一种具有长循环性纳米药物载体的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料制备技术领域，具体涉及一种具有长循环性纳米药物载体的制备方法，还涉及该长循环性纳米药物载体的应用。

背景技术

目前临床广泛使用的化疗药物在体内分布较广，尤其在一些正常组织中也有分布，不仅降低了药物的生物利用率，还会对正常组织造成显著的毒副作用。另外，药物在血液中循环时间太短，难以到达病灶部位。提高化疗药物对癌细胞的选择性，降低其在非靶向部位的分布，提高药物利用率是提高癌症治疗药物疗效的关键。

壳聚糖是一种资源丰富的天然阳离子聚合物，具有独特的性质，如无毒、生物相容性、生物降解性、生物活性和粘膜粘附性，已广泛用于载药体系。通过壳聚糖纳米药物载体对化疗药物进行包裹负载，不仅可以提高化疗药物对癌细胞的选择性，而且能降低其在非靶向部位的分布，进而提高药物利用率。

聚乙二醇单甲醚是一类分子量较低的水溶性聚醚，利用聚乙二醇单甲醚接枝改性壳聚糖，一方面使壳聚糖的水溶性增加；另一方面，由于聚乙二醇具有电中性、亲水性、柔性链及超强的水合能力，使得聚乙二醇改性的纳米药物载体对于巨噬细胞可以“伪装”或“隐形”，从而实现药物在体内的长循环。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有长循环性纳米药物载体的制备方法。

本发明的另一目的是提供上述长循环性纳米药物载体在化疗药物控释缓释方面的应用。

本发明所采用的技术方案是，一种具有长循环性纳米药物载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，采用一步法制备聚乙二醇改性壳聚糖CS-g-mPEG，首先，甲醛和壳聚糖上的氨基形成希弗氏碱，然后聚乙二醇单甲醚(mPEG)上的羟基和希弗氏碱发生加成反应生成聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖；

步骤2，利用N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)自由基聚合制备聚阴离子poly(NIPAm-co-AMPS)，PNAM；

步骤3，以CS-g-mPEG作为聚阳离子，以PNAM作为聚阴离子，通过聚电解质复合法制备具有长循环性纳米药物载体。

本发明的特点还在于，

步骤1中，具体为：将壳聚糖溶解于甲酸中，待其完全溶解后，加入二甲基亚砜稀释，随后加入mPEG，持续搅拌15min，最后加入质量分数为37％的甲醛溶液，继续反应4-6h，停止反应后，将反应液移至透析袋中，用去离子水透析3天，之后移至离心管中，在-46℃的条件下冷冻干燥3天，得到白色棉絮状产物，即可得到CS-g-mPEG。

壳聚糖在甲酸溶液中的浓度为10mg/mL，甲酸与二甲基亚砜的体积比为1：2，壳聚糖、聚乙二醇单甲醚与甲醛的质量比为1：8～12：1；透析袋的截留分子量3500Da。

步骤2中，具体为：

将单体NIPAm和单体AMPS溶解于混合溶剂中，将引发剂与单体混合液混合，然后在N

引发剂为偶氮二异庚腈，引发剂的质量是单体NIPAm和单体AMPS总质量的1％；NIPAm与AMPS的摩尔比为3:7。

混合溶剂由体积比为4：1的蒸馏水和1,4-二氧六环混合而成。

步骤3中，具体为：

步骤3.1，配制CS-g-mPEG的醋酸溶液和聚阴离子PNAM水溶液；用1mol/L的NaOH溶液将CS-g-mPEG的醋酸溶液的pH调节至5；用1mol/L的NaOH溶液将聚阴离子PNAM水溶液的pH调节至5.5；

步骤3.2，在磁力搅拌的条件下，将聚阴离子PNAM溶液用注射器滴加至CS-g-mPEG的醋酸溶液中，滴加完毕后继续搅拌2h，用0.45μm的滤膜对反应液进行过滤，即可得到以CS-g-mPEG为壳、以PNAM为核的具有长循环性能纳米药物载体。

步骤3.1中，CS-g-mPEG在醋酸溶液中的质量浓度为0.1～1.0mg/mL；聚阴离子PNAM水溶液的质量浓度为0.1～1.0mg/mL。

步骤3.2中，CS-g-mPEG醋酸溶液与PNAM水溶液的体积比为4：1～5，磁力搅拌的速度为900～1500rpm；注射器的滴加速度为2μL/s。

本发明的有益效果是，本发明制备的纳米药物载体不仅具备壳聚糖的可生物降解性、无毒性和低免疫原性以及抑菌抗癌等优势，还具有聚乙二醇良好的生物相容性以及在血液中的长循环性，提高了小分子化疗药物对癌细胞的选择性，减少了用药次数，降低了对正常组织与细胞的损害，从而也提高了药物的生物利用率。采用聚电解质复合法合成的纳米药物载体在结构与性能上与生物大分子相似，且过程中没有使用任何有机溶剂和表面活性剂，毒性更小、安全性更高。

附图说明

图1是本发明方法制备的CS-g-mPEG的核磁共振谱图；

图2是本发明方法制备的CS-g-mPEG的红外谱图；

图3是本发明制备的载药壳聚糖纳米颗粒的示意图；

图4是本发明制备的CS-g-mPEG/PNAM纳米颗粒的DLS图；

图5是本发明制备的CS-g-mPEG/PNAM纳米颗粒的TEM图；

图6是本发明制备的CS-g-mPEG/PNAM纳米颗粒与细胞培养24h后倒置显微镜照片；

图7是阳性对照苯酚与细胞培养24h后倒置显微镜照片。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明一种具有长循环性纳米药物载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，采用一步法制备聚乙二醇改性壳聚糖CS-g-mPEG，首先，甲醛和壳聚糖上的氨基形成希弗氏碱，然后聚乙二醇单甲醚上的羟基和希弗氏碱发生加成反应生成聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖；

具体为：将壳聚糖(CS)溶解于甲酸(HCOOH)中，待其完全溶解后，加入二甲基亚砜(DMSO)稀释，随后加入聚乙二醇单甲醚(mPEG)，持续搅拌15min，最后加入质量分数为37％的甲醛(HCHO)溶液，继续反应4-6h，停止反应后，将反应液移至透析袋中，用去离子水透析3天，之后移至离心管中，在-46℃的条件下冷冻干燥3天，得到白色棉絮状产物，即可得到聚乙二醇改性壳聚糖(CS-g-mPEG)；

其中，壳聚糖在甲酸溶液中的浓度为10mg/mL，甲酸与二甲基亚砜的体积比为1：2，壳聚糖、聚乙二醇单甲醚与甲醛的质量比为1：8～12：1；

透析袋的截留分子量3500Da；

步骤2，利用N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)自由基聚合制备聚阴离子PNAM，具体为：

将单体NIPAm和单体AMPS溶解于混合溶剂中，将引发剂与单体混合液混合，然后在N

滴加时长为2-3h。引发剂为偶氮二异庚腈(AVBN)，引发剂的质量是单体NIPAm和单体AMPS总质量的1％；

混合溶剂由体积比为4：1的蒸馏水和1,4-二氧六环混合而成；

其中，NIPAm与AMPS的摩尔比为3:7，单体在混合溶剂中总浓度为0.5mol/L；

步骤3，以CS-g-mPEG作为聚阳离子，以PNAM作为聚阴离子，通过聚电解质复合法制备具有长循环性纳米药物载体；具体为：

步骤3.1，配制CS-g-mPEG的醋酸溶液和聚阴离子PNAM水溶液；用1mol/L的NaOH溶液将CS-g-mPEG的醋酸溶液的pH调节至5；用1mol/L的NaOH溶液将聚阴离子PNAM水溶液的pH调节至5.5；

醋酸溶液的质量分数为1％；

CS-g-mPEG在醋酸溶液中的质量浓度为0.1～1.0mg/mL；聚阴离子PNAM水溶液的质量浓度为0.1～1.0mg/mL；

步骤3.2，在磁力搅拌的条件下，将聚阴离子PNAM溶液用注射器滴加至CS-g-mPEG的醋酸溶液中，滴加完毕后继续搅拌2h，用0.45μm的滤膜对反应液进行过滤，即可得到以CS-g-mPEG为壳、以PNAM为核的具有长循环性能纳米药物载体；

CS-g-mPEG醋酸溶液与PNAM水溶液的体积比为4：1～5，磁力搅拌的速度为900～1500rpm；注射器的滴加速度为2μL/s。

本发明的具有长循环性能纳米药物载体的制备方法，以聚乙二醇单甲醚(mPEG)改性壳聚糖的接枝产物作为聚阳离子，以N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)自由基聚合的聚合物作为聚阴离子poly(NIPAm-co-AMPS)(PNAM)，通过聚电解质复合法制备具有长循环性能壳聚糖纳米颗粒，可以达到免疫隐形、提高治疗效果。

本发明的制备方法中，首先用聚乙二醇对壳聚糖进行表面改性，然后在温和条件下利用温度、pH敏感型阴离子聚合物与改性后壳聚糖之间的静电相互作用，通过聚电解质复合法使分子链相互缠绕形成粒径均一的纳米颗粒。采用聚电解质复法合成的大分子复合物在结构与性能上与生物大分子存在许多相似性如表面电荷、亲疏水性、小分子的选择输运等，这有助于模拟生物体内的过程、实现一些特殊的功能，在生物医学领域有着巨大的应用前景。

图1为本发明方法制备的接枝产物CS-g-mPEG的核磁共振谱图，3.58ppm处是-NHCH2(e)CH2(d)-中H(d)峰，3.48ppm处是-CH2CH2(b)OCH3中H(b)峰，3.30ppm处是-OCH2CH2(c)-和壳聚糖糖环残基上3、4、5、6位H的峰，2.98ppm处是-OCH3(a)峰，2.68ppm处是-NHCH2(e)CH2(d)-中H(e)峰，说明成功制备了mPEG改性壳聚糖。

图2本发明CS及CS-g-mPEG的红外谱图，壳聚糖发生接枝反应后，3286.2cm

本发明的长循环性纳米药物载体在化疗药物控释缓释方面的应用。以抗癌药物5-氟尿嘧啶为药物模型，制备载5-氟尿嘧啶壳聚糖纳米药物载体，将一定量纳米颗粒分散液转移至截留分子量为7.0kDa的透析袋中，放入不同pH缓冲溶液为释放外液的离心管中，置于37℃、100rpm的恒温摇床上进行药物控释。每隔一定时间从离心管中取出2.0mL样品溶液，并补加2.0mL对应pH的缓冲液，分别测试所取样品溶液中5-FU在266nm处的紫外吸收，从而计算一定时间内药物的累积释放率。通过测定不同温度、不同pH条件下药物释放速率的不同，以实现缓慢释放及可控释放。

图3是制备载药壳聚糖纳米颗粒的示意图，将药物5-氟尿嘧啶与CS-g-mPEG混合在一起，通过静电相互作用，与聚合物分子链上的磺酸基团发生相互作用，分子链缠绕从而形成将5-氟尿嘧啶包裹在纳米颗粒内部。

图4是本发明制备CS-g-mPEG/PNAM纳米颗粒的DLS图，在最佳条件下制备的纳米颗粒水分散体系的平均水合粒径为261.23nm，其粒径分布PDI为0.07。图5是本发明制备CS-g-mPEG/PNAM纳米颗粒的TEM图，最佳条件下制备纳米颗粒的粒径在50～200nm。

图6和图7分别是本发明制备CS-g-mPEG/PNAM纳米颗粒以及阳性对照苯酚与细胞培养24h后倒置显微镜照片；阳性对照组细胞已经大部分死亡，经聚乙二醇改性形成的纳米颗粒组细胞分布紧密，多呈梭形，胞体饱满，说明了聚乙二醇改性壳聚糖纳米颗粒具有良好生物相容性。

实施例1

本发明一种具有长循环性纳米药物载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，采用一步法制备聚乙二醇改性壳聚糖CS-g-mPEG，首先，甲醛和壳聚糖上的氨基形成希弗氏碱，然后聚乙二醇单甲醚上的羟基和希弗氏碱发生加成反应生成聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖；

具体为：将壳聚糖(CS)溶解于甲酸(HCOOH)中，待其完全溶解后，加入二甲基亚砜(DMSO)稀释，随后加入聚乙二醇单甲醚(mPEG)，持续搅拌15min，最后加入质量分数为37％的甲醛(HCHO)溶液，继续反应4h，停止反应后，将反应液移至透析袋中，用去离子水透析3天，之后移至离心管中，在-46℃的条件下冷冻干燥3天，得到白色棉絮状产物，即可得到聚乙二醇改性壳聚糖(CS-g-mPEG)；

其中，壳聚糖在甲酸溶液中的浓度为10mg/mL，甲酸与二甲基亚砜的体积比为1：2，壳聚糖、聚乙二醇单甲醚与甲醛的质量比为1：12：1；

透析袋的截留分子量3500Da；

步骤2，利用N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)自由基聚合制备聚阴离子PNAM，具体为：

将单体NIPAm和单体AMPS溶解于混合溶剂中，将引发剂与单体混合液混合，然后在N

滴加时长为2-3h。引发剂为偶氮二异庚腈(AVBN)，引发剂的质量是单体NIPAm和单体AMPS总质量的1％；

混合溶剂由体积比为4：1的蒸馏水和1,4-二氧六环混合而成；

其中，NIPAm与AMPS的摩尔比为3:7，单体在混合溶剂中总浓度为0.5mol/L；

步骤3，以CS-g-mPEG作为聚阳离子，以PNAM作为聚阴离子，通过聚电解质复合法制备具有长循环性纳米药物载体；具体为：

步骤3.1，配制CS-g-mPEG的醋酸溶液和聚阴离子PNAM水溶液；并用1mol/L的NaOH溶液将CS-g-mPEG的醋酸溶液的pH调节至5；用1mol/L的NaOH溶液将聚阴离子PNAM水溶液的pH调节至5.5；

醋酸溶液的质量分数为1％；

CS-g-mPEG在醋酸溶液中的质量浓度为0.2mg/mL；聚阴离子PNAM水溶液的质量浓度为0.2mg/mL；

步骤3.2，在磁力搅拌的条件下，将聚阴离子PNAM溶液用注射器滴加至CS-g-mPEG的醋酸溶液中，滴加完毕后继续搅拌2h，用0.45μm的滤膜对反应液进行过滤，CS-g-mPEG醋酸溶液与PNAM水溶液的体积比为4：3，磁力搅拌的速度为900rpm；注射器的滴加速度为2μL/s。即可得到以CS-g-mPEG为壳、以PNAM为核的具有长循环性能纳米药物载体；其平均粒径为289.33nm，pdI为0.089。

实施例2

本发明一种具有长循环性纳米药物载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，采用一步法制备聚乙二醇改性壳聚糖CS-g-mPEG，首先，甲醛和壳聚糖上的氨基形成希弗氏碱，然后聚乙二醇单甲醚上的羟基和希弗氏碱发生加成反应生成聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖；

具体为：将壳聚糖(CS)溶解于甲酸(HCOOH)中，待其完全溶解后，加入二甲基亚砜(DMSO)稀释，随后加入聚乙二醇单甲醚(mPEG)，持续搅拌15min，最后加入质量分数为37％的甲醛(HCHO)溶液，继续反应4.5h，停止反应后，将反应液移至透析袋中，用去离子水透析3天，之后移至离心管中，在-46℃的条件下冷冻干燥3天，得到白色棉絮状产物，即可得到聚乙二醇改性壳聚糖(CS-g-mPEG)；

其中，壳聚糖在甲酸溶液中的浓度为10mg/mL，甲酸与二甲基亚砜的体积比为1：2，壳聚糖、聚乙二醇单甲醚与甲醛的质量比为1：12：1；

透析袋的截留分子量3500Da；

步骤2，利用N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)自由基聚合制备聚阴离子PNAM，具体为：

将单体NIPAm和单体AMPS溶解于混合溶剂中，将引发剂与单体混合液混合，然后在N

滴加时长为2h，引发剂为偶氮二异庚腈(AVBN)，引发剂的质量是单体NIPAm和单体AMPS总质量的1％；

混合溶剂由体积比为4：1的蒸馏水和1,4-二氧六环混合而成；

其中，NIPAm与AMPS的摩尔比为3:7，单体在混合溶剂中总浓度为0.5mol/L；

步骤3，以CS-g-mPEG作为聚阳离子，以PNAM作为聚阴离子，通过聚电解质复合法制备具有长循环性纳米药物载体；具体为：

步骤3.1，配制CS-g-mPEG的醋酸溶液和聚阴离子PNAM水溶液；并用1mol/L的NaOH溶液将CS-g-mPEG的醋酸溶液的pH调节至5；用1mol/L的NaOH溶液将聚阴离子PNAM水溶液的pH调节至5.5；

醋酸溶液的质量分数为1％；

CS-g-mPEG在醋酸溶液中的质量浓度为0.2mg/mL；聚阴离子PNAM水溶液的质量浓度为0.2mg/mL；

步骤3.2，在磁力搅拌的条件下，将聚阴离子PNAM溶液用注射器滴加至CS-g-mPEG的醋酸溶液中，滴加完毕后继续搅拌2h，用0.45μm的滤膜对反应液进行过滤，即可得到以CS-g-mPEG为壳、以PNAM为核的具有长循环性能纳米药物载体；其平均粒径为261.23nm，pdI为0.07；

CS-g-mPEG醋酸溶液与PNAM水溶液的体积比为4：4，磁力搅拌的速度为1000rpm；注射器的滴加速度为2μL/s。

实施例3

本发明一种具有长循环性纳米药物载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，采用一步法制备聚乙二醇改性壳聚糖CS-g-mPEG，首先，甲醛和壳聚糖上的氨基形成希弗氏碱，然后聚乙二醇单甲醚上的羟基和希弗氏碱发生加成反应生成聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖；

具体为：将壳聚糖(CS)溶解于甲酸(HCOOH)中，待其完全溶解后，加入二甲基亚砜(DMSO)稀释，随后加入聚乙二醇单甲醚(mPEG)，持续搅拌15min，最后加入质量分数为37％的甲醛(HCHO)溶液，继续反应5h，停止反应后，将反应液移至透析袋中，用去离子水透析3天，之后移至离心管中，在-46℃的条件下冷冻干燥3天，得到白色棉絮状产物，即可得到聚乙二醇改性壳聚糖(CS-g-mPEG)；

其中，壳聚糖在甲酸溶液中的浓度为10mg/mL，甲酸与二甲基亚砜的体积比为1：2，壳聚糖、聚乙二醇单甲醚与甲醛的质量比为1：12：1；透析袋的截留分子量3500Da；

步骤2，利用N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)自由基聚合制备聚阴离子PNAM，具体为：

将单体NIPAm和单体AMPS溶解于混合溶剂中，将引发剂与单体混合液混合，然后在N

滴加时长为2.5h，引发剂为偶氮二异庚腈(AVBN)，引发剂的质量是单体NIPAm和单体AMPS总质量的1％；

混合溶剂由体积比为4：1的蒸馏水和1,4-二氧六环混合而成；

其中，NIPAm与AMPS的摩尔比为3:7，单体在混合溶剂中总浓度为0.5mol/L；

步骤3，以CS-g-mPEG作为聚阳离子，以PNAM作为聚阴离子，通过聚电解质复合法制备具有长循环性纳米药物载体；具体为：

步骤3.1，配制CS-g-mPEG的醋酸溶液和聚阴离子PNAM水溶液；并用1mol/L的NaOH溶液将CS-g-mPEG的醋酸溶液的pH调节至5；用1mol/L的NaOH溶液将聚阴离子PNAM水溶液的pH调节至5.5；

醋酸溶液的质量分数为1％；

CS-g-mPEG在醋酸溶液中的质量浓度为1.0mg/mL；聚阴离子PNAM水溶液的质量浓度为1.0mg/mL；

步骤3.2，在磁力搅拌的条件下，将聚阴离子PNAM溶液用注射器滴加至CS-g-mPEG的醋酸溶液中，滴加完毕后继续搅拌2h，用0.45μm的滤膜对反应液进行过滤，即可得到以CS-g-mPEG为壳、以PNAM为核的具有长循环性能纳米药物载体；其平均粒径为333.67nm，pdI为0.117。

CS-g-mPEG醋酸溶液与PNAM水溶液的体积比为4：4，磁力搅拌的速度为1100rpm；注射器的滴加速度为2μL/s。

实施例4

本发明一种具有长循环性纳米药物载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，采用一步法制备聚乙二醇改性壳聚糖CS-g-mPEG，首先，甲醛和壳聚糖上的氨基形成希弗氏碱，然后聚乙二醇单甲醚上的羟基和希弗氏碱发生加成反应生成聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖；

具体为：将壳聚糖(CS)溶解于甲酸(HCOOH)中，待其完全溶解后，加入二甲基亚砜(DMSO)稀释，随后加入聚乙二醇单甲醚(mPEG)，持续搅拌15min，最后加入质量分数为37％的甲醛(HCHO)溶液，继续反应6h，停止反应后，将反应液移至透析袋中，用去离子水透析3天，之后移至离心管中，在-46℃的条件下冷冻干燥3天，得到白色棉絮状产物，即可得到聚乙二醇改性壳聚糖(CS-g-mPEG)；

其中，壳聚糖在甲酸溶液中的浓度为10mg/mL，甲酸与二甲基亚砜的体积比为1：2，壳聚糖、聚乙二醇单甲醚与甲醛的质量比为1：8：1；

透析袋的截留分子量3500Da；

步骤2，利用N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)自由基聚合制备聚阴离子PNAM，具体为：

将单体NIPAm和单体AMPS溶解于混合溶剂中，将引发剂与单体混合液混合，然后在N

滴加时长为3h，引发剂为偶氮二异庚腈(AVBN)，引发剂的质量是单体NIPAm和单体AMPS总质量的1％；

混合溶剂由体积比为4：1的蒸馏水和1,4-二氧六环混合而成；

其中，NIPAm与AMPS的摩尔比为3:7，单体在混合溶剂中总浓度为0.5mol/L；

步骤3，以CS-g-mPEG作为聚阳离子，以PNAM作为聚阴离子，通过聚电解质复合法制备具有长循环性纳米药物载体；具体为：

步骤3.1，配制CS-g-mPEG的醋酸溶液和聚阴离子PNAM水溶液；并用1mol/L的NaOH溶液将CS-g-mPEG的醋酸溶液的pH调节至5；用1mol/L的NaOH溶液将聚阴离子PNAM水溶液的pH调节至5.5；

CS-g-mPEG在醋酸溶液中的质量浓度为0.2mg/mL；聚阴离子PNAM水溶液的质量浓度为0.2mg/mL；

步骤3.2，在磁力搅拌的条件下，将聚阴离子PNAM溶液用注射器滴加至CS-g-mPEG的醋酸溶液中，滴加完毕后继续搅拌2h，用0.45μm的滤膜对反应液进行过滤，即可得到以CS-g-mPEG为壳、以PNAM为核的具有长循环性能纳米药物载体；其平均粒径为617.05nm，pdI为0.107。

CS-g-mPEG醋酸溶液与PNAM水溶液的体积比为4：1，磁力搅拌的速度为1200rpm；注射器的滴加速度为2μL/s。

实施例5

本发明一种具有长循环性纳米药物载体的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，采用一步法制备聚乙二醇改性壳聚糖CS-g-mPEG，首先，甲醛和壳聚糖上的氨基形成希弗氏碱，然后聚乙二醇单甲醚上的羟基和希弗氏碱发生加成反应生成聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖；

具体为：将壳聚糖(CS)溶解于甲酸(HCOOH)中，待其完全溶解后，加入二甲基亚砜(DMSO)稀释，随后加入聚乙二醇单甲醚(mPEG)，持续搅拌15min，最后加入质量分数为37％的甲醛(HCHO)溶液，继续反应6h，停止反应后，将反应液移至透析袋中，用去离子水透析3天，之后移至离心管中，在-46℃的条件下冷冻干燥3天，得到白色棉絮状产物，即可得到聚乙二醇改性壳聚糖(CS-g-mPEG)；

其中，壳聚糖在甲酸溶液中的浓度为10mg/mL，甲酸与二甲基亚砜的体积比为1：2，壳聚糖、聚乙二醇单甲醚与甲醛的质量比为1：8：1；

透析袋的截留分子量3500Da；

步骤2，利用N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)自由基聚合制备聚阴离子PNAM，具体为：

将单体NIPAm和单体AMPS溶解于混合溶剂中，将引发剂与单体混合液混合，然后在N

滴加时长为3h，引发剂为偶氮二异庚腈(AVBN)，引发剂的质量是单体NIPAm和单体AMPS总质量的1％；

混合溶剂由体积比为4：1的蒸馏水和1,4-二氧六环混合而成；

其中，NIPAm与AMPS的摩尔比为3:7，单体在混合溶剂中总浓度为0.5mol/L；

步骤3，以CS-g-mPEG作为聚阳离子，以PNAM作为聚阴离子，通过聚电解质复合法制备具有长循环性纳米药物载体；具体为：

步骤3.1，配制CS-g-mPEG的醋酸溶液和聚阴离子PNAM水溶液；并用1mol/L的NaOH溶液将CS-g-mPEG的醋酸溶液的pH调节至5；用1mol/L的NaOH溶液将聚阴离子PNAM水溶液的pH调节至5.5；

CS-g-mPEG在醋酸溶液中的质量浓度为0.4mg/mL；聚阴离子PNAM水溶液的质量浓度为0.4mg/mL；

步骤3.2，在磁力搅拌的条件下，将聚阴离子PNAM溶液用注射器滴加至CS-g-mPEG的醋酸溶液中，滴加完毕后继续搅拌2h，用0.45μm的滤膜对反应液进行过滤，即可得到以CS-g-mPEG为壳、以PNAM为核的具有长循环性能纳米药物载体；其平均粒径为536.15nm，pdI为0.202。

CS-g-mPEG醋酸溶液与PNAM水溶液的体积比为4：2，磁力搅拌的速度为1500rpm；注射器的滴加速度为2μL/s。