抗菌色天光肽及其制备方法与用途

技术领域

本发明提供了一种抗菌寡肽，特别是一种抗菌色天光肽及其制备方法和用途，属于生物技术领域。

背景技术

随着水产养殖的扩大化生产和水产养殖环境的不断恶化，一些水生性致病菌也呈现上升趋势，严重威胁着水产养殖户们的日常养殖，所以尽快研究出一种有效抑制水产致病菌的抗菌肽迫在眉睫。生物活性肽是涉及生物体内多种细胞功能的生物活性物质，在生物体内已发现几百种，不同的生物肽具有不同的结构和生理功能，如抗病毒、抗癌、抗血栓、抗高血压、免疫调节、激素调节、抑菌、降胆固醇等作用。寡肽具有生物活性，从食品中提取的蛋白质可能对人体有益。随着对蛋白酶解技术的研究逐渐深入，发现介于蛋白质和氨基酸间的肽类物质在食品方面具有极强的活性、多样性，更高的安全性。根据市场需求，寡肽类物质已近越来越多的被应用于药物、化妆品以及保健品等各个领域。海洋肽在海洋生物中广泛分布，所以以资源丰富的海洋麻虾为原料，提高产品的附加值。从海洋海洋麻虾中分离出抗菌肽，可作为食品配方中的功能性成分，能促进消费者健康，提高食品的货架期。因此，开发出安全的抗菌肽具有广阔的应用前景。

据调查研究发现，很多不同来源的水解蛋白都具有一定的抗氧化和抗菌能力，包括陆源蛋白，例如核桃蛋白、大豆蛋白、花生蛋白、玉米蛋白、油料种子蛋白、小麦醇溶蛋白和蚕丝蛋白等的水解物都具有一定的抗氧化性；乳清蛋白、卵白蛋白等蛋白水解产物具有一定的抗菌性。但是与海洋来源的蛋白相比，陆源蛋白受到地域、成本、气候的影响比较大。而且水解所用的酶绝大多数为市售商品酶，水解所得产物相差不大。目前市场上已经形成商品化的合成化学抗菌剂，例如无机抗菌剂银、锌和铜离子，具有较强的抗菌能力。有机抗菌剂主要是以季铵盐类、双胍类、醇类、含氯类盐酸、(异)噻唑类、有机卤化物、有机金属化合物、酚类、吡啶类、咪唑类卤代烷基类、碘化物等。然而，以上的抗菌剂具有潜在的风险，易从环境中析出，易产生耐药性，分解产物有毒，安全性没有完全确定，应严格限制其使用。因此，开发安全的、天然的、能够代替传统抗生素药物的抗菌肽具有广阔的应用前景应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种来自海洋的抗菌活性好的抗菌色天光肽。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了前述抗菌色天光肽的制备方法。

本发明所要解决的再一个技术问题是提供了前述抗菌色天光肽的用途。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种抗菌色天光肽，其特点是：其氨基酸序列为：Trp-Asp-Cys。

本发明还公开了抗菌色天光肽的制备方法，其特点是：以海洋虾为原料，采用蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗菌色天光肽；所述酶解条件为：pH为5.0－8.0、温度20℃－40℃、酶解时间为2h－6h、酶-底物配比为800－1200U/g。

本发明所述的抗菌色天光肽的制备方法，其进一步优选的技术方案是：所述分离纯化的方法选自超滤、SDS-PAGE蛋白胶、Sephadex G-25离子交换色谱、RP-HPLC反相高效液相色谱中的一种或多种。

本发明所述的抗菌色天光肽的制备方法，其进一步优选的技术方案是：所述酶解条件为：pH为8.0、温度40℃、酶解时间为6h、酶-底物配比为1000U/g；所述蛋白酶为枝芽孢杆菌(virgibacillus sp)ST-1，保藏编号：CGMCC NO.17006所产的蛋白酶。

本发明所述的抗菌色天光肽的制备方法，其进一步优选的技术方案是：所述分离纯化的具体步骤为：

(1)酶解产物首先利用分子量截留范围为3KDa和10KDa的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为不同分子量范围不同的组分，分别为分子量大于10KDa的组分、分子量介于3KDa和10KDa的组分、分子量小于3KDa的组分；(2)收集具有抗氧化活性的组分，再用Sephadex G-25离子交换色谱进行分离，上样后洗去未吸附组分，再以纯水为洗脱液进行洗脱，流速为0.8ml/min，在280nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性和抗菌活性；利用蛋白质固相序列分析仪鉴定三个肽的氨基酸序列。

本发明所述的抗菌色天光肽的制备方法，其进一步优选的技术方案是：原料海洋虾为海洋麻虾，酶解前对海洋麻虾按以下方法进行处理：将冷冻后的海洋麻虾放在4℃的冰箱解冻12h，然后以1:1的比例加入纯水，搅拌混匀后，用匀浆机进行组织匀浆破碎，将匀浆后的液体干燥制粉。

本发明所述的抗菌色天光肽的制备方法，其进一步优选的技术方案是：海洋麻虾粉的酶解方法如下：

酶产自枝芽孢杆菌(virgibacillus sp)ST-1，其菌种保藏编号：CGMCC NO.17006，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2018年12月19日；

采用蛋白酶酶解海洋麻虾粉，酶解条件取pH为8.0、温度40℃、酶解时间为6h、酶与底物比为1000U/g，用1M的HCl调节pH稳定，水解6h后，沸水浴中灭酶15min，然后迅速冷却至室温，置于离心机中，以5000r/min离心20min，取上清液备用；

酶解产物的分离纯化方法如下：

将得到的酶解产物利用分子量截留范围为3KDa和10KDa的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于10KDa的组分、分子量介于 3KDa和10KDa的组分、分子量小于3KDa的组分；分别测得三组分子量不同的的超滤液的自由基清除活性。收集具有最佳抗氧化活性的组分，再用Sephadex G-25离子交换色谱进行分离，上样后，洗去未吸附组分，再以纯水为洗脱液进行洗脱，流速为0.8ml/min，在 280nm下进行测量；测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性和抗菌活性。

本发明还公开了抗菌色天光肽的另一种制备方法：采用肽合成方法或者合成与修饰方法合成得到抗菌色天光肽；所述的合成或修饰方法包括但不限于：生物合成、化学合成、酶催化合成、连接，加成，耦连或者衍生。

本发明抗菌色天光肽Trp-Asp-Cys可以采用生物法，化学法，酶法合成。也可以略加修饰后使用。

本发明还公开了色天光肽或肽化合物的用途所述的用途为将色天光肽作为有效成份在制备抑制微生物的生长繁殖或杀灭微生物的药物或药物组合物中的用途。

本发明还公开了色天光肽或肽化合物的另一种用途，所述的用途为将色天光肽作为有效成份在制备抑制革兰氏阴性细菌的药物或药物组合物中的用途。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明是一种天然抗菌剂，消除了人工合成抗菌剂以及抗生素所可能引起的残留及抗药性等副作用，可以取代传统的人工合成抗菌剂，其抗微生物活力高，特别是对水产病原细菌具有较强的抑制能力。它可改善我国对水产副产物利用率低的情况，既提高水产资源的利用，又能解除消费者对抗菌剂在食品安全方面的顾虑。

附图说明

图1为麻虾蛋白酶解物经超滤分离后的DPPH自由基的清除效果；

图2为麻虾蛋白酶解物的Sephadex G-25洗脱图；

图3为Sephadex G-25七个色谱分离组分对总抗氧化能力；

图4为峰3的MS/MS；

图5为各肽段的抗菌活性；

图6为色天光肽对副溶血弧菌的抑制作用；

图7为色天光肽的纯度；

图8为色天光肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌鳗弧菌以及副溶血弧菌的抑制作用。

具体实施方式

以下参照附图，进一步描述本发明的技术实施方式，以使本领域技术人员进一步地实现本发明，而不构成对本发明权利的限制。

实施例1，抗菌色天光肽的制备方法：

(1)海洋麻虾粉的制备

采用连云港海域捕捞所得的海洋麻虾；将冷冻后的海洋麻虾放在4℃的冰箱解冻12h，然后以1:1的比例加入纯水，搅拌混匀后，用匀浆机进行组织匀浆破碎，将匀浆后的液体干燥制粉。

(2)海洋麻虾粉的酶解

酶产自野生菌株枝芽孢杆菌(virgibacillus sp)ST-1，CGMCC NO.17006。

采用蛋白酶酶解海洋麻虾粉，酶解条件取pH为8.0、温度40℃、酶解时间为6h、酶与底物比为1000U/g，用1M的HCl调节pH稳定，水解6h后，沸水浴中灭酶15min，然后迅速冷却至室温，置于离心机中，以5000r/min离心20min，取上清液备用。

(3)酶解产物的分离、纯化

将得到的酶解产物利用分子量截留范围为3KDa和10KDa的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于10KDa的组分、分子量介于 3KDa和10KDa的组分、分子量小于3KDa的组分；分别测得三组分子量不同的的超滤液的自由基清除活性。收集具有最佳抗氧化活性的组分，再用Sephadex G-25离子交换色谱进行分离，上样后，洗去未吸附组分，再以纯水为洗脱液进行洗脱，流速为0.8ml/min，在 280nm下进行测量。测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性和抗菌活性。

(4)总抗氧化能力

将总计0.25mL的SPs水溶液与0.25mL的0.2M PBS溶液(pH 6.6)和0.25mL的1％K3Fe(CN)6混合，并将混合物在50℃下孵育20min。然后将0.25mL三氯乙酸(10％)加入到混合物中。将混合物以5000r/min离心10min。将0.5mL上清液与2.5mL蒸馏水和 0.1mL FeCl3(0.2％)混合。然后将混合物在室温下孵育10min。在700nm下测量混合物的吸光度。蒸馏水和GSH分别用作空白对照和阳性对照。所有样品均重复三次。

(5)抗菌活性鉴定

选取几种不同种类的细菌(含有革兰氏阳性和阴性细菌)进行培养，将配制成一定浓度的峰 3以3％的添加量加入到细菌培养基中，终浓度为50mM，以不添加肽的为空白。30℃，180 r/min，培养8h，在600nm下测得吸光值。

(6)抗菌肽的鉴定

利用RP-HPLC反相高效液相色谱对组分3进行鉴定，以含0.1％甲酸铵的浓度梯度为2～ 80％的乙腈溶液作为洗脱液进行线性洗脱，所用色谱柱为packed with AcclaimPepMap RPLC C18，5μm，上样量为20μL，流速为600nL/min，检测波长为215nm。结果显示峰3是一个含有多个活性肽组分的峰，需进一步分离。

(7)寡肽序列鉴定

利用液相色谱串联质谱LC-MS/MS的寡肽序列鉴定技术测定本发明的抗菌寡肽的氨基酸测定洗脱峰3的氨基酸序列。

(8)抗菌寡肽的合成

将所得到的肽段序列进行抑菌试验，其中序列Trp-Asp-Cys对水产致病微生物的抑菌效果最好。合成该抗菌肽，其纯度>95％，分子量为479.15Da。

实施例2，抗菌色天光肽的制备实验：

采用的仪器、检测手段如下：

应用超滤、Sephadex G-25离子交换色谱、RP-HPLC反相高效液相色谱等多种分离纯化手段，实现具有显著活性的抗菌肽的高效分离纯化。

利用Shimadzu液相色谱质谱仪(SHIMADZU LCMS-2020)和Applied Biosystems494蛋白固定测序仪测定纯化后的抗菌肽的分子量和氨基酸序列

实验方法如下：

称取10g海洋麻虾粉加入去离子水50mL溶解，然后用1M HCl将其pH调节至8.0。接着再按照酶-底物配比为1000U/g的比例加入相应量的酶，温度40℃，酶解时间为6h。接着在沸水浴中灭酶15min，冷却后再5000r/min离心20min，收集上清液备用。

将上清液用分子量截留范围为3KDa和10KDa的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于10KDa的组分、分子量介于3 KDa和10KDa的组分、分子量小于3KDa的组分，并测定其抗氧化活性(如图1所示)，可以看出小于3KDa的组分具有最好的抗氧化活性。

收集分子量小于3KDa的组分，再用Sephadex G-25离子交换色谱进行分离，上样后洗去未吸附组分，再以纯水为洗脱液进行洗脱，流速为0.8ml/min，在280nm下进行测量，见图2。收集并测定各吸收峰对应的洗脱组分的总抗氧化活(如图3所示)。可以看出，峰3具有最好的抗氧化活性。

将分离出来的峰3进行氨基酸测序和分子量鉴定(如图4所示)，将各肽段进行水生致病菌抑制试验，测定抗菌活性。具体方法：选取致病性细菌(含有革兰氏阳性和阴性细菌)进行培养，将配制成一定浓度的肽以3％的添加量加入到细菌培养基中，终浓度为50 mM，以不添加肽的为空白。30℃，180rpm，培养8h，在600nm下测得吸光值。如图5所示，色天光肽具有较好的抗菌活性。

将色天光肽以0、0.5、1、5、10mg/mL的浓度加入到以副溶血弧菌的培养基中培养24h，每隔2h测一次OD600nm，通过测得菌浓度判断色天光肽对副溶血弧菌抑菌活性 (如图6所示)。

利用RP-HPLC反相高效液相色谱对分离得到的抗氧化活性肽的纯度进行鉴定，以含 10mM乙酸铵的浓度梯度为5～27.5％的乙腈溶液作为洗脱液进行线性梯度洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μC18，上样量为20μL，流速为l ml/min，检测波长为215nm，结果显示，其为单一的峰，说明其已经达到较高纯度(如图7所示)。

色天光肽抗菌活性检测：在培养基中添加色天光肽达到终浓度为：1mg/mL,10 mg/mL,不添加为对照，培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，鳗弧菌以及副溶血弧菌，30℃，180rpm，培养8h，在600nm下测得吸光值。结果表明：色天光肽具有很强的抑制致病菌的能力，由图8可以看出，它对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，鳗弧菌以及副溶血弧菌均有很强的抑制作用。

利用蛋白质固相测序仪利用蛋白质固相测序仪Applied Biosystems 494测定纯化后的抗氧化活性肽的氨基酸序列。得到其氨基酸全序列为：Trp-Asp-Cys(分子量为479.15Da)。