一种Net1基因细胞模型的构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Net1基因细胞模型的构建方法与应用。

背景技术

随着人口老龄化、噪声、病毒感染、耳毒性药物滥用以及环境污染等不良因素的发展和加剧，耳聋及听力障碍人群的数量正逐步上升。耳聋已成为影响社会政治和经济的全球性健康问题，其中感音神经性聋约占耳聋患者的63％。然而，目前临床上尚无疗效确切的内耳靶向性药物可用于治疗感音神经性聋。由于哺乳动物耳蜗毛细胞不可再生，因此如何使毛细胞在损伤后修复和再生，从而在根本上治疗感音神经性聋是近年来听觉领域研究的重点。而提供一种非人类的动物模型作为研究与试验平台以表征毛细胞的修复与再生，同样具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提出了一种Net1基因细胞模型的构建方法与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种Net1基因细胞模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤1：培养OC细胞，用siRNA敲减所述OC细胞中的Net1基因，检测敲减效率；

步骤2：Lgr5-EGFP小鼠耳蜗，消化成单细胞后，分选出表达Lgr5细胞，在细胞培养皿中培养；通过siRNA敲除所述表达Lgr5细胞中的Net1基因；

步骤3：进行细胞成球试验，观察并量化球形的数量和直径来评估所述表达Lgr5细胞的增殖能力。

可选地，构建shRNA作为阴性对照，用与GFP结合的无义siRNA评估转染效率。

可选地，用N1603、N1130、N622三种不同的siRNA敲减OC细胞中的Net1基因。

可选地，所述步骤1中培养OC细胞的培养液含有DMEM、10％FBS与氨苄青霉素。

可选地，还包括以下步骤：将所述步骤3中的第一代成球细胞置入培养液中，用EdU染色以及毛细胞标志物抗体标记染色，并结合细胞免疫荧光观察毛细胞分化情况。

可选地，所述毛细胞标志物为myosin7a。

本发明还揭示了上述任一所述的小鼠基因构建方法在研究毛细胞再生的中应用。

本发明的有益效果：

综上所述，通过构建本示例中的细胞模型的方法，能够反映出敲减Net1对毛细胞增殖与分化的影响，因此将该模型作为试验与研究平台，能够有效地促进修复毛细胞的研究。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本申请的细胞模型的基因敲减效率的对比；

图2为本申请的细胞模型敲减Net1前后的的Lgr5细胞的增殖情况对比；

图3为本申请的细胞模型敲减Net1前后的的Lgr5细胞的分化情况对比；

图4为本申请的细胞模型构建方法的流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1～4所示，本申请的一个示例中，公开了一种细胞模型的构建方法，首先应当选用siRNA进行Net1基因的敲减，在本示例中，采用N1603、N1130、N622三种不同的siRNA敲减oc-1细胞中的Net1基因。用DMEM基本培养基(含DMEM、10％FBS、0.1％的氨苄青霉素)培养OC-1细胞，细胞经三次传代后提取RNA，采用RT-qPCR技术检测OC-1细胞中Net1基因的敲减效率，并与未敲减的对照组作比较，最终选择N622 siRNA进行实验。

二、表达Lgr5祖细胞的分离培养及Net1基因敲除：

取新生Lgr5-EGFP小鼠耳蜗放入装有50ul 1×PBS的1.5ml EP管中，用50ul0.25％胰酶-EDTA在37℃下培养8-12min后消化成单细胞。采用流式细胞分选技术从含有Lgr5-EGFP细胞的单细胞悬液中分选出表达Lgr5细胞，在细胞培养皿中培养。用在OC-1细胞中敲除效率最佳的siRNA敲除表达Lgr5细胞中的Net1基因。

三、Net1基因敲除对表达Lgr5祖细胞增殖/分化的影响：

采用细胞成球和分化实验研究Net1基因敲减对表达Lgr5细胞增殖/分化的影响，通过活细胞工作站显微镜观察、细胞免疫荧光的方法评估表达Lgr5细胞增殖、分化为毛细胞的能力。

增殖情况：将Net1基因敲减的表达Lgr5细胞接种在96孔皿上以2个细胞/ul的密度培养5天，其中培养液含DMEM/F12、2％B27、1％N2、IGF、EGF、b-FGF、肝素、0.1％的氨苄青霉素。通过活细胞工作站显微镜观察并量化球形的数量和直径来评估表达Lgr5细胞的增殖能力。Net1基因敲减对表达Lgr5细胞成球的数量有抑制作用，成球直径无显著性差异，表明Net1基因敲减对表达Lgr5细胞增殖有抑制作用。

分化情况：将第一代成球细胞接种在层粘连蛋白覆盖的4孔皿上培养10天，其培养液含DMEM/F12、2％B27、1％N2、0.1％的氨苄青霉素。10天后，用EdU染色以及myosin7a(毛细胞标志物)相关抗体标记染色并结合细胞免疫荧光研究Net1基因敲减对表达Lgr5细胞向毛细胞分化的调控。Net1基因敲减对表达Lgr5细胞分化为Myo7a+细胞数量无显著性差异，表明Net1基因敲减对表达Lgr5细胞分化为毛细胞无调控作用。

最终表明通过敲减Net1基因可以抑制毛细胞的增值，可以通过调控Net1基因从而促进毛细胞增值。

综上所述，通过构建本示例中的细胞模型的方法，能够提供一种具有显著促进毛细胞增殖的过程，因此将该模型作为试验与研究平台，能够有效地促进修复毛细胞的研究。

根据上述细胞模型，在本发明的另一个示例中，公开了一种采用上述细胞模型在研究毛细胞再生中的应用，通过该模型，反映了一种通过敲减Net1基因控制毛细胞增殖的过程，对研究毛细胞的修复具有重要的研究意义。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。