新型昆虫抑制性蛋白

相关申请的引用

本申请要求2019年1月22日提交的美国临时申请号62/795,066的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。

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技术领域

本发明总体上涉及昆虫抑制性蛋白领域。公开了一类表现出针对作物和种子的农业相关害虫的昆虫抑制活性的新型蛋白质。特别地，所公开类别的蛋白质针对作物和种子的农业相关害虫、特别是昆虫害虫的鳞翅目物种具有杀虫活性。提供了含有编码所公开的毒素蛋白中的一种或多种的重组多核苷酸构建体的植物、植物部分和种子。

发明背景

提高农业重要植物的作物产量变得越来越重要，所述植物包括玉米、大豆、甘蔗、水稻、小麦、蔬菜和棉花等。除了对食物、衣服的农产品的需求不断增长和为不断增长的人群体提供能源之外，预计气候相关的影响以及人口增长对除农业实践以外的土地使用的压力还会减少可用于农业的耕地的数量。这些因素导致对粮食安全的严峻预测，特别是在植物生物技术和农艺实践没有重大改进的情况下。鉴于这些压力，技术、农业技术和病虫害治理的环境可持续改进是在有限量的可用于农业的耕地上扩大作物产量的重要工具。

昆虫，特别是鳞翅目和鞘翅目内的昆虫，被认为是损害田作物、从而降低受侵扰地区的作物产量的主要原因。对农业产生负面影响的鳞翅目害虫物种包括但不限于黑粘虫(莎草粘虫)、小地老虎(地蚕)、玉米穗虫(谷实夜娥)、棉叶虫(棉叶波纹夜蛾)、小菜蛾(小菜蛾)、欧洲玉米螟(玉米螟)、秋粘虫(草地贪夜蛾)、Cry1Fa1抗性秋粘虫(草地贪夜蛾)、旧世界棉铃虫(OWB，棉铃虫)、南方粘虫(南部灰翅夜蛾)大豆尺蠖(大豆夜蛾)、斑点棉铃虫(翠纹钻夜蛾)、西南玉米螟(Southwestern corn borer/Diatraea grandiosella)、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)、斜纹夜蛾(Tobacco cutworm/Spodoptera litura，也被称为簇毛虫)、西部豆切根虫(豆白缘切根虫)以及藜豆毛虫(藜豆夜蛾)。

历史上，依靠合成化学杀虫剂的广泛应用作为农业中的害虫防治剂。除了新出现的抗药性问题外，对环境和人类健康的关注也刺激了生物杀虫剂的研究与开发。这项研究工作带来了各种昆虫病原性微生物物种(包括细菌)的逐步发现和使用。

当发现和发展了昆虫病原性细菌、特别是属于芽孢杆菌属的细菌作为生物害虫防治剂的潜力时，生物防治范式发生了转变。由于已发现细菌苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株表现出针对特定昆虫的高毒性，因此已将Bt菌株用作杀虫蛋白的来源。已知Bt菌株产生δ-内毒素，所述δ-内毒素在孢子形成开始时和在静止生长期期间位于伴孢晶体包涵体内(例如Cry蛋白)，并且还已知产生分泌的杀虫蛋白。在易感昆虫摄食后，δ-内毒素以及分泌的毒素在中肠上皮表面发挥作用，从而破坏细胞膜，导致细胞破裂和死亡。还已经在除Bt以外的细菌物种中鉴定了编码杀虫蛋白的基因，所述细菌物种包括其他芽孢杆菌(Bacillus)和多种多样的另外细菌物种，如侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)(“Ls”以前称为球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus))、日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)和缓病类芽孢杆菌(Paenibacillus lentimorbus)。

结晶和分泌的可溶性杀虫毒素对它们的宿主具有高度特异性，并且已被全世界公认为化学杀虫剂的替代品。例如，杀虫毒素蛋白已被用于各种农业应用中，以保护农业上重要的植物免受昆虫侵扰，减少对化学杀虫剂施加的需求，并提高产量。杀虫毒素蛋白通过机械方法，如喷洒以将含有多种细菌菌株的微生物制剂分散到植物表面上，并通过使用遗传转化技术来产生表达杀虫毒素蛋白的转基因植物和种子而防治农作物的农业相关害虫。

表达杀虫毒素蛋白的转基因植物的使用已得到全球适应性。例如，在2016年，用表达Bt毒素的转基因作物种植了2310万公顷，并且用表达Bt毒素并具有除草剂耐受性性状的转基因作物种植了7540万公顷(ISAAA.2016.Global Status of CommercializedBiotech/GM Crops:2016.ISAAA Brief No.52.ISAAA:Ithaca,NY)。转基因防昆虫作物的全球使用以及在这些作物中使用的杀虫毒素蛋白的数量有限对于现有昆虫等位基因产生了选择压力，所述昆虫等位基因赋予对目前利用的杀虫蛋白的抗性。

目标害虫对杀虫毒素蛋白的抗性的发展产生对发现和开发新形式的杀虫毒素蛋白的持续需求，所述新形式的杀虫毒素蛋白可用于管理表达杀虫毒素蛋白的转基因作物的昆虫抗性的增加。具有改进的功效并且表现出对更广泛的易感昆虫物种的防治的新型蛋白质毒素将减少可发展抗性等位基因的存活昆虫的数量。另外，在一种植物中使用两种或更多种对同一昆虫害虫有毒并展示不同作用方式的转基因杀虫毒素蛋白降低任何单一目标昆虫物种中抗性的可能性。

因此，发明人在本文中公开了来自缓病类芽孢杆菌的新型蛋白质毒素家族，以及表现出针对目标鳞翅目物种的杀虫活性的类似毒素蛋白、变体蛋白和示例性重组蛋白。

发明内容

本文公开了一组具有昆虫抑制活性的新型杀虫蛋白(毒素蛋白)，在本文中称为TIC7941(属于TIC7941蛋白毒素类别)，其显示表现出针对作物的一种或多种害虫的抑制活性。所述TIC7941蛋白和TIC7941蛋白毒素类别中的蛋白质可单独使用，或者与其他杀虫蛋白和毒性剂组合用于制剂和植物体内，从而提供当前在农业系统中使用的杀虫蛋白和杀虫剂化学品的替代物。

在一个实施方案中，本申请中公开了一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含与编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段可操作连接的异源启动子片段，其中(a)所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或(b)所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(c)所述多核苷酸区段与具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的核苷酸序列的多核苷酸杂交；或(d)所述编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％序列同一性的多核苷酸序列；或(e)所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自由以下组成的组：质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒和细菌或酵母人工染色体。所述重组核酸分子可包含用于在植物中表达杀虫蛋白的序列；或在植物细胞中表达以产生杀虫有效量的杀虫蛋白。

在本申请的另一个实施方案中是包含本申请的重组核酸分子的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由细菌和植物细胞组成的组。所考虑的细菌宿主细胞包括土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoec)和欧文氏菌属(Erwinia)。在某些实施方案中，所述芽孢杆菌属物种是蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，所述短芽孢杆菌属是侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosperous)，或者埃希氏菌属是大肠杆菌。所考虑的植物宿主细胞包括双子叶植物细胞和单子叶植物细胞。所考虑的植物细胞还包括苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花(棉属物种)、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、瓜(melon)、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜(pumpkin)、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎(rootstock)、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、笋瓜(squash)、草莓、糖甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜以及小麦植物细胞。

在另一个实施方案中，所述杀虫蛋白表现出针对鳞翅目昆虫的活性，所述鳞翅目昆虫包括藜豆毛虫、甘蔗螟、小玉米秆螟、玉米穗虫、烟草蚜虫、大豆尺蠖、黑粘虫、南方粘虫、秋粘虫、甜菜粘虫、旧世界棉铃虫、东方叶虫、棉红铃虫、小地老虎、西南玉米螟、棉叶虫、小菜蛾、斑点棉铃虫、斜纹夜蛾、西部豆切根虫和欧洲玉米螟。

在本申请中还考虑了包含重组核酸分子的植物，所述重组核酸分子包含与编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段可操作连接的异源启动子片段，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或(b)所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(c)所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的核苷酸序列的互补序列杂交；或(d)所述植物表现出可检测量的所述杀虫蛋白。在某些实施方案中，所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14。在一个实施方案中，所述植物是双子叶植物或单子叶植物。在另一个实施方案中，所述植物进一步选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、笋瓜、草莓、糖甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜以及小麦。

在其他实施方案中，公开了包含重组核酸分子的种子。

在另一个实施方案中，考虑了包含在本申请中公开的重组核酸分子的昆虫抑制性组合物。所述昆虫抑制性组合物还可包含编码至少一种不同于所述杀虫蛋白的其他杀虫剂的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：昆虫抑制性蛋白、昆虫抑制性dsRNA分子和辅助蛋白。还考虑，所述昆虫抑制性组合物中的至少一种其他杀虫剂表现出针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目中的一种或多种害虫物种的活性。所述昆虫抑制性组合物中的至少一种其他杀虫剂在一个实施方案中选自由以下组成的组：Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1C、Cry1C变体、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、TIC3131、TIC2160、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035、AXMI-036、AXMI-045、Axmi52、Axmi58、Axmi88、Axmi97、Axmi102、Axmi112、Axmi117、Axmi100、AXMI-115、AXMI-113和AXMI-005、AXMI134、AXMI-150、Axmi171、AXMI-184、axmi196、axmi204、axmi207、axmi209、Axmi205、AXMI218、AXMI220、AXMI221z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z、AXMI238、AXMI270、AXMI279、AXMI335、AXMI345、AXMI-R1及其变体、IP3及其变体、DIG-3、DIG-5、DIG-10、DIG-11、DIG-657蛋白、PHI-4变体、PIP-72变体、PIP-45变体、PIP-64变体、PIP-74变体、PIP-77变体、DIG-305、PIP-47变体、DIG-17、DIG-90、DIG-79以及DIG-303。

还考虑了包含可检测量的本申请中公开的重组核酸分子的商品。此类商品包括用谷物处理机装袋的商品玉米、玉米薄片、玉米饼、玉米细粉、玉米粗粉、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮饲料、玉米淀粉、玉米谷类食品等，以及相应的大豆、稻、小麦、高粱、木豆、花生、水果、瓜和蔬菜商品，包括在适当的情况下此类商品的含有可检测量的本申请的此类多核苷酸和或多肽的果汁、浓缩物、果酱、果冻、橘果酱和其他可食用形式，完整或加工的棉籽、棉油、棉绒、种子以及经加工以获得饲料或食品、纤维、纸、生物质和燃料产品(如源自棉油的燃料或源自轧棉机废料的粒料)的植物部分，完整或加工的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、大豆粗粉(soybean meal)、大豆细粉(soybean flour)、大豆薄片、大豆麸皮、豆浆、大豆干酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的奶油、大豆生物质以及使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品。

在本申请中还考虑了一种生产包含本申请中公开的重组核酸分子的种子的方法。所述方法包括种植至少一种包含本申请中公开的重组核酸分子的种子；由所述种子生长成植物；以及从所述植物收获种子，其中所收获的种子包含本申请中的重组核酸分子。

在另一个说明性实施方案中，提供了一种抗昆虫侵扰的植物，其中所述植物的细胞包含：(a)重组核酸分子，所述重组核酸分子编码杀虫有效量的如在SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14中列出的杀虫蛋白；或(b)杀虫有效量的蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％、或85％、或90％、或95％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在本申请中还公开了用于防治鳞翅目物种害虫以及防治植物、特别是作物植物的鳞翅目物种害虫侵扰的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)使所述害虫与杀虫有效量的如在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14中列出的杀虫蛋白接触；或(b)使所述害虫与杀虫有效量的一种或多种杀虫蛋白接触，所述杀虫蛋白包含与SEQID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％、85％、或90％、或95％或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

本文进一步提供了一种检测包含编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的重组核酸分子的存在的方法，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或(b)所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(c)所述多核苷酸区段与具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的核苷酸序列的多核苷酸杂交。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括使核酸样品与核酸探针接触，所述核酸探针在严格杂交条件下与来自包含编码本文所提供的杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的植物的基因组DNA杂交，并且在此类杂交条件下不与来自不包含所述区段的在其他方面同基因植物的基因组DNA杂交，其中所述探针与SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:13或编码杀虫蛋白的序列同源或互补，所述杀虫蛋白包含与SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。所述方法还可包括(a)使所述样品和探针经受严格杂交条件；以及(b)检测所述探针与所述样品的DNA的杂交。

本发明还提供了检测包含蛋白质的样品中杀虫蛋白或其片段的存在的方法，其中所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14具有至少80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述方法包括：(a)使样品与免疫反应性抗体接触；以及(b)检测所述所述蛋白质的存在。在一些实施方案中，所述检测步骤包括ELISA或蛋白质印迹。

在本申请中还公开了一种用于提高天然杀虫蛋白针对昆虫害虫物种的杀虫活性的方法，所述方法包括：通过将编码昆虫肠受体结合肽的DNA片段插入编码所述杀虫蛋白的编码序列中来工程化变体杀虫蛋白；其中所述工程化的杀虫蛋白的杀虫活性大于所述天然杀虫蛋白对所述昆虫害虫物种的杀虫活性。在本发明的一个实施方案中，所述昆虫肠受体可以是钙粘蛋白样蛋白(CADR)、GPI锚定氨基肽酶-N(APN)、GPI锚定碱性磷酸酶、跨膜ABC转运蛋白或ADAM金属蛋白酶。在本发明的另一个实施方案中，所述编码昆虫肠受体结合肽的DNA片段选自由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16组成的组并且编码提供为SEQ ID NO:17的受体结合肽。

在本发明的一个实施方案中是重组核酸分子，所述重组核酸分子包含与编码杀虫蛋白或其杀虫片段的多核苷酸区段可操作连接的异源启动子，所述多核苷酸区段与包含生殖组织特异性miRNA靶结合位点元件的DNA序列可操作地连接，其中所述miRNA靶结合位点元件相对于编码杀虫蛋白或其杀虫片段的所述多核苷酸区段是异源的。所述miRNA靶结合位点元件选自由以下组成的组：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。

在本发明的另一个实施方案中是一种用于降低转基因植物的生殖组织中的杀虫蛋白表达的方法，所述方法包括在所述转基因植物中表达重组核酸分子，所述重组核酸分子包含与编码杀虫蛋白或其杀虫片段的多核苷酸区段可操作连接的异源启动子，所述多核苷酸区段与包含生殖组织特异性miRNA靶结合位点元件的DNA序列可操作地连接，其中所述miRNA靶结合位点元件相对于编码杀虫蛋白或其杀虫片段的所述多核苷酸区段是异源的。所述miRNA靶结合位点元件选自由以下组成的组：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。本发明的另一实施方案是一种选自由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成的组的重组DNA分子。

序列简要说明

SEQ ID NO:1是编码获自缓病类芽孢杆菌物种DSC020651的TIC7941杀虫蛋白的核酸序列。

SEQ ID NO:2是TIC7941杀虫蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是针对在植物细胞中表达而设计的编码TIC7941PL_1杀虫蛋白的合成编码序列。

SEQ ID NO:4是TIC7941PL_1蛋白的氨基酸序列，其中紧随起始甲硫氨酸插入另外的丙氨酸氨基酸。

SEQ ID NO:5是编码TIC7941_His杀虫蛋白的核酸序列，其中编码组氨酸标签的核酸序列与TIC7941编码序列5'且同框可操作地连接。

SEQ ID NO:6是TIC7941_His杀虫蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7是编码TIC7941_2His杀虫蛋白的核酸序列，其中编码组氨酸标签的核酸序列5'且同框可操作地连接。

SEQ ID NO:8是TIC7941_2His杀虫蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9是编码TIC7941_3His杀虫蛋白的核酸序列，其中编码组氨酸标签的核酸序列5'且同框可操作地连接。

SEQ ID NO:10是TIC7941_3His杀虫蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11是针对在植物细胞中表达而设计的编码TIC7941PL_2杀虫蛋白的合成编码序列。

SEQ ID NO:12是TIC7941PL_2的氨基酸序列，其中紧随起始甲硫氨酸插入另外的丙氨酸氨基酸。

SEQ ID NO:13是针对在植物细胞中表达而设计的编码TIC7941PL_3杀虫蛋白的合成编码序列。

SEQ ID NO:14是TIC7941PL_3的氨基酸序列，其中紧随起始甲硫氨酸插入另外的丙氨酸氨基酸。

SEQ ID NO:15是用于在细菌中表达的编码FAW ABCc4受体结合肽序列FAWPEPBIN的合成编码序列(FAWPEPBIN_Bac)。在TIC7941_2His的核苷酸位置2413-2448内和TIC7941_3His的核苷酸位置2410-2445内发现合成序列。

SEQ ID NO:16是用于在植物细胞中表达的编码FAW ABCc4受体结合肽序列FAWPEPBIN的合成编码序列(FAWPEPBIN_PL)。在TIC7941PL_2的核苷酸位置2386-2421内和TIC7941PL_3的核苷酸位置2383-2418内发现合成序列。

SEQ ID NO:17是由SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16编码的FAW ABCc4受体结合肽序列(FAWPEPBIN)，并且位于TIC7941_2His的氨基酸位置805-816、TIC7941_3His的氨基酸位置804-815、TIC7941PL_2的氨基酸位置796-807和TIC7941PL_3的氨基酸位置795-806。

SEQ ID NO:18是编码miRNA靶结合位点Gm.miR395_1的DNA序列。

SEQ ID NO:19是编码miRNA结合靶位点Gm.miR395_2的DNA序列。

SEQ ID NO:20是DNA序列(SUP-miR395)，其中使用DNA序列SP-ART.8a-1连接miRNA靶结合位点Gm.miR395_1和Gm.miR395_2。

SEQ ID NO:21是编码miRNA靶结合位点Gm.miR4392_1的DNA序列。

SEQ ID NO:22是编码miRNA靶结合位点Gm.miR4392_2的DNA序列。

SEQ ID NO:23是DNA序列(SUP-miR4392)，其中使用DNA序列SP-ART.8a-1连接miRNA靶结合位点Gm.miR4392_1和Gm.miR4392_2。

SEQ ID NO:24是接头SP-ART.8a-1的DNA序列。

SEQ ID NO:25是编码可操作地连接至SUP-miR395的TIC7941PL_1的DNA序列(TIC7941PL_1-mi395)。

SEQ ID NO:26是编码可操作地连接至SUP-miR4392的TIC7941PL_1的DNA序列(TIC7941PL_1-mi4392)。

具体实施方式

农业害虫防治领域的问题的特征可在于需要新的毒素蛋白，所述毒素蛋白可有效地对抗目标害虫，对目标害虫表现出广谱毒性，能够在植物中表达而不会引起不合乎需要的农艺问题，并且提供与在植物中商业使用的当前毒素相比的替代作用方式。

以TIC7941、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2和TIC7941PL_3为例的新型杀虫蛋白在本文中公开，并且解决了这些需求中的每一种，特别是针对广谱鳞翅目害虫，并且更特别是针对小地老虎(地蚕)、玉米穗虫(谷实夜娥)、欧洲玉米螟(玉米螟)、秋粘虫(草地贪夜蛾)、南方粘虫(南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(大豆夜蛾)、西南玉米螟(Southwestern corn borer/Diatraea grandiosella)。

在本申请中提及TIC7941、“TIC7941蛋白”、“TIC7941蛋白毒素”、“TIC7941毒素蛋白”、“TIC7941杀虫蛋白”、“TIC7941相关毒素”、“TIC7941相关毒素蛋白”、TIC7941PL_1、“TIC7941PL_1蛋白”、“TIC7941PL_1蛋白毒素”、“TIC7941PL_1毒素蛋白”、“TIC7941PL_1杀虫蛋白”、“TIC7941PL_1相关毒素”、“TIC7941PL_1相关毒素蛋白”等是指任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，其包含TIC7941(SEQ ID NO:2)、TIC7941PL_1(SEQ ID NO:4)、TIC7941PL_2(SEQ ID NO:12)和TIC7941PL_3(SEQ ID NO:14)及其赋予针对鳞翅目害虫的活性的杀虫或昆虫抑制区段或它们的组合的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列，由所述杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列组成，基本上与所述杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列同源，与所述杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列类似或源自所述杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列，包括如果这种蛋白与TIC7941、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2或TIC7941PL_3的比对产生从约80％至100％的任何分数百分比的氨基酸序列同一性则表现出杀虫或昆虫抑制活性的任何蛋白。TIC7941、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2和TIC7941PL_3蛋白包括所述蛋白质的质体靶向形式和非质体靶向形式两者。

在本申请中使用术语“区段”或“片段”来描述比描述TIC7941蛋白的完整氨基酸或核酸序列更短的连续氨基酸或核酸序列。如果表现出昆虫抑制活性的区段或片段与SEQ IDNO:2中所列出的TIC7941蛋白或SEQ ID NO:4中所列出的TIC7941PL_1蛋白或SEQ ID NO:12中所列出的TIC7941PL_2蛋白或SEQ ID NO:14中所列出的TIC7941PL_3蛋白的相应部分的比对在所述区段或片段与TIC7941、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2或TIC7941PL_3蛋白的相应部分之间产生从约80％至约100％的任何分数百分比的氨基酸序列同一性，则在本申请中还公开了这种区段或片段。

在另外的特定实施方案中，TIC7941、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2或TIC7941PL_3蛋白的片段可被定义为表现出其所来源的起始蛋白分子所具有的杀虫活性。编码TIC7941、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2或TIC7941PL_3蛋白的核酸序列的片段可被定义为编码蛋白质，所述蛋白质表现出由其所来源的起始核酸序列编码的蛋白质分子所具有的杀虫活性。本文所述的片段或变体还可包含本文鉴定的负责蛋白质的杀虫活性的结构域。

在具体实施方案中，提供TIC7941、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2或TIC7941PL_3蛋白的片段，所述片段包含如本文公开的具有杀虫活性的TIC7941、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2或TIC7941PL_3蛋白的至少约50、至少约75、至少约95、至少约100、至少约125、至少约150、至少约175、至少约200、至少约225、至少约250、至少约275、至少约300、至少约500、至少约600、至少约700、至少约750、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1100、至少约1150或至少约1175个连续氨基酸或更长。在某些实施方案中，本发明提供SEQ ID NO:2、4、12或14中任一项的具有全长序列的活性的片段。从起始分子产生此类片段的方法在本领域中是熟知的。

在本申请中提及术语“活性的”或“活性”、“杀虫活性(pesticidal activity)”或“杀虫的(pesticidal)”或“杀虫活性(insecticidal activity)”、“昆虫抑制”或“杀虫的(insecticidal)”是指毒性剂如蛋白质毒素在抑制(抑制生长、摄食、繁殖力或存活力)、遏制(遏制生长、摄食、繁殖力或存活力)、防治(防治害虫侵扰、防治害虫对含有有效量的TIC7941蛋白的特定作物的摄食活动)或杀死(导致发病、死亡或繁殖力降低)害虫方面的功效。这些术语意图包括向害虫提供杀虫有效量的毒性蛋白的结果，其中害虫暴露于毒性蛋白导致发病、死亡、繁殖力降低或生长迟缓。这些术语还包括由于在植物中或上提供杀虫有效量的毒性蛋白而从植物、植物组织、植物部分、种子、植物细胞或植物可能生长的特定地理位置驱除害虫。一般而言，杀虫活性是指毒性蛋白有效抑制生长、发育、存活力、摄食行为、交配行为、繁殖力或由昆虫摄食特定目标害虫的这种蛋白质、蛋白质片段、蛋白质区段或多核苷酸引起的任何可测量的不利影响减轻的能力，所述特定目标害虫包括但不限于鳞翅目昆虫。毒性蛋白可由植物产生，或者可施加至植物或植物所位于的位置内的环境。术语“生物活性”、“有效(effective)”、“有效(efficacious)”或其变型也是本申请中可互换使用的术语，以描述本发明的蛋白质对目标昆虫害虫的作用。

当在目标害虫的饮食中提供时，杀虫有效量的毒性剂在所述毒剂接触所述害虫时表现出杀虫活性。毒性剂可以是杀虫蛋白或本领域已知的一种或多种化学剂。杀虫(Pesticidal)或杀虫(insecticidal)化学剂和杀虫或杀虫蛋白剂可单独使用或彼此组合使用。化学剂包括但不限于靶向特定基因以在目标害虫中进行遏制的dsRNA分子、有机氯化物、有机磷酸盐、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、新烟碱和兰尼碱。杀虫或杀虫蛋白剂包括本申请中列出的蛋白毒素，以及其他蛋白质毒性剂，包括靶向鳞翅目的那些，以及用于防治其他植物害虫的蛋白毒素，如本领域中可用于防治鞘翅目、半翅目和同翅目物种的Cry和Cyt蛋白。

意图提及害虫，特别是作物植物的害虫是指农作物植物的昆虫害虫，特别是通过TIC7941蛋白毒素类别防治的那些鳞翅目昆虫害虫。然而，当靶向这些害虫的毒性剂与TIC7941蛋白质或与TIC7941蛋白80％至约100％同一的蛋白质共定位或一起存在时，提及害虫也可包括植物的鞘翅目、半翅目和同翅目昆虫害虫，以及线虫和真菌。

TIC7941蛋白通过共同的功能相关，并且表现出针对来自鳞翅目昆虫物种的昆虫害虫(包括成虫、蛹、幼虫和新生儿)的杀虫活性。

鳞翅目昆虫包括但不限于夜蛾科中的粘虫、切根虫、尺蠖和heliothine，例如，秋粘虫(草地贪夜蛾)、甜菜粘虫(Beet armyworm/Spodoptera exigua)、黑粘虫(莎草粘虫)、南方粘虫(南部灰翅夜蛾)、贝莎粘虫(蓓带夜娥)、小地老虎(地蚕)、粉纹夜蛾(cabbagelooper/Trichoplusia ni)、大豆尺蠖(大豆夜蛾)、藜豆毛虫(藜豆夜蛾)、苜蓿绿夜蛾(Green cloverworm/Hypena scabra)、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)、颗粒地老虎(地生地老虎)、粘虫(一星粘虫)、西方地老虎(西方灰地老虎)；来自螟蛾科家族的螟、鞘蛾、结网虫、球果螟、菜青虫和雕蛾，例如，欧洲玉米螟(玉米螟)、脐橙螟(Navel orangeworm/Amyeloistransitella)、玉米根结网虫(玉米根草螟)、草地螟(sod webworm/Herpetogrammalicarsisalis)、向日葵螟(向日葵同斑螟)、小玉米秆螟(南美玉米苗斑螟)；卷叶蛾科的卷叶蛾、蚜虫、种子虫和果虫，例如苹果小卷蛾(苹果蠹蛾)、葡萄小卷叶蛾(Endopizaviteana)、东方果蛾(梨小食心虫)、向日葵芽娥(向日葵芽卷叶娥)；以及许多其他经济上重要的鳞翅目，例如小菜蛾(diamondback moth/Plutella xylostella)、棉红铃虫(pinkbollworm/Pectinophora gossypiella)和舞毒蛾(gypsy moth/Lymantria dispar)。鳞翅目的其他昆虫害虫包括，例如，棉叶虫(棉叶波纹夜蛾)、果树卷叶蛾(果树黄卷蛾)、欧洲卷叶蛾(玫瑰卷叶蛾)和其他黄卷蛾属物种(二化螟、亚洲稻螟或水稻二化螟)、稻纵卷叶螟(rice leaf roller/Cnaphalocrocis medinalis)、玉米根结网虫(玉米根草螟)、早熟禾草螟(bluegrass webworm/Crambus teterrellus)、西南玉米螟(southwestern corn borer/Diatraea grandiosella)、小蔗秆草螟(surgarcane borer/Diatraea saccharalis)、多刺棉铃虫(棉斑实蛾)、斑点棉铃虫(翠纹钻夜蛾)、美国棉铃虫(棉铃虫)、玉米穗虫(谷实夜娥，也称为大豆食心虫和棉铃虫)、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)、草地螟(sod webworm/Herpetogrammalicarsisalis)、西部豆切根虫(豆白缘切根虫)、欧洲葡萄蔓蛾(葡萄花翅小卷蛾)、柑橘潜叶蛾(桔潜蛾)、大白粉蝶(大菜粉蝶)、小白粉蝶(菜粉蝶，也被称为进口菜青虫)、甜菜粘虫(beet armyworm/Spodoptera exigua)、斜纹夜蛾(tobacco cutworm/Spodoptera litura，也被称为簇毛虫)和番茄潜叶蝇(番茄斑潜蝇)。

在本申请中，提及“分离的DNA分子”或等效术语或短语意图表示所述DNA分子是单独存在或与其他组合物组合存在，但不在其天然环境中的一种。例如，天然存在于生物体基因组的DNA中的核酸元件，如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等，不被认为是“分离的”。只要所述元件在生物体的基因组中以及在它所天然存在的基因组中的位置即可。然而，只要所述元件不在生物体的基因组之内并且不在其天然存在的基因组之内，则这些元件中的每一个以及这些元件的子部分在本公开的范围内将是“分离的”。类似地，编码杀虫蛋白或所述蛋白质的任何天然存在的杀虫变体的核苷酸序列将是分离的核苷酸序列，只要所述核苷酸序列不在天然发现编码所述蛋白的序列的细菌DNA内。出于本公开的目的，认为编码天然存在的杀虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列将是分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即，插入植物或细菌细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列，将被认为是分离的核苷酸序列，无论它是存在于用于转化细胞的质粒或类似结构中、植物或细菌基因组内，还是以可检测量存在于源自植物或细菌的组织、后代、生物样品或商品中。

如本文使用，“重组DNA分子”是包含在没有人为干预的情况下完全不会自然出现的组合DNA分子的DNA分子。例如，重组DNA分子可为包含相对于彼此异源的至少两个DNA分子的DNA分子，包含与在自然界中存在的DNA序列有偏差的DNA序列的DNA分子，或通过遗传转化或基因编辑并入宿主细胞的DNA中的DNA分子。类似地，“重组蛋白分子”是包含在没有人为干预的情况下完全不会自然出现的氨基酸的组合的蛋白质分子。例如，重组蛋白分子可以是包含相对于彼此异源的至少两个氨基酸分子的蛋白质分子，包含与在自然界中存在的氨基酸序列有偏差的氨基酸序列的蛋白质分子，或由于宿主细胞的遗传转化或通过宿主细胞基因组的基因编辑而在宿主细胞中表达的蛋白质分子。

如在本申请中进一步描述的，在获自缓病类芽孢杆菌菌株DSC020651的DNA中发现了编码TIC7941(SEQ ID NO:2)的开放阅读框(ORF)。将编码序列克隆并在微生物宿主细胞中表达，以产生用于生物测定的重组蛋白。使用TIC7941的微生物宿主细胞来源的蛋白质进行的生物测定展示针对鳞翅目物种小地老虎(地蚕)、玉米穗虫(谷实夜娥)、欧洲玉米螟(玉米螟)、南方粘虫(南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(大豆夜蛾)以及西南玉米螟(Southwesterncorn borer/Diatraea grandiosella)。

编码TIC7941和TIC7941的变体的合成序列被设计用于在植物细胞中表达。编码序列TIC7941PL_1(SEQ ID NO:3)编码TIC7941PL_1杀虫蛋白，所述杀虫蛋白与TIC7941蛋白序列相同，除了在起始甲硫氨酸后插入了额外的丙氨酸以提高表达。当在转基因玉米中表达时，TIC7941PL_1在叶盘测定中展示针对小地老虎(BCW，地蚕)、玉米穗虫(CEW，谷实夜娥)和西南玉米螟(SWCB，西南玉米螟)的杀虫活性。当在转基因大豆植物中表达时，TIC7941PL_1在叶盘测定中展示针对南方粘虫(SAW，南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(SBL，大豆夜蛾)和大豆食心虫(SPW，谷实夜娥)的杀虫活性。TIC7941PL_2编码序列(SEQ ID NO:11)和TIC7941PL_3编码序列(SEQ ID NO:13)分别编码TIC7941PL_2(SEQ ID NO:12)和TIC7941PL_3(SEQ ID NO:14)杀虫蛋白。它们含有在起始甲硫氨酸后插入的额外丙氨酸氨基酸以提高表达。TIC7941PL_2和TIC7941PL_3两者还含有插入在TIC7941的结构域2环内的秋粘虫跨膜ABC转运蛋白(ABCc4)蛋白结合肽片段。在TIC7941PL_2中，ABCc4蛋白结合片段位于氨基酸位置796-807处。在TIC7941PL_3中，ABCc4蛋白结合片段位于氨基酸位置795-806处。

为了在植物细胞中表达，可将TIC7941PL_1、TIC7941PL_2或TIC7941PL_3蛋白表达为驻留在细胞质中或靶向植物细胞的各种细胞器。例如，使蛋白质靶向叶绿体可使得转基因植物中表达的蛋白质水平增加，同时防止出现偏差表型。靶向也可使得转基因事件中的害虫抗药性功效增加。目标肽或转运肽是短的(3-70个氨基酸长)的肽链，所述肽链将蛋白质转运至细胞中的特定区域，包括细胞核、线粒体、内质网(ER)、叶绿体、质外体、过氧化物酶体和质膜。一些目标肽在蛋白质被转运之后通过信号肽酶从蛋白质裂解。为了靶向到叶绿体，蛋白质含有大约40-50个氨基酸的转运肽。对于使用叶绿体转运肽的描述，参见美国专利号5,188,642和5,728,925。许多叶绿体定位蛋白质从核基因作为前体来表达并且通过叶绿体转运肽(CTP)靶向输送至叶绿体。此类分离的叶绿体蛋白质的实例包括但不限于与核酮糖-1,5,-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光复合蛋白质I和蛋白质II、硫氧还蛋白F、烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)以及美国专利第7,193,133号中描述的转运肽相关联的那些蛋白质。已经在体内和体外证明可通过使用与异源CTP的蛋白质融合物来使非叶绿体蛋白质靶向至叶绿体，并且所述CTP足以使蛋白质靶向叶绿体。掺入合适的叶绿体转运肽如拟南芥EPSPS CTP(CTP2)(参见Klee等人,Mol.Gen.Genet.210:437-442,1987)或矮牵牛EPSPS CTP(CTP4)(参见della-Cioppa等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:6873-6877,1986)已经显示使异源EPSPS蛋白序列靶向转基因植物中的叶绿体(参见美国专利号5,627,061；5,633,435；和5,312,910、和EP 0218571；EP 189707；EP 508909；以及EP 924299)。为了使TIC7941、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2或TIC7941PL_3毒素蛋白靶向叶绿体，将编码叶绿体转运肽的序列5ˊ放置为与编码TIC7941、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2或TIC7941PL_3毒素蛋白的合成编码序列可操作地连接并同框，所述合成编码序列已被设计用于在植物细胞中最佳表达。

预期可通过使用TIC7941的氨基酸序列产生具有新颖性质的新型蛋白来产生与TIC7941有关的另外毒素蛋白序列。可对TIC7941毒素蛋白进行比对，以将氨基酸序列水平上的差异组合成新的氨基酸序列变体，并对编码所述变体的重组核酸序列进行适当的变化。

本公开进一步考虑，可通过使用本领域已知的各种基因编辑方法在植物中工程化TIC7941蛋白毒素类别的改进的变体。用于基因组编辑的此类技术包括但不限于ZFN(锌指核酸酶)、大范围核酸酶、TALEN(转录活化因子样效应物核酸酶)和CRISPR(聚簇规律间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关)系统。这些基因组编辑方法可用于将在植物细胞内转化的毒素蛋白编码序列改变为不同的毒素编码序列。具体地，通过这些方法，毒素编码序列内的一个或多个密码子被改变以工程化新的蛋白质氨基酸序列。或者，替代或缺失编码序列内的片段，或将另外的DNA片段插入编码序列中，以工程化新的毒素编码序列。新的编码序列可编码具有新特性的毒素蛋白，所述新特性如具有增加的针对昆虫害虫的活性或谱，以及提供针对其中对原始昆虫毒素蛋白发展抗性的昆虫害虫物种的活性。可通过本领域已知的方法将包含基因编辑的毒素编码序列的植物细胞用于产生表达新毒素蛋白的完整植物。

还预期TIC7941或其蛋白质变体的片段可以是截短形式，其中从蛋白质的N-末端、C-末端、蛋白质的中部或它们的组合缺失一个或多个氨基酸，其中所述片段和变体保留昆虫抑制活性。这些片段可以是TIC7941的天然存在的或合成的变体，或衍生的蛋白质变体，但应保留至少TIC7941的昆虫抑制活性。本文所述的片段或变体还可包含本文鉴定的负责蛋白质的杀虫活性的结构域。

可使用本领域中已知的各种基于计算机的算法鉴定类似于在TIC7941蛋白毒素类别中的蛋白质的蛋白质并且彼此进行比较(参见表1)。在本申请中报告的氨基酸序列同一性是使用这些默认参数的Clustal W比对的结果：权重矩阵：blosum，空位开放罚分：10.0，空位延伸罚分：0.05，亲水性空位：开，亲水性残基：GPSNDQERK，残基特异性空位罚分：开(Thompson,等人(1994)Nucleic Acids Research,22:4673-4680)。氨基酸同一性百分比进一步通过100％乘以(氨基酸同一性/主题蛋白质的长度)的乘积来计算。其他比对算法在本领域中也是可用的，并且提供与使用Clustal W比对获得的结果相似的结果，并且在本文中考虑。

意图如果在查询中，例如在Clustal W比对中使用表现出针对鳞翅目昆虫物种的昆虫抑制活性的蛋白质，并且如列出为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:10的本发明的蛋白质在这种比对中被鉴定为命中，在所述比对中查询蛋白表现出沿查询蛋白的长度的至少80％至约100％氨基酸同一性(为约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或此范围内的任何百分比分数的氨基酸同一性)，则所述蛋白质与TIC7941蛋白毒素类别的成员有关。

除了同一性百分比外，TIC7941蛋白还可通过一级结构(保守氨基酸基序)、长度(约807个氨基酸)以及其他特征相关联。表1中报告了TIC7941蛋白毒素的特征。

表1.TIC7941蛋白毒素类别的选定特征。

如实施例中进一步描述的，编码TIC7941的变体的合成核酸分子序列被设计用于在植物中使用。被设计用于在植物中使用的编码TIC7941PL_1、TIC7941PL_2和TIC7941PL_3蛋白的示例性重组核酸分子序列分别呈现为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13。相对于TIC7941蛋白，TIC7941PL_1、TIC7941PL_2和TIC7941PL_3蛋白具有紧随起始甲硫氨酸的额外丙氨酸氨基酸。这种额外丙氨酸残基据信可提高植物体内蛋白质的表达。TIC7941PL_2和TIC7941PL_3蛋白还包含ABCc4肽结合片段，以提高所述蛋白针对秋粘虫(草地贪夜蛾)的功效。

可根据本领域已知的转化方法和技术来构建含有重组核酸分子序列的表达盒和载体，并将所述表达盒和载体引入玉米、大豆或棉花植物细胞中。例如，土壤杆菌属介导的转化描述于美国专利申请公布2009/0138985A1(大豆)、2008/0280361A1(大豆)、2009/0142837A1(玉米)、2008/0282432(棉花)、2008/0256667(棉花)、2003/0110531(小麦)、2001/0042257A1(甜菜)、美国专利第5,750,871号(芥花)、第7,026,528号(小麦)和第6,365,807号(稻)以及Arencibia等人(1998)Transgenic Res.7:213-222(甘蔗)中，其全部以引用的方式整体并入本文。可将转化的细胞再生为表达TIC7941PL_1、TIC7941PL_2或TIC7941PL_3蛋白的转化生物植物，并通过使用从转化的植物获得的植物叶盘在鳞翅目害虫幼虫存在下进行的生物测定来证明杀虫活性。植物可通过再生、种子、花粉或分生组织转化技术而来源于植物细胞。用于转化植物的方法在本领域中是已知的。

作为传统转化方法的替代，可将DNA序列(如转基因，表达盒等)经由定点整合插入或整合到植物或植物细胞的基因组内的特定位点或基因座中。因此，本发明的重组DNA构建体和分子可包含供体模板序列，所述供体模板序列包含至少一种转基因、表达盒或其他DNA序列，以用于插入植物或植物细胞的基因组中。用于定点整合的这种供体模板还可包含侧接插入序列(即，待被插入植物基因组中的序列、转基因、盒等)的一个或两个同源臂。本公开的重组DNA构建体还可包含表达盒，所述表达盒编码位点特异性核酸酶和/或任何相关蛋白质以进行定点整合。这些核酸酶表达盒可与供体模板存在于相同的分子或载体中(顺式)，或存在于单独的分子或载体中(反式)。用于定点整合的若干方法在本领域中是已知的，涉及切割基因组DNA以在所需的基因组位点或基因座处产生双链断裂(DSB)或切口的不同的蛋白质(或蛋白质复合物和/或指导RNA)。简言之，如本领域中所理解的，在修复由核酸酶引入的DSB或切口的过程中，供体模板DNA可被整合到DSB或切口的位点处的基因组中。供体模板中同源臂的存在可在修复过程中通过同源重组促进插入序列采用和靶向到植物基因组中，尽管插入事件可通过非同源末端连接(NHEJ)发生。可使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程化的或天然的大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶和RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cpf1)。对于使用RNA指导的位点特异性核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)的方法，重组DNA构建体还将包含编码一个或多个指导RNA以将核酸酶引导至植物基因组内的所需位点的序列。

考虑了编码TIC7941蛋白的重组核酸分子组合物。例如，可用重组DNA构建体表达TIC7941、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2和TIC7941PL_3蛋白，其中具有编码所述蛋白的ORF的多核苷酸分子可操作连接至遗传表达元件(如启动子)以及在所述构建体所预期的系统中表达所必需的任何其他调控元件。非限制性实例包括与TIC7941蛋白编码序列可操作连接的植物功能性启动子以在植物中表达所述蛋白质，或与TIC7941蛋白编码序列可操作性连接的Bt功能性启动子以用于在Bt细菌或其他芽孢杆菌属物种中表达所述蛋白质。其他元件可与TIC7941蛋白编码序列可操作地连接，包括但不限于增强子、内含子、未翻译的前导序列、所编码的蛋白质固定标签(HIS-tag)、易位肽(即质体转运肽，信号肽)、翻译后修饰酶的多肽序列、核糖体结合位点和RNAi靶位点。随此提供的示例性重组多核苷酸分子包括但不限于与多核苷酸如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸编码具有如SEQID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:14中列出的氨基酸序列的相应多肽或蛋白质。异源启动子还可与编码质体靶向TIC7941PL_1、TIC7941PL_2或TIC7941PL_3或非靶向TIC7941PL_1、TIC7941PL_2或TIC7941PL_3的合成DNA编码序列可操作地连接。编码本文公开的蛋白质的重组核酸分子的密码子可被同义密码子取代(本领域中称为沉默取代)。

包含TIC7941蛋白编码序列的重组DNA构建体还可包含编码一种或多种昆虫抑制剂的DNA区域，所述区域可被配置为同时表达编码TIC7941蛋白、与TIC7941蛋白不同的蛋白质、昆虫抑制性dsRNA分子或辅助蛋白的DNA序列或与所述DNA序列共表达。辅助蛋白包括但不限于辅因子、酶、结合配偶体或可起到有助于昆虫抑制剂的有效性的其他剂，例如通过辅助其表达、影响其在植物中的稳定性、优化用于寡聚的自由能、增强其毒性并增加其活性范围。辅助蛋白可例如促进一种或多种昆虫抑制剂的摄取或增强所述毒性剂的毒性作用。

可组装重组DNA构建体，以使得所有蛋白质或dsRNA分子从一个启动子表达，或者每种蛋白质或dsRNA分子在单独的启动子控制下或其一些组合。本发明的蛋白质可由多基因表达系统表达，在所述表达系统中TIC7941蛋白毒素类别的一种或多种蛋白质由共同核苷酸区段表达，所述核苷酸区段根据所选择的表达系统的类型还含有其它开放阅读框和启动子。例如，细菌多基因表达系统可利用单个启动子来驱动来自单个操纵子内的多重连接/串联开放阅读框的表达(即多顺反子表达)。在另一个实例中，植物多基因表达系统可利用多个未连接的或连接的表达盒，每个表达盒表达不同的蛋白质或其他剂，如一个或多个dsRNA分子。

包含TIC7941蛋白编码序列的重组多核苷酸或重组DNA构建体可通过载体(例如质粒、杆状病毒、合成染色体、病毒体、粘粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体)递送至宿主细胞。此类载体可用于在宿主细胞中实现TIC7941蛋白编码序列的稳定或瞬时表达，或随后表达所编码的多肽。包含TIC7941蛋白编码序列并且引入到宿主细胞内的外源性重组多核苷酸或重组DNA构建体在本申请中被称为“转基因”。

本文提供了含有表达TIC7941、TIC7941_His、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2或TIC7941PL_3蛋白编码序列的重组多核苷酸的转基因细菌、转基因植物细胞、转基因植物和转基因植物部分。术语“细菌细胞”或“细菌”可包括但不限于，土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)或根瘤菌属(Rhizobium)细胞。术语“植物细胞”或“植物”可包括但不限于双子叶或单子叶植物。术语“植物细胞”或“植物”还可包括但不限于苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、笋瓜、草莓、糖甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜以及小麦植物细胞或植物。在某些实施方案中，提供了由转基因植物细胞再生的转基因植物和转基因植物部分。在某些实施方案中，可通过切割、折断、研磨或以其他方式使所述部分与植物解离而从转基因种子获得转基因植物。在某些实施方案中，植物部分可以是种子、圆荚、叶、花、茎、根或其任何部分，或者是转基因植物部分的不可再生部分。如在这种背景下所用的，转基因植物部分的“不可再生”部分是不能诱导来形成全植物或者不能诱导来形成能够有性和/或无性繁殖的全植物的部分。在某些实施方案中，植物部分的不可再生部分是转基因种子、圆荚、叶、花、茎或根的部分。

提供了制备包含昆虫、鳞翅目抑制量的TIC7941蛋白的转基因植物的方法。此类植物可通过将编码本申请中所提供的任何蛋白质的重组多核苷酸引入到植物细胞中并且选择源自所述植物细胞的表达昆虫、鳞翅目抑制量的所述蛋白质的植物来制备。植物可通过再生、种子、花粉或分生组织转化技术而来源于植物细胞。用于转化植物的方法在本领域中是已知的。

本文还公开了加工的植物产品，其中所述加工的产品包含可检测量的TIC7941蛋白、其昆虫抑制性区段或片段或其任何区分部分。在某些实施方案中，所述加工的产品选自由以下组成的组：植物部分、植物生物质、油、粗粉、糖、动物饲料、细粉、片、糠、皮棉、果壳、加工的种子以及种子。在某些实施方案中，加工的产品是不可再生的。植物产品可包含源自转基因植物或转基因植物部分的商品或其他商业产品，其中可通过检测编码或包含TIC7941蛋白的区分部分的核苷酸区段或表达的RNA或蛋白质来通过商业追踪商品或其他产品。

表达TIC7941蛋白的植物可通过用表达其他毒素蛋白和/或表达其他转基因性状如除草剂耐受性基因、赋予产量或胁迫耐受性状的基因等的转基因事件育种而杂交，或者可将此类性状组合在单个载体中，以使得所述性状全部相连。

如实施例中进一步描述的，可使用本领域普通技术人员已知的方法如聚合酶链反应(PCR)、热扩增和杂交来鉴定TIC7941蛋白毒素类别和与TIC7941蛋白毒素类别的成员具有实质同一性百分比的序列。例如，TIC7941蛋白毒素类别中的蛋白质可用于产生与相关蛋白特异性地结合的抗体，并且可用于筛选和查找密切相关的其他蛋白质成员。

此外，编码TIC7941毒素蛋白的核苷酸序列可用作用于筛选的探针和引物以使用热循环或等温扩增和杂交方法鉴定所述类别的其他成员。例如，源自如在SEQ ID NO:3、SEQID NO:11和SEQ ID NO:13中列出的序列的寡核苷酸可用于确定源自商品的脱氧核糖核酸样品中TIC7941转基因的存在或不存在。鉴于采用寡核苷酸的某些核酸检测方法的灵敏度，预期可使用源自如在SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13中列出的序列的寡核苷酸来检测源自汇集来源的商品中的TIC7941PL_1、TIC7941PL_2和TIC7941PL_3转基因，其中仅一小部分商品源自含有所述转基因中任一者的转基因植物。进一步认识到，此类寡核苷酸可用于在SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13中的每一者中引入核苷酸序列变异。此类“诱变”寡核苷酸可用于鉴定在转基因植物宿主细胞中表现出一系列昆虫抑制活性或变化的表达的TIC7941蛋白毒素类别氨基酸序列变体。

核苷酸序列同源物(例如由在严格杂交条件下与本申请中公开的每个或任何序列杂交的核苷酸序列编码的杀虫蛋白)也是本发明的一个实施方案。本发明还提供了一种用于检测与第二核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列的方法，其中所述第一核苷酸序列(或其反向互补序列)编码杀虫蛋白或其杀虫片段，并且与所述第二核苷酸序列杂交。在这种情况下，在严格杂交条件下第二核苷酸序列可以是呈现为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:13的任何核苷酸序列。核苷酸编码序列在适当杂交条件(如严格杂交条件)下彼此杂交，并且由这些核苷酸序列编码的蛋白质与针对其他蛋白质中的任一者产生的抗血清交叉反应。如本文所定义，严格杂交条件至少包括在42℃下杂交，然后在室温下各自用2X SSC、0.1％SDS洗涤两次，每次5分钟，然后在65℃下在0.5X SSC、0.1SDS中洗涤两次，每次30分钟。在甚至更高温度下洗涤构成甚至更严格的条件，例如68℃、然后在含0.1％SDS的2xSSC中在68℃下洗涤的杂交条件。

本领域技术人员将认识到，由于遗传密码的冗余，许多其他序列能够编码此类相关蛋白以及那些序列达到它们在芽孢杆菌属菌株或植物细胞中用于表达杀虫蛋白的程度是本发明的实施方案，当然认识到许多此类冗余编码序列在这些条件下将不会与编码TIC7941的天然芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属序列杂交。本申请考虑使用本领域普通技术人员已知的这些和其他鉴定方法来鉴定TIC7941蛋白编码序列和与TIC7941蛋白编码序列具有实质百分比同一性的序列。

本公开还考虑使用本领域已知的分子方法来工程化和克隆商业上有用的蛋白质，包括来自杀虫蛋白质的蛋白质的嵌合体；例如，可从TIC7941相关蛋白的区段组装嵌合体以得到另外有用的实施方案，包括将TIC7941、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2和TIC7941PL_3的区段与不同于TIC7941、TIC7941PL_1、TIC7941PL_2和TIC7941PL_3的多种蛋白质的区段组装；以及相关蛋白质。可将TIC7941蛋白彼此进行比对并且与其他芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属或其他杀虫蛋白(无论这些在系统发生上是近缘还是远缘)进行比对，并且可鉴定出每种这样的蛋白的区段，所述区段可用于在所比对的蛋白质之间进行取代，从而产生嵌合蛋白质的构建。可对此类嵌合蛋白进行害虫生物测定分析，并针对与嵌合体中每个这样的区段所来源的亲本蛋白质相比，存在或不存在增加的生物活性或扩展的目标害虫范围进行表征。通过与其他蛋白质交换结构域或区段或通过使用本领域已知的定向进化方法，可针对对特定害虫或更广泛的害虫的活性对多肽的杀虫活性进行进一步工程化。

此外，本公开考虑通过在天然杀虫蛋白内插入肽序列来对变体杀虫蛋白进行工程化，所述肽序列可提高针对特定昆虫害虫物种的杀虫活性。所插入的肽结合至昆虫中肠受体。内毒素与位于昆虫中肠中的特定受体的特异性结合是杀虫蛋白的杀虫作用模式中的一个步骤。已经描述了至少五种不同的蛋白质受体参与导致昆虫死亡的相互作用：钙粘蛋白样蛋白(CADR)、糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的氨肽酶-N(APN)、GPI锚定的碱性磷酸酶(ALP)、跨膜ABC转运蛋白以及“Disentegrin和金属蛋白酶”或ADAM金属蛋白酶。此外，已经提出糖脂在昆虫和线虫中也是重要的Cry受体分子(Pigott等人(2007)Role of Receptors inBacillus thuringiensis Crystal Toxin Activity.Microbiology and MolecularBiology Reviews,71(2):255-281；Ochoa-Campuzano等人(2007)An ADAMmetalloprotease is a Cry3Aa Bacillus thuringiensis toxin receptor.Biochemicaland Biophysical Research Communication,362(2):437-442)。肽片段FAWPEPBIN结合至秋粘虫(FAW)跨膜ABC转运蛋白ABCc4。在TIC7941的结构域2环内插入编码肽FAWPEPBIN(SEQID NO:17)的编码序列FAWPEPBIN_Bac(SEQ ID NO:15)增加了某些变体中针对FAW的杀虫活性。具体地，在TIC7941_2His中的氨基酸位置805-816中插入FAWPEPBIN导致几乎未展现出针对FAW的活性，而在TIC7941_3His中的氨基酸位置804-815中插入FAWPEPBIN展现针对FAW的活性。

编码FAWPEPBIN肽的合成DNA序列FAWPEPBIN_PL(SEQ ID NO:16)被设计用于在植物细胞中表达。FAWPEPBIN_PL位于合成编码序列TIC7941PL_2的核苷酸位置2386与2421之间以及TIC7941PL_3合成编码序列的核苷酸位置2383-2418之内。FAWPEPBIN肽片段位于TIC7941PL_2的氨基酸位置796-807和TIC7941PL_3的氨基酸位置795-806内。用包含用于表达TIC7941PL_2和TIC7941PL_3的转基因盒的二元载体转化玉米植物。表达TIC7941PL_2和TIC7941PL_3的植物将用于测定工程化的毒素对FAW的杀虫活性。

在本申请中还公开了用TIC7941蛋白防治昆虫，特别是防治对作物的鳞翅目侵扰的方法。此类方法可包括生长包含昆虫或鳞翅目抑制量的TIC7941毒素蛋白的植物。在某些实施方案中，此类方法可进一步包括以下中的任一者或多者：(i)向植物或产生植物的种子施加包含或编码TIC7941毒素蛋白的任何组合物；(ii)用编码TIC7941毒素蛋白的多核苷酸转化植物或产生植物的植物细胞。一般来说，考虑TIC7941毒素蛋白可提供于组合物中、提供于微生物中或提供于转基因植物中以赋予针对鳞翅目昆虫的昆虫抑制活性。

在某些实施方案中，TIC7941蛋白的重组核酸分子是通过培养重组芽孢杆菌属或在适合表达TIC7941毒素蛋白的条件下经转化以表达TIC7941毒素蛋白的任何其他重组细菌细胞而制备的昆虫抑制性组合物的杀虫活性成分。可通过干燥、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩表达/产生所述重组多肽的此类重组细胞的培养物来制备这种组合物。这样的过程可产生芽孢杆菌属或其他昆虫病原性细菌细胞提取物、细胞悬浮液、细胞匀浆、细胞溶解产物、细胞上清液、细胞滤液或细胞团块。通过获得如此产生的重组多肽，包含所述重组多肽的组合物可包括细菌细胞、细菌孢子和伴孢包涵体，并且可被配制用于多种用途，包括作为农业昆虫抑制性喷雾产品或作为饮食生物测定中的昆虫抑制性制剂。

在一个实施方案中，为了降低抗性发展的可能性，包含TIC7941毒素蛋白的昆虫抑制性组合物还可包含至少一种另外的多肽，所述至少一种另外的多肽表现出针对相同鳞翅目昆虫物种的昆虫抑制活性、但不同于TIC7941毒素蛋白。用于这种组合物的可能的另外多肽包括本领域普通技术人员已知的任何昆虫抑制性蛋白或昆虫抑制性dsRNA分子。使用此类核糖核苷酸序列防治昆虫害虫的一个实例描述于Baum等人(美国专利公布2006/0021087A1)中。用于防治鳞翅目害虫的这种另外的多肽可选自由如但不限于以下的昆虫抑制性蛋白组成的组：Cry1A(美国专利号5,880,275)、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B(美国专利公布号10/525,318)、Cry1C(美国专利号6,033,874)、Cry1D、Cry1Da及其变体、Cry1E、Cry1F和Cry1A/F嵌合体(美国专利号7,070,982；6,962,705；和6,713,063)、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry1型嵌合体如但不限于TIC836、TIC860、TIC867、TIC869和TIC1100(国际申请公布WO2016/061391(A2))、TIC2160(国际申请公布WO2016/061392(A2))、Cry2A、Cry2Ab(美国专利号7,064,249)、Cry2Ae、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET66、TIC400、TIC800、TIC834、TIC1415、Vip3A、VIP3Ab、VIP3B、AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045(美国专利公布2013-0117884 A1)、AXMI-52、AXMI-58、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100(美国专利公布2013-0310543 A1)、AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005(美国专利公布2013-0104259 A1)、AXMI-134(美国专利公布2013-0167264 A1)、AXMI-150(美国专利公布2010-0160231 A1)、AXMI-184(美国专利公布2010-0004176 A1)、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209(美国专利公布2011-0030096 A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公布2014-0245491 A1)、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z、AXMI-225z(美国专利公布2014-0196175 A1)、AXMI-238(美国专利公布2014-0033363 A1)、AXMI-270(美国专利公布2014-0223598 A1)、AXMI-345(美国专利公布2014-0373195 A1)、AXMI-335(国际申请公布WO2013/134523(A2))、DIG-3(美国专利公布2013-0219570 A1)、DIG-5(美国专利公布2010-0317569 A1)、DIG-11(美国专利公布2010-0319093 A1)、AfIP-1A及其衍生物(美国专利公布2014-0033361 A1)、AfIP-1B及其衍生物(美国专利公布2014-0033361 A1)、PIP-1APIP-1B(美国专利公布2014-0007292 A1)、PSEEN3174(美国专利公布2014-0007292 A1)、AECFG-592740(美国专利公布2014-0007292 A1)、Pput_1063(美国专利公布2014-0007292A1)、DIG-657(国际专利公布WO2015/195594 A2)、Pput_1064(美国专利公布2014-0007292A1)、GS-135及其衍生物(美国专利公布2012-0233726 A1)、GS153及其衍生物(美国专利公布2012-0192310 A1)、GS154及其衍生物(美国专利公布2012-0192310 A1)、GS155及其衍生物(美国专利公布2012-0192310 A1)、如美国专利公布2012-0167259 A1中描述的SEQ IDNO:2及其衍生物、如美国专利公布2012-0047606 A1中描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2011-0154536 A1中描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2011-0112013 A1中描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0192256 A1中描述的SEQ ID NO:2和4及其衍生物、如美国专利公布2010-0077507 A1中描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0077508 A1中描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2009-0313721 A1中描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0269221A1中描述的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如美国专利号7,772,465(B2)中描述的SEQ IDNO:2及其衍生物、如WO2014/008054 A2中描述的CF161_0085及其衍生物、如美国专利公布US2008-0172762 A1、US2011-0055968A1和US2012-0117690 A1中描述的鳞翅目毒性蛋白及其衍生物、如US7510878(B2)中描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利号7812129(B1)中描述的SEQ ID NO:2及其衍生物、如美国专利公布号2015-0264940A1中描述的DIG-911和DIG-180等。

在其他实施方案中，这样的组合物/制剂还可包含至少一种另外的多肽，所述至少一种另外的多肽表现出针对未受本发明的其他昆虫抑制性蛋白抑制的昆虫的昆虫抑制活性，以扩大所获得的昆虫抑制谱。例如，为了防治半翅目害虫，本发明的昆虫抑制性蛋白的组合可与半翅目活性蛋白如TIC1415(美国专利公布2013-0097735 A1)、TIC807(美国专利号8609936)、TIC834(美国专利公布2013-0269060 A1)、AXMI-036(美国专利公布2010-0137216 A1)和AXMI-171(美国专利公布2013-0055469 A1)一起使用。用于防治鞘翅目害虫的另外的多肽可选自由如但不限于以下的昆虫抑制性蛋白组成的组：Cry3Bb(美国专利号6,501,009)、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、AXMI134(美国专利公布2013-0167264 A1)、AXMI-184(美国专利公布2010-0004176 A1)、AXMI-205(美国专利公布2014-0298538 A1)、AXMI-207(美国专利公布2013-0303440 A1)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公布20140245491A1)、AXMI-221z、AXMI-223z(美国专利公布2014-0196175 A1)、AXMI-279(美国专利公布2014-0223599 A1)、AXMI-R1及其变体(美国专利公布2010-0197592A1)、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC901、TIC1201、TIC3131、DIG-10(美国专利公布2010-0319092A1)、eHIPs(美国专利申请公布号2010/0017914)、IP3及其变体(美国专利公布2012-0210462 A1)、PHI-4变体(美国专利申请公布2016-0281105 A1)、PIP-72变体(WO 2016-144688 A1)、PIP-45变体、PIP-64变体、PIP-74变体、PIP-75变体和PIP-77变体(WO 2016-144686 A1)、DIG-305(WO 2016109214 A1)、PIP-47变体(美国专利公布2016-0186204 A1)、DIG-17、DIG-90、DIG-79(WO 2016-057123 A1)、DIG-303(WO 2016-070079A1)以及ω-六毒素-Hv1a(美国专利申请公布2014-0366227A1)。

用于防治鞘翅目、鳞翅目和半翅目昆虫害虫的另外多肽可在由Neil Crickmore维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名网站(可从互联网www.btnomenclature.info上访问)找到。

昆虫对某些杀虫剂产生抗性的可能性已在本领域中得到证明。一种昆虫抗性管理策略是采用表达通过不同作用方式起作用的两种不同昆虫抑制剂的转基因作物。因此，对任一种昆虫抑制剂具有抗性的任何昆虫都可由另一种昆虫抑制剂防治。另一种昆虫抗性管理策略是采用对于靶向鳞翅目害虫物种而言不保护的植物，以为此类未受保护的植物提供庇护。一个特定实例描述于美国专利号6,551,962中，其以引用的方式整体并入。

其他实施方案，如待与种子处理中的蛋白质、喷洒、滴落或擦拭制剂一起使用的被设计用于防治也通过本文公开的蛋白质防治的害虫的局部施加的杀虫化学物质也可直接施加至土壤(土壤杀虫液)、施用至表达本文公开的蛋白质的生长植物上或配制成施加至含有编码所公开的一种或多种蛋白质的一种或多种转基因的种子。用于种子处理中的此类制剂可与本领域中已知的各种贴纸和增粘剂一起施加。此类制剂可含有在作用方式上与所公开的蛋白质具有协同作用的杀虫剂，以使得所述制剂杀虫剂通过不同的作用方式起作用，以防治可由所公开的蛋白质防治的相同或相似的害虫，或者此类杀虫剂起作用以防治在不受TIC7941杀虫蛋白有效防治的更广泛宿主范围或植物害虫物种内的害虫。

前述组合物/制剂还可包含农业上可接受的载体如诱饵、粉末、粉剂、小丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体悬浮液、水溶液、芽孢杆菌孢子/晶体制剂、种子处理、经转化以表达一种或多种蛋白质的重组植物细胞/植物组织/种子/植物或经转化以表达一种或多种蛋白质的细菌。取决于重组多肽中固有的昆虫抑制或杀虫抑制的水平以及待施加至植物或饮食测定的制剂的水平，所述组合物/制剂可包含按重量计各种量的重组多肽，例如0.0001重量％至0.001重量％至0.01重量％至1重量％至99重量％的重组多肽。

本公开还考虑了通过使用微小RNA(miRNA)来减少转基因植物的生殖组织中杀虫蛋白的表达的组合物和方法。miRNA是植物中基因沉默机制的重要组成部分。在植物中，miRNA的产生是组织特异性过程，与转录和剪接紧密相关，并且甚至在miRNA前体之间不同。miRNA由植物中的核DNA编码，经由与mRNA分子内的互补序列碱基配对起作用(Achkar等人(2016)miRNA Biogenesis:A Dynamic Pathway,Trends in Plant Science.21(12):1034-1044)。miRNA由初级miRNA转录物(pri-miRNA)产生。新生pri-miRNA在5'端封端且在3'端聚腺苷酸化，并且含有内含子的pri-miRNA被剪接或选择性剪接。pri-miRNA由含有核RNA酶DICER-LIKE 1(DCL1)及其辅助蛋白SERRATE(SE)和HYPONASTIC LEAVES(HYL1)作为核心组分的切割复合物加工，以产生成熟的二十一(21)个核苷酸的miRNA/miRNA*双链体。通过HUAENAHANCER 1(HEN1)进行3′-末端2′-O-甲基化来使miRNA/miRNA*双链体稳定。HEN1还有助于从细胞核和RNA诱导的沉默复合体(RISC)组装输出miRNA/miRNA*双链体。在RICS负载期间，选择小RNA双链体的一条链作为引导链，并掺入ARGONAUTE 1(AGO1)中以形成功能性RISC，而另一条链(过客链)被除去并降解。将miRNA负载至AGO蛋白中受由碱基对错配引起的miRNA/miRNA*双链体中的凸起的影响。AGO1优选具有中心错配的双链体(Yu等人(2017)The“how”and“where”of plant microRNAs.New Phytologist,216:1002-1017)。

植物miRNA经由两种主要机制在转录后水平调控靶基因：转录物裂解和翻译阻抑。在植物中，与转录物裂解相比，观察到翻译阻抑的频率较低。miRNA引导的RNA裂解发生在靶mRNA中的精确位置。裂解是通过AGO蛋白的PIWI结构域完成的，其形成RNA酶H样折叠并表现出核酸内切酶活性。5'和3'裂解片段随后被核酸外切酶降解。miRNA介导的翻译抑制所需的已知因素包括微管切割酶KATANIN 1(KTN1)、VARICOSE(VCS)的处理小体(P体)组分、GW重复蛋白SUO和ER膜蛋白ALTERED MERISTEM PROGRAM 1(AMP1)。这些基因中的突变在蛋白质水平上选择性地干扰miRNA引导的阻抑，从而表明转录物裂解和翻译阻抑是两种独立的作用方式。关于miRNA介导的翻译阻抑的分子机制尚不清楚。体外分析表明，植物miRNA能够抑制翻译起始或阻碍核糖体的移动(Yu等人(2017)The“how”and“where”of plantmicroRNAs.New Phytologist,216:1002-1017)。

除mRNA裂解和翻译阻抑外，一些miRNA还从其转录物触发次级短干扰RNA(siRNA)的产生，并且这是植物中普遍存在且保守的现象(Yu等人(2017)The“how”and“where”ofplant microRNAs.New Phytologist,216:1002-1017)。与上述二十一(21)个核苷酸的miRNA相反，通常触发这些次级siRNA的产生的miRNA的长度为二十二(22)个核苷酸。通过RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)将靶向RNA转化为双链RNA(dsRNA)，然后通过DCL核酸酶将所述双链RNA裂解为siRNA。通常，双链体的一条链优先与AGO蛋白缔合形成效应子复合物(RNA诱导的沉默复合物，或RISC)，所述效应子复合物基于序列互补性靶向并沉默转录物。在拟南芥中，在靶RNA的AGO1介导的miRNA引导的RNA裂解后，5'或3'裂解片段通过基因沉默抑制子3(SGS3)稳定，所述基因沉默抑制子通过识别二十二(22)个核苷酸miRNA/靶标双链体的特征而与RISC缔合以保护裂解。募集RNA依赖性RNA聚合酶6(RDR6)，以将裂解片段转化为dsRNA，然后将所述dsRNA在二十一(21)个核苷酸的间隔片段处从降解中切割成siRNA。在植物中，这一过程可通过在主要靶RNA上通过RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)转录后产生次生siRNA来放大。(Cuperus等人,(2010)Unique Functionality of 22nt miRNAs inTriggering RDR6-Dependent siRNA Biogenesis from Target Transcripts inArabidopsis.Nat Struct Mol Biol,17(8):997-1003；Chen等人,(2010)22-NucleotideRNAs trigger secondary siRNA biogenesis in Plants.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,107:15269-15274；Yu等人(2017)The“how”and“where”of plantmicroRNAs.New Phytologist,216:1002-1017)。

通过对大豆中各种组织中的miRNA进行数据挖掘，鉴定了与营养组织相比在生殖组织中过表达的两种miRNA：miR395和miR4392。miR395被加工成二十一(21)个核苷酸的miRNA/miRNA*双链体，并且主要在大豆花的雄蕊中表达。将miR4392加工成二十二(22)个核苷酸的miRNA/miRNA*双链体并触发由其转录物产生次级siRNA，从而放大抑制信号。miR4392在大豆花药中高度富集。miRNA与ARG O蛋白结合形成沉默复合物，充当序列特异性向导，从而在靶RNA的3′非翻译区(3′UTR)内通过miRNA与本文称为“miRNA靶结合位点”的互补位点之间的碱基配对而将所述沉默复合物引导至转录物。对应于miR395(Gm.miR395_1(SEQ ID NO:18)和Gm.miR395_2(SEQ ID NO:19))和miR4392(Gm.miR4392_1(SEQ ID NO:21)和Gm.miR4392_2(SEQ ID NO:22))的miRNA靶结合位点使用DNA间隔区(SP-ART.8a-1，SEQ ID NO:24)可操作地连接以分别构建SUP-mi R395(SEQ ID NO:20)和SUP-miR4392(SEQID NO:23)。进而将SUP-miR395和SUP-miR4392可操作地连接在终止密码子之后的TIC7941PL_1编码序列3′，从而分别产生转基因TIC7941PL_1-miR395(SEQ ID NO:25)和TIC7941PL_1-miR4392(SEQ ID NO:26)。TIC7941PL_1-miR395和TIC7941PL_1-miR4392的表达对TIC7941PL_1的杀虫活性没有影响。当在叶盘测定中与TIC7941PL_1相比时，TIC7941PL_1-miR395和TIC7941PL_1-miR4392两者展现针对南方粘虫(SAW，南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(SBL，大豆夜蛾)和大豆食心虫(SPW，谷实夜娥)的类似杀虫活性。将miR395和miR4392靶位点可操作地连接至TIC7941PL_1编码序列意图降低TIC7941PL_1杀虫蛋白在表达TIC7941PL_1-miR395或TIC7941PL_1-miR4392的转基因大豆的生殖组织中的表达。

根据上述内容，本领域技术人员应了解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在已公开并仍获得类似或相似结果的特定方面中做出改变。因此，本文所公开的特定结构和功能详情将不被解释为限制性的。应理解，本文引用的每个参考文献的全部公开内容并入本申请的公开内容内。

实施例

实施例1

TIC7941的发现、克隆和表达

鉴定编码新型缓病类芽孢杆菌杀虫蛋白的序列，克隆并确认序列，并在昆虫生物测定中进行了测试。从缓病类芽孢杆菌物种DSC020651分离的杀虫蛋白TIC7941代表新型的Vip3C样蛋白。TIC7941的远缘序列是Vip3Ca1(72.43％同一性，最接近的已知亲缘物)、Vip3Aa1(64.45％同一性)和Vip3B样蛋白(59％同一性)。

通过本领域已知的方法合成了TIC7941的编码区的全长拷贝和TIC7941的His标签型式(TIC7941_His)，并且它们包含每个编码序列的翻译起始密码子和终止密码子。使用本领域已知的方法，将TIC7941编码序列克隆到Bt表达载体中，所述表达载体与Bt可表达启动子可操作的连接。Bt表达载体包含在芽孢杆菌的孢子形成阶段期间处于开启状态的启动子。此外，将TIC7941_His编码序列克隆到用于大肠杆菌(E.coli)中的蛋白质表达的载体中。为了分离大肠杆菌表达的蛋白质，将组氨酸标签可操作地连接至所表达的编码序列，以促进蛋白质的柱纯化。表2中呈现用于细菌表达的编码序列及其相应的蛋白质序列。

表2.用于在Bt和大肠杆菌中表达的毒素编码序列和相应的蛋白质序列。

实施例2

TIC7941在昆虫生物测定中展现鳞翅目活性

杀虫蛋白TIC7941在Bt和大肠杆菌中表达，并测定针对各种鳞翅目、鞘翅目、半翅目和双翅目物种的毒性。将来自Bt和大肠杆菌两者的TIC7941和TIC7941_His的制剂针对鳞翅目物种小地老虎(BCW，地蚕)、玉米穗虫(CEW，也称为大豆食心虫(SPW)，谷实夜娥)、欧洲玉米螟(ECB，玉米螟)、秋粘虫(FAW，草地贪夜蛾)、南方粘虫(SAW，南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(SBL，大豆夜蛾)、西南玉米螟(SWCB，西南玉米螟)、烟草蚜虫(TBW，烟芽夜蛾)和藜豆毛虫(VBW，藜豆夜蛾)；鞘翅目物种科罗拉多马铃薯甲虫(CPB，马铃薯甲虫)和西方玉米根虫(WCB，玉米根叶甲)；以及半翅目物种牧草盲蝽(TPB，美洲牧草盲蝽)和西部牧草盲蝽(WTP，豆荚草盲蝽)；以及双翅目物种黄热蚊(YFM，埃及伊蚊)进行了测定。

为了在Bt宿主中产生TIC7941，将表达TIC7941的Bt菌株生长二十四(24)小时，然后将培养物添加至昆虫饮食中。通过将吃具有来自表达TIC7941的Bt菌株的培养物的饮食的昆虫与吃来自具有未处理的对照培养物的饮食的昆虫的生长和发育进行比较来评估死亡率和生长迟缓。

将表达TIC7941_His的大肠杆菌菌株以与Bt菌株相似的方式处理并在蛋白质纯化后以昆虫饮食的形式提供，并与吃具有未处理的对照培养物的饮食的昆虫的生长和发育进行比较。TIC7941展现针对鳞翅目昆虫害虫物种小地老虎、玉米穗虫、欧洲玉米螟、南方粘虫、大豆尺蠖和西南玉米螟的杀虫活性。针对大豆尺蠖的活性特别高。

实施例3

在稳定转化的玉米植物中针对鳞翅目害虫的TIC7941PL_1活性的测定

使用本领域中已知的方法克隆了包含被设计为表达非靶向TIC7941PL_1杀虫蛋白的转基因盒的二元植物转化载体。所得载体用于稳定地转化玉米植物。从转化体中收获组织，并用于针对各种鳞翅目昆虫害虫的昆虫生物测定。

构建用于在植物中表达TIC7941的合成编码序列，将其克隆到二元植物转化载体中，并用于转化玉米植物细胞。根据美国专利5,500,365中总体描述的方法合成了合成序列，以避免某些有害的问题序列如富含ATTTA和A/T的植物聚腺苷酸化序列，同时保留了天然类芽孢杆菌蛋白的氨基酸序列。合成编码序列(SEQ ID NO:3)编码TIC7941PL_1蛋白(SEQID NO:4)，所述蛋白相对于TIC7941蛋白包含紧随起始甲硫氨酸的额外丙氨酸残基。所得植物转化载体包含用于表达TIC7941PL_1杀虫蛋白的第一转基因盒，所述第一转基因盒包含组成型启动子，所述组成型启动子与前导序列5′可操作地连接，所述前导序列与内含子5′可操作地连接，所述内含子与编码非靶向TIC7941PL_1蛋白(SEQ ID NO:4)的合成编码序列5′可操作地连接，所述合成编码序列进而与3ˊUTR 5ˊ可操作地连接；以及用于使用草甘膦选择来选择转化的植物细胞的第二转基因盒。

使用土壤杆菌介导的转化方法，用如上所述的二元转化载体转化玉米植物细胞。通过本领域中已知的方法诱导转化的细胞以形成植物。使用植物叶盘的生物测定类似于美国专利号8,344,207中所述进行。将不到一天龄的单只新鲜孵化的新生幼虫放在每个叶盘样品上，并喂养大约四天。使用未转化的玉米植物来获得用作阴性对照的组织。针对BCW、CEW、FAW和SWCB评估来自每种二元载体的多个转化R

使用植物叶盘评估了十二个转化的R

表3.表达TIC7941PL_1的转化玉米R

如可在表3中观察到，所测定的十二个转化的R

选择事件一至六在F

表4.表达TIC7941PL_1的转化玉米F

如可在表4中看出，所有六个事件都展现针对BCW的抗性，六个事件中的五个展现针对CEW的抗性，并且六个事件中的两个展现针对SWCB的抗性。用转基因盒稳定转化以表达TIC7941的玉米植物展现针对鳞翅目害虫物种如BCW、CEW和SWCB的抗性。

实施例4

在稳定转化的大豆植物中针对鳞翅目害虫的TIC7941PL_1活性的测定

使用本领域中已知的方法克隆了包含被设计为表达非靶向TIC7941PL_1杀虫蛋白的转基因盒的二元植物转化载体。所得载体用于稳定地转化大豆植物。从转化体中收获组织，并用于针对各种鳞翅目昆虫害虫的昆虫生物测定。

如实施例3中所述将被设计用于植物表达的合成TIC7941PL_1编码序列克隆到二元植物转化载体中，并且用于转化大豆植物细胞。使用本领域已知的方法构建包含非靶向TIC7941PL_1编码序列的二元载体。所得的植物转化载体包含用于表达TIC7941PL_1杀虫蛋白的第一转基因盒，所述第一转基因盒包含植物可表达启动子，所述植物可表达启动子与前导序列5′可操作地连接，所述前导序列与编码非靶向TIC7941PL_1蛋白(SEQ ID NO:4)的合成编码序列5′可操作地连接，所述合成编码序列进而与3ˊUTR 5ˊ可操作地连接；以及用于使用壮观霉素选择来选择转化的植物细胞的第二转基因盒。如上所述构建了四(4)种二元转化载体。每种构建体包含TIC7941PL_1表达盒，所述表达盒包含不同的启动子和3ˊUTR。

通过本领域中已知的方法诱导转化的大豆细胞以形成植物。使用植物叶盘的生物测定类似于美国专利第8,344,207号中所述进行。使用未转化的大豆植物来获得用作阴性对照的组织。针对SAW、SBL、SPW和VBW评估来自每种二元载体的多个转化事件。

使用植物叶盘评估了使用四种不同的二元构建体源自转化的R

表5.表达TIC7941PL_1的转化大豆R

如可从表5中看出，用四(4)种构建体中的每一者转化的表达TIC7941PL_1的R

实施例5

在稳定转化的棉花植物中针对鳞翅目害虫的TIC7941PL_1活性的测定

使用本领域中已知的方法克隆了包含被设计为表达质体靶向和非靶向TIC7941PL_1杀虫蛋白两者的转基因盒的二元植物转化载体。所得载体用于稳定地转化棉花植物。从转化体中收获组织，并用于针对各种鳞翅目昆虫害虫的昆虫生物测定。

如实施例3中所述将被设计用于植物表达的合成编码序列克隆到二元植物转化载体中，并且用于转化棉花植物细胞。使用本领域已知的方法构建包含质体靶向和非靶向TIC7941PL_1编码序列的二元载体。所得的植物转化载体包含用于表达TIC7941PL_1杀虫蛋白的第一转基因盒，所述第一转基因盒包含组成型启动子，所述组成型启动子与前导序列5′可操作地连接，所述前导序列与编码质体靶向或非靶向TIC7941PL_1蛋白的合成编码序列5′可操作地连接，所述合成编码序列进而与3ˊUTR 5ˊ可操作地连接；以及用于使用壮观霉素选择来选择转化的植物细胞的第二转基因盒。

通过本领域中已知的方法诱导转化的棉花细胞以形成植物。使用植物叶盘的生物测定类似于美国专利第8,344,207号中所述进行。使用未转化的棉花植物来获得用作阴性对照的组织。针对CBW、FAW、SBL和TBW以及已知对棉花作物造成农艺损伤的任何其他鳞翅目昆虫害虫物种评估了来自每种二元载体的多个转化事件。

除叶盘外，其他组织也可用于评估转基因棉花植物如方形物和棉铃中由TIC7941PL_1毒素蛋白的表达所赋予的抗性。将损伤等级评定得分应用于与每种昆虫害虫相对应的每个样品，并与阴性对照进行比较，以确定TIC7941PL_1的表达是否提供对特定昆虫害虫物种的抗性。

实施例6

提高TIC7941针对秋粘虫的杀虫活性

此实施例说明通过将FAW跨膜ABC转运蛋白(ABCc4)结合肽插入TIC7941蛋白序列中来提高TIC7941针对秋粘虫的杀虫活性。

肽片段FAWPEPBIN(呈现为SEQ ID NO:17)结合至FAW跨膜ABC转运蛋白ABCc4。FAWPEPBIN_Bac(SEQ ID NO:15)是编码FAWPEPBIN(SEQ ID NO:17)的合成编码序列，以用于在细菌中表达FAWPEPBIN肽。

在昆虫生物测定中比较了具有FAWPEPBIN肽的工程化的His标记的TIC7941蛋白，所述肽插入所述蛋白质的结构域2环中的不同位置。TIC7941_2His编码序列(SEQ ID NO:7)编码TIC7941_2His杀虫蛋白(SEQ ID NO:8)。TIC7941_3His编码序列(SEQ ID NO:9)编码TIC7941_3His杀虫蛋白(SEQ ID NO:10)。在TIC7941_2His的核苷酸位置2413-2448内和TIC7941_3His的位置2410-2445内发现FAWPEPBIN_Bac合成编码序列。FAWPEPBIN肽序列位于TIC7941_2His的氨基酸位置805至816和TIC7941_3His的氨基酸位置804至815。

测定了TIC7941_His、TIC7941_2His和TIC7941_3His杀虫蛋白针对FAW的杀虫活性。TIC7941_His和TIC7941_2His两者均展现很少或没有针对FAW的活性。然而，TIC7941_3His展现针对FAW的提高的杀虫活性。因此，在TIC7941_3His的氨基酸位置804-815中插入合成编码序列FAWPEPBIN_Bac提高了TIC7941蛋白针对FAW的杀虫活性。

实施例7

在稳定转化的玉米植物中TIC7941PL_2和TIC7941PL_3针对秋粘虫的活性的测定

使用本领域中已知的方法克隆了包含被设计为表达TIC7941PL_2和TIC7941PL_3杀虫蛋白的转基因盒的二元植物转化载体。所得载体用于稳定地转化玉米植物。从转化体中收获组织，并用于针对FAW和鳞翅目昆虫害虫的昆虫生物测定。

如先前实施例3中所述构建二元植物转化载体。所述二元载体包含用于表达TIC7941PL_2或TIC7941PL_3的转基因盒。TIC7941PL_2和TIC7941PL_3包含ABCc4受体结合肽FAWPEPBIN。将用于在植物细胞中表达并编码秋粘虫跨膜ABC转运蛋白ABCc4结合肽FAWPEPBIN的合成DNA序列(FAWPEPBIN_PL，SEQ ID NO:16)插入TIC7941PL_1毒素蛋白中。在TIC7941PL_2的核苷酸位置2386-2421内和TIC7941PL_3的核苷酸位置2383-2418内发现FAWPEPBIN_PL编码DNA片段。FAWPEPBIN肽片段位于TIC7941PL_2的氨基酸位置796-807和TIC7941PL_3的氨基酸位置795-806处。

使用土壤杆菌介导的转化方法，用如上所述的二元转化载体转化玉米植物细胞。通过本领域中已知的方法诱导转化的细胞以形成植物。使用植物叶盘的生物测定类似于美国专利第8,344,207号中所述进行。使用未转化的玉米植物来获得用作阴性对照的组织。针对FAW评估来自每种二元载体的多个转化R

实施例8

通过使用miRNA靶位点减少稳定转化的大豆植物的生殖组织中的TIC7941PL_1表达

此实施例说明通过使用可操作连接的miRNA识别位点，在稳定转化的大豆植物的生殖组织中TIC7941PL_1的表达减少。

植物miRNA经由两种主要机制在转录后水平调控靶基因：转录物裂解和翻译阻抑。此外，一些miRNA还从其转录物触发次级短干扰RNA(siRNA)的产生，从而放大了miRNA对表达的影响。miRNA的长度通常为二十一(21)个核苷酸，但触发产生次级siRNA的那些miRNA的长度为二十二(22)个核苷酸。通过对大豆中各种组织中的miRNA进行数据挖掘，鉴定了与营养组织相比在生殖组织中过表达的两种miRNA：miR395和miR4392。miR395被加工成二十一(21)个核苷酸的miRNA/miRNA*双链体，并且主要在大豆花的雄蕊中表达。将miR4392加工成二十二(22)个核苷酸的miRNA/miRNA*双链体并触发由其转录物产生次级siRNA，从而放大抑制信号。miR4392在大豆花药中高度富集。miRNA与ARGO蛋白结合形成沉默复合物，充当序列特异性向导，从而在靶RNA的3′非翻译区(3′UTR)内通过miRNA与miRNA靶结合位点之间的碱基配对而将所述沉默复合物引导至转录物。

使用DNA间隔区(SP-ART.8a-1，SEQ ID NO:24)可操作地连接对应于miR395(Gm.miR395_1(SEQ ID NO:18)和Gm.miR395_2(SEQ ID NO:19))的靶位点以构建SUP-miR395(SEQ ID NO:20)。使用DNA间隔区(SP-ART.8a-1，SEQ ID NO:24)可操作地连接对应于miR4392(Gm.miR4392_1(SEQ ID NO:21)和Gm.miR4392_2(SEQ ID NO:22))的靶位点以构建SUP-miR4392(SEQ ID NO:23)。将SUP-miR395和SUP-miR4392可操作地连接在终止密码子之后的TIC7941PL_1编码序列3′，从而分别产生转基因TIC7941PL_1-miR395(SEQ ID NO:25)和TIC7941PL_1-miR4392(SEQ ID NO:26)。

使用本领域已知的方法构建了包含被设计为表达非靶向TIC7941PL_1-miR395和TIC7941PL_1-miR4392的转基因盒的二元植物转化载体，并且所述二元植物转化载体与实施例4中所述的那些相似。使用与实施例4中的构建体3相同的启动子、前导序列和3′UTR元件构建了两种构建体，并且所述构建体包含TIC7941PL_1-miR395和TIC7941PL_1-miR4392DNA序列。如实施例4中所述，使用叶盘针对SAW、SBL、SPW和VBW评估了来自每种二元载体的多个转化事件。构建体3TIC7941PL_1充当对照，以用于比较包含非靶向TIC7941PL_1-miR395和TIC7941PL_1-miR4392的构建体的杀虫活性。

表6.表达TIC7941PL_1的转化大豆R

如可在表6中看出，将miRNA靶结合位点可操作地连接至TIC7941PL_1编码序列不会影响TIC7941PL_1的杀虫活性。两种miRNA靶结合位点构建体展现相同水平的针对SAW、SBL、SPW和VBC的杀虫活性。如先前在实施例4中观察到的，TIC7941PL_1展现针对SAW,SBL和SPW的高抗性和高外显率。

根据本公开，本文公开且要求保护的所有组合物可在无需过度实验的情况下制备和实施。尽管已经根据前述说明性实施方案描述了本发明的组合物，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的真实概念、精神和范围的情况下，可对本文所述的组合物进行变化、改变、修改和变更。更具体地，显而易见的是在化学上和生理学上都相关的某些剂可取代本文所述的剂，同时达到相同或相似结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类相似的取代和修改均被认为是在所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。

说明书中所引用的所有公布和公布的专利文件均以引用的方式并入本文中，其并入程度就如同各个别公布或专利申请特定地并且个别地被指示以引用的方式并入一般。