用于确定光学介质的折射率的方法和显微镜

技术领域

本发明涉及一种用于确定显微镜中的光学介质的折射率的方法，该显微镜具有面向样本空间的物镜，其中，具有待确定的折射率的光学介质是两种光学介质之一，这些光学介质在样本空间中与盖玻片或载玻片的两个相反的表面邻接，由此形成两个部分反射的界面，这些界面相距物镜以不同的间距布置。本发明还涉及一种显微镜，其带有用于确定光学介质的折射率的机构。

背景技术

样本的光纤维成像受不同的光学介质影响，这些介质在显微镜的样本空间中彼此邻接。这些光学介质由于它们的折射率不同而形成了界面，在这些界面处折射率跳跃式地变化。这些界面中的每一个都根据那里的折射率突变有多大而不同地影响到光学成像。尤其是球面像差受折射率的跳跃式变化的显著影响。参与成像的光学介质通常包括盖玻片或载玻片以及从相反侧与盖玻片或载玻片邻接的两种介质。后者例如由位于盖玻片或载玻片与物镜之间的浸没介质和在样本周围的包埋介质构成。

为了能够实现有效地矫正受折射率的跳跃式变化影响的成像误差，重要的是，知道所用光学介质的折射率。在此，往往事先以较高的精度知道盖玻片或载玻片的和浸没介质的折射率。但这并不适用于在样本周围的包埋介质的折射率。该折射率因此要在专门为此规定的测量中在显微镜之外或之内求取。

在显微镜之外测量折射率牵涉到在测量之后进行的样本制备的不可衡量性。在显微镜之外得到的测量值与在光显微成像中实际上起作用的折射率的关系无法得到保证。因而在有些情况下，例如在活细胞显微术中，包埋介质的折射率显著地受样本影响，因而在显微制备之外根本就无法以足够的精度测量。

DE 10 2006 021 996 A1公开了一种用于内部全反射显微术(简写为TIRF)的显微镜，其能实现确定显微镜内部的折射率。该TIRF显微镜包括物镜，利用该物镜对样本施加以瞬逝的照明。在样本上全反射的照明光借助探测器予以检测。在样本上反射的照明光的强度在跃迁处从最大值下降到零，借助该跃迁来确定全反射的入射角。然后基于入射角来求取折射率。但对折射率的这种确定需要具有高数值孔径的浸没物镜，以便能够在全反射情况下照明样本。这种物镜制造繁琐，因而昂贵。

关于现有技术，还参见DE 10 2010 030 430 A1，其中公开了一种用于显微镜的三角自动聚焦机构。该自动聚焦机构在样本上产生狭缝图像，该狭缝图像成像到对位置灵敏的探测器上。通过由探测器检测到的入射位置来控制自动聚焦。

发明内容

本发明的目的是，提出能实现简单地且精确地确定光学介质的折射率的方法和显微镜。

该目的通过根据权利要求1的方法和根据权利要求9的显微镜得以实现。有利的改进分别在从属权利要求中给出。

根据本发明的方法用于确定在显微镜中的光学介质的折射率，该显微镜具有面向样本空间的物镜，其中，带有待确定的折射率的光学介质是两种光学介质之一，这些光学介质在样本空间中与盖玻片或载玻片的两个相反的表面邻接，并且由此形成两个部分反射的界面，这些界面相距物镜以不同的间距布置。在该方法中，使得测量光束透过物镜在倾斜地入射情况下转向至盖玻片或载玻片。产生两个在空间上彼此分开的反射光束，其方式为，使得测量光束分别部分地在两个界面上反射。使得两个反射光束被物镜接收，并且转向至对位置灵敏的探测器。借助对位置灵敏的探测器来检测两个反射光束的强度。基于两个反射光束的所检测的强度来求取光学介质的折射率。

在本申请中，盖玻片或载玻片尤其是指遮盖样本的盖玻片、载物片、皮氏培养皿的底部或者微量滴定板的阱底部。

两个反射光束的强度与测量光束在两个界面上的反射和透射有关，这些界面通过盖玻片或载玻片和从相反侧与盖玻片或载玻片邻接的两种光学介质来规定。两个在空间上彼此分开的反射光束的强度最终基于反射和透射过程，这些过程因而主要由盖玻片或载玻片的以及与盖玻片或载玻片邻接的光学介质的折射率决定。如果盖玻片或载玻片的折射率以及与其邻接的两种光学介质之一的折射率是已知的，则可以由通过对位置灵敏的探测器检测到的强度和对测量光束在样本空间中的入射角度的了解，可靠地确定另一种介质的折射率。

使得测量光束倾斜地转向至盖玻片或载玻片，由此实现两个反射光束的在空间上的分开。由于两个部分反射的界面在轴向上相互错开，也就是说，沿着物镜的光学轴线彼此间隔开，所以，测量光束倾斜地入射到两个界面上负责使得两个反射光束在不同的光路上反射回到物镜中。结果，于是可以在对位置灵敏的探测器上在不同的入射地点彼此分开地检测两个反射光束。

本发明能实现简单且精确地确定显微镜内部的光学介质的折射率。这可以有益地用于调节其它的显微镜参数。特别地，本发明能实现针对不同的包埋介质在显微镜物镜上规定的矫正调节的自动化，其方式例如为，根据所求取的折射率自动地控制在显微镜物镜中含有的矫正透镜。也可行的是，根据所求取的折射率，在反卷积的过程中对点扩展函数进行建模。

在一种有利的改进中，一种光学介质的折射率与另一种光学介质的折射率、盖玻片或载玻片的折射率和测量光束的数值孔径相关地求取。在此，测量光束的数值孔径可以通过物镜的焦距和测量光束在物镜光瞳中的位置来确定。

两个界面的反射率和透射率、盖玻片或载玻片的折射率和规定了相应的界面的光学介质的折射率及测量光束的数值孔径通过所谓的菲涅耳公式相互关联。反射率和透射率可以基于两个反射光束的强度来确定。此外如果盖玻片或载玻片的折射率、测量光束的数值孔径以及两种光学介质之一的折射率是已知的，则可以简单地计算出另一种介质的折射率。

在一种优选的实施方式中，一种光学介质的折射率基于两个反射光束的强度比例来求取。由此，根据本发明对折射率的测量仿佛是自我参照的。这意味着，折射率可以无关于测量光束的强度来确定，也就是说，无需知道该强度。

优选地，把测量光束引入物镜的入射光瞳的部分区域中，该部分区域相对于入射光瞳的中心错开。通过这种方式，物镜的入射光瞳被测量光束偏心地照明，由此使得测量光束在从物镜出来时相对于物镜的光学轴线倾斜。对入射光瞳的这种偏心的照明于是能实现以特别简单的方式使得在两个界面上产生的反射光束按所希望地在空间上分开。这些反射光束于是优选被引回到物镜中，从而它们在与测量光束的传播方向相反的方向上经过入射光瞳的相对于入射光瞳的前述部分区域错开的另一部分区域。

在一种有利的设计中规定，通过测量光束在两个界面上分别产生测量图样，两个测量图样被两个反射光束成像到对位置灵敏的探测器上。于是例如可行的是，相应的测量图样以狭缝光阑图像的形式产生，该狭缝光阑是发出测量光束的光源的一部分或者置于该光源之前。

优选地，以在空间上的强度分布的形式来检测成像到对位置灵敏的探测器上的两个测量图样，由该强度分布来确定两个反射光束的强度。如果成像到对位置灵敏的探测器上的测量图样例如由狭缝光阑的图像产生，则得到前述的强度分布，其方式为，沿着与狭缝光阑的纵向方向平行的方向，对探测器上的相应的光圈图像予以积分。相应的光圈图像的在探测器上检测到的位置，在这种情况下通过在强度分布中出现的峰值得到体现，该位置与在相关的部分反射的界面与物镜之间的间距有关。

优选地，根据本发明要确定其折射率的光学介质，是用于样本的包埋介质，该包埋介质与盖玻片或载玻片的两个表面之一邻接。在这种情况下，其折射率从一开始就已知的另一种光学介质，优选是浸没介质，该浸没介质一方面与盖玻片或载玻片的另一表面邻接，另一方面与物镜邻接。但不言而喻的是，根据本发明的方法不局限于此。因而可行的是，求取任何任意的介质的折射率，只要该折射率直接与盖玻片或载玻片的两个界面之一邻接，并且由此形成部分反射的界面。

根据本发明的显微镜包括带有盖玻片或载玻片和两种光学介质的样本空间、指配于样本空间的物镜、两个部分反射的界面以及用于确定两种光学介质之一的折射率的机构，这些界面在样本空间中相距物镜不同间距地布置，并以如下方式形成：两种光学介质在样本空间中与盖玻片或载玻片的两个相反的表面邻接。前述机构被设计用来使得测量光束透过物镜在倾斜地入射情况下转向至盖玻片或载玻片。此外，该机构被设计用于产生两个在空间上彼此分开的反射光束，其方式为，使得测量光束分别部分地在两个界面上反射。该机构具有对位置灵敏的探测器，并且被设计用于使得两个反射光束被物镜接收并且转向到对位置灵敏的探测器上。对位置灵敏的探测器被设计用于检测两个反射光束的强度。被设置用来确定折射率的机构还包括求取单元，该求取单元被设计用来基于两个反射光束的所检测的强度来求取光学介质的折射率。

优选地，该机构具有带光阑开口的孔径光阑，该孔径光阑相对于物镜的光学轴线偏心地间隔开地布置。孔径光阑限定测量光束的横截面，使得测量光束偏心地照明物镜的入射光瞳，并且由此相对于光学轴线倾斜地从物镜中射出。通过这种方式确保，在两个部分反射的界面上产生的反射光束可以在空间上彼此分开地引回到物镜中，并最终在对位置灵敏的探测器上在不同的入射地点被检测。偏心地照明物镜的入射光瞳还具有如下优点：避免靠近轴线的光分量，其引起所谓的一阶反射，所述反射在形成物镜的透镜的面顶点处最强地产生并且使信号噪声比变差。

在一种优选的设计中，该机构具有光源，所述光源发出在红外波长范围内的测量光束。这具有如下优点：通过测量光束在盖玻片或载玻片上产生的测量图样对于人的眼睛不可见，因而不会干扰利用显微镜观察样本。但同样可行的是，采用在可见波长范围内的测量光束。如果测量光束由红外波长范围内的光构成，则可以借助合适的介质模型或者矫正来推断出在可见光谱范围内的折射率。

优选地，对位置灵敏的探测器是行扫描探测器，其经过设计，从而它能检测两个反射光束的强度分布的整体，该强度分布体现了测量图样的两个图像。替代地，对位置灵敏的探测器也可以设计成面探测器，例如二维的CCD-摄像机。

在一种有利的设计中，求取单元具有存储器，在该存储器中可存储用于求取光学介质的折射率的参数。由此例如可行的是，针对多个显微镜组件预备好对于确定折射率关键的参数，这些显微镜组件根据应用而定有选择地在显微镜中使用。于是可以比如存储不同浸没介质的和不同盖玻片或载玻片的折射率，以及存储不同物镜的光学数据，且根据需要为了确定所搜寻的折射率而读出。

优选地，盖玻片或载玻片的相反的表面相互平面平行地设计。

根据本发明的机构由于其当前介绍的结构特性和功能特性，也适合于在显微镜中用作自动聚焦机构。此外，该机构由于其特性而提供了如下可行性：除了光学介质的折射率外，还确定其它的影响光学显微成像的参数，比如盖玻片或载玻片的厚度和/或斜度。

本发明可应用于多种类型的显微镜，例如倒置式或直立式透射光显微镜。

附图说明

下面借助附图详述本发明。其中：

图1为作为第一实施例的倒置式透射光显微镜的示意图；

图2示出被指定用于确定光学介质的折射率的机构，该机构是根据图1的显微镜的一部分；

图3为示意图，其示出根据图1的显微镜的样本空间；

图4示出通过根据图2的机构的对位置灵敏的探测器检测的强度分布；

图5为流程图，其示出根据本发明的用于确定折射率的方法的一种特殊的实施方式；

图6示出一种特性曲线，其表明两个反射光束的强度与包埋介质的折射率的比例；

图7为直立式透射光显微镜的示意图，其形成根据本发明的显微镜的第二实施例。

具体实施方式

图1示出作为第一实施例的显微镜10，根据本发明的折射率确定可应用于该显微镜。

显微镜10设计成倒置式透射光显微镜。该显微镜因而包括物镜12以及光源16，该物镜从下面面向图1中用标号14标出的样本空间，该光源从上面朝向样本空间14。显微镜10还具有带目镜20的镜筒18，操作人员经由该目镜可以观察通过物镜12捕获的样本图像。此外设置了控制单元22，其控制各种不同的显微镜组件。

用于遮盖图1中未明确示出的样本的盖玻片24位于显微镜10的样本空间中。光学的介质26位于盖玻片24上，样本嵌入该介质中，并且该介质在后面称为包埋介质26。在样本空间14中还布置了浸没介质28，该浸没介质在图1中从上面与物镜12邻接，从下面与盖玻片24邻接。

显微镜10还具有在图1中整体标有标号30的机构，该机构用于求取容纳样本的包埋介质26的折射率。该机构在图2中更详细地示出。

如图2中所示，机构30具有光源32，该光源发出在红外波长范围内的测量光束34。光源32例如是具有狭缝光阑33的LED，测量光束34透过该狭缝光阑朝向照明光学件36。在经过照明光学件36之后，测量光束34射到孔径光阑38上，该孔径光阑居中地位于照明光学件36的光学轴线O1上并且具有光阑开口39，该光阑开口偏心地与照明光学件36的光学轴线O1间隔开地布置。孔径光阑38的光阑开口限定了测量光束34的光横截面，使得测量光束34的仅仅在图2中位于照明光学件36的光学轴线O1下方的部分在转向棱镜40的方向上经过孔径光阑。

在其光横截面上受限的测量光束34在转向棱镜40上反射到传输光学件42中，该传输光学件由沿着其光学轴线O2可移动的聚焦透镜44、散射光光阑46和另一透镜48构成。在经过传输光学件42之后，测量光束34射到二色性的分光器50上，该分光器反射红外波长范围内的光，而它传输可见范围内的光。通过二色性的反射镜50，测量光束34朝向物镜12反射。在此，在二色性的反射镜50上反射的测量光束34与物镜12的光学轴线O3平行错开地伸展。通过这种方式，测量光束34被导入物镜12的入射光瞳52的部分区域中，该部分区域相对于物镜12的光学轴线O3且进而相对于入射光瞳52的中心侧向地错开(参见图3)。物镜12的入射光瞳52因而偏心地照射，这导致测量光束34以角度α相对于光学轴线O3倾斜地转向到样本空间14中。

为简明起见，在根据图2的视图中省去了包埋介质26和浸没介质28，它们在样本空间14中从相反侧与盖玻片24邻接。在下面倾斜地入射到样本空间14中的测量光束34，如下面参照图3详述，在盖玻片24上反射，由此产生两个返回到物镜12中的反射光束，这些反射光束在根据图2的示意图中(不同于根据图3的详图)以唯一的用54标出的光束的形式被示出。

在经过物镜12之后，两个反射光束54射到二色性的反射镜50上，该反射镜使得反射光束54转向到传输光学件42中。在经过传输光学件42之后，反射光束54射到转向棱镜40上，该转向棱镜使得反射光束54反射到探测光学件56上。探测光学件56使得反射光束54朝向光谱滤光器58，该光谱滤光器只能让红外波长范围内的光透过，却阻止在该波长范围之外的散射光。透过光谱滤光器58传输的反射光束54最终射到对位置灵敏的探测器60上，该探测器能够位置分辨地检测反射光束54的强度。

在图2中，为完整起见，也示出了通过二色性的反射镜50实现使得镜筒18与机构30耦接。据此，二色性的反射镜50在当前的实施例中也用于把可见的探测光62通过传输而供应给镜筒18，该探测光用于真正的显微镜成像，物镜12把该探测光从样本空间14引向二色性的反射镜50。

在图3中详细地示出如何通过测量光束的反射来产生两个(在图3中用54a、54b标出)反射光束，这些反射光束根据本发明用来确定包埋介质26的折射率。因此，偏心地照射物镜12的入射光瞳52的测量光束34透过物镜12以角度α相对于光学轴线O3倾斜地转向到盖玻片24的面向物镜12的、在图3中用64标出的正面。由于盖玻片24和与其正面64邻接的浸没介质28具有不同的折射率，盖玻片24的正面64和与邻接的浸没介质28形成了第一界面，入射的测量光束34在该界面上部分地被反射。测量光束的在该第一界面上反射的部分产生了被引回到物镜12中的第一反射光束54a。

测量光束34的透过第一界面的另一部分66，在进入到盖玻片24中时离开物镜12的光学轴线O3折射，并与该光学轴线夹成一个比角度α大的角度β。测量光束34的该透射的部分66部分地在第二界面上反射，该第二界面由盖玻片24的背面68和与其邻接的包埋介质26限定，该包埋介质具有不同于盖玻片24的折射率。通过测量光束34的在第二界面上的所述第二次部分反射，产生了第二反射光束54b，该第二反射光束穿过盖玻片24的正面64，然后回到物镜12中。

如根据图3的视图中所示，测量光束34倾斜地入射到样本空间14中，这使得通过在盖玻片24的正面64或背面68上的两次部分反射而产生的反射光束54a、54b在不同的光路上回到物镜12中。通过这种方式，两个反射光束54a、54b在不同的入射地点射到对位置灵敏的探测器60上。换句话说，在盖玻片24的正面64或背面68上以狭缝图像的形式产生的两个测量图样在空间上彼此分开地成像到对位置灵敏的探测器60上，如根据图4的曲线图中所示。

图4示出示范性两个反射光束54a、54b共同地在对位置灵敏的探测器60上产生的强度分布V。在此，该曲线图的横坐标70表明在探测器60上的入射地点，纵坐标72表明在相应的入射地点测得的强度。根据图4的强度分布V示出了两个峰值，其中的用P1标出的峰值指配于第一反射光束54a，用P2标出的峰值指配于第二反射光束54b。由峰值P1比峰值P2高且尖锐的情况可以看出，在根据图3的例子中，测量光束34聚焦到盖玻片24的正面64上。这意味着，在盖玻片24的正面64上产生光源32的狭缝光阑33的聚焦图像，而在盖玻片24的背面68上产生狭缝光阑33的相比之下失焦的图像。这在如下方面相应于根据图3的视图：第一次部分反射在盖玻片24的正面64上在以物镜12的光学轴线O3为中心的点上发生。相比之下，第二次部分反射在盖玻片24的背面38上在对此横向于光学轴线O3错开的点上发生。在图4中所示的峰值P1、P2下方的面积分别是相应的反射光束54a、54b的强度的量度。

图5示出流程图，其纯示范性地示出根据本发明如何能够求取包埋介质26的折射率。

在第一步骤S1中，把测量光束34透过物镜12引入到样本空间18中。在经过浸没液体28之后，测量光束34如图3中所示以角度α倾斜地射到盖玻片24的正面64上。角度α可以由物镜12与盖玻片24的正面64之间的间距以及测量光束34的数值孔径来确定。在此，测量光束34的数值孔径借助物镜12的焦距和测量光束34在物镜12的入射光瞳52中的位置来产生，或者借助孔径光阑38的光阑开口39的位置和放大比例来产生，孔径光阑38以该放大比例成像到物镜12的入射光瞳52中。

在第二步骤S2中，通过在盖玻片24的正面64和背面68上的两次部分反射来产生两个在空间上彼此分开的反射光束54a、54b。

在第三步骤S3中，把两个反射光束54a、54b引到对位置灵敏的探测器60上。由于两个反射光束54a、54b在空间上彼此分开，它们在不同的入射地点射到对位置灵敏的探测器60上。

在第四步骤S4中，通过对位置灵敏的探测器60来检测两个反射光束54a、54b的在后续称为I

在第五步骤S5中，最后基于两个反射光束54a、54b的强度I

下面将介绍如何能够具体地计算两个反射光束54a和54b的强度I

反射光束54a的强度I

I

在此，R

反射光束54b的强度I

I

在此，R

两个强度I

因此，当前情况是一种自我参照式的测量。可以基于光学介质26、28的在界面64、68上的折射率和和入射的测量光束34的数值孔径，借助菲涅耳公式(见BORN和WOLF，光学原理，剑桥大学出版社，第7版，1999年，第40至45页)来确定反射率和透射率R

在已知测量光束34的数值孔径且已知浸没介质28与盖玻片24的折射率情况下，包埋介质26的折射率是唯一的未知数，且可以借助关系式(3)来确定。这可以分析地进行，通过数值分析来进行，或者借助具有用表格列出的值的查询表和插值来进行。

图6示出了一种示范性的特性曲线K，其表明了两个强度I

图7示出一种显微镜78，其与图1中所示的显微镜10不同地被设计成直立式透射光显微镜。在此，在图7中与根据图1的显微镜10的组件相应的那些显微镜组件标有已经在图1中用过的标号。

不同于根据图1的实施方式，对于图7中所示的显微镜，物镜12布置在样本空间18的上方，而光源16位于样本空间18的下方。相应地，浸没介质28位于盖玻片24的上方，而包埋介质26布置在盖玻片24的下方，该浸没介质一方面与物镜12邻接，另一方面与盖玻片24邻接，包埋介质的折射率根据本发明要予以确定。

对于根据图7的显微镜78，根据本发明确定包埋介质28的折射率按与图1中所示的显微镜10相同的方式来进行。

本发明已在前面借助特殊的实施例介绍过了。不言而喻，本发明并不局限于这些实施例，而是可以有一系列变型。

因而在根据图3的例子中，在盖玻片24的正面64上产生狭缝光阑33的聚焦的图像，且在盖玻片64的背面68上产生该狭缝光阑的失焦的图像。但相反的情况同样是可行的，从而在盖玻片24的背面68上产生聚焦的狭缝图像，且在该盖玻片的正面64上产生聚焦的狭缝图像。聚焦平面也可以位于盖玻片24内部，从而两个狭缝图像都不聚焦。

附图标记清单

10 显微镜

12 物镜

14 样本空间

16 光源

18 镜筒

22 控制单元

20 目镜

24 盖玻片

26、28 光学介质

30 机构

32 光源

33 狭缝光阑

34 测量光束

36 照明光学件

38 孔径光阑

39 光阑开口

40 转向棱镜

42 传输光学件

44 聚焦透镜

46 散射光光阑

50 分光器

52 入射光瞳

54、54a、54b 反射光束

56 探测光学件

58 光谱滤光器

60 探测器

62 成像光路

64、68 表面

66 透射的测量光束

70、74 横坐标

72、76 纵坐标

K 特性曲线

O1、O2、O3 光学轴线

P1、P2 峰值

V 强度分布

α、β 角度