调节免疫应答

技术领域

本公开涉及调节免疫应答的方法和组合物、治疗或预防疾病如自身免疫性和炎性疾病和癌症的方法，以及增强对抗原的免疫应答的方法和治疗传染性疾病的方法。

背景

炎症是血管组织对有害刺激物如病原体、受损细胞或刺激剂的复杂生物学反应的部分。炎症是生物消除有害刺激及启动组织愈合过程的保护性尝试。无炎症情况下，伤口和感染将永不痊愈。类似地，组织的渐进性破坏将损害生物的存活。然而，慢性炎症也可能导致宿主很多疾病，如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和甚至癌症。

自身免疫疾病是免疫系统错误地攻击并摧毁健康身体组织时发生的病状。存在超过80 种不同类型的自体免疫疾病。在自身免疫疾病患者中，系统对正常情况下它将会忽略的正常身体组织做出反应。

癌症免疫疗法涵盖种类各异的治疗方案，包括被动施用肿瘤特异性单克隆抗体和其他免疫系统组分、激发或增进特异性T细胞介导针对肿瘤细胞的免疫应答的主动免疫、过继转移离体修饰的T细胞和用免疫调节剂非特异性增强免疫应答性。免疫疗法已经对管理类型广泛的癌症产生明显影响，然而，癌症免疫疗法领域是复杂的并且正快速演进。免疫疗法与常规化疗在其作用机制以及产生的反应类型方面不同，并且许多主动免疫疗法并入多种组件(例如抗原、佐剂和递送载具)。

日益地认识到，稳健的治疗活性要求免疫接种与旨在增强总体免疫应答性并克服肿瘤借以促进耐受性环境的免疫抑制机制的其他免疫调节策略组合。

因此，仍需要在治疗自身免疫性疾病与炎性疾病和癌症时以及免疫接种期间调节患者免疫应答的方法。

发明概述

发明人研究了免疫细胞中天然杀伤细胞颗粒蛋白7(NKG7)的表达并且已经确定NKG7 表达的丧失导致促炎细胞因子的血浓度降低和抗炎细胞因子升高。

因此，在一个方面，本公开提供一种调节受试者中免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用调节NKG7活性的化合物。

在一些实施方案中，化合物抑制NKG7活性。

在一个实施方案中，化合物是结合NKG7并抑制NKG7活性的抗体。

在一些实施方案中，化合物增加NKG7活性。

在一个实施方案中，化合物是结合NKG7并增加NKG7活性的抗体。

在一些实施方案中，化合物是NKG7多肽或其片段。

在一些实施方案中，调节NKG7活性的抗体结合NKG7的胞外环1或胞外环2。在一个具体实施方案中，抗体结合了包含SEQ ID NO:11、12、13或14中一个或多个氨基酸的表位。

在另一个方面，本公开提供一种通过调节受试者细胞中的NKG7表达，在受试者中调节免疫应答和/或治疗或预防自身免疫疾病或炎性病症的方法，所述方法包括编辑NKG7基因或编码NKG7基因的NKG7调节元件的其他DNA序列，从而导致调节受试者细胞中NKG7 基因的表达或功能。

在一个实施方案中，将该方法对获自受试者的细胞离体进行，其中编辑包括向细胞引入一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶，旨在NKG7基因或编码NKG7基因的调节元件的其他DNA序列内部或其附近实现一个或多个单链断口(SSBs)或双链断口(DSBs)，导致其内部或附近永久性缺失、插入、纠正或调节一个或多个突变或外显子的表达或功能或影响 NKG7基因或编码NKG7基因的调节元件的其他DNA序列的表达或功能，并且该方法包括向受试者返回细胞。

在另一个实施方案中，将方法在体内进行并且通过将基因编辑系统体内递送至受试者，进行编辑。

在一些实施方案中，基因编辑系统是CRISPR/Cas9基因编辑系统。

在另一个方面，本公开提供一种治疗或预防受试者中自身免疫疾病或炎性病症的方法，所述方法包括向受试者施用抑制NKG7活性的化合物。

在一些实施方案中，自身免疫疾病或炎性病症选自移植物抗宿主病(GVHD)、类风湿性关节炎、炎性肠病(IBD)、狼疮、神经炎症、多发性硬化、阿尔茨海默病、帕金森病和全身性炎症反应综合征(SIRS)。

在一个实施方案中，自身免疫疾病或炎性病症是类风湿性关节炎。

在另一个实施方案中，自身免疫疾病或炎性病症是炎性肠病(IBD)。

在一个实施方案中，炎性肠病是克罗恩氏病。

在另一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎。

在另一个方面，本公开提供一种接受同种异体移植物的移植物接受者中移植物抗宿主病风险(GVHD)的方法，所述方法包括向移植物接受者施用抑制NKG7活性的化合物。

在一些实施方案中，在接受同种异体移植物之前向移植物接受者施用抑制NKG7活性的化合物。

在一些实施方案中，在接受同种异体移植物之时或之后向移植物接受者施用抑制NKG7 活性的化合物。

在一个实施方案中，化合物是结合NKG7并抑制NKG7活性的抗体。

在另一个方面，本公开提供一种治疗受试者中癌症的方法，所述方法包括向受试者施用增加受试者中NKG7活性的化合物。

在一些实施方案中，化合物是结合NKG7并增加NKG7活性的抗体。

在一些实施方案中，受试者经癌症免疫疗法治疗。

在一些实施方案中，癌症免疫疗法选自免疫检查点抑制蛋白疗法和抗体疗法。

在一个方面，本公开提供一种增强受试者中对疫苗抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用

i)增加NKG7活性的化合物，和

ii)疫苗抗原。

在一些实施方案中，NKG7包含与SEQ ID NOs:1、3、5、7或9中任一者至少90％相同的氨基酸序列并且具有NKG7活性。

在一些实施方案中，NKG7由核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下与包含选自 SEQ ID NOs:2、4、6、8或10中任一者的序列的核酸杂交。

在一些实施方案中，NKG7由选自SEQ ID NOs:1、3、5、7或9中任一者并且具有一个或几个氨基酸置换、或缺失或添加的序列组成。

在一个方面，本公开提供一种治疗或预防自身免疫疾病或炎性病症的药物组合物，所述药物组合物包含抑制NKG7活性的化合物和可药用载体。

在另一个方面，本公开提供一种治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含增加 NKG7活性的化合物和可药用载体。

在另一个方面，本公开提供了抑制NKG7活性的化合物在制造治疗自身免疫疾病或炎性病症的药物中的用途。

在另一个方面，本公开提供了增加NKG7活性的化合物在制造治疗癌症的药物中的用途在另一个方面，本公开提供了包含增加NKG7活性的化合物的免疫原性组合物。

在整个这份说明书范围内，词“包含”，或变体如“包括”或“含有”，将理解为意指含所述的要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤群组，但是不排斥任何其要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤群组。

序列表要素

SEQ ID NO:1–NKG7多肽的氨基酸序列

SEQ ID NO:2–NKG7核酸编码序列

SEQ ID NO:3–NKG7多肽同工型1的氨基酸序列

SEQ ID NO:4–NKG7同工型1的核酸编码序列

SEQ ID NO:5–NKG7多肽变体的氨基酸序列

SEQ ID NO:6–NKG7多肽变体的核酸编码序列

SEQ ID NO:7–鼠NKG7多肽的氨基酸序列

SEQ ID NO:8–鼠NKG7多肽的核酸编码序列

SEQ ID NO:9–鼠NKG7多肽变体的氨基酸序列

SEQ ID NO:10–鼠NKG7多肽变体的核酸编码序列

SEQ ID NO:11–胞外环1的预测氨基酸序列

SEQ ID NO:12–胞外环2的预测氨基酸序列

SEQ ID NO:13–鼠胞外环1的预测氨基酸序列

SEQ ID NO:14–鼠胞外环2的预测氨基酸序列

附图简述

图1.来自初始和杜氏利什曼原虫(L.donovani)感染的C57BL/6小鼠肝脏(正在消退的感染，急性部位)和脾脏(慢性感染部位)和来自感染期间和治疗后内脏利什曼病(VL)患者中外周血单核细胞(PBMCs)的CD4

图2.瀑布图显示慢性特征标识中上调的基因(从小鼠脾脏和人外周血单核细胞(PBMCs) 分离的CD4+ T细胞之间共同的差异性表达的基因)(A)。NKG7是从小鼠脾脏分离的CD4

图3.来自癌症基因组图集(TCGA)的数据显示来自多种癌症的肿瘤内部、最特别地来自肾脏肾透明细胞癌(KIRC)和胶质母细胞瘤(GBM)的NKG7差异性表达(A；改编自http://firebrowse.org/)。尽管表达数据获自肿瘤活检样品，但NKG7上引起癌症风险的突变位点的证据稀少(B；改编自http://www.cbioportal.org/output)。来自皮肤的皮肤黑素瘤队列 (TGCA：SKCM)的患者划分成高NKG7表达者(最高四分位数)和低NKG7表达者(最低四分位数)揭示高NKG7表达组中存活概率明显增加(C；阴影面积表示置信区间)。

图4.生成小鼠模型B6.Nkg7-cre(A)，并且与B6.membrane tdTomato/membraneGFP (mT/mG)杂交，以产生报道小鼠Nkg7-cre x mT/mG(B)。在初始状态的天然杀伤细胞上显示了表达Cre的(+)小鼠中依据替代标志物GFP确定的Nkg7表达。

图5.B6N.Nkg7-KO小鼠为杜氏利什曼原虫感染。感染后(p.i.)第14天，对Nkg7缺陷性的影响定量。与C57BL/6N(野生型)小鼠相比，有Nkg7缺陷的小鼠显示更小的脾脏重量和肝脏重量(A)。与野生型小鼠相比，Nkg7-缺陷型小鼠中的寄生虫负担明显升高(B)。还发现与野生型小鼠相比，Nkg7-缺陷型小鼠血清中促炎细胞因子干扰素(IFN)γ、肿瘤坏死因子(TNF) 和IL-6的水平更低(C)。

图6.已经报道NKG7含有4个跨膜区，通过跨膜预测程序TMpred(https://embnet.vital- it.ch/software/TMPRED_form.html)对人蛋白(A)和小鼠蛋白(B)进行确认。预测的NKG7蛋白模型揭示在人和小鼠NKG7二者中均存在的两个胞外环，经箭头标识(C)。

图7.来自C57BL/6N(B6N；野生型)和B6N.Nkg7-/-小鼠的脾单核细胞经纯化的单克隆抗小鼠(α)-CD3+α-CD28+重组(r)IL-2(Th0状况)、脂多糖(LPS)或ODN 1826(CpG)刺激24小时。通过细胞计数珠阵列(CBA)在采集自LPS孔和CpG孔的上清液中检出较高水平的抗炎细胞因子白介素(IL)-10。n＝3(三次重复)。使用两因素方差分析(ANOVA)连同Sidak’s多重比较检验，确定统计显著性。**和***分别表示<0.01和0.001的p值。

图8.线图显示在杜氏利什曼原虫感染期间所示时间点处每个细胞亚群内部表达GFP的细胞的比例变化。使用Kruskal-Wallis检验连同Dunn’s多重比较检验，确定统计显著性。* 表示p值并且误差线代表均数±均数标准误(SEM)。

图9.野生型(WT；C57BL/6N)小鼠和Nkg7缺陷型(B6N.Nkg7

图10.野生型(WT；C57BL/6N)小鼠或Nkg7-缺陷型(B6N.Nkg7

图11.对野生型(WT；C57BL/6N)小鼠或Nkg7-缺陷型(B6N.Nkg7

图12.野生型(WT；C57BL/6N)或Nkg7缺陷型(B6N.Nkg7-/-)小鼠为表达萤光素酶的伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)ANKA(PbA)感染。与WT小鼠相比，Nkg7-缺陷型小鼠显示寄生的红细胞(pRBC)的水平升高(A)。对Nkg7-缺陷型小鼠记录到比WT小鼠低的实验性脑型疟疾(ECM)评分(B)。WT小鼠感染后第7天和第8天之间死于感染在，而Nkg7-缺陷型小鼠存活直至感染后第14天(C)。生物发光成像显示与Nkg7-缺陷型小鼠相比，WT小鼠的全身(D) 和脑(E)中生物发光增加和因此寄生虫负担增加。使用两因素方差分析(ANOVA)连同Sidak’s多重比较试验(A)、对数秩(Mantel–Cox)检验(C)或Mann–Whitney检验(D和E)，进行统计检验。指示p值，其中*表示p<0.05并且***表示p<0.001。误差线代表均数±均数标准误(SEM)。N＝每组5只小鼠。

发明详述

除非另外具体限定，否则本文所用的全部技术术语和科学术语应当理解为具有如本领域 (例如，免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学、细胞生物学、生物化学和化学领域内)普通技术人员通常理解的相同意思。

除非另外说明，否则本公开中利用的重组蛋白技术、细胞培养技术和免疫技术是本领域技术人员已知的标准方法，如以下文献中描述的那些：J.Perbal,A PracticalGuide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)；J.Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbour Laboratory Press(2001)；T.A.Brown(编者), Essential Molecular Biology:A Practical Approach,第1和第2卷,IRL Press(1991)；D.M. Glover和B.D.Hames(编者),DNA Cloning:A PracticalApproach,第1-4卷,IRL Press(1995年和1996年),和F.M.Ausubel等人(编者),CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988,包括至今的更新),Ed Harlow和David Lane(编者) Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988),和J.E.Coligan等人 (编者)CurrentProtocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括至今的更新)。

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应当理解为意指“X和Y”或“X或Y”并且应当视作为两种意思或任一种意思提供明确支持。

如本文所用，术语“疾病或病状”指对正常功能的破坏或干扰，并且不意在限于任何具体的病状、疾病或病症。

如本文所用，术语“治疗”以及其各种词性形式(“treating”,“treat”或“treatment”)包括施用本文所述的化合物或分子以减少、阻止或消除疾病或病状的至少一个症状。

如本文所用，术语“预防”以及其各种词性形式(“preventing”,“prevent”或“prevention”) 包括施用治疗有效量的化合物或分子，其足以制止或阻碍疾病或病状的至少一个症状发展。

如本文所用，术语“受试者”应当意指任何动物，包括人，例如哺乳动物。示例性受试者包括但不限于人、小鼠和大鼠。在一个实例中，受试者是人。在另一个实例中，受试者是小鼠。

如本文所用的“施用”意在广义地解释并且包括向受试者施用如本文所述的化合物或分子以及向细胞提供如本文所述的化合物或分子。

活化的天然杀伤(NK)细胞和T细胞共有许多溶细胞性组分和表面抗原。通过差别和扣减性杂交策略的组合，Turman等人(1993)分离了编码NKG7的cDNA(OMIM条目606008)。推导的148个氨基酸I型整合跨膜蛋白具有一个信号序列、一个带多个T细胞表位但无N-糖基化位点或半胱氨酸残基的38个残基的外部结构域和一个带几个磷酸化位点的64个氨基酸的胞质结构域。

a迄今，未充分描述NKG7在蛋白质水平的表达。这主要归因于试剂(包括单克隆抗体和小鼠模型)稀缺。因此，在理解NKG7的功能、奠定其功能的分子机制和与之实际相互作用的其他分子方面存在缺口。在本公开中，现在已经展示NKG7是促炎和抗炎细胞因子的调节物。因此，对NKG7活性的调节可以用于其中想要增加免疫应答的治疗性应用中，例如用于癌症免疫疗法和诱导针对免疫原的免疫应答，以及用于抗炎疗法中，如用于治疗和预防自身免疫疾病、炎性病况和移植物抗宿主病。

SEQ ID NO:1、3和5中提供人NKG7氨基酸序列的实例，并且SEQ ID NO:2、4和6 中提供其核酸编码序列。SEQ ID No:7、8、9和10中提供鼠NKG7氨基酸序列和核酸序列的实例。

在一些实施方案中，NKG7可以包含与SEQ ID No:1、3、5、7或9中任一者至少80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，NKG7可以包含与SEQ ID Nos:1、3、5、7或9中任一者至少85％、或至少86％、87％、88％、或89％、或至少90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，NKG7由核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下与包含SEQID Nos:2、4、6、8或10中任一者的核酸杂交。

在一些实施方案中，NKG7由选自SEQ ID Nos:1、3、5、7和9中任一者并且具有一个或几个氨基酸置换、或缺失或添加的序列组成。

如本文所用，‘NKG7活性’指NKG7调节促炎和/或抗炎细胞因子产生的能力。特别地， NKG7活性指NKG7诱导或上调促炎细胞因子(如干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子(TNFα)和 IL-6)在受试者中表达的能力，和/或NKG7抑制或减少抗炎细胞因子表达的能力。

因此，术语‘调节NKG7活性’指增加或抑制NKG7诱导促炎细胞因子表达和/或调节抗炎细胞因子表达的能力，这取决于所需的治疗结果。在一些实施方案中，可以用直接结合于 NKG7的化合物(例如，结合NKG7并调节NKG7活性的抗体)实现调节NKG7活性。在一些实施方案中，通过使用调节NKG7表达的化合物(例如，如siRNA分子)实现调节NKG7活性，因调节NKG7表达，所述化合物还调节NKG7活性(例如，在一些实施方案中，减少NKG7 表达导致受试者中NKG7活性降低)。

可以使用本领域已知的任何合适的手段确定NKG7表达和/或活性水平。例如，可以使用与NKG7结合的抗体，通过免疫测定法确定NKG7的表达和/或活性水平。备选地或额外地，可以通过本领域已知的核酸检测方法确定NKG7的表达和/或活性水平。在一些实施方案中，通过测量来自受试者的样品中(例如，如来自受试者的血液样品中)促炎细胞因子和/或抗炎细胞因子的水平，确定NKG7活性。例如，可以通过测量促炎细胞因子(如IL-6、 INF-γ和TNFα)水平，和/或测量抗炎细胞因子(如IL-10、IL-4或IL-13)水平，确定NKG7活性。

如本文所用的术语‘增加NKG7活性’指化合物能够上调NKG7表达或活性，因此导致促炎细胞因子增加和/或抗炎细胞因子减少的用途。例如，在一些实施方案中，增加NKG7 活性的化合物可以是结合NKG7的小分子、NKG7配体或激动剂抗体。在一些实施方案中，增加NKG7活性的化合物可以是具有NKG7活性的NKG7多肽或其片段。

如本文所用的术语‘抑制NKG7活性’指化合物能够减少或下调NKG7表达或活性，因此导致促炎细胞因子减少和/或抗炎细胞因子增加的用途。例如，在一些实施方案中，抑制NKG7活性的化合物可以是结合NKG7的小分子、NKG7配体或抗体。在一些实施方案中，能够抑制NKG7活性的化合物可以是抑制或下调NKG7表达的核酸分子。例如，核酸分子可以是siRNA、双链RNA、反义核酸或miRNA。

如通过本公开构思，“化合物”可以采取多种形式的任一者，包括天然化合物、化学小分子化合物或生物化合物或大分子。示例性化合物包括抗体或抗体的抗原结合片段、核酸、多肽、肽和小分子。

术语“蛋白质”应当理解为包括单一多肽链，即，一系列由肽键连接的连续氨基酸或一系列彼此共价或非共价连接的多肽链(即，多肽复合体)。例如，可以使用合适的化学键或二硫键，共价连接多肽链系列。非共价键的实例包括氢键、离子键、范德瓦尔斯力和疏水相互作用。

术语“多肽”或“多肽链”将从前述段落中理解为意指一系列由肽键连接的连续氨基酸。

技术人员将知晓，“抗体”通常被视为一种包含由多条多肽链(例如，包含VL的多肽和包含VH的多肽)组成的可变区的蛋白质。抗体通常还包含恒定结构域，所述恒定结构域中的某些可以排列成恒定区，所述恒定区在重链情况下包含恒定片段或可结晶片段(Fc)。VH和VL相互作用以形成包含抗原结合区的Fv，所述抗原结合区能够与一种或一些密切相关的抗原特异性结合。通常，来自哺乳动物的轻链是κ轻链或λ轻链并且来自哺乳动物的重链是α、δ、ε、γ或μ。抗体可以例如属于任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。术语“抗体”还涵盖人源化抗体、灵长类化抗体、人抗体和嵌合抗体。

如本文所用，术语“Fv”应当意指任何蛋白质，无论是否包含多个多肽或单一多肽，其中VL和VH缔合以形成具有抗原结合位点(即，能够与抗原特异性结合)的复合体。形成抗原结合位点的VH和VL可以在单一多肽链中或在不同的多肽链中形成。另外，本公开的 Fv(以及本公开的任何蛋白质)可以具有多个可以结合或可以不结合相同抗原的抗原结合位点。这个术语应当理解为涵盖直接衍生自抗体的片段以及使用重组手段产生的与这种片段相对应的蛋白质。在一些实例中，VH不与重链恒定结构域(CH)1连接和/或VL不与轻链恒定结构域(CL)连接。含有Fv的示例性多肽或蛋白质包括Fab片段、Fab’片段、F(ab’)片段、scFv、双体抗体(diabody)、三体抗体、四体抗体或高阶复合体，或与其恒定区或恒定结构域(例如， CH2或CH3结构域)连接的前述任一者，例如，迷你抗体。“Fab片段”由免疫球蛋白的单价抗原结合片段组成，并且可以通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体来产生，以产生由完整轻链和重链的部分组成的片段，或可以使用重组手段产生。抗体的“Fab'片段”可以通过以下方式获得：用胃蛋白酶处理完整抗体，随后还原，以产生由完整轻链和包含VH和单个恒定结构域的重链的一部分组成的分子。以这种方式处理的每个抗体获得两个Fab'片段。也可以通过重组手段产生Fab’片段。抗体的“F(ab')

“Fab

如本文所用，提到化合物或其抗原结合位点与抗原相互作用时，术语“结合”意指这种相互作用依赖于抗原上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在。

如本文所用，术语“特异性结合”或“特异地结合”应当意指，本公开的化合物与特定抗原或表达该抗原的细胞比它与备选性抗原或细胞更频繁、更快速、持续时间更长地和/或以更大亲和力反应或缔合。例如，化合物以相比它与其他细胞因子受体结合或与多反应性天然抗体(即，已知结合人类中天然存在的多种抗原的天然存在抗体)共同识别的抗原结合实质上更大(例如，20倍或40倍或60倍或80倍至100倍或150倍或200倍)的亲和力与NKG7结合。

在一些实施方案中，结合NKG7的抗体可以是多特异性抗体，如双特异性抗体，例如，其包含两种不同抗体的两个不同片段，从而双特异性抗体结合两个类型的抗原。例如，双特异性抗体可以包含结合NKG7的片段和与第二抗原结合的第二片段。第二抗原可以例如是免疫细胞的标志物，例如在NK细胞上的CD56，或对CD4

结合NKG7的抗体是市售的。例如，多克隆抗NKG7抗体是可获得的(HPA071454；Sigma Aldrich)，并且单克隆结合NKG7的抗体也是市售的(抗TIA-1(抗NKG-7)；IM2550；Beckman Coulter)。

本领域熟知用于生成和分离与指定抗原结合的抗体的方法。

术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是这样的蛋白质或多肽，其中依据其衍生起源或来源，所述蛋白质或多肽不与其天然状态下伴随它的天然相关组分结合；基本上不含来自相同来源的其他蛋白质。可以使用本领域已知的蛋白质纯化技术，通过分离，使蛋白质基本上不含天然相关组分或基本上是纯化的。通过“基本上纯化的”意指蛋白质基本上不含污染物质，例如，至少约70％或75％或80％或85％或90％或95％或96％或97％或98％或99％不含污染物质。

术语“重组”应当理解为意指人工遗传重组的产物。因此，在重组蛋白包含抗体抗原结合结构域的语境下，这个术语不涵盖在受试者身体内部天然存在的抗体，所述抗体是B细胞成熟期间发生的天然重组的产物。然而，如果分离了这种抗体，则应将它视为包含抗体抗原结合结构域的分离的蛋白质。类似地，如果分离并使用重组手段表达编码该蛋白质的核酸，则所得的蛋白质是包含抗体抗原结合结构域的重组蛋白。重组蛋白还涵盖当某蛋白质处于例如其中表达它的细胞、组织或受试者内部时，通过人工重组手段表达的该蛋白质。

如本文所用，术语“抗原结合位点”应当意指由能够与抗原结合或特异性结合的蛋白质形成的结构。抗原结合位点不必要是一系列连续氨基酸，或甚至不必要是单一多肽链中的氨基酸。例如，在产生自两条不同多肽链的Fv中，抗原结合位点由VL和VH的一系列氨基酸组成，所述氨基酸与抗原相互作用并且通常在每个可变区的一个或多个CDR中，然而并非总是如此。在一些实例中，抗原结合位点是VH或VL或Fv。

如本文所用，术语“表位”(同义词“抗原决定簇”)应当是理解为意指NKG7的与包含抗体的抗原结合位点的蛋白质结合的区域。这个术语不必然地限于蛋白质与其接触的具体残基或结构。例如，这个术语包括跨越蛋白质接触的氨基酸的区域和/或这个区域外部的5-10个或2-5个或1-3个氨基酸。在一些实例中，表位包含当NKG7折叠时彼此紧密定位的一系列不连续氨基酸，即，“构象表位”。技术人员还将知晓，术语“表位”不限于肽或多肽。例如，术语“表位”包括分子的化学活跃表面集合(surface grouping)，如糖侧链、磷酰基侧链或磺酰侧链，并且在某些例子中，可以具有特定的三维结构性特征，和/或特定的电荷特征。

在本公开的一些实施方案中，如本文所述的治疗和/或预防方法涉及减少NKG7表达。例如，这种方法可以涉及施用减少编码NKG7的核酸转录和/或翻译的化合物。在一个实例中，抑制NKG7活性的化合物是核酸，例如，反义多核苷酸、核酶、PNA、干扰性RNA、 siRNA或微RNA。

RNA干扰(RNAi)可用于特异性抑制特定的蛋白质产生。不受理论限制，这项技术依赖于含有以下序列的dsRNA分子的存在，所述序列实质上与目的基因的mRNA或其部份(在这种情况下编码NKG7的mRNA)相同。便利地，dsRNA可以在重组载体宿主细胞中从单个启动子产生，其中有义序列和反义序列旁侧有不相关的序列，所述的不相关序列使得有义序列和反义序列杂交以形成dsRNA分子成为可能，不相关的序列形成环结构，如短发夹RNA(shRNA)。设计和产生对本公开合适的dsRNA分子完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其考虑WO99/32619、WO99/53050、WO99/49029和WO01/34815时如此。用于RNAi的这类dsRNA分子包括但不限于短发夹RNA(shRNA)和双功能shRNA。

示例性小干扰性RNA(“siRNA”)分子包含与靶mRNA的约19-21个连续核苷酸相同的核苷酸序列。例如，siRNA序列始于双核苷酸AA，包含约30-70％(例如，30-60％、如 40-60％例如约45％-55％)的GC-含量，并且对除了待引入它的哺乳动物的基因组中的靶之外的任何核苷酸序列没有高同一性百分数，例如如通过标准BLAST检索所确定。

术语“反义核酸”应当意指与编码本公开的任何实例中如本文所述多肽的特定mRNA 分子的至少一部分互补并且能够干扰转录后事件(如mRNA翻译)的DNA或RNA或其衍生物(例如，LNA或PNA)，或其组合。本领域已知反义方法的用途(参见例如，Hartmann和Endres(编者),Manual of Antisense Methodology,Kluwer(1999))。

本公开的反义核酸将在生理条件下与靶核酸杂交。反义核酸包含与实现控制基因表达或剪接的结构基因或编码区或序列对应的序列。例如，反义核酸可以对应于编码NKG7、或5' 非翻译区(UTR)或3’-UTR或其组合的核酸的靶向的编码区。它可以部分地互补于内含子序列，后者可以在转录期间或之后被剪接掉，例如仅剪接至靶基因的外显子序列。反义序列的长度应当是编码NKG7的核酸的至少19个连续核苷酸，例如，至少50个核苷酸，如至少100、200、500或1000个核苷酸。可以使用与完整基因转录物互补的全长序列。反义序列对靶向的转录物的同一性程度应当是至少90％，例如，95-100％。

在另一个实例中，化合物可以是核酸适配体(可适配的寡聚物)。适配体是能够形成二级结构和/或三级结构的单链寡核苷酸或寡核苷酸类似物，所述结构提供与特定靶分子(如蛋白质或小分子，例如，NKG7)结合的能力。因此，适配体视为抗体的寡核苷酸类似物。通常而言，适配体包含约15至约100个核苷酸，如约15至约40个核苷酸，例如约20至约40个核苷酸，原因是可以通过常规技术制备落在这些长度范围内的寡个核苷酸。

适配体可以从适配体文库分离或鉴定。例如，通过将随机寡核苷酸克隆入载体(或在 RNA适配体情况下，表达载体)产生适配体文库，其中随机序列旁侧有提供PCR引物结合位点的已知序列。选择提供所需生物学活性(例如，与NKG7特异性结合)的适配体。例如，使用SELEX(指数富集的配体系统进化)，选择活性增加的适配体。例如Elloington和Szostak,Nature 346:818–22,1990；US 5270163；和/或US 5475096中描述了产生和/或筛查适配体文库的适合方法。

在一些实施方案中，基因编辑系统可以用来调节NKG7的活性。在一个实例中，成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关9(Cas9)酶可以用于称作CRIPR/Cas9的技术，以编辑独立细胞和完整生物内部的基因(Zhang等人,2014)。这项技术可以用来从人或动物种系DNA删除NKG7(Hultquist等人,2016)。备选地，CRISPR/Cas9可以用来修饰NKG7基因或相关DNA的调节区，以增强或限制基因转录，并因此增强或限制蛋白质表达(Ledford,2015)。类似地，无活性形式的Cas9可以配合CRISPR使用，以避免切割DNA，反而与靶基因或靶RNA结合以沉默诸基因(Dominguez,2016)。本领域普通技术人员还可能利用如本领域已知修饰NKG7活性的其他基因系统或技术。这类系统和技术包括基于核酸酶的平台，包括锌指核酸酶、转录激活物样效应核酸酶(TALENs)和大范围核酸酶(meganucleases)。

在一些实施方案中，可以在体外细胞中使用基因编辑系统调节NKG7的活性或表达。

在其他实施方案中，可能想要进行在已经从受试者获得的细胞中调节NKG7活性或表达的离体方法。随后可以将这些修饰的细胞返回患者，以通过调节受试者中NKG7的活性或表达，用于治疗活性。

在另一个实施方案中，本领域技术人员可以使用向受试者施用以体内修饰受试者中 NKG7活性或表达的基因编辑系统。本领域已知的递送基因编辑系统技术包括包装样式如基于病毒包装、mRNA、质粒和蛋白质的方案。

根据本公开，本领域技术人员将能够实施筛选分析法，以鉴定与NKG7结合和/或调节其活性的抗体和分子，包括本文在实施例部分中所述的测定法。例如，技术人员可以根据实施例1中描述的方法，在供试化合物存在下进行T细胞活化测定法。因此，该测定法可以涉及用刺激物如CPG或LPS活化小鼠或人T细胞、小鼠脾脏细胞或人PBMC的纯化群体并且检测细胞因子产生的增加或抑制。如本领域理解，T细胞激活测定法可以利用诸如有限稀释培养、ELISPOT、细胞因子捕获和生物传感器测定法以及市售T细胞活化测定法等技术。其他测定法可以基于检测APC向T细胞呈递抗原的能力改变，或T辅助细胞产生细胞因子和/ 或调节其他免疫细胞(如B细胞、细胞毒T细胞或抗原呈递细胞)活性的能力。

本文中公开了治疗方法，其中抑制或减少促炎细胞因子表达和/或增加抗炎细胞因子在治疗上有益，如在自身免疫性、炎症、过敏性疾病、败血症、GVHD中或在其他疾病状况的缓解炎性副作用时是治疗上有益的。因此，在一些实施方案中，可以向受试者施用抑制NKG7活性的化合物，以治疗或预防自身免疫疾病和/或炎性病症。

如本文所用的“自身免疫性”或“自身免疫疾病或病况”广义地指源自并且针对个体自身组织或者共分离的疾病或病症或其表现或从其中所致的病状并且包括。这里，自身免疫病症包括炎性或过敏性病况，例如，以可能与组织破坏相关的宿主对抗自我抗原的免疫反应为特征的慢性病，如类风湿性关节炎。

在一些实施方案中，自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、I型糖尿病、多发性硬化、Hashinoto甲状腺炎、系统性红斑狼疮、胃炎、自身免疫性肝炎、溶血性贫血、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性眼色素层视网膜炎、肾小球肾炎、Guillain-Barre综合征、银屑病、脱发和重症肌无力。

本文中互换使用的“炎性疾病”、“炎性病症”和/或“炎症”广义地指慢性或急性炎性疾病，并且明确地包括炎性自身免疫性疾病和炎性过敏性疾病。这些病症以举例方式包括以针对有害刺激物(如病原体、受损细胞或刺激剂)的免疫应答失调为特征的炎性异常。炎性疾病是种类庞大的人类疾病之基础。具有炎症过程方面病因学起源的疾病包括癌症、动脉粥样硬化、神经炎症和局部缺血性心脏病。与炎症相关的病症实例包括：慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏性、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、结节病、血管炎、间质性膀胱炎、正常补体血症性荨麻疹性血管炎、心包炎、肌炎、抗合成酶综合征、巩膜炎、巨噬细胞活化综合征、 Behcet综合征、PAPA综合征、Blau's综合征、痛风、成人和青少年Still病、隐热蛋白病(cryropyrinopathy)、Muckle-Wells综合征、家族性寒冷所致自身炎性综合征、新生儿发作多系统炎性疾病、家族性地中海热、慢性婴儿神经系统、皮肤和关节综合征、全身性幼年特发性关节炎、高IgD综合征、Schnitzler综合征、TNF受体相关的周期性综合征(TRAPSP)、牙龈炎、牙周炎、肝炎、肝硬化、胰腺炎、心肌炎、血管炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎和炎性皮肤病，其选自银屑病、异位性皮炎、湿疹、酒渣鼻、荨麻疹和粉刺；和其他病症，包括全身性炎症反应综合征(SIRS)、阿尔茨海默病和帕金森病。

在一些实施方案中，自身免疫性和/或炎性病症是炎性肠病症。如本文所用，术语“炎性肠病症”包括依据以下标准中至少一者诊断的病症：1)结肠壁中有炎症和/或2)炎症的炎性标志物检验呈阳性的粪便样品，结合自述有至少一个症状的患者。症状包括但不限于通过排便缓解的下腹痛、交替便秘/腹泻、小直径粪便排便、绞痛、腹泻、便秘、急迫、胃肠胀气、水泻伴或不伴疼痛、臌胀、恶心和或失禁。炎性肠病症包括炎性肠激惹综合征、克罗恩氏病、肠激惹综合征-腹泻型、肠激惹综合征-便秘型、肠激惹综合征-混合型、肠激惹综合征-交替型、消化不良、显微镜下结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、未定型结肠炎、乳糜泻及其组合。

在一些实施方案中，炎性肠病症是炎性肠病(IBD)。炎症性肠病包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎二者。克罗恩氏病是可能影响从口至肛门的胃肠道任何部分的炎性肠病。它造成胃肠道衬层炎症，后者可以导致腹痛、重度腹泻、疲乏、体重减轻和营养不良。由克罗恩氏病引起的炎症可以涉及不同人群中的不同胃肠道区域。与克罗恩氏病相关的炎症经常扩展深入到受肠组织影响的各层。克罗恩氏病可以是痛性和消耗性的，并且有时可以导致危及生命的并发症。并发症包括肠道阻塞、肠中溃疡和获得足够营养的问题。其他并发症发生在胃肠道外部并且包括贫血、皮疹、关节炎、眼炎症和疲劳。传统治疗可能帮助控制症状，并且包括药物、营养补充剂和/或手术。尽管一些患者可能长时间缓解，期间他们无症状，但目前无法治愈克罗恩氏病。因此，仍需要用于管理和治疗克罗恩氏病的方法。

溃疡性结肠炎是大肠(也称作结肠)慢性病，其中结肠衬层变得发炎并且形成产生脓和粘液的微小开放性伤处或溃疡。炎症和溃疡组合可以造成腹部不适和结肠频繁排空。现有的溃疡性结肠炎治疗涉及带有明显副作用的强烈和冗长的联合药物疗法，或甚至需要手术除去部分结肠。因此，需要更有效的溃疡性结肠炎治疗法，其更易施用并且可以治愈这种消耗性疾病。

在一些实施方案中，本公开提供一种治疗或预防移植物接受者、尤其同种异体移植物接受者中移植物抗宿主病的方法。GVHD是同种异体移植物后的常见并发症。它通常与干细胞或骨髓移植物相关，但该术语还适用于其他形式的组织移植。组织(移植物)中的免疫细胞(白血细胞)将接受者(宿主)识别为“外来”。在一个实施方案中，GVHD是急性GVHD。急性或暴发形式疾病(aGVHD)通常在移植后前100天以内观察到并且鉴于相关的发病率和死亡率，对移植物造成重大挑战。急性移植物抗宿主病可能以选择性肝脏、皮肤(疹)、粘膜和胃肠道损伤为特征。较新的研究显示，其他移植物抗宿主病靶器官包括免疫系统(造血系统，例如，骨髓和胸腺)本身，和特发性肺炎形式的肺。急性GVHD是依据器官涉及的数目和程度分期和定级(0-IV)。IV级GVHD患者通常具有不良预后。如果GVHD为重度且需要涉及类固醇和额外药剂的强力免疫抑制以实现控制，则患者可能因免疫抑制而形成重度感染并且可能死于感染。

本公开提供一种通过调节NKG7活性来调节受试者对癌细胞的免疫应答，治疗受试者中癌症的方法。因此，在一些实施方案中，以NKG7的调节物治疗患者可以作为一种形式的癌症免疫疗法使用。如本领域已知，癌症免疫疗法是用来治疗患者的疗法，其包括或使用免疫系统的组分。因此，在一些实施方案中，在患者中施用增加NKG7活性的化合物可以用来增加患者中针对癌细胞的免疫应答。

在一些实施方案中，本文公开的治疗方法可以与其他癌症免疫疗法和免疫治疗剂组合或结合使用。

免疫疗法可以归类为主动、被动或混合(主动和被动)。这些方案利用以下事实：癌细胞经常在其表面上拥有可以为免疫系统检出的分子，称作肿瘤相关抗原(TAA)；它们经常是蛋白质或其他大分子(例如糖类)。主动免疫疗法通过靶向TAA，指引免疫系统攻击肿瘤细胞。被动免疫疗法增强现有的抗肿瘤反应并且包括使用单克隆抗体、淋巴细胞和细胞因子。

在这些疗法当中，多种抗体疗法在各个管辖区获批治疗广泛类型的癌症。细胞表面受体是抗体疗法的常见靶并且包括CD20、CD274和CD279。一旦与癌抗原结合，则抗体可以诱导抗体依赖的细胞介导细胞毒性、激活补体系统或阻止受体与其配体相互作用，这些均可以导致细胞死亡。获批的抗体包括阿伦珠单抗(alemtuzumab)、伊匹木单抗、纳武单抗(nivolumab)、奥法木单抗(ofatumumab)和利妥昔单抗。

主动细胞疗法通常涉及从血液或从自肿瘤取出免疫细胞。培养那些对肿瘤特异的细胞并使其返回患者，在患者中它们攻击肿瘤；或者，可以将免疫细胞经遗传工程化以表达肿瘤特异性受体，培养并返回患者。可以按这种方式使用的细胞类型是天然杀伤细胞、淋巴因子活化的杀伤细胞、细胞毒T细胞和树突细胞。一个具体类型的细胞治疗是CAR-T治疗。嵌合抗原受体(CAR，也称作嵌合免疫受体，嵌合T细胞受体或人工T细胞受体)是将任意特异性移植到免疫效应细胞上的工程化受体。一般，这些受体用来将单克隆抗体特异性移植到T细胞上，通过逆转录病毒载体促进其编码性序列的转移。这些受体称作嵌合，因为它们包含来自不同来源的部分。CAR T细胞设计的基本原理涉及合并抗原结合作用和T细胞活化功能的重组受体。CAR T细胞的总体前提是快速产生靶向特定肿瘤细胞的T细胞。科学家可以从患者取出T细胞，对其遗传工程化，并且随后把它们放回患者以靶向癌细胞。

在一些实施方案中，癌症免疫治疗剂可以选自以下一者或多者：免疫检查点调节剂、癌疫苗、溶瘤性病毒、细胞因子和基于细胞的免疫疗法。

在一些实施方案中，抑制性免疫检查点分子选自以下一者或多者：程序性死亡配体1 (PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白 4(CTLA-4)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)、T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)、T细胞活化作用的V-结构域 Ig阻抑蛋白(VISTA)、B和T淋巴细胞衰减蛋白(BTLA)、CD160、疱疹病毒进入介导物(HVEM)和带Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。

在一些实施方案中，本公开提供一种增加、增强或刺激患癌个体中免疫应答或功能的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的增加NKG7活性的化合物和抗癌药或抗癌疗法。在其他方面，本公开提供一种有效量的增加NKG7活性的物质在制造用于增加、增强或刺激患癌个体中免疫应答或功能的药物中的用途，其中增加NKG7活性的物质与抗癌药或抗癌疗法组合使用。在其他方面，本公开提供一种有效量的抗癌药在制造用于增加、增强或刺激患癌个体中免疫应答或功能的药物中的用途，其中抗癌药与增加NKG7活性的化合物组合使用。在其他方面，本公开提供一种药物组合物，其包含增加NKG7活性的物质，与抗癌药或抗癌疗法组合用于增加、增强或刺激免疫应答或功能。在其他方面，本公开提供一种药物组合物，其包含抗癌药，与增加NKG7活性的物质组合用于增加、增强或刺激免疫应答或功能。

在一些实施方案中，增加NKG7的化合物可以与包含肿瘤相关抗原的癌疫苗组合或结合使用。在一些实施方案中，癌疫苗选自以下一者或多者：Oncophage、人乳头瘤病毒HPV疫苗，任选地Gardasil或Cervarix、乙型肝炎疫苗，任选地Engerix-B、Recombivax HB或Twinrix，和sipuleucel-T(Provenge)、或者包含选自以下一者或多者的癌抗原：人Her2/neu、 Her1/EGF受体(EGFR)、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE 受体)、MAGE-3、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF- A)VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、 CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱糖蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酰环化酶C、NY-ESO-1、p53、存活素、整联蛋白αvβ3、整联蛋白α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原 (PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或 TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板衍生生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白质二硫化物异构酶 (PDI)、再生肝脏的磷酸酶3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层起源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷酯)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)和间皮素。

在一些实施方案中，向受试者分别施用增加NKG7活性的化合物和癌症免疫治疗剂。在一些实施方案中，将增加NKG7活性的化合物和癌症免疫治疗剂作为相同组合物的部分一起施用。

将可以理解，可以将涉及使用增加NKG7活性的化合物的癌症免疫治疗方法独立地进行或作为其他已知癌症治疗方案的辅助来进行。例如，治疗可以结合诸如化疗、放射疗法、干细胞移植和/或免疫疗法(例如，单克隆抗体疗法)等治疗或在其之后实施。治疗脑肿瘤中使用的化疗药实例包括替莫唑胺、BCNU(卡莫司汀)、PCV(丙卡巴肼、CCNV(洛莫司汀)和长春新碱组合)、卡铂、依托泊苷、伊立替康、顺-视黄酸、沙立度胺、他莫西芬和COX-2抑制剂。其他已知的化疗药包括苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、米托蒽醌、甲氨蝶呤、氟达拉滨、阿糖胞苷、依托泊苷、拓泊替康、泼尼松、地塞米松、长春新碱和长春碱。

在一些实施方案中，本公开提供在治疗或预防传染性疾病中增加或增强免疫应答和/或增强对源自传染物的疫苗抗原的免疫应答的方法。

如本文所用，“疫苗”指含有免疫原性决定因素(即抗原)的任何组合物，所述免疫原性决定因素以如此方式刺激免疫系统，从而它可以更好地应答于后续攻击或致病性感染或肿瘤。将可以理解，疫苗通常含有免疫原性决定因素和任选地佐剂，佐剂起到非特异性增强对免疫原性决定因素的免疫应答的作用。

因此，在一些实施方案中，本公开提供一种通过向受试者施用增加NKG7活性的组合物，增强受试者中对疫苗抗原的免疫应答的方法。例如，通过增加NKG7活性，可以实现增强的针对抗原的免疫应答，原因在于促炎细胞因子如IL-6、IFN-γ和TNF-α增加。因此，在一些实施方案中，与疫苗或疫苗抗原组合和或结合施用时，增加NKG7活性的化合物具有佐剂作用。

在一些实施方案中，增加NKG7活性的化合物可以用来增强针对源自细菌性、病毒性和 /或寄生性病原体的疫苗抗原的免疫应答。

在一些实施方案中，本公开提供一种减少传染物引起的炎性免疫应答的方法。例如，可能想要在出现全身性炎性免疫应答的受试者中减少炎性免疫应答和/或可能想要在败血症患者中减少炎性免疫应答。可以通过向受试者施用抑制NKG7表达或活性的化合物，减少炎性免疫应答。

包含调节NKG7活性的化合物连同可接受载体或稀释剂的组合物可用于本文所公开的方法中。可以通过将具有适宜纯度的所需化合物与任选的可药用载体、辅料或稳定剂混合，以冻干制剂、水溶液剂或含水混悬剂形式制备治疗性组合物(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980))。可接受的载体、辅料或稳定剂在所用的剂量和浓度优选地对接受者无毒，并且包括缓冲剂如Tris、HEPES、PIPES、磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟苯甲酸酯如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露醇或糊精；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEEN

这类载体的额外例子包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐、或电解质类如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮和基于纤维素的物质。

待用于体内施用的治疗性组合物应当是无菌的。在冻干和重构之前或之后，通过用无菌过滤膜过滤轻易地实现这点。如果全身施用，组合物可以按冻干形式或在溶液中储存。如果处于冻干形式，一般将它与其它成分联合配制，以在使用时用适宜的稀释剂重构。液态制剂的例子是皮下注射用单剂小瓶中灌装的无菌、清亮、无色、不防腐的溶液剂。

另外，施用组合物的单次或多次施用，这取决于如所要求及患者耐受的剂量和频率。取决于施用的具体治疗药或预防药、疾病或病状严重程度和类型、施用途径以及患者年龄、体重、反应和既往病史，剂量和频率一般将根据专用于每位患者的因素变动。本领域技术人员可以通过考虑这类因素并通过遵循例如文献中报告和Physician's DeskReference(医师案头参考)(第56版，2002)中推荐的剂量，选择合适的方案。通常，剂量足以在不对患者产生不可接受毒性的情况下，治疗或减轻疾病的症状或体征。

在任何治疗方案中，可以向患者施用治疗性组合物,单一地或以联合的施用，所述联合包含其他治疗药、组合物等，包括但不限于免疫抑制剂、耐受性诱导剂、增效剂和副作用减轻剂。免疫抑制剂的实例包括泼尼松、美法仑(melphalain)、泼尼松龙(prednisolone)、 DECADRON(Merck,Sharp&Dohme,West Point,Pa.)、环磷酰胺、环孢菌素、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和静脉内γ球蛋白或其组合。优选的增效剂包括莫能菌素、氯化铵、哌克昔林、维拉帕米、金刚烷胺(amantadine)和氯喹。全部这些药物均按通常接受的有效剂量范围(如Physician's Desk Reference(医师案头参考),第41版,PublisherEdward R.Barnhart,N.J. (1987)中公开的那些范围)施用。

实施例

实施例1.方法和材料

使用年龄在8-12周龄之间的雌性小鼠。C57BL/6J(野生型；WT)小鼠购自沃尔特和伊丽莎·霍尔研究所(Walter and Eliza Hall Institute)(WEHI；Kew,VIC,澳大利亚)。自行繁殖C57BL/6N和B6N.Nkg7-KO小鼠。全部小鼠均在无病原体条件下圈养于QIMRBerghofer Medical Research Institute Animal Facility(Herston,QLD)处。实验性使用符合“澳大利亚为科学目的护理和使用动物实务守则”(澳大利亚国家健康和医学研究理事会)(“Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals forScientific Purposes”(Australian National Health and Medical ResearchCouncil))并且经QIMR Berghofer Medical Research Institute Animal EthicsCommittee批准(Herston,QLD,澳大利亚；批准编号：A02-633M、A02-634M或A1707615M)。

产生Nkg7-cre x B6.mT/mG小鼠

在Nkg7启动子控制下表达cre重组酶的C57BL/6J小鼠(B6J.Nkg7-cre)由Walterand Eliza Hall Institute(WEHI)的Melbourne Advanced Genome Editing Centre(MAGEC)使用 CRISPR/Cas9介导的基因编辑产生。简而言之，基于前述方法，单一向导物(sg)RNA(序列： CATGGAGCCCTGCCGGTCCC)用来在Nkg7基因座中诱导双链断口，以刺激同源重组，并且含有约2kb同源性臂的打靶载体用来引入cre重组酶编码序列。

检测cre重组酶序列的正向引物(ACGACCAAGTGACAGCAATG)和反向引物(GCTAACCAGCGTTTTCGTTC)用来通过聚合酶链反应(PCR)筛选有活力的群体(pup)供打靶载体整合。检测到301bp扩增子，其中存在cre重组酶序列。选择表达cre序列的F0小鼠供回交，后者产生F1杂交小鼠。上文描述的PCR用来筛选F1小鼠的cre序列。通过长距离 PCR执行进一步验证，以核实打靶载体的正确位置整合。

将B6J.Nkg7-cre小鼠与mT/mG(B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor

通过在Rag1

通过CO

通过CO

根据生产商的说明，使用小鼠CD4

使用皮肤刮匙刀片，从每只死后小鼠的肝脏和脾脏取得一片大约10-20mg的组织。将组织收集入150μl QuickExtract

全部流式细胞术染色均在

如Ashurst撰写的方案和R脚本中所概述那样进行tSNE。简而言之，使用FlowJov10 OSX(FlowJo,LLC)，在最后的共同群体上对样品设门。双指数刻度随后应用于全部目的荧光团。通过增加宽度基础以减少阴性数据扩散，修正刻度。向每份样品的设门群体分派样品编号并且在FlowJo v10 OSX(FlowJo,LLC)上降采样到50,000个事件。从全部样品中降采样的群体随后合并成单一文件。选择目的标志物作为tSNE参数并且应用以下设置：

·迭代(Iteration)：1000

·困惑度(Perplexity)：30

·Eta(学习率)200

·θ：0.5

合并的文件内部的每份样品基于先前分派的样品编号和对每份样品观察到的tSNE参数区分。使用输出的通道值作为Ashurst(2017)所书写脚本的输入，在R中生成彩色化tSNE 曲线。

按照生产商的说明，使用BD细胞计数珠阵列(CBA)小鼠炎症试剂盒或小鼠 Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒(BD Biosciences)评估细胞因子水平。不稀释使用来自小鼠血液的血清样品或血浆样品，而将上清液在1x PBS中1:5稀释，以检测大部分细胞因子。将上清液在1x PBS中1:50稀释，以检测IFNγ。使用BD

根据生产商的说明，在QIAshredder柱中均化储存于缓冲液RLT中的FACS

从Kala-azar Medical Research Center(Muzaffapur,Bihar,印度)处诊断患有VL的有症状患者中获得血液。通过显微术检测脾穿刺涂片中的无鞭毛体或通过使用rk39浸渍检查法，诊断患者。在入院日(第0天)和用AmBisome(Gilead Sciences,Inc.,FosterCity CA,美国)后30 天(第30天)，在BD

根据生产商的说明，在QIAshredder柱中均化细胞，之后使用RNeasy微量试剂盒提取 RNA(二者均来自

在Galaxy平台(https://galaxy-qld.genome.edu.au/galaxy/)[7]上处理RNA-seq数据。使用 FastQC(Andrews,2014)进行质量控制。使用针对参考的剪接转录物比对(STAR)(Dobin等人2013)，映射读段，并且Cufflinks(Trapnell等人2010)用于转录物组装并估计每百万个已映射读段的转录物的每千碱基读段数(RPKM)。若适用，Cuffmerge用来合并多个转录物装配 (Trapnell等人,2012)。HTseq用来将映射的读段变换成计数数据，后者用于下游分析的输入(Anders等人2015)。在R(R核心团队,2017,R Foundation forStatistical Computing:维也纳，奥地利)上运行的EdgeR(Robinson等人2010)用来从RNA-seq数据集生成一系列差异性表达的基因。使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA；

下载TCGA Research Network(https://cancergenome.nih.gov/)先前发表的RNA-seq数据，并使用R上的TCGAbiolinks软件包(Colaprico等人2016)处理。简而言之，转录物计数依据基因长度归一化，并且滤除跨全部样品的表达均数的最低四分位数(<25％)内的基因。将样品根据目的基因表达值定序并分层为两个组，其中最高四分位数(>75％)命名为高表达，并且最低四分位数(<25％)命名为低表达。分析这些组之间的总生存期并且作为Kaplan–Meier曲线绘出，使用对数秩检验确定p值。随后在2个基因目的之间进行相关性分析并且关系表示为 r。

使用Prism 7(GraphPad软件)进行统计分析。确定p值并且显示为*、**、***和****，其分别代表p<0.05、0.01、0.001和0.0001。

从雌性Foxp3-RFP

从初始或感染的Foxp3-RFP

对于人样品，根据生产商的说明，使用人CD4微珠(Miltenyi Biotec)，通过MACS富集CD4

从小鼠分离脾单核细胞，如‘脾单细胞悬液的制备’章节中所述。将4×10

用1x10

对Rag2γc-KO小鼠组静脉内注射(i.v.)用荧光活化细胞分选法(FACS)分离的2x10

在施用含有2.5％DSS盐(分子量约40,000；Alfa Aesar,MA美国)的饮用水之前记录小鼠的起始重量。每日就结肠炎症状评定小鼠并且在大致相同时间记录体重。当体重丢失％超过 10％时，每日二次评定小鼠并称重。在第6天移除含有DSS的饮用水并且给予小鼠新鲜的饮用水。在施用DSS后第7天处死全部小鼠，在此期间测量结肠并将其保存在福尔马林中供组织学切片用。随后将结肠转移至70％乙醇并包埋在石蜡中，之后切片。就多项参数评定苏木精和伊红(H&E)染色的切片，所述参数包括隐窝结构、隐窝脓肿、组织损伤、炎性细胞浸润、和固有层中性粒细胞的量。

将表达萤光素酶的伯氏疟原虫ANKA寄生虫腹腔内(i.p.)注射入C57BL/6J(野生型)传代小鼠。感染后4天后，当寄生虫血症率在1-3％之间时，使传代小鼠安乐死并通过心脏穿刺法，将血液采集入5ml RPMI/PS+5U/ml肝素。通过添加5ml RPMI/PS并且按338g在室温离心7分钟，制备寄生虫接种物。弃去上清液并且将红血细胞(RBC)沉淀物重悬于1mlRPMI/PS中供计数。在0.1％台盼蓝溶液(自1x PBS中的0.4％起稀释；MP Biomedicals PtyLtd,Seven Hills NSW，澳大利亚)中配制RBC供计数。配制含有5x10

实施例2.结果

通过荧光活化细胞分选法(FACS)分离从初始和杜氏利什曼原虫感染的C57BL/6小鼠的肝脏和脾脏中分选的CD4

来自每个来源的DEG比较确定三个来源之间且跨两个哺乳动物宿主物种共有的VL期间CD4

慢性特征标识包含49个上调的基因(图2A)，NKG7是从小鼠脾脏分离的CD4

为了研究NKG7在癌症中的潜在作用，从作为The Cancer Genome Atlas(TCGA)组成部分的37个癌症数据集中获得NKG7基因表达水平。在肿瘤内部、最特别地在肾脏肾透明细胞癌(KIRC)和胶质母细胞瘤(GBM)中发现NKG7差异性表达(图3A；改编自 http://firebrowse.org/)。尽管表达数据获自肿瘤活检样品，但NKG7上引起癌症风险的突变位点的证据稀少(图3B；改编自http://www.cbioportal.org/output)。另外，迄今的基因表达数据表明，与其他组织相比，NKG7表达在骨髓和免疫系统中最高，高得多 (https://www.proteinatlas.org/ENSG00000105374-NKG7/tissue)。

为了确定NKG7表达的差异是否有益或不利，基于患者样品的NKG7表达情况，订购470份来自皮肤的皮肤黑素瘤队列(TGCA：SKCM)的患者样品。患者划分成高NKG7表达 (最高四分位数，“高NKG7”)和低NKG7表达(最低四分位数，“低NKG7”)，揭示NKG7 高表达组中存活概率明显增加(图3C；p<0.0001，阴影面积表示置信区间)。这提示靶向 NKG7的临床意义更宽泛。随后进行SKCM数据集中NKG7表达和CD4、CD8或NCAM表达之间的相关分析，以确定NKG7是否与CD4表达、CD8表达或NCAM表达相关。这些结果显示，NKG7表达与CD4和CD8高度相关，但与NCAM表达不相关。

生成B6.Nkg7-cre小鼠以表征各种背景下Nkg7的表达或丢失(图4A)。为确定Nkg7的表达，将B6.Nkg7-cre小鼠与B6膜tdTomato/膜绿色荧光蛋白(GFP)(mT/mG)小鼠杂交，以产生 Nkg7报道小鼠Nkg7-cre x mT/mG(图4B)。依据替代标志物GFP在Cre-表达(+)小鼠中确定Nkg7表达，并且在初始状态的天然杀伤细胞上加以验证。进行t-分布随机邻域嵌入(t-SNE)，以依据初始状态下的关键免疫亚群评价表达Nkg7。t-SNE曲线显示，初始状态下 GFP的表达限于NK细胞(NK1.1

Nkg7-cre x mT/mG小鼠为杜氏利什曼原虫感染并且在感染后(p.i.)第13、第28和第58天追踪每个免疫细胞亚群内部GFP表达的变化。NK细胞群体内部GFP表达在感染期间减少，而GFP

B6N.Nkg7-KO小鼠为杜氏利什曼原虫感染并且测量内脏利什曼病期间Nkg7缺陷性对宿主保护和病理学的影响。在感染后(p.i.)第14天对Nkg7缺陷性的影响定量，并且发现与对照 (野生型)小鼠相比，有Nkg7缺陷的小鼠显示更小的脾脏重量和肝脏重量(图5A)。这显示较低炎症水平导致较少的组织损伤。与野生型小鼠相比，Nkg7-缺陷型小鼠中的寄生虫负担明显升高(5B)，显示Nkg7缺陷性导致炎症反应受损，并且因此，宿主清除寄生虫的免疫应答能力受损。与这些观察结果一致，发现与对照小鼠相比，Nkg7-缺陷型小鼠血清中促炎细胞因子干扰素(IFN)γ、肿瘤坏死因子(TNF)和IL-6的水平更低(5C)。

在感染后第14、第28和第58天测量脾脏和肝脏中的寄生虫负担(寄生虫负担表述为 Leishman–Donovan单位(LDU))，并且发现除感染后第14天之外，在感染后第28和第58天，肝脏寄生虫负担增加(图9A)。然而，如先前观察，促炎细胞因子IFNγ、TNF和MCP-1增加限于感染后第14天(图9B)。接下来，发明人力图鉴定有助于所观测表型的免疫细胞群体。鉴于杜氏利什曼原虫感染期间CD4

使用跨膜预测程序TMpred，确认NKG7为跨膜蛋白。来自TMpred对人蛋白(图6A)和小鼠蛋白(图6B)的预测指示，存在可能在胞外侧表达的四个跨膜螺旋和两个胞外环。预测的 NKG7蛋白模型与TMpred的预测一致并且显示在人和小鼠NKG7二者中均保守的两个胞外环(箭头指示)(图6C)。SEQ ID Nos:11和12中提供人NKG7胞外环的氨基酸序列，并且SEQ IDNos:13和14中提供小鼠NKG7胞外环的氨基酸序列。

为了确定免疫刺激剂背景下Nkg7缺陷性的影响，本发明人从C57BL/6N(B6N；野生型) 和B6N.Nkg7

为了研究癌症背景下Nkg7的作用，将B16F10细胞或LWT1细胞转移入C57BL/6N(B6N；野生型)和B6N.Nkg7-KO小鼠。Nkg7缺陷性在两个模型中均导致肺转移灶增加(图10A)。鉴于NK细胞在这些模型内部控制转移的重要性，将NK细胞从B6N对照小鼠或B6N.Nkg7-KO小鼠分离并转移入Rag2γc-KO小鼠。观察到相同表型，甚至Nkg7缺陷性限于NK细胞时也是如此，这提示它们在Nkg7不存在的情况下增加转移的作用(图10B)。Nkg7缺陷性减少葡聚糖硫酸钠(DSS)所致结肠炎期间的炎症

对C57BL/6N(B6N；野生型)和B6N.Nkg7-KO小鼠给予含DSS的饮用水6天，以诱导结肠炎。每日测量症状的严重程度(报告为疾病活动性指数(DAI))和体重变化。与野生型小鼠相比时，B6N.Nkg7-KO小鼠显示疾病严重程度较轻和体重丢失减少(图11A)。结肠缩短表示炎症，并且相对于野生型小鼠，施用DSS后第7天对结肠长度的测量显示B6N.Nkg7-KO小鼠中炎症较少(图11B)。结肠切片的组织学分析还提示B6N.Nkg7-KO小鼠中炎症较少，连同被观察到大体完好的肠隐窝(图11C)和记录较低组织学评分的部分(图11D)。

在C57BL/6N(B6N；野生型)小鼠中，伯氏疟原虫ANKA感染是致死的，原因在于形成炎症介导的实验性脑型疟疾(ECM)。C57BL/6N(B6N；野生型)和B6N.Nkg7-KO小鼠经伯氏疟原虫ANKA感染，以确定Nkg7缺陷性是否对ECM产生影响。尽管发现B6N.Nkg7-KO小鼠具有增加的循环型寄生化红细胞(pRBCs)(图12A)，但与野生型小鼠相比，这些小鼠显示出不太严重的ECM症状(报告为ECM评分；图12B)。B6N.Nkg7-KO小鼠还存活直至感染后第14天，此时它们罹患贫血症状，而不是ECM症状(图12C)。反过来，野生型小鼠在感染后第7天和第8天之间死于ECM。萤光素酶-表达伯氏疟原虫ANKA寄生虫的用途允许使用生物发光成像测量全身和脑寄生虫负担。相对于野生型小鼠，B6N.Nkg7-KO小鼠显示全身寄生虫负担(图12D)和脑寄生虫负担(图12E)降低。

RNA-seq数据集确定NKG7是杜氏利什曼原虫感染期间从人外周血单核细胞(PBMCs)和小鼠脾脏分离的CD4

另外，已经鉴定到CD4+ T细胞中NKG7表达的诱导物和阻抑物。使用从KOMP库获得的Nkg7-KO小鼠，显示Nkg7丢失导致杜氏利什曼原虫感染期间血液中促炎细胞因子的浓度显著降低。

本领域技术人员将会认识到，在不脱离本公开的总体宽范围情况下，可以对上述的实施方案作出众多变型和/或修改。因此，本发明的实施方案应从全部方面视为说明性而非限制性的。

文中讨论和/或参考的全部出版物均完整并入本文。

本申请要求AU 2018901677的优先权，所述文献的完整内容完整并入本文。

对本说明书中已经包括的文献、动作、材料、装置、制品等的任何讨论仅目的在于提供本发明的语境。不应视为承认任何或全部这些内容构成现有技术基础的一部分，或是本申请的每项权利要求的优先权日之前存在的本发明相关技术领域的公知常识。

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权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种调节受试者中免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用调节NKG7活性的化合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中化合物抑制NKG7活性。

3.根据权利要求2所述的方法，其中化合物是结合NKG7并抑制NKG7活性的抗体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中化合物增加NKG7活性。

5.根据权利要求4所述的方法，其中化合物是结合NKG7并增加NKG7活性的抗体。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中抗体结合NKG7的胞外环1或胞外环2。

7.治疗或预防受试者中自身免疫疾病或炎性病况的方法，所述方法包括向受试者施用抑制NKG7活性的化合物。

8.根据权利要求7所述的方法、其中自身免疫疾病或炎性病况选自移植物抗宿主病(GVHD)、类风湿性关节炎、炎性肠病(IBD)、狼疮、神经炎症、多发性硬化、帕金森病、阿尔茨海默病和全身性炎症反应综合征(SIRS)。

9.降低接受同种异体移植物的接受者中移植物抗宿主病风险(GVHD)的方法，所述方法包括向移植物接受者施用抑制NKG7活性的化合物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中在接受同种异体移植物之前向移植物接受者施用抑制NKG7活性的化合物。

11.根据权利要求9所述的方法，其中在接受同种异体移植物之时或之后向移植物接受者施用抑制NKG7活性的化合物。

12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其中化合物是结合NKG7并抑制NKG7活性的抗体。

13.治疗受试者中癌症的方法，所述方法包括向受试者施用增加受试者中NKG7活性的化合物。

14.根据权利要求9所述的方法，其中化合物是结合NKG7并增加NKG7活性的抗体。

15.根据权利要求所述13或权利要求14的方法，其中受试者经癌症免疫疗法治疗。

16.根据权利要求15所述的方法，其中癌症免疫疗法选自免疫检查点抑制蛋白疗法和抗体疗法。

17.一种增强受试者中对疫苗抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用

i)增加NKG7活性的化合物，和

ii)疫苗抗原。

18.前述权利要求中任一项所述的方法，其中NKG7包含与SEQ ID Nos:1、3、5、7或9中任一者至少90％相同的氨基酸序列并且具有NKG7活性。

19.前述权利要求中任一项所述的方法，其中NKG7由核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下与包含选自SEQ ID Nos:2、4、6、8或10中任一者的序列的核酸杂交。

20.前述权利要求中任一项所述的方法，其中NKG7由SEQ ID NOs:1、3、5、7或9并且具有一个或几个氨基酸置换、或缺失或添加中任一者组成。

21.治疗或预防自身免疫疾病或炎性病症的药物组合物，所述药物组合物包含抑制NKG7活性的化合物和可药用载体。

22.治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含增加NKG7活性的化合物和可药用载体。

23.抑制NKG7活性的化合物在制造治疗自身免疫疾病或炎性病症的药物中的用途。

24.增加NKG7活性的化合物在制造治疗癌症的药物中的用途。