一种血浆外泌体miR-596的应用

技术领域

本发明涉及特发性肺动脉高压预后技术领域，尤其涉及一种血浆外泌体miR-596的应用。

背景技术

特发性肺动脉高压(IPAH)是一种肌性肺小动脉疾病，其特征是肺动脉压力和肺血管阻力(PVR)无明显原因地逐渐升高，最终因右心衰竭而死亡。IPAH诊断的黄金标准是基于右心导管插入术(RHC)的多项血液动力学指标，例如PVR、平均肺动脉压力(mPAP)、平均肺动脉楔压(mPAWP)等。除了诊断价值外，一些血液动力学参数还可用作评估IPAH患者预后的生物标志物。然而，这些参数是通过侵入性检查获得的，需要迫切地挑选出更好的生物标志物。

外泌体是一类直径为50-150nm的小细胞外囊泡，来源于与质膜融合的多囊泡内体。分泌的外泌体可被受体细胞吸收，外泌体的内容物也可以传递到受体细胞中，这所代表的一种新型的细胞间通讯途径在疾病发展中起重要作用。微小核糖核酸(miRNA)是外泌体的重要组成部分。许多研究指出，miRNA在IPAH的发生和发展中起着重要作用。Sharma等人确定了源自艾滋病毒感染和可卡因治疗的巨噬细胞的外泌体通过递送miRNA促进了肺平滑肌增殖，这可能在PAH的发展中起着至关重要的作用。虽然外泌体miRNA调控PAH病理过程中的许多关键驱动因素，但血浆外泌体miRNA是否能预测IPAH患者的预后尚不清楚。

在本专利中，我们旨在比较存活患者和非存活患者之间血浆外泌体miRNA的表达，研究外泌体miRNA的表达与生存率之间的关系，并为IPAH的临床防治提供最佳预后建议。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种血浆外泌体miR-596的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

提供一种检测血浆外泌体miR-596的制剂在制备预测特发性肺动脉高压患者生存率试剂盒中的应用。

优选地，所述血浆外泌体miR-596表达水平较低的患者具有较高的生存率。

进一步优选地，所述血浆外泌体miR-596表达水平低于2.6的患者具有较高的生存率。

优选地，所述预测的敏感性不低于70.6％。

优选地，所述预测的特异性不低于92.3％。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明首次发现IPAH存活患者和非存活患者血浆外泌体miR-596的表达不同。血浆外泌体miR-596可作为一个独立的生存率预测因子，为临床预后和评估患者IPAH的严重程度提供参考。

附图说明

图1为发现组IPAH患者血浆外泌体和几种外泌体miRNA的特征，其中(A)为透射电子显微镜下的血浆外泌体图像；(B)为通过蛋白质印迹法确定外泌体标记物TSG101和CD63在外泌体中的表达；(C)为外泌体的粒径分布；(D-G)为IPAH患者中几种血浆外泌体miRNA的表达；

图2为在发现组和验证组的IPAH患者中，通过实时PCR反应检测血浆外泌体miR-596的表达，其中(A)为发现组血浆外泌体miR-596的表达；(B)为验证组血浆外泌体miR-596的表达；(C)为发现组和验证组血浆外泌体miR-596的表达；

图3为Kaplan-Meier生存分析，其中，(A)为miR-596水平预测所有患者的生存率；(B)为PVR水平预测所有患者的生存率；(C)为结合miR-596和PVR水平预测所有患者的生存率；根据miR-596和PVR的临界值对患者进行分组。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

①研究人群

从2010年5月至2012年4月，招募了12例(5例男性)新确诊的IPAH成年患者作为发现组，从2013年5月至2016年9月，招募了46例(18例男性)新确诊的IPAH成年患者作为验证组。根据欧洲心脏病学会和欧洲呼吸学会当时的指南，对两组患者进行了IPAH诊断。具体而言，两组患者的纳入标准为mPAP≥25mmHg、mPAWP≤15mmHg和PVR>3WU和排除引起PAH的其他原因的患者。排除PAH相关病因明确的患者，例如结缔组织疾病和先天性心脏病，以及因左心疾病所致的肺动脉高压和慢性血栓栓塞性肺动脉高压等其他肺动脉阻塞患者。我们还排除了患有可能影响血浆含量的急性或慢性疾病患者(即急性或慢性感染、慢性自身免疫性疾病和原发性内分泌失调)，以及在研究时或曾经接受显著抑制外泌体产生的药物治疗的患者。该研究方案由上海肺科医院伦理委员会审查和批准。在执行任何与研究相关的程序之前，从每位患者处获得书面知情同意。

②基线和随访期间的测量

人口统计数据包括性别、年龄、体表面积(BSA)、六分钟步行距离(6MWD)、N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、世界卫生组织功能分类(WHO FC)和血流动力学参数。如先前的基线研究所述，通过RHC收集血液动力学参数，根据美国胸科学会的指南进行6MWD测试。

随访间隔由医生根据个人的医疗保健需求决定。根据ESC指南，鼓励每3-6个月对PAH患者以及病情相对不稳定的患者(疾病进展迅速且控制不佳的患者)进行首次随访，建议每6-12个月通过门诊或电话对控制良好且无明显恶化的患者进行随访。主要结果是全因死亡率。从确诊之日至2020年11月8日对两组进行生存率评估。

③外泌体的纯化和鉴定

在乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血剂试管中收集血样(5mL)，并在4℃下以3000g离心15分钟。然后将上层水相(血浆)转移到试管中并储存在-80℃。储存在-80℃冰箱中的血浆样品将取出用于本研究。在4℃解冻后，使用ExoQuick-TC外泌体沉淀溶液从每个患者的700微升血浆中提取外泌体。

利用配备asCMOS照相机的NanoSight NS 300(Malvern)分析外泌体的大小分布和浓度。NanoSight应用了NTA技术，结合了光散射和布朗运动，来测量外泌体上清液中颗粒的大小和浓度。在外泌体的整个分离过程之后，首先将沉淀重悬于100μL过滤的PBS中，然后稀释100倍。测量条件包括温度为25℃；粘度为1cP，每个捕获帧25s；测量时间为60s。结果表征为至少三个单独测量的平均尺寸和浓度。

如前所述，通过蛋白质印迹法确定外泌体的标记蛋白(TSG101和CD63)。外泌体的蛋白质首先通过SDS PAGE凝胶分离，然后电泳转移到聚偏氟乙烯膜(Millipore，Billerica，MA and Bio-Rad，Hercules，CA)。将膜与TSG101和CD63的多克隆抗体(CellSignaling Technology，Danvers，MA)在4℃下孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶连接的抗兔或抗小鼠的二级抗体(Cell Signaling Technology，MA)孵育。抗原-抗体复合物通过Pierce ECLWestern Blotting Substrate显现。

④miRNAs微阵列分析

根据制造商的方案，使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取总RNA。如前所述，将每个样品中的5μg总RNA标记在miRNA微阵列芯片(Exiqon Company，Denmark)上进行杂交。miR VanaTM qRT-PCR miRNA检测试剂盒(Ambion，USA)用于检测发现组中血浆外泌体miRNA的表达，并采用实时荧光定量PCR验证发现组的结果，并确认验证组的结果。U6 snRNA作为内部对照。应用2

⑤统计分析

结果以均值±标准偏差(SD)或连续变量的中位数(和四分位数范围)和分类变量的绝对数表示。独立样本t检验或Mann-Whitney U检验以进行比较连续变量平均值的差异，卡方检验以评估分类变量的分布差异。相关性评估采用Pearson或Spearman系数。采用Kaplan-Meier法生成生存曲线，采用log-rank检验比较两组间生存曲线的差异。采用ROC曲线和曲线下面积以评估因素的预测能力。通常进行系数标准化，以找出多元回归分析中哪个自变量对因变量的影响更大。数据分析使用SPSS(Statistic Package for SocialScience，Chicago，IL)19.0版和GraphPad Prism(San Diego，CA，USA)6.0版软件。双尾p值<0.05被认为是具有显著的统计学差异。

⑥患者特征

人口统计学和血液动力学数据如表1所示。发现组共有12名IPAH患者，验证组中有46名IPAH患者符合纳入标准。发现组的平均年龄为36.3±1.8岁，验证组的平均年龄为44.6±15.6岁。所有患者的平均随访时间为60.3±35.4个月。本研究实现了100％的随访。发现组组和验证组分别有4例患者(2例男性)和15例患者(6例男性)死亡。将发现组的患者进一步分为存活患者和非存活患者以进行进一步的分析。

表1IPAH患者的基线特征

在发现组和验证组的所有患者中，存活患者和非存活患者之间的人口统计学变量均无显著差异。非存活患者的心率高于存活患者(p＝0.025，表2)。血流动力学参数显示，非存活组的平均右心房压，平均肺动脉压，平均肺毛细血管楔压和肺血管阻力显著高于存活组(均p<0.05，表2)。非存活患者的心输出量和心脏指数低于存活患者(均p<0.05，表2)。非存活患者和存活患者之间在特定药物治疗上没有显著差异。

表2所有患者存活患者和非存活患者之间的基线特征

⑦IPAH存活患者和非存活患者外泌体miRNAs的表达

在透射电子显微镜下可以清楚地观察到外泌体的经典和清晰的囊泡结构(图1A)，通过蛋白质印迹法检测到了外泌体标记物TSG101和CD-63(图1B)，并且外泌体的直径大多在30-150nm(图1C)。存活患者中外泌体miRNA的表达不同于非存活患者。具体而言，发现组中非存活患者的血浆外泌体miR-411-3p、miR-4685-3p、miR-493-5p和miR-596的表达显著较高(分别为p＝0.005、p＝0.012、p＝0.007、p＝0.010，图1D-G)。发现组组和验证组均显示了通过实时PCR测得miR-596的类似结果(均p<0.05，图2A-2C)。

⑧IPAH患者外泌体miR-596与血流动力学参数的相关性

在发现组和验证组的所有患者中，均检测到几种外泌体miRNAs与血流动力学之间的相关性(表3)。在存活时长、置信区间和miR-596水平之间也存在显著的负相关(均p<0.0001，表3)。平均右心房压、PVR和miR-596水平之间存在显著正相关(均p<0.01，表3)。

表3所有IPAH患者外泌体miR-596与血流动力学参数的相关性

注：右上角表示相关系数，左下角表示相关的p值。

⑨外泌体miR-596在预测IPAH患者生存结局中的作用

单因素和多因素分析显示，血浆外泌体miR-596和PVR的表达水平是发现组生存率的独立预测因子(均p<0.05，表4)。为了评估血浆外泌体miR-596和PVR在IPAH患者生存率的预测能力，对所有受试者均进行了ROC曲线分析(表5)。ROC分析表明，血浆外泌体miR-596和PVR的临界值区分了存活患者和非存活患者，所有患者的敏感性分别为70.6％和76.5％，特异性分别为92.3％和66.7％(分别的p<0.0001和p＝0.007，表5)。

表4所有患者中与所选miRNA水平相关的生存率的单因素和多因素分析结果

表5所有患者中miR-596和PVR的ROC

根据外泌体miR-596和PVR的临界值生成的Kaplan-Meier曲线显示，在所有患者中，外泌体miR-596表达水平和PVR较低的患者预后明显优于外泌体miR-596表达水平和PVR较高的患者(对数秩p<0.0001和p＝0.002，图3A和B)。这两个独立预测因子的组合确定了生存率显著不同的亚组(对数秩p<0.0001，图3C)。miR-596<2.6和PVR<12.6WU的亚组比其他三个亚组有更高的生存率(图3C)。而miR-596≥2.6和PVR≥12.6WU的亚组在这四个亚组中生存率最低(图3C)。

表6

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。