体的实例是慢病毒和腺相关病毒(AAV)。慢病毒是逆转录病毒的亚类。慢病毒可以整合到非分裂细胞诸如神经元的基因组中。慢病毒以高效率感染、长期稳定表达转基因和低免疫原性为特征。在实施方案中，慢病毒载体可以被用于将微小RNA递送至脑。

AAV是已知感染许多细胞类型并且对人类无致病性的有缺陷的细小病毒。AAV可以感染分裂细胞和非分裂细胞两者。在实施方案中，AAV载体可以在本文用于将微小RNA递送至脑。在本文中可以使用任何已知的腺相关病毒(AAV)，例如，AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9和AAVRec3可以结合神经元使用。用于本文公开的方法的AAV载体包括在美国序列号美国临时专利申请第62/550,458号中描述的AAV载体，该美国临时专利申请通过引用以其整体并入本文。通过假型包装(pseudotyping)，即混合来自不同病毒血清型的衣壳和基因组，已经开发了另外的合适的AAV血清型。因此，例如，AAV2/7指示的病毒含有被包装在来自血清型7的衣壳中的血清型2的基因组。其他实例是AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9等。杂合AAV衣壳血清型rec1、rec2、rec3和rec4通过对衣壳序列的片段重排来产生，这些衣壳序列的片段在所有三种非人灵长类AAV血清型cy5、rh20和rh39中都与AAV8匹配。参见，Charbel等人,PLoSOne.2013Apr 9；8(4):e60361。术语rec3AAV和AAVRec3在本文中可以可互换地使用。自身互补的腺相关病毒(scAAV)还可以被用作载体。虽然AAV包装单链DNA并且需要第二链合成的过程，但scAAV包装退火在一起以形成双链DNA的两条链。通过跳过第二链合成，scAAV允许在细胞中快速表达。

本领域普通技术人员可以使用已知的技术构建合适的载体。可以选择或构建除了微小RNA之外还包含适当的调节序列的合适的载体，所述调节序列包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、标志物基因和其他适当的序列。本领域技术人员熟悉包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、标志物基因和其他合适的序列的适当的调节序列。

本文中的表达载体包括可操作地连接至编码序列或ORF以促进其在靶向的宿主细胞中的表达的适当的序列。“可操作地连接的”序列包括诸如毗邻编码序列的启动子的表达控制序列和反式或远端地作用以控制期望的产物的表达的表达控制序列两者。

典型地，载体包括有助于微小RNA在靶细胞内表达的启动子。启动子可以选自可以驱动所选择的转基因在脑中表达的许多组成型启动子或诱导型启动子。组成型启动子的实例包括CMV立即早期增强子/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子-外显子1-内含子1元件、RSV LTR启动子/增强子、SV40启动子、CMV启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。

特异性可以排他地通过受体的区域性和细胞类型特异性表达来实现，例如使用组织或区域特异性启动子来实现。病毒基因启动子元件可以帮助决定表达微小RNA的细胞的类型。一些启动子是非特异性的(例如CAG，一种合成启动子)，而其他启动子是神经元特异性的。CAG启动子是可以用于驱动高水平表达的强的合成启动子。CAG启动子由以下组成：1)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件，2)鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子，以及3)兔β-珠蛋白基因的剪接受体。在实施方案中，启动子是CAG启动子。神经元特异性启动子包括(例如，突触蛋白；hSyn)或偏爱特定的神经元类型，例如强啡肽启动子、脑啡肽启动子、偏爱星形胶质细胞的GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白)启动子，或偏爱皮质谷氨酸能细胞但也可以靶向皮质下GABA能细胞的CaMKIIa启动子。在实施方案中，启动子是CamkIIa(αCaM激酶II基因)启动子，其可以驱动在前脑中表达。其他神经元细胞类型特异性启动子包括NSE启动子、酪氨酸羟化酶启动子、髓鞘碱性蛋白启动子、神经胶质纤维酸性蛋白启动子和神经微丝基因(重链、中链、轻链)启动子。

表达控制序列还可以包括适当的转录起始序列、终止序列和增强子序列；高效的RNA加工信号，诸如剪接和聚腺苷酸化信号；使细胞质mRNA稳定的序列；增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强核酸或蛋白质稳定性的序列；以及当期望时，增强产物加工和/或分泌的序列。许多多样化的表达控制序列包括天然的和非天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的表达控制序列是本领域已知的，并且可以根据期望的表达类型在本文中使用。

除了启动子之外，真核细胞的表达控制序列通常包括增强子诸如来源于免疫球蛋白基因、SV40、CMV等的增强子，以及可以包括剪接供体位点和剪接受体位点的聚腺苷酸化序列。聚腺苷酸化序列通常插入到编码序列的3’和3'ITR序列的5’。可以在本文的载体中使用的聚A信号的说明性实例包括聚A序列(例如，AATAAA、ATTAAA或AGTAAA)、牛生长激素聚A序列(BGHpA)、兔β-珠蛋白聚A序列(rβgpA)或本领域中已知的另一种合适的异源或内源聚A序列。

本文中有用的调节序列还可以包含内含子，诸如位于启动子/增强子序列和编码序列之间的内含子。一种有用的内含子序列来源于SV40，并且被称为SV40 T内含子序列。另一种包括土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)。WPRE是DNA序列，该DNA序列当被转录时产生增强表达的三级结构。

本文中的载体可以包含报告基因，例如编码荧光团的那些。荧光团是荧光化合物，该荧光化合物通常在特定频率激发后可以重新发射光。它们可以用作标签或标志物，该标签或标志物可以被附接到例如蛋白质上，以允许蛋白质被定位。许多合适的荧光团在本领域中是已知的。所述荧光团可以通过它们发射的颜色例如蓝色、蓝绿色、绿色、黄色、橙色、红色和其他颜色被分类。例如，mCherry、mRasberry、mTomato和mRuby是红色荧光团蛋白；citrine、venus和EYFP是黄色荧光团蛋白。绿色荧光蛋白(GFP)是常用的荧光团。

本文描述的微小RNA(无论是通过表达载体还是通过非表达载体形式递送)被用于治疗安格曼综合征。安格曼综合征的症状可以包括但不限于智力残疾、言语缺乏、癫痫发作和特有的行为特征。安格曼综合征的行为特征包括快乐举止、容易引发大笑、注意力短暂、运动过度行为、咀嚼东西(mouthing of objects)、睡眠障碍和亲水。本文中的治疗方法可以包括提供前述症状中的一种或更多种的改善。

在某些方面中，可以在治疗之前对怀疑携带导致安格曼综合征的遗传缺陷的患者进行测试，以检测和确认这样的缺陷的存在。在一个实例中，可对患者进行测试以检测UBE3A基因的缺陷。分子遗传学测试(甲基化测试和UBE3A序列分析)能够鉴定出大约90％的个体的改变。

在已经确定与患者的安格曼综合征相关的异常活动的位置或疑似位置后，可以实施根据本公开内容的靶向治疗。确定脑或另外受影响的神经元组织中的异常活动的位置的方法是本领域熟知的。在实施方案中，可以靶向被确定为异常活动的起源部位的区域。

在一些实施方案中，本文公开的载体被直接施用至中枢神经系统，例如脑或脊髓。可以使用本领域已知的将载体直接施用至中枢神经系统的任何方法。载体可以被引入到脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、垂体、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体、大脑包括枕叶、颞叶、顶叶和额叶、皮质、基底神经节、海马体和杏仁核)、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。载体可以通过例如腰椎穿刺被递送到脑脊液中。此外，当施用通过静脉内进行时，可以对患者脑中的靶位置应用超声以增强靶位置处患者的血脑屏障的渗透性以便于摄取载体。应用超声以增强患者的血脑屏障的渗透性在序列号62/471,635中被公开，其内容以其整体并入本文。

用于向靶位置诸如脑直接施用材料的方法是熟知的。例如，可以在颅骨中钻孔，例如颅骨钻孔(Burr hole)，并且可以使用适当尺寸的针以将载体或非载体媒介物递送至靶位置。在实施方案中，颅骨的一部分可以被去除以使靶位置处或靶位置附近的硬脑膜物质暴露(开颅术)，并且载体或非载体媒介物可以被直接施用至靶位置。在实施方案中，载体或非载体媒介物使用立体定位(stereotaxic coordinate)、微量移液管和自动泵注射到颅内，以将载体或非载体媒介物精确递送至期望的区域，伴随对周围组织的损害最小。

在某些方面中，微量泵可以用于将包含含有微小RNA的载体或非载体媒介物的药物组合物递送至脑中的靶区域。组合物可以立即或经过延长的时间段例如经过1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟或更多分钟被递送。在载体递送至脑中的靶位置之后，可以允许经过足够量的时间以允许微小RNA在靶位置处表达。

在某些方面中，本文中的载体或非载体递送媒介物可以被全身施用。全身递送包括口服施用模式、含服施用模式、舌下施用模式、直肠施用模式、局部施用模式、鼻内施用模式、阴道施用模式和肠胃外施用模式。肠胃外施用模式的实例包括静脉内施用模式、腹膜内施用模式、肌内施用模式和皮下施用模式。在实施方案中，载体或非载体递送媒介物将循环直到它们接触CNS包括脑中的靶位置，在所述靶位置它们递送微小RNA或导致微小RNA被表达并且起作用以例如帮助网络形成和/或调节神经元信号传导网络。

微小RNA以有效针对患者中的安格曼综合征的量使用。活性成分的剂量取决于患者的年龄、体重和个体状况、个体药代动力学数据和施用模式。在人类个体具有约70kg的体重的情况下，微小RNA施用的每日剂量可以是从0.01mg/kg体重至100mg/kg体重，例如从0.1mg/kg体重至50mg/kg体重、从1mg/kg至20mg/kg体重，以单个剂量或以几个剂量施用。

在实施方案中，超声治疗通过破坏血脑屏障被用于增强微小RNA向脑中的靶位置的递送。本文中聚焦的超声能量的使用破坏BBB，而不会不利地影响载体、非载体递送媒介物、微小RNA和/或脑组织本身。本文中超声能量的使用可以增加载体、非载体递送媒介物和/或微小RNA向脑中的靶位置的递送速度，减少可能与载体、非载体递送媒介物和/或微小RNA向脑中的靶位置的递送相关的副作用，减少剂量的量，同时将载体、非载体递送媒介物和/或微小RNA集中在靶位置处，并且可以允许载体、非载体递送媒介物和/或微小RNA的量在靶位置处受控释放。用于通过颅骨递送超声能量的方法是本领域已知的。参见例如美国专利第5,752,515号和美国公布第2009/0005711号，其都在此通过引用以其各自的整体并入。还参见Hynynen等人,NeuroImage 24(2005)12-120。

根据本公开内容，微小RNA治疗提供了在施用至患者后持续多于1小时的安格曼综合征的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，微小RNA治疗提供了在施用至患者后持续多于2小时的该紊乱的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，微小RNA治疗提供了在施用至患者后持续多于3小时的该紊乱的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，微小RNA治疗提供了在施用至患者后持续多于4小时的该紊乱的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，微小RNA治疗提供了在施用至患者后持续多于6小时的该紊乱的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，微小RNA治疗提供了在施用至患者后持续多于8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时的该紊乱的一种或更多种症状的改善。在实施方案中，根据本公开内容，提供了在施用至患者后持续12小时的至少一种症状的改善。在实施方案中，微小RNA治疗提供了患者的次日功能的改善。例如，微小RNA可以提供在施用并从一夜睡眠中醒来后持续多于约例如2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时或24小时的该紊乱的一种或更多种症状的改善。

在实施方案中，本文描述的方法有效地降低、延迟或阻止安格曼综合征的一种或更多种其他临床症状。例如，可以将微小RNA治疗对患者中枢神经系统的靶位置(包括脑)的作用与未治疗的患者或治疗之前患者的情况进行比较。在实施方案中，测量患者在治疗之前的症状、药理学和/或生理学指标(indicator)，并且在治疗开始之后再次测量一次或更多次。在实施方案中，对照是参考水平或基于测量不患待治疗的疾病或病症的一个或更多个患者(例如，健康患者)中的症状、药理学或生理学指标确定的平均值。在实施方案中，将治疗之前脑组织中miR-145和/或miR-92a的量与治疗之后脑组织中miR-145和/或miR-92a的量进行比较。在实施方案中，将治疗的效果与本领域技术人员的视界(purview)范围内的常规治疗进行比较。

通过与基线相比在一定时间段后示出症状的频率或严重程度的降低(例如，超过10％、20％、30％、40％或50％)，可以确立对如本文公开的安格曼综合征的有效治疗。例如，在1个月的基线时间段之后，在2个月的双盲时间段期间，可以对具有微小RNA治疗的患者随机分配安慰剂作为标准疗法的附加疗法。主要结果测量值可以包括对微小RNA和对安慰剂的响应者的百分比，其被定义为在双盲时间段的第二个月期间已经经历了症状与基线相比至少10％至50％的降低。

在实施方案中，包含载体、非载体递送媒介物和/或微小RNA的药物组合物可以提供常规释放曲线或修改的释放曲线。药物组合物可以使用包含被认为是安全且有效的材料的药学上可接受的“运载体”来制备。“运载体”包括药物制剂中存在的除了活性物质或成分以外的所有组分。术语“运载体”包括但不限于稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、填充剂和包衣组合物。本领域技术人员熟悉这样的药物运载体以及使用这样的运载体复配(compounding)药物组合物的方法。

在实施方案中，包含载体、非载体递送媒介物和/或微小RNA的药物组合物适合于肠胃外施用，包括例如肌内(i.m.)、静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)或鞘内(i.t.)。肠胃外组合物必须是无菌的，用于通过注射、输注或植入到身体内施用，并且可以被包装在单剂量容器或多剂量容器中。在实施方案中，用于肠胃外施用至患者的液体药物组合物包含任何上文描述的相应的量的活性物质，例如载体、非载体递送媒介物和/或微小RNA。在实施方案中，用于肠胃外施用的药物组合物被配制为约例如0.1ml、0.25ml、0.5ml、0.75ml、1ml、1.25ml、1.5ml、1.75ml、2ml、2.25ml、2.5ml、2.75ml、3ml、3.25ml、3.5ml、3.75ml、4ml、4.25ml、4.5ml、4.75ml、5ml、10ml、20ml、25ml、50ml、100ml、200ml、250ml或500ml的总体积。在实施方案中，包含表达载体的药物组合物的体积是微升量。例如，可以注射0.1微升至10微升或更多微升。例如，0.1微升、0.2微升、0.3微升、0.4微升、0.5微升、0.6微升、0.7微升、0.8微升、0.9微升、1.0微升、1.25微升、1.5微升、1.75微升、2.0微升、2.25微升、2.5微升、2.75微升、3.0微升、3.25微升、3.5微升、3.75微升、4.0微升、4.25微升、4.5微升、4.75微升、5.0微升、5.25微升、5.5微升、5.75微升、6.0微升、6.25微升、6.5微升、6.75微升、7.0微升、8.25微升、8.5微升、8.75、9.0微升、9.25微升、9.5微升、9.75微升或10微升。在实施方案中，组合物被包含在微量移液管、袋、玻璃小瓶(vial)、塑料小瓶或瓶(bottle)中。

在实施方案中，用于肠胃外施用的药物组合物包含上文描述的相应的量。在实施方案中，用于肠胃外施用的药物组合物包含约0.0001mg至约500mg活性物质，例如载体、非载体递送媒介物和/或微小RNA。在实施方案中，用于肠胃外施用至患者的药物组合物包括处于约0.001mg/ml至约500mg/ml的相应浓度的活性物质，例如载体、非载体递送媒介物和/或微小RNA。在实施方案中，用于肠胃外施用的药物组合物包含处于例如，约0.005mg/ml至约50mg/ml、约0.01mg/ml至约50mg/ml、约0.1mg/ml至约10mg/ml、约0.05mg/ml至约25mg/ml、约0.05mg/ml至约10mg/ml、约0.05mg/ml至约5mg/ml或约0.05mg/ml至约1mg/ml的相应浓度的活性物质。在实施方案中，用于肠胃外施用的药物组合物包含处于例如，约0.05mg/ml至约15mg/ml、约0.5mg/ml至约10mg/ml、约0.25mg/ml至约5mg/ml、约0.5mg/ml至约7mg/ml、约1mg/ml至约10mg/ml、约5mg/ml至约10mg/ml或约5mg/ml至约15mg/ml的相应浓度的活性物质。

在实施方案中，提供了用于肠胃外施用的药物组合物，其中药物组合物稳定至少六个月。在实施方案中，用于肠胃外施用的药物组合物持续例如至少3个月或6个月表现出不超过约5％的活性物质的减少。在实施方案中，载体或非载体媒介物的量降解不超过约，例如2.5％、1％、0.5％或0.1％。在实施方案中，至少六个月的降解小于约例如5％、2.5％、1％、0.5％、0.25％、0.1％。

在实施方案中，提供了用于肠胃外施用的药物组合物，其中药物组合物保持可溶。在实施方案中，提供了用于肠胃外施用的药物组合物，该药物组合物是稳定的、可溶性的、局部部位相容的和/或可即用的(ready-to-use)。在实施方案中，本文中的药物组合物是可即用的，用于直接施用至有相应需要的患者。

本文提供的用于肠胃外施用的药物组合物可以包含一种或更多种赋形剂，例如溶剂、溶解度增强剂、悬浮剂、缓冲剂、等渗剂、稳定剂或抗微生物防腐剂。当使用时，肠胃外组合物的赋形剂将不会不利地影响组合物中使用的载体、非载体递送媒介物和/或微小RNA的稳定性、生物可利用度、安全性和/或效力。因此，提供了这样的肠胃外组合物，其中在剂型的任何组分之间不存在不相容性。

在实施方案中，包括载体、非载体递送媒介物和/或微小RNA的肠胃外组合物包含稳定量的至少一种赋形剂。例如，赋形剂可以选自由以下组成的组：缓冲剂、增溶剂、张度剂、抗氧化剂、螯合剂、抗微生物剂和防腐剂。本领域技术人员将理解，赋形剂可以具有多于一种功能，并且被分类到一个或更多个特定的组中。

在实施方案中，肠胃外组合物包含载体、非载体递送媒介物和/或微小RNA以及赋形剂，并且其中赋形剂以小于约，例如，10％、5％、2.5％、1％或0.5％的重量百分比(w/v)存在。在实施方案中，赋形剂以在约，例如，1.0％至10％、10％至25％、15％至35％、0.5％至5％、0.001％至1％、0.01％至1％、0.1％至1％或0.5％至1％之间的重量百分比存在。在实施方案中，赋形剂以在约，例如，0.001％至1％之间、0.01％至1％之间、1.0％至5％之间、10％至15％之间或1％至15％之间的重量百分比存在。

在实施方案中，肠胃外组合物可以根据需要例如每日一次、每日两次、每日三次、每日四次、每日五次、每日六次或更多次施用，或者取决于患者的需要连续施用。

在实施方案中，提供了活性物质的肠胃外组合物，其中组合物的pH在约4.0至约8.0之间。在实施方案中，组合物的pH在例如，约5.0至约8.0、约6.0至约8.0、约6.5至约8.0之间。在实施方案中，组合物的pH在例如，约6.5至约7.5、约7.0至约7.8、约7.2至约7.8或约7.3至约7.6之间。在实施方案中，水溶液的pH是，例如，约6.8、约7.0、约7.2、约7.4、约7.6、约7.7、约7.8、约8.0、约8.2、约8.4或约8.6。

除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术术语和科学术语都具有与本文中本公开内容所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。

如本文中所使用的术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于值如何被测量或确定，即测量系统的局限性。例如，按照本领域的实践，“约”可以意指在3个或多于3个标准偏差内。可选择地，“约”可以意指给定值的多达20％、多达10％、多达5％和/或多达1％的范围。可选择地，特别地，关于生物系统或过程，该术语可以意指在值的数量级内，优选地在值的5倍内，并且更优选地在值的2倍内。

“改善”指的是对安格曼综合征的治疗。

“次日功能的改善”或“其中存在次日功能的改善”指的是在从过夜睡眠时间段醒来后的改善，其中向患者施用微小RNA疗法的有益效果适于本文中的综合征或紊乱的至少一种症状，并且在醒来后一定时间段，例如2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时等被患者主观地或被观察者客观地可辨别的。

“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”可以指的是以下：减轻或延迟可能罹患或易患疾病或病症但尚未经历或显示疾病或病症的临床症状或亚临床症状的患者中该疾病或病症的临床症状的出现。在某些实施方案中，“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”可以指的是阻止可能罹患或易患疾病或病症但尚未经历或显示疾病或病症的临床症状或亚临床症状的患者中该疾病或病症的临床症状的出现。“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”还指的是抑制疾病或病症，例如，阻止或降低其发展或其至少一种临床症状或亚临床症状。“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”还指的是缓解疾病或病症，例如，引起疾病或病症或其至少一种临床症状或亚临床症状的消退。对待被治疗的患者的益处可以是在统计学上显著的、数学上显著的或者至少是患者和/或医师可感知的。尽管如此，预防性(prophylactic)(预防性(preventive))治疗和治疗性(therapeutic)(治愈性(curative))治疗是本文公开内容的两个独立的实施方案。

“药学上可接受的”指的是“通常被认为是安全的”分子实体和组合物，例如，其是生理学上可耐受的并且当被施用至人类时通常不产生过敏反应或类似的不良反应诸如胃部不适等。在实施方案中，该术语指的是被联邦或州政府的管理机构批准为GRAS列表(经历上市前审查并且根据联邦食品、药物和化妆品法案(Federal Food,Drug and CosmeticAct)的第204(s)和409节被FDA批准的)或类似列表(美国药典或另一种公认的用于在动物并且更特别地用于在人类中使用的药典)的分子实体和组合物。

“有效量”或“治疗有效量”可以意指足以减轻所治疗的综合征、紊乱、疾病或病症的一种或更多种症状或者以其他方式提供期望的药理学效果和/或生理学效果的剂量。“有效量”或“治疗有效量”可以在本文中可互换地使用。

“与......共施用(co-administered with)”、“与......组合施用(administeredin combination with)”、“......的组合(a combination of)”或“与......一起施用(administered along with)”可以可互换地使用，并且意指在疗法的过程中施用两种或更多种剂。这些剂可以同时一起施用或以间隔开的时间间隔分开施用。这些剂可以以单一剂型或以单独的剂型被施用。

“有相应需要的患者”可以包括已经被诊断为患有安格曼综合征的个体，例如哺乳动物诸如人类、犬科、猫科、猪类、啮齿动物等，所述方法可以被提供至任何个体，包括例如其中患者是新生儿、婴儿、儿科患者(6个月至12岁)、青少年患者(年龄12-18岁)或成人(超过18岁)。患者包括哺乳动物。这样的患者包括，例如，被诊断为患有Ube3a基因的遗传缺陷的患者。

“前药(prodrug)”指的是以无活性(或活性显著较少)形式被施用至受试者的药理学物质(药物)。一旦被施用，前药在身体内(体内)被代谢为具有期望的药理学活性的化合物。

“类似物”和“衍生物”可以互换地使用，并且指的是与母体化合物具有相同核但可以在键级(bond order)、一个或更多个原子和/或原子基团的不存在或存在、及其组合方面与母体化合物不同的化合物。对映异构体是衍生物的实例。衍生物可以例如，在核上存在的一个或更多个取代基方面与母体化合物不同，其可以包括一个或更多个原子、官能团或亚结构。通常，可以设想衍生物至少在理论上经由化学过程和/或物理过程由母体化合物形成。

如本文中所使用的术语“药学上可接受的盐”指的是本文定义的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸式盐或碱式盐来改性。药学上可接受的盐的实例包括但不限于与无机碱的无毒碱加成盐。合适的无机碱诸如碱金属碱和碱土金属碱包括金属阳离子，诸如钠、钾、镁、钙等。药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由母体化合物合成。

应当理解，本文提供的实施例和实施方案是示例性的示例实施方案。本领域技术人员将设想与本文公开的内容的范围一致的实施例和实施方案的多种修改。这样的修改意图被权利要求书涵盖。

序列表

<110> 奥维德医疗公司

马修·杜林

<120> MIR-92A或MIR-145在治疗安格曼综合征中的用途

<130> 2262-63 PCT

<150> US 62/684,774

<151> 2018-06-14

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 微小RNA-92a-3p

<400> 1

uauugcacuu gucccggccu gu 22

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的: 微小RNA-145-5p

<400> 2

guccaguuuu cccaggaauc ccu 23