从发酵液中分离乙酸盐

本申请要求于2019年10月22日提交的美国临时申请序列号62/924,666和于2020年10月19日提交的美国申请第17/074,342号的权益。所述两个申请的内容通过引用整体明确地并入本文。

技术领域

本申请涉及从在气体底物的存在下培养微生物所产生的发酵液中分离一种或多种靶组分，所述分离是在模拟移动床模式下使用连续离子交换进行的。

背景技术

缓解迫切的气候变化需要大幅减少温室气体(GHG)的排放，所述GHG如通过煤和石油等化石燃料的燃烧生成的那些。虽然化学品和运输燃料的可持续来源目前不足以显著取代对化石碳的依赖，但气体发酵最近已成为用于将如二氧化碳(CO

发明内容

公开了一种用于从发酵液中分离靶组分的方法。所述方法包括使气体底物和微生物发酵以生成包括所述微生物和所述靶组分的发酵液；在连续离子交换模拟移动床中将所述发酵液通入到具有离子交换树脂的分离单元；通过与所述树脂的离子交换选择性地保留所述靶组分，并使所述微生物通过连续离子交换模拟移动床；使所述离子交换树脂再生；以及回收靶组分。所述靶组分可以是如甲酸盐、乙酸盐、乳酸盐或两者等任何低分子量有机酸的共轭碱。所述靶组分可以发生反应以形成一种或多种产物。所述微生物可以衍生自选自由以下组成的组的亲代微生物：伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜喊菌(Alkalibaculum bacchii)、长生布劳特氏菌(Blautia producta)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、克氏梭菌(Clostridium coskatii)、德氏梭菌(Clostridium drakei)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、马氏梭菌(Clostridium magnum)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、粪味梭菌(Clostridiumscatologenes)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、热自养穆尔氏菌(Moorellathermautotrophica)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、森林土壤醋酸鼠孢菌(Sporomusa silvacetica)、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)。所述微生物可以是梭菌属(genus Clostridium)的成员。所述微生物可以衍生自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌或克氏梭菌。所述气体底物可以是工业废气、工业尾气、合成气、气化废物或气化生物质。所述靶化合物可以是乙酸盐，并且所述一种或多种产物可以是乙酸乙烯酯。所述乙酸乙烯酯可以进一步发生反应以形成聚乙酸乙烯酯或聚乙烯醇。

公开了一种组合物，其包括衍生自乙酸乙烯酯的组分，所述乙酸乙烯酯由通过所述方法回收的所述乙酸盐反应得到。所述组合物可以是聚合物、共聚物、粘合剂、涂料、油漆、薄膜、织物、泡沫、电线绝缘体或电缆绝缘体。

公开了一种用于从发酵液中分离靶组分的另外的方法。所述方法包括使气体底物和微生物发酵以生成包括所述微生物和所述靶组分的发酵液；将所述发酵液通入到第一分离区以将包括所述微生物的所述发酵液的第一部分分离并再循环(recycle)到生物反应器；将所述发酵液的第二部分通入到包括离子交换树脂的第二分离区；通过与所述树脂的离子交换选择性地保留所述靶组分，并使剩余部分通过所述第二分离区；以及用再生物使所述离子交换树脂再生并回收所述靶组分。所述再生物可以包括所述剩余部分的至少一部分，或者可以衍生自所述剩余部分。所述靶组分可以是低分子量有机酸的共轭碱。所述靶组分可以是乙酸盐、乳酸盐或两者。所述离子交换树脂可以是强阴离子交换树脂。所述气体底物可以是工业废气、工业尾气、衍生自气化废物的合成气、衍生自气化生物质的合成气或其任何组合。所述靶组分可以发生反应以形成一种或多种产物。所述靶化合物可以是乙酸盐，并且所述一种或多种产物可以是乙酸乙烯酯。所述乙酸乙烯酯可以发生反应以形成聚乙酸乙烯酯或聚乙烯醇。所述聚乙酸乙烯酯或聚乙烯醇可以用于形成聚合物、共聚物、粘合剂、涂料、油漆、薄膜、织物、泡沫、电线绝缘体或电缆绝缘体。

公开了一种生物转化设备，所述生物转化设备包括：生物反应器系统，所述生物反应器系统包括进入生物反应器的入口和离开所述生物反应器的出口，所述生物反应器用于容纳培养基和微生物以代谢所述底物中的碳源并产生产物；分离区，所述分离区包括与所述生物反应器的所述出口流体连通的第一入口、模拟移动床构型中的离子交换树脂膨胀床、与再生物来源流体连通的第二入口、与所述生物反应器系统流体连通的出口和产物出口。

公开了另外的生物转化设备。所述设备包括生物反应器系统，所述生物反应器系统包括进入生物反应器的入口和离开所述生物反应器的出口，所述生物反应器含有培养基和微生物以代谢底物中的碳源并产生产物；第一分离区，所述第一分离区包括与所述生物反应器的所述出口流体连通的入口、用于分离微生物生物质的膜、与所述生物反应器流体连通的渗余物出口和渗透物出口；以及第二分离区，所述第二分离区包括与所述第一分离区的所述渗透物出口流体连通的第一入口、至少一个离子交换树脂床、与再生物来源流体连通的第二入口、与再生物来源流体连通的出口和产物出口。

附图说明

图1表示根据本公开的一个实施例的具有生物反应器系统和分离区的生物转化设备。

图2表示根据本公开的一个实施例的具有生物反应器系统、第一分离区和第二分离区的生物转化设备。

具体实施方式

本公开解决了将发酵产物与发酵液分离的问题。具体地，本公开涉及分离可能存在于发酵液中的低分子量酸和/或其共轭碱。可以使用如离子交换、蒸馏、酯化后蒸馏或液-液萃取等技术将低分子量酸与发酵液分离。另一种合适的技术被称为“盐析”，这是一种利用某些分子在离子强度非常高的溶液中溶解度降低的纯化方法。尽管参考离子交换技术解释了本公开的细节，但是可以采用上述分离技术中的任何分离技术来分离低分子量酸和/或其共轭碱。

要从发酵液中分离的一种示例性产物(也被称为靶组分)是乙酸盐，其在水中部分地从乙酸中解离。要从发酵液中分离的另一种示例性产物(也被称为靶组分)是乳酸盐，其在水中部分地从乳酸中解离。要从发酵液中分离的一种示例性产物是甲酸盐，其在水中部分地从甲酸中解离。从发酵液中回收的乙酸盐可以容易地转化为乙酸，所述乙酸是形成乙酸乙烯酯的主要反应物，所述乙酸乙烯酯也被称为乙酸乙烯酯单体(VAM)。VAM是重要的商业产品，因为VAM可以聚合形成聚乙酸乙烯酯。因此，VAM在用于生产粘合剂、涂料、油漆、薄膜、织物、泡沫、电线绝缘体和电缆绝缘体的聚合物和树脂的工业生产中很重要。乙酸还可以用于食品和硅化学领域的反应中。类似地，从发酵液中回收的乳酸可以容易地转化为乳酸，所述乳酸是皮肤护理产品中的一种成分。将乳酸添加到皮肤护理产品中，以增强皮肤提亮效果、改善胶原蛋白和弹性蛋白合成并加速角质剥脱和细胞更新。对祛痘和抗衰老产品的需求上升有望刺激对乳酸的产品需求。

除非另有定义，否则如贯穿本说明书使用的以下术语定义如下：

当涉及发酵过程使用时，术语“增加效率”、“增加的效率”等包含但不限于增加以下中的一种或多种：催化发酵的微生物的生长速率、升高的产物浓度下的生长和/或产物产生速率、增加每体积消耗的底物所产生的期望产物的体积、增加期望产物的产生速率或产生水平、增加期望产物与发酵的其它副产物相比的相对比例、减少过程中消耗的水的量以及减少过程所利用的能量的量。

术语“发酵”应解释为在底物中产生化学变化的代谢过程。例如，发酵过程接收一种或多种底物并通过利用一种或多种微生物来产生一种或多种产物。术语“发酵”、“气体发酵”等应解释为接收一种或多种底物如通过气化产生的合成气并通过利用一种或多种C1固定型微生物来产生一种或多种产物的过程。优选地，发酵过程包含使用一种或多种生物反应器。发酵过程可以描述为“分批”或“连续”。“分批发酵”用于描述这样的发酵过程：其中生物反应器填充有原材料例如碳源以及微生物，其中产物在生物反应器中保留到直到发酵完成。在“分批”过程中，在发酵完成之后，提取产物并在下一“分批”开始之前清洁生物反应器。“连续发酵”用于描述这样的发酵过程：其中发酵过程持续较长时间段，并且产物和/或代谢物在发酵期间提取。优选地，发酵过程是连续的。

当用于指微生物时，术语“非天然存在的”旨在意指微生物具有在所参考物种的天然存在的菌株(包含所参考物种的野生型菌株)中未发现的至少一种基因修饰。非天然存在的微生物通常在实验室或研究机构中开发。

术语“基因修饰”、“基因改变”或“基因工程”广义上指通过人工对微生物的基因组或核酸的操作。同样，术语“经基因修饰的”、“经基因改变的”或“经基因工程化的”是指含有这种基因修饰、基因改变或基因工程的微生物。这些术语可用于区分实验室产生的微生物和自然存在的微生物。基因修饰的方法包含例如异源基因表达、基因或启动子插入或缺失、核酸突变、经改变的基因表达或失活、酶工程、定向进化、基于知识的设计、随机诱变方法、基因改组和密码子优化。

如梭菌(Clostridia)等微生物的代谢工程可以极大地扩展其产生除天然代谢物如乙醇以外的许多重要燃料和化学分子的能力。然而，直到最近，梭菌仍被认为在遗传上是棘手的，并且因此通常对广泛的代谢工程工作没有限制。近年来，已经开发了用于针对梭菌进行基因组工程的若干种不同方法，包含基于内含子的方法(ClosTron)(Kuehne,《菌株工程：方法和方案(Strain Eng:Methods and Protocols)》,389-407,2011)、等位基因交换法(ACE)(Heap,《核酸研究(Nucl Acids Res)》,40:e59,2012；Ng,《公共科学图书馆：综合(PLoS One)》,8:e56051,2013)、三重杂交(Liew,《微生物学前沿(Frontiers Microbiol)》,7:694,2016)、通过I-SceI介导的方法(Zhang,《微生物学方法杂志(Journal MicrobiolMethods)》,108:49-60,2015)、MazF(Al-Hinai,《应用与环境微生物学(Appl EnvironMicrobiol)》,78:8112-8121,2012)或其它方法(Argyros,《应用与环境微生物学》,77:8288-8294,2011)、Cre-Lox(Ueki,《分子生物技术(mBio)》,5:e01636-01614,2014)以及CRISPR/Cas9(Nagaraju,《生物燃料生物技术(Biotechnol Biofuels)》,9:219,2016)。然而，由于缓慢而费力的循环时间以及这些基因技术跨物种的可转移性的限制，以迭代方式引入多于几个基因改变仍然极具挑战性。此外，尚未充分了解梭菌中的C1代谢，以至于无法可靠地预测将使趋于产物合成的C1摄取、转化和碳/能量/氧化还原流最大化的修饰。因此，在梭菌中引入靶途径仍然是繁琐且耗时的过程。

“重组”指示核酸、蛋白质或微生物是基因修饰、基因工程或基因重组的产物。一般而言，术语“重组”是指含有源自多个来源如两种或更多种不同的微生物菌株或物种的基因材料或由其编码的核酸、蛋白质或微生物。

“野生型”是指区别于突变形式或变体形式的在其存在于自然中时的有机体、菌株、基因或特性的典型形式。

“内源性”是指在衍生出本公开的微生物的野生型或亲代微生物中存在或表达的核酸或蛋白质。例如，内源基因是天然存在于衍生出本公开的微生物的野生型或亲代微生物中的基因。在一个实施例中，内源基因的表达可以由外源调控元件如外源启动子控制。

“外源”是指起源于本公开的微生物之外的核酸或蛋白质。例如，可以人工或重组产生外源基因或酶并将其引入本公开的微生物中或在本公开的微生物中表达。也可以从异源微生物中分离外源基因或酶并将其引入本公开的微生物中或在本公开的微生物中表达。外源核酸可以被改编以整合到本公开的微生物的基因组中或在本公开的微生物中例如在质粒中保持染色体外状态。

“异源”是指在衍生出本公开的微生物的野生型或亲代微生物中不存在的核酸或蛋白质。例如，异源基因或酶可以衍生自不同的菌株或物种并被引入本公开的微生物中或在本公开的微生物中表达。异源基因或酶可以以其存在于不同菌株或物种中的形式被引入本公开的微生物或在本公开的微生物中表达。替代性地，可以以某种方式修饰异源基因或酶，例如，通过对其进行密码子优化以用于在本公开的微生物中表达或通过对其进行工程化以改变功能如以逆转酶活性方向或改变底物特异性。

术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。所述术语指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以进行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座(loci)(基因座(locus))、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸或核苷酸类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以在组装聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后如通过与标记组分缀合来进一步修饰。

如本文所使用的，“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录的过程(如转录为mRNA或其它RNA转录物)和/或经转录mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，其可以包括经修饰氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。术语还涵盖已被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，如与标记组分缀合。如本文所使用的，术语“氨基酸”包含天然和/或非天然或合成的氨基酸，包含甘氨酸和D或L光学异构体两者以及氨基酸类似物和肽模拟物。

“酶活性”或简称为“活性”广义上是指酶促活性，包含但不限于酶的活性、酶的量或酶催化反应的可用性。因此，“增加”酶活性包含增加酶的活性、增加酶的量或增加酶催化反应的可用性。类似地，“降低”酶活性包含降低酶的活性、降低酶的量或降低酶催化反应的可用性。

“突变”是指与衍生出本公开的微生物的野生型或亲代微生物相比，在本公开的微生物中已被修饰的核酸或蛋白质。在一个实施例中，突变可以是编码酶的基因中的缺失、插入或取代。在另一个实施例中，突变可以是酶中一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代。

具体地，“破坏性突变”是减少或消除(即“破坏”)基因或酶的表达或活性的突变。破坏性突变可以部分灭活、完全灭活或删除基因或酶。破坏性突变可以是减少、防止或阻断酶产生的产物的生物合成的任何突变。破坏性突变可以是敲除(KO)突变。这种破坏也可能是降低但不完全消除基因、蛋白质或酶的表达或活性的敲低(KD)突变。虽然KO通常可以有效地提高产物产量，但有时会带来生长缺陷或遗传不稳定性的不利影响，尤其是对于非生长耦合产物而言。所述破坏性突变可以包含例如编码酶的基因中的突变、参与编码酶的基因表达的基因调节元件中的突变、引入产生降低或抑制酶活性的蛋白质的核酸、或引入抑制蛋白质或酶表达的核酸(例如，反义RNA、siRNA、CRISPR)。可以使用本领域已知的任何方法引入破坏性突变。

破坏性突变的引入导致本公开的微生物不产生目标产物或基本上不产生目标产物，或者与衍生出本公开的微生物的亲代微生物相比目标产物的量减少。例如，本公开的微生物可能不产生目标产物，或者可能产生比亲代微生物少至少约1％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的目标产物。例如，本公开的微生物可能产生小于约0.001、0.01、0.10、0.30、0.50或1.0g/L的目标产物。

“密码子优化”是指用于在特定菌株或物种中对核酸进行优化的或改进的翻译的核酸如基因突变。密码子优化可以产生更快的翻译速率或更高的翻译准确性。在一个实施例中，本公开的基因经密码子优化以在梭菌(特别是产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌)中表达。在另一个实施例中，本公开的基因经密码子优化以在产乙醇梭菌LZ1561中表达，所述产乙醇梭菌以DSMZ登录号DSM23693进行保藏。

“过表达”是指与衍生出本公开的微生物的野生型或亲代微生物相比本公开的微生物中的核酸或蛋白质的表达增加。过表达可以通过本领域已知的任何手段实现，包含修饰基因拷贝数、基因转录速率、基因翻译速率或酶降解速率。

术语“变体”包含其序列不同于参考核酸和蛋白质的序列如现有技术中公开的或本文例举的参考核酸和蛋白质的序列的核酸和蛋白质。本公开可以使用执行与参考核酸或蛋白质基本相同的功能的变体核酸或蛋白质实践。例如，变体蛋白质可以进行与参考蛋白质基本上相同的功能或催化与参考蛋白质基本上相同的反应。变体基因可以编码与参考基因相同或基本上相同的蛋白质。变体启动子可以具有与参考启动子基本上相同的能力来促进一种或多种基因的表达。

此类核酸或蛋白质在本文中可以被称为“功能等效变体”。举例来说，核酸的功能等效变体可以包含等位基因变体、基因片段、突变基因、多态性等。来自其它微生物的同源基因也是功能等效变体的实例。这些同源基因包含如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)或扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)等物种中的同源基因，其详细信息可在如Genbank或NCBI等网站上公开获得。功能等效变体还包含其序列由于特定微生物的密码子优化而变化的核酸。核酸的功能等效变体将与参考的核酸优选地具有至少大约70％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％或更高的核酸序列同一性(同源性百分比)。蛋白质的功能等效变体与参考的蛋白质优选具有至少大约70％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％或更高的氨基酸同一性(同源性百分比)。可以使用本领域已知的任何方法评估变体核酸或蛋白质的功能等效性。

“互补性”是指一个核酸通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)或其它非传统类型与另一个核酸序列形成一个或多个氢键的能力。互补性百分比表示核酸分子中能够与第二个核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，5/10、6/10、7/10、8/10、9/10、10/10是50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基氢键结合。如本文所使用的，“基本上互补”是指互补程度至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％。8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸的区结构域内互补程度至少为97％、98％、99％或100％，或指在严格条件下杂交的两种核酸。

如本文所使用的，杂交的“严格条件”是指与靶序列互补的核酸主要与靶序列杂交而基本上不与非靶序列杂交的条件。严格条件通常是序列依赖性的并且取决于许多因素而变化。一般来说，序列越长，序列与其靶序列特异性杂交的温度就越高。严格条件的非限制性实例在本领域中是众所周知的(例如，Tijssen,《生物化学与分子生物学实验技术——与核酸探针杂交(Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acid probes)》,第二章“杂交原理与核酸探针测定策略概述(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assay)”,纽约爱思唯尔公司(Elsevier),1993)。

“杂交”是指一个或多个多核苷酸发生反应以形成通过在核苷酸残基碱基之间进行氢键结合稳定的复合物的反应。氢键结合可以通过沃森克里克碱基配对(Watson Crickbase pairing)、胡格斯坦结合(Hoogstein binding)或任何其它序列特异性方式发生。复合物可以包括形成双链结构的两条链、形成多链复合物的三条或多条链、单个自杂交链或这些的任意组合。杂交反应可以构成更广泛过程(如启动PCR，或用酶切割多核苷酸)中的一个步骤。能够与给定序列杂交的序列被称为给定序列的“互补序列”。

可以使用本领域已知的任何方法将核酸递送到本公开的微生物。例如，核酸可以作为裸核酸递送或者可以用一种或多种试剂如脂质体配制。适当时，核酸可以是DNA、RNA、cDNA或其组合。在某些实施例中可以使用限制性抑制剂。另外的载体可以包含质粒、病毒、噬菌体、粘粒和人工染色体。在一个实施例中，使用质粒将核酸递送到本公开的微生物。举例来说，转化(包含转导或转染)可以通过电穿孔、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态、原生质体转化、前噬菌体诱导或缀合来实现。在具有活性限制酶系统的某些实施例中，可能会有必要在将核酸引入到微生物中之前使核酸甲基化。

此外，可以将核酸设计成包括调控元件如启动子以增加或以其它方式控制特定核酸的表达。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。理想情况下，启动子是伍德-隆达尔(Wood-Ljungdahl)途径启动子、铁氧还蛋白启动子、丙酮酸盐:铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合操纵子启动子、ATP合酶操纵子启动子或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。

“微生物”是微观有机体，具体地是细菌、古菌、病毒或真菌。本公开的微生物通常是细菌。如本文所使用的，对“微生物”的叙述应被视为涵盖“细菌”。

“亲代微生物”是用于生成本公开的微生物的微生物。亲代微生物可以是天然存在的微生物(即，野生型微生物)或先前已经被修饰的微生物(即，突变或重组微生物)。本公开的微生物可以被修饰成表达或过表达未在亲代微生物中表达或过表达的一种或多种酶。类似地，本公开的微生物可以被修饰成含有亲代微生物所不含的一个或多个基因。本公开的微生物还可以被修饰成不表达或表达在亲代微生物中表达的较低量的一种或多种酶。在一个实施例中，亲代微生物是产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)。在一个实施例中，亲代微生物是产乙醇梭菌LZ1561，其根据《布达佩斯条约(BudapestTreaty)》的条款于2010年6月7日保藏在位于德国布伦瑞克省D-38124Inhoffenstraβ7B的Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，并予以登录号DSM23693。此菌株在国际专利申请第PCT/NZ2011/000144号中进行了描述，所述国际专利申请以WO 2012/015317公开。

术语“衍生自”指示核酸、蛋白质或微生物从不同的(例如，亲代或野生型)核酸、蛋白质或微生物修饰或改编，以产生新的核酸、蛋白质或微生物。此类修饰或改编通常包含核酸或基因的插入、缺失、突变或取代。通常，本公开的微生物衍生自亲代微生物。在一个实施例中，本公开的微生物衍生自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌。在一个实施例中，本公开的微生物衍生自产乙醇梭菌LZ1561，其以DSMZ登录号DSM23693进行保藏。

本公开的微生物可以基于功能特性进一步分类。例如，本公开的微生物可以是或可以衍生自C1固定型微生物、厌氧菌、产乙酸菌、产乙醇菌(ethanologen)、一氧化碳营养菌(carboxydotroph)和/或甲烷氧化菌。表1提供了微生物的代表性列表并标识了其功能特性。

“伍德-隆达尔”是指碳固定的伍德-隆达尔途径，如例如由Ragsdale,《生物化学与生物物理学报(Biochim Biophys Acta)》,1784:1873-1898,2008所描述的。“伍德-隆达尔微生物”可预见地指代含有伍德-隆达尔途径的微生物。一般来说，本公开的微生物含有天然伍德-隆达尔途径。在本文中，伍德-隆达尔途径可以是天然的未经修饰的伍德-隆达尔途径，或者所述伍德-隆达尔途径可以是有一定程度的基因修饰(例如，过表达、异源表达、敲除等)的伍德-隆达尔途径，只要所述伍德-隆达尔途径仍然起作用以将CO、CO

“C1”是指单碳分子，例如CO、CO

“厌氧菌”是不需要氧气即可生长的微生物。如果氧气超过某一阈值存在，则厌氧菌可能会产生不良反应或甚至死亡。然而，一些厌氧菌能够耐受低水平的氧气(例如，0.000001-5％的氧气)。本公开的微生物通常是厌氧菌。在一个实施例中，本公开的微生物衍生自表1中所鉴定的厌氧菌。

“产乙酸菌”是使用伍德-隆达尔途径作为其进行能量保存和合成乙酰辅酶A和乙酰辅酶A衍生的产物如乙酸盐的主要机制的专性厌氧细菌(Ragsdale,《生物化学与生物物理学报》,1784:1873-1898,2008)。具体地，产乙酸菌使用伍德-隆达尔途径作为(1)用于从CO

“产乙醇菌”是产生或能够产生乙醇的微生物。本公开的微生物通常是产乙醇菌。在一个实施例中，本公开的微生物衍生自表1中所鉴定的产乙醇菌。

“自养菌”是能够在不存在有机碳的情况下生长的微生物。相反，自养菌使用无机碳源，如CO和/或CO

“一氧化碳营养菌”是能够利用CO作为碳和能量的唯一来源的微生物。本公开的微生物通常是一氧化碳营养菌。在一个实施例中，本公开的微生物衍生自表1中所鉴定的产羧酸菌。

“甲烷氧化菌”是能够利用甲烷作为碳和能量的唯一来源的微生物。在某些实施例中，本公开的微生物是甲烷氧化菌或衍生自甲烷氧化菌。在其它实施例中，本公开的微生物不是甲烷氧化菌或不衍生自甲烷氧化菌。

更广泛地说，本公开的微生物可以衍生自表1中标识的任何属或种。例如，微生物可以是选自由以下组成的组的属的成员：醋酸杆菌属、碱杆菌属、布劳特氏菌属、丁酸杆菌属、梭菌属、真杆菌属、穆尔氏菌属、产醋杆菌属、鼠孢菌属和嗜热厌氧杆菌属。具体地，微生物可以衍生自选自由以下组成的组的亲代细菌：伍氏醋酸杆菌、巴氏碱杆菌、长生布劳特氏菌、食甲基丁酸杆菌、醋酸梭菌、产乙醇梭菌、食一氧化碳梭菌、科斯卡塔梭菌、德氏梭菌、蚁酸醋酸梭菌、扬氏梭菌、马氏梭菌、拉氏梭菌、粪味梭菌、粘液真杆菌、热自养穆尔氏菌、热醋穆尔氏菌、普氏产醋杆菌、卵形鼠孢菌、森林土壤醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌和凯伍嗜热厌氧菌。

在一个实施例中，本公开的微生物衍生自梭菌的簇，所述簇包括产乙醇梭菌物种、扬氏梭菌物种和拉氏梭菌物种。这些物种最初由以下报告和表征：Abrini,《微生物学文献集(Arch Microbiol)》,161:345-351,1994(产乙醇梭菌)；Tanner,《国际系统细菌学杂志(Int J System Bacteriol)》,43:232-236,1993(扬氏梭菌)；以及Huhnke,WO 2008/028055(拉氏梭菌)。

这三个物种有许多相似之处。具体地，这些物种都是梭菌属的C1固定型、厌氧型、产乙酸型、产乙醇型和一氧化碳营养型成员。这些物种具有类似的基因型和表型以及类似的能量保存和发酵代谢模式。此外，这些物种聚集在具有99％以上同一性的16S rRNA DNA的梭菌rRNA同源群I中，其DNA G+C含量为约22-30mol％，是革兰氏阳性，具有类似的形态和大小(对数生长细胞介于0.5-0.7x 3-5μm之间)，具有嗜温性(在30-37℃下生长最佳)，具有约4-7.5的类似pH范围(最佳pH为约5.5-6)，缺乏细胞色素并通过Rnf复合物保存能量。此外，在这些物种中已示出了羧酸到其对应的醇的还原(Perez,《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)》,110:1066-1077,2012)。重要的是，这些物种还都示出在含CO气体上的强自养性生长、产生乙醇和乙酸盐(或乙酸)作为主要发酵产物并且在某些条件下产生少量的2,3-丁二醇和乳酸。

然而，这三种物种也有许多不同之处。这些物种分离自不同的来源：来自兔子肠道的产乙醇梭菌、来自鸡圈废物的扬氏梭菌以及来自淡水沉积物的拉氏梭菌。这些物种在各种糖(例如，鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如，葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸)和其它底物(例如，甜菜碱、丁醇)的利用方面有所不同。此外，这些物种在针对某些维生素(例如，硫胺素、生物素)的营养缺陷型方面有所不同。虽然已经发现这些基因和蛋白质的一般结构和数量在所有物种中都是相同的，但是这些物种在伍德-隆达尔途径基因和蛋白质的核酸和氨基酸序列方面存在差异(

因此，总的来说，产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌的特性中的许多特性并不对所述物种具有特异性，而是梭菌属的C1固定型、厌氧型、产乙酸型、产乙醇型和一氧化碳营养型成员的这一簇的一般特性。然而，由于这些物种实际上是不同的，因此这些物种中的一种物种的基因修饰或操作在这些物种的另一种物种中可能不具有相同的作用。例如，可以观察到生长、性能或产物产生的不同。

本公开的微生物还可以衍生自产乙醇梭菌、扬氏梭菌或拉氏梭菌的分离株或突变体。产乙醇梭菌的分离株和突变体包含JA1-1(DSM10061)(Abrini,《微生物学文献集》,161:345-351,1994)、LZ1560(DSM19630)(WO 2009/064200)和LZ1561(DSM23693)(WO 2012/015317)。扬氏梭菌的分离株和突变体包含ATCC 49587(Tanner,《国际系统细菌学杂志(IntJ Syst Bacteriol)》,43:232-236,1993)、PETCT(DSM13528，ATCC 55383)、ERI-2(ATCC55380)(US 5,593,886)、C-01(ATCC 55988)(US 6,368,819)、O-52(ATCC 55989)(US 6,368,819)和OTA-1(Tirado-Acevedo,《使用扬氏梭菌从合成气中产生生物乙醇(Productionof bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii)》,博士论文,北卡罗莱纳州立大学(North Carolina State University),2010)。拉氏梭菌的分离株和突变体包含PI 1(ATCC BAA-622、ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)。

“底物”是指本公开的微生物的碳源和/或能量来源。底物通常呈气态并且包括C1碳源，例如CO、CO

底物通常包括至少一定量的CO，如约1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mol％的CO。底物可以包括一定范围的CO，如约20-80mol％、30-70mol％或40-60mol％的CO。优选地，底物包括约40-70mol％的CO(例如，钢厂或高炉气)、约20-30mol％的CO(例如，碱性氧气炉气)或约15-45mol％的CO(例如，合成气)。在一些实施例中，底物可以包括相对较低量的CO，如约1-10mol％或1-20mol％的CO。本公开的微生物通常将底物中的CO的至少一部分转化为产物。在一些实施例中，底物不包括或基本上不包括(<1mol％)CO。

底物可以包括一定量的H

底物可以包括一定量的CO

尽管底物通常是气态的，但底物也可以以替代形式提供。举例来说，可以使用微泡分散发生器将底物溶解在用含CO气体饱和的液体中。通过另外的实例，底物可以吸附到固体载体上。

底物和/或C1碳源可以是作为工业过程的副产物或从一些其它来源获得的废气，例如来自汽车废气或生物质气化。在某些实施例中，工业过程选自由以下组成的组：如炼钢厂制造等黑色金属产品制造、有色金属产品制造、石油精炼、煤气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产。在这些实施例中，可以使用任何便利的方法从工业过程中捕获底物和/或C1碳源，然后将获底物和/或C1碳源排放到大气中。

底物和/或C1碳源可以是合成气，如通过煤炭或精炼残余物的气化、生物质或木质纤维素材料的气化或天然气的重整而获得的合成气。在另一个实施例中，合成气可以从市政固体废物或工业固体废物的气化中获得。

底物的组成可能对反应的效率和/或成本有重大影响。例如，氧气(O

在特定实施例中，氢气的存在使得发酵过程的总体效率提高。

可以改善合成气组合物以提供期望的或最佳的H

在存在氢气的情况下操作发酵过程具有减少通过发酵过程产生的CO

当CO是乙醇产生的唯一碳源和能量来源时，碳的一部分损失为CO

6CO+3H

随着底物中可用的H

5CO+1H

4CO+2H

3CO+3H

“流”是指能够例如从一个过程通入到另一个过程、从一个模块通入到另一个模块和/或从一个过程通入到碳捕获装置的任何底物。

如本文所使用的“反应物”是指在化学反应期间参与并经历改变的物质。在特定实施例中，反应物包含但不限于CO和/或H2。

如本文所使用的“微生物抑制剂”是指减慢或防止特定化学反应或包含微生物的其它过程的一种或多种成分。在特定实施例中，微生物抑制剂包含但不限于氧气(O2)、氰化氢(HCN)、乙炔(C

如本文所使用的“催化剂抑制剂”、“吸附剂抑制剂”等是指降低化学反应的速率或防止化学反应的一种或多种物质。在特定实施例中，催化剂和/或吸附剂抑制剂可以包含但不限于硫化氢(H

“去除过程”、“去除模块”、“清理模块”等包含能够从气体流转化和/或去除微生物抑制剂和/或催化剂抑制剂的技术。在特定实施例中，必须通过上游去除模块去除催化剂抑制剂，以防止抑制下游去除模块中的一种或多种催化剂。

如本文所使用的术语“成分”、“污染物”等是指可以在气体流中发现的微生物抑制剂和/或催化剂抑制剂。在特定实施例成分包含但不限于硫化合物、芳香族化合物、炔烃、烯烃、烷烃、链烯、氮化合物、含磷化合物、微粒物质、固体、氧气、卤化化合物、含硅化合物、羰基、金属离子、醇、酯、酮、过氧化物、醛、醚和焦油。

术语“经过处理的气体”、“经过处理的流”等是指已经通过至少一个去除模块并且已经使一种或多种成分去除和/或转化的气体流。

术语“期望的组合物”用于指代物质中的组分(例如，气流，包含但不限于合成气)的期望水平和类型。更具体地，如果气体含有特定组分(例如CO、H

底物的组成可能对反应的效率和/或成本有重大影响。例如，氧气(O

如本文所使用的术语“碳捕获”是指封存来自包括CO

将CO

将CO

将CO

或这些过程的组合。

在某些实施例中，发酵在不存在碳水化合物底物如糖、淀粉、木质素、纤维素或半纤维素的情况下进行。

可以用气体流培养本公开的微生物以产生一种或多种产物。举例来说，本公开的微生物可以产生或可以被工程化以产生乙醇(WO 2007/117157)、乙酸盐(WO 2007/117157)、1-丁醇(WO 2008/115080、WO 2012/053905和WO 2017/066498)、丁酸盐(WO 2008/115080)、2,3-丁二醇(WO 2009/151342和WO 2016/094334)、乳酸盐(WO 2011/112103)、丁烯(WO 2012/024522)、丁二烯(WO 2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(WO 2012/024522和WO 2013/185123)、乙烯(WO 2012/026833)、丙酮(WO 2012/115527)、异丙醇(WO 2012/115527)、脂质(WO 2013/036147)、3-羟基丙酸酯(3-HP)(WO 2013/180581)、萜烯，包含异戊二烯(WO 2013/180584)、脂肪酸(WO 2013/191567)、2-丁醇(WO 2013/185123)、1,2-丙二醇(WO 2014/036152)、1-丙醇(WO 2014/036152和WO 2017/066498)、1-己醇(WO 2017/066498)、1-辛醇(WO 2017/066498)、分支酸盐衍生产物(WO 2016/191625)、3-羟基丁酸酯(WO 2017/066498)、1,3-丁二醇(WO 2017/066498)、2-羟基异丁酸或2-羟基异丁酸(WO2017/066498)、异丁烯(WO 2017/066498)、己二酸(WO 2017/066498)、1,3-己二醇(WO2017/066498)、3-甲基-2-丁醇(WO 2017/066498)、2-丁烯-1-醇(WO 2017/066498)、异戊酸盐(WO 2017/066498)、异戊醇(WO 2017/066498)和单乙二醇(WO 2019/126400)。在某些实施例中，微生物生物质本身可以被视为产物。这些产物可以被进一步转化，以产生柴油、喷气燃料和/或汽油中的至少一种组分。另外，可以进一步处理微生物生物质以产生单细胞蛋白(SCP)。

“单细胞蛋白质”(SCP)是指可以用于富含蛋白质的人和/或动物饲料的通常置换蛋白质补充剂的常规来源，如豆粕或鱼粉的微生物生物质。为了产生单细胞蛋白或其它产物，方法可以包括另外的分离、加工或处理步骤。例如，方法可以包括对微生物生物质进行灭菌，对微生物生物质进行离心和/或对微生物生物质进行干燥。在某些实施例中，微生物生物质使用喷雾干燥或桨叶干燥进行干燥。所述方法还可以包括使用本领域已知的任何方法来降低微生物生物质的核酸含量，因为摄取核酸含量高的饮食可能导致核酸降解产物的累积和/或胃肠不适。单细胞蛋白质可以适合于喂养如牲畜或宠物等动物。特别地，动物饲料可以适合于喂养一种或多种肉牛、奶牛、猪、绵羊、山羊、马、骡、驴、鹿、水牛/野牛、骆马、羊驼、驯鹿、骆驼、白臀野牛、大额牛、牦牛、鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、珍珠鸡、雏鸟/鸽子、鱼、虾、甲壳类动物、猫、狗和啮齿动物。动物饲料的组成可以根据不同动物的营养要求定制。此外，过程可以包括将微生物生物质与一种或多种赋形剂共混或组合。

“赋形剂”可以指代可以添加到微生物生物质中以增强或改变动物饲料的形式、性质或营养含量的任何物质。举例来说，赋形剂可包含以下中的一种或多种：碳水化合物、纤维、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质、水、香料、甜味剂、抗氧化剂、酶、防腐剂、益生菌或抗生素。在一些实施例中，赋形剂可以是干草、稻草、青贮饲料、谷物、油或脂肪或其它植物材料。赋形剂可以是在Chiba,第18节：“饮食调配物和常用饲料原(Diet Formulation andCommon Feed Ingredients)”,《动物营养手册(Animal Nutrition Handbook)》,第3次修订版,第575-633页,2014中鉴定的任何饲料原料。

“天然产物”是由未经基因修饰的微生物产生的产物。例如，乙醇、乙酸盐和2,3-丁二醇是产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的天然产物。“非天然产物”是由经基因修饰的微生物产生的产物，而不是由衍生出经基因修饰的微生物的未经基因修饰的微生物产生的产物。

“选择率”是指目标产物的产量与微生物所产生的全部发酵产物的产量的比率。本公开的微生物可以被工程化以便以特定选择率或最小选择率产生产物。在一个实施例中，目标产物占由本公开的微生物产生的全部发酵产物的至少约5％、10％、15％、20％、30％、50％或75％。在一个实施例中，目标产物占由本公开微的生物产生的全部发酵产物的至少10％，使得本公开的微生物针对目标产物的选择率为至少10％。在另一个实施例中，目标产物占由本公开的微生物产生的全部发酵产物的至少30％，使得本公开的微生物针对目标产物的选择率为至少30％。

“提高效率”、“提高的效率”等包含但不限于提高生长速率、产物产生速率或体积、消耗每体积底物的产物体积或产物选择率。可以相对于衍生出本公开的微生物的亲代微生物的性能来测量效率。

培养通常在生物反应器中进行。术语“生物反应器”包含由一个或多个容器、塔或管路布置组成的培养/发酵装置，如连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、气泡柱、气升式发酵器、静态混合器或适合气-液接触的其它容器或其它装置。在一些实施例中，生物反应器可以包括第一生长反应器和第二培养/发酵反应器。可以向这些反应器中的一个或两个提供底物。如本文所使用的，术语“培养”和“发酵”可互换使用。这些术语涵盖培养/发酵过程的生长阶段和产物生物合成阶段两者。

培养通常在含有足以允许微生物生长的营养素、维生素和/或矿物质的水性培养基中维持。优选地，水性培养基是厌氧微生物生长培养基，如基本厌氧微生物生长培养基。合适的培养基是本领域众所周知的。

培养/发酵应当期望地在用于产生目标产物的适当条件下进行。培养/发酵通常在厌氧条件下进行。要考虑的反应条件包含压力(或分压)、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌槽反应器的话)、接种物水平、用于确保处于液相的气体不会变成限制的最大气体底物浓度以及用于避免产物抑制的最大产物浓度。具体地，可以控制底物的引入速率来以确保处于液相的气体的浓度不会变成限制，因为在气体限制的条件下，产物可能会因培养而被消耗。

在升高的压力下操作生物反应器允许增加从气相到液相的气体质量传递的速率。因此，通常是优选的是，在高于大气压力的压力下进行培养/发酵。同样，由于给定气体转化率部分地为底物保留时间的作用并且保留时间指示生物反应器的所需体积，所以使用加压系统可以大大减小所需生物反应器的体积，并且因此降低培养/发酵设备的资金成本。这进而意味着当将生物反应器保持在升高的压力而不是大气压下时，可以减少保留时间，所述保留时间被定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速。最佳反应条件将部分取决于所使用的特定微生物。然而，一般来说，优选的是，在高于大气压力的压力下进行发酵。此外，由于给定的气体转化速率在某种程度上随底物保留时间而变，并且获得所需保留时间又指示生物反应器的所需体积，所以使用加压系统可以大大减小所需生物反应器的体积，并且因此降低发酵设备的资金成本。

在某些实施例中，发酵在没有光的情况下或在存在不足以满足光合微生物的能量需求的光量的情况下进行。在某些实施例中，本公开的微生物是非光合微生物。

如本文所使用的，术语“发酵液(fermentation broth或broth)”是指生物反应器中组分的混合物，所述混合物包含细胞和营养培养基以及发酵产物和副产物。如本文所使用的，“分离器”是适于接收来自生物反应器的发酵液并使发酵液通过过滤器以产生“渗余物”和“渗透物”的模块。过滤器可以是膜，例如交叉流动膜或中空纤维膜。术语“渗透物”用于指代通过分离器的基本上可溶的发酵液组分。渗透物将通常含有可溶性发酵产物、副产物和营养物质。渗余物将通常含有细胞。如本文所使用的，术语“发酵液渗出物”用于指代从生物反应器中去除并且没有通入到分离器的一部分发酵液。

可使用任何方法或技术领域中已知的方法的组合从发酵液中分离或纯化目标产物，所述方法包含例如分馏、蒸发、渗透蒸发、气体剥离、相分离和萃取发酵(包含例如液-液萃取)。在某些实施例中，目标产物通过以下从发酵液中回收：从生物反应器中不断去除发酵液的一部分、从发酵液分离微生物细胞(宜通过过滤)以及从发酵液中回收一种或多种目标产物。醇和/或丙酮可以例如通过蒸馏回收。酸可以例如通过吸附于活性炭来回收。分离的微生物细胞优选地再循环回到生物反应器。去除目标产物之后残留的无细胞渗透物也优选地返回到生物反应器。可以向无细胞渗透物添加另外的营养素来补给培养基，随后使其返回到生物反应器。

初级微生物可以例如选自由以下组成的组：醋酸菌属、嗜碱菌属、布劳特氏菌属、丁酸菌属、梭菌属、真细菌属、穆尔氏菌属、氧代杆菌属、孢子菌属和嗜热厌氧菌属。具体地，初级微生物可以衍生自选自由以下组成的组的亲代细菌：伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜喊菌、长生布劳特氏菌、食甲基丁酸杆菌、醋酸梭菌、产乙醇梭菌、食一氧化碳梭菌、克氏梭菌、德氏梭菌、乙酸醋酸梭菌、扬氏梭菌、马氏梭菌、拉氏梭菌、粪味梭菌、粘液真杆菌、热自养穆尔氏菌、热醋穆尔氏菌、普氏产醋杆菌、卵形鼠孢菌、森林土壤醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌和凯伍热厌氧菌。初级微生物还可以选自由以下组成的组：瘤胃聚乙酸菌(Acetitomaculumruminis)、潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)、拜氏醋酸杆菌(Acetobacteriumbakii)、甲醇醋酸杆菌(Acetobacterium carbinolicum)、脱卤醋酸杆菌(Acetobacteriumdehalogenans)、粪醋酸杆菌(Acetobacterium fimetarium)、苹果酸醋酸杆菌(Acetobacterium malicum)、泽生醋酸杆菌(Acetobacterium paludosum)、冻原醋酸杆菌(Acetobacterium tundrae)、威氏醋酸杆菌(Acetobacterium wieringae)、伍氏醋酸杆菌、阿拉伯醋酸杆菌(Acetohalobium arabicum)、长醋丝菌(Acetonema longum)、同型产乙酸菌(Blautia coccoides)、氢营养布劳特氏菌(Blautia hydrogenotrophica)、长生布劳特氏菌、施林克布劳特氏菌(Blautia schinkii)、食甲基丁酸杆菌、醋酸梭菌、产乙醇梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、蚁酸醋酸梭菌、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)、扬氏梭菌、马氏梭菌、马犹姆贝梭菌(Clostridium mayombei)、食甲氧基苯甲酸梭菌(Clostridiummethoxybenzovorans)、拉氏梭菌、粪味梭菌、聚集真杆菌(Eubacterium aggregans)、粘液真杆菌、穆尔德穆尔氏菌(Morellla mulderi)、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、普氏产醋杆菌、食酸鼠孢菌(Sporomusa acidovorans)、食空气鼠孢菌(Sporomusa aerivorans)、丙二酸鼠孢菌(Sporomusa malonica)、卵形鼠孢菌、少食鼠孢菌(Sporomusa paucivorans)、根系鼠孢菌(Sporomusa rhizae)、球形鼠孢菌、白蚁鼠孢菌(Sporomusa termitida)、棕色热产醋菌(Thermoacetogenium phaeum)、凯伍热厌氧菌、醋酸杆菌、穆尔氏菌、穆尔氏菌属HUC22-1、热醋穆尔氏菌、芽胞梭菌、羧化梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌、嘌呤梭菌(CIostridium acidiurici)、热球菌(Pyrococcus)、激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)、真杆菌、粘液真杆菌、脱硫杆菌(Desulfobacterium)、一氧化碳嗜热菌(Cabroxydothermus)、产醋菌(Acetogenium)、厌氧醋菌(Acetoanaerobium)、丁酸杆菌、食甲基丁酸杆菌、消化链球菌、瘤胃球菌、产醋杆菌、普氏产醋杆菌、甲烷八叠球菌(Methanosarcina)、氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus)、粘液真杆菌、东方脱硫肠状菌(Desulfotomaculum orientis)、嗜甘氨酸消化球菌(Peptococcus glycinophilus)、大消化球菌(Peptococcus magnus)、自养古菌(Ignicoccus hospitalis)、凯伍热厌氧菌和棕色热产醋菌。微生物还可以选自Schiel-Bengelsdorf,《欧洲生化学会联合会快报(FEBSLetters)》586:2191-2198,2012的表1。在一个实施例中，初级微生物是伍氏醋酸杆菌。在另一个实施例中，初级微生物是伍德-隆达尔微生物。“伍德-隆达尔”是指碳固定的伍德-隆达尔途径，如例如由Ragsdale,《生物化学与生物物理学报(Biochim Biophys Acta)》,1784:1873-1898,2008所描述的。“伍德-隆达尔微生物”可预见地指代含有伍德-隆达尔途径的微生物。初级微生物通常含有天然的伍德-隆达尔途径。

在另一个实施例中，初级微生物是产乙酸菌。“产乙酸菌”是使用伍德-隆达尔途径作为其进行能量保存和合成乙酰辅酶A和乙酰辅酶A衍生的产物如乙酸盐的主要机制的专性厌氧细菌(Ragsdale,《生物化学与生物物理学报》,1784:1873-1898,2008)。具体地，产乙酸菌使用伍德-隆达尔途径作为(1)用于从CO

初级微生物能够消耗提供碳和/或能量的底物(“初级底物”)。初级底物通常呈气态并且包括C1碳源，例如，CO、CO

在实施例中，初级底物包括CO

初级底物可以是作为工业过程的副产物或从一些其它来源(如从汽车废气或生物质气化)获得的废气。在某些实施例中，工业过程选自由以下组成的组：如炼钢厂制造等黑色金属产品制造、有色金属产品制造、石油精炼、煤气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产。在这些实施例中，可以使用任何便利的方法从工业过程中捕获底物和/或C1碳源，然后将获底物和/或C1碳源排放到大气中。

初级底物还可以是合成气，如通过煤炭或精炼残余物的气化、生物质或木质纤维素材料的气化或天然气的重整获得的合成气。在另一个实施例中，合成气可以从市政固体废物或工业固体废物的气化中获得。

底物的组成可能对反应的效率和/或成本有重大影响。例如，氧气(O

在某些实施例中，发酵在不存在碳水化合物底物如糖、淀粉、木质素、纤维素或半纤维素的情况下进行。

发酵产生至少一种产物(“产物”)。通常，此产物将是乙酸盐，尽管发酵也可能产生如乙醇和乳酸盐等其它产物。微生物生物质也可以被视为产物，因为其在动物饲料和肥料中具有应用潜力。重要的是，术语“乙酸盐”和“乙酸”在本文中可以互换使用，并且“乳酸盐”和“乳酸”在本文中可以互换使用。然后需要将一种或多种产物从发酵液中分离并回收。

术语“发酵”应解释为在底物中产生化学变化的代谢过程。例如，发酵过程接收一种或多种底物并通过利用一种或多种微生物来产生一种或多种产物。术语“发酵”应当被解释为接收一种或多种底物并通过利用一种或多种微生物产生一种或多种产物的过程。发酵过程通常包含使用一种或多种生物反应器。发酵过程可以描述为“分批”或“连续”。“分批发酵”用于描述这样的发酵过程：其中生物反应器填充有原材料例如碳源以及微生物，其中产物在生物反应器中保留到直到发酵完成。在“分批”过程中，在发酵完成之后，提取产物并在下一“分批”开始之前清洁生物反应器。“连续发酵”用于描述这样的发酵过程：其中发酵过程持续较长时间段，并且产物和/或代谢物在发酵期间提取。优选地，发酵过程是连续的。培养通常在生物反应器中进行。术语“生物反应器”包含由一个或多个容器、塔或管路布置组成的培养/发酵装置，如连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、气泡柱、气升式发酵器、静态混合器或适合气-液接触的其它容器或其它装置。在一些实施例中，生物反应器可以包括第一生长反应器和第二培养/发酵反应器。可以向这些反应器中的一个或两个提供底物。如本文所使用的，术语“培养”和“发酵”可互换使用。这些术语涵盖培养/发酵过程的生长阶段和产物生物合成阶段两者。

培养通常在含有足以允许微生物生长的营养素、维生素和/或矿物质的水性培养基中维持。在一个实施例中，水性培养基是厌氧微生物生长培养基，如最小厌氧微生物生长培养基。合适的培养基是本领域众所周知的。

培养/发酵应当期望地在用于产生目标产物的适当条件下进行。培养/发酵通常在厌氧条件下进行。要考虑的反应条件包含压力(或分压)、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌槽反应器的话)、接种物水平、用于确保处于液相的气体不会变成限制的最大气体底物浓度以及用于避免产物抑制的最大产物浓度。具体地，可以控制底物的引入速率来以确保处于液相的气体的浓度不会变成限制，因为在气体限制的条件下，产物可能会因培养而被消耗。

可使用任何方法或技术领域中已知的方法的组合从发酵液中分离或纯化目标产物，所述方法包含例如分馏、蒸发、渗透蒸发、气体剥离、相分离和萃取发酵(包含例如液-液萃取)。在某些实施例中，目标产物通过以下从发酵液中回收：从生物反应器中不断去除发酵液的一部分、从发酵液分离微生物细胞(宜通过过滤)以及从发酵液中回收一种或多种目标产物。醇和/或丙酮可以例如通过蒸馏回收。分离的微生物细胞优选地再循环回到生物反应器。去除目标产物之后残留的无细胞渗透物也优选地返回到生物反应器。可以向无细胞渗透物添加另外的营养素来补给培养基，随后使其返回到生物反应器。

在一个实施例中，使用离子交换吸附分离技术从发酵液中回收乙酸盐和/或乳酸盐。本公开中描述的方法的优点在于能够从发酵液中分离酸的共轭碱，而基本上无需改变可能影响微生物的发酵液的pH。通过这种方式，可以从活发酵液中分离乙酸盐和/或乳酸盐或另一种低分子量有机酸的共轭碱，并且可以将含有活微生物的活发酵液返回到生物反应器。具体地，通过集成膨胀床吸附和模拟移动床技术完成分离。

吸附技术通过使含有一种或多种靶化合物的流动液体流与固定相相互作用来分离。一种吸附机制是利用离子交换树脂的离子交换。离子交换操作可以连续进行。在膨胀床技术中，树脂床通过向上的进料流而流化，并且所产生的床空隙允许微粒生物质流过床，而不会阻塞床并保持捕集在离子交换树脂床中。因此，未澄清的或未加工的活发酵液可以通过膨胀床，而生物质不会被物理捕集。树脂选择也很重要，因为某些微生物对特定的树脂具有亲和力。因此，树脂可以被选择以与靶向的分子离子交换以进行分离并且还必须与发酵液的特定微生物相容。最终，在一个实施例中，在模拟移动床模式(SMB)下操作膨胀床。SMB是众所周知的并且用于获得最佳的树脂利用率和优异分离度。在SMB中，通过在流体流动的方向上周期性地转变不同的入口和出口来模拟树脂流速。与模拟移动床技术整合的膨胀床吸附描述于《化学工程与技术(Chem.Eng.Technol.)》2018,41,第12期,2393-2401中。

使本公开的澄清的或未澄清的发酵液部分地或全部通过含有离子交换树脂的分离单元并在模拟移动床模式下作为膨胀吸附床操作。离子交换树脂被选择以与发酵液中的乙酸盐或乳酸盐或两者进行离子交换。离子交换树脂被进一步选择以与发酵液的微生物相容。相容性至少部分地基于微生物的性质和其粘附或附着到树脂的自然趋势。期望微生物不粘附或不附着到树脂的离子交换树脂。树脂可以是任何合适的类型，包含凝胶型或多孔树脂，如大孔聚苯乙烯树脂。离子交换树脂可以是强阴离子交换树脂类型。一类强阴离子交换树脂的合适实例是以以下商品名出售的氯化物形式的树脂：可从伯乐公司(Bio Rad)获得的AG 1-X8和AG 1-X2、可从陶氏公司(Dow)获得Amberlite HPR9200 Cl、可从杜邦公司(DuPont)获得Amberlite IRA900 Cl和可从三菱化学公司(Mitsubishi Chemical)获得的Diaion PA408 Cl。

具体实例包含从因在气体底物存在的情况下培养梭菌属微生物而得到的发酵液中分离乙酸盐，所述分离在模拟移动床模式下操作的膨胀吸附床中使用离子交换树脂。另一个具体实例包含分离因在气体底物存在的情况下培养梭菌属微生物而得到的乳酸盐，所述分离在模拟移动床模式下操作的膨胀吸附床中使用离子交换树脂。另一个具体实例包含从因在气体底物存在的情况下培养梭菌属微生物而得到的发酵液中分离乙酸盐和乳酸盐，所述分离在模拟移动床模式下操作的膨胀吸附床中使用离子交换树脂。可以回收乙酸盐、乳酸盐或两者，并且离子交换树脂按照所选离子交换树脂的惯例再生。例如，可以使用含有硝酸盐或氯化物的溶液回收乙酸盐、乳酸盐或两者。

因为发酵液是水性的，所以乙酸和乳酸仅部分地解离。因此，在通过离子交换去除乙酸盐和乳酸盐之后，剩余的乙酸和或乳酸与发酵液一起再循环(recirculate)并且可以进一步解离以提供另外的乙酸盐和乳酸盐，所述另外的乙酸盐和乳酸盐可以在通过离子交换分离步骤另外通入时进行分离和回收。根据应用的具体情况，可能需要pH调整。

在分离并回收了来自发酵液的乙酸盐的情况下，可以将乙酸盐转化为乙酸。乙酸可以与乙烯和氧气催化反应以形成乙酸乙烯酯。催化剂可以是钯催化剂。

2C2H2+2CH3CO2H+O2→2CH3CO2CHCH2+2H2O

在一个实施例中，在用于形成乙酸乙烯酯的反应中使用的乙烯可以至少部分地衍生自乙醇，所述乙醇是含一氧化碳气体的气体发酵的结果。含一氧化碳气体可以如上所述。

乙酸乙烯酯也被称为乙酸乙烯酯单体(VAM)并且可以聚合以得到聚乙酸乙烯酯(PVA)或者聚合并反应以形成聚乙烯醇。乙酸乙烯酯还可以与其它单体聚合以产生各种共聚物，包含乙烯-乙酸乙烯酯、乙酸乙烯酯-丙烯酸、聚氯乙酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮。乙酸乙烯酯还可以与溴反应以形成二溴化物、与氢卤化物反应以形成1-卤代乙酸乙酯、在铂催化剂存在的情况下与乙酸反应以得到乙烯二乙酯。乙酸乙烯酯可以进行酯交换以得到乙烯基醚。

本文还公开了一种生物转化设备，其包括生物反应器系统和上述分离区。转到图1，入口104将进料管线106中的气体底物引导到生物反应器102。生物反应器102含有培养基和微生物以代谢底物中的碳源并产生产物。出口108允许来自生物反应器的发酵液从生物反应器中通过，所述生物反应器包含培养基、微生物、一种或多种产物。分离区112的入口110与出口108流体连通。分离区112含有模拟移动床构型下的离子交换树脂膨胀床。在分离区112中，一种或多种产物与树脂进行离子交换，并且由此保留在床中。包含微生物的发酵液的剩余部分通过离子交换树脂到达出口118，并且可以通过管线120再循环到生物反应器102以再循环到生物反应器102的入口122。分离区具有与再生物来源流体连通的入口114，以使离子交换树脂再生并释放产物。分离区112还具有产物出口116，用于回收经释放的产物。任选地，在离子交换过程期间从离子交换树脂中释放的抗衡离子可以在再循环到生物反应器之前从发酵液中去除。模拟移动床操作的详细信息是已知的，并且此处不再讨论。

在另一个实施例中，生物转化设备包括上述生物反应器系统和分离区，以及定位于生物反应器系统与分离区之间的微生物生物质分离区。在此实施例中，仅将生物反应器的发酵液的一部分通入到含有离子交换树脂的分离区。微生物生物质分离区可以采用如膜分离等技术来分离含有发酵液的一部分的微生物生物质，然后可以将其再循环到生物反应器。然后可以将发酵液的剩余部分通入到含有离子交换树脂的分离区。含有离子交换树脂的分离区可以以各种不同的操作模式操作，如固定床模式、使用两个或多个固定床的摇摆床模式、模拟移动床模式、移动床模式或其它模式。

在使发酵液通过含有离子交换树脂的分离区之前去除微生物生物质的一个优点是，由于通过分离区处理的材料的体积减小，可以减小分离区的大小。另一个优点是在离子交换过程期间方便且容易地控制微生物生物质暴露于从离子交换树脂中释放的抗衡离子。

转到图2，入口204将进料管线206中的气体底物引导到生物反应器202。生物反应器202含有培养基和微生物以代谢底物中的碳源并产生产物。出口208允许来自生物反应器的包含培养基、微生物、一种或多种产物的发酵液从生物反应器202通过导管222到达微生物生物质分离区224。微生物生物质分离区224在图2中示出为膜分离区，其中发酵液的渗余物部分含有微生物生物质，并且发酵液的渗透物部分含有如要分离的乙酸盐或乳酸盐等靶组分。含有微生物生物质的发酵液的渗余物部分在管线228中再循环到生物反应器202。含有一种或多种要分离的产物(如乙酸盐)的发酵液的渗透物部分通过管线226从微生物生物质分离区224引导到分离区230。可以采用其它微生物生物质分离技术，并且所示膜分离技术仅是示例性的。

分离区230含有至少一个离子交换树脂固定床。分离区230含有至少两个离子交换树脂固定床可能是有利的，使得一个固定床可以在线并运行，而另一个正在再生。一种或多种产物与树脂进行离子交换，并且由此保留在床中。在管线226中引导的发酵液的一部分进入分离区230并与离子交换树脂接触，其中所述一种或多种产物产物与树脂进行离子交换，并且由此保留在床中。发酵液的未保留部分(现在另外含有来自树脂的抗衡离子)通过离子交换树脂床，并在流出物流232中从分离区230中去除，并发送到处理单元234进行处理以用作离子交换树脂的再生剂。处理可以包含通过管线236添加溶液和去除在管线242中含有不太有利的抗衡离子的反应产物来反应掉特定的抗衡离子而有利于另一个抗衡离子。再生物在管线238中通过分离区230以与离子交换树脂接触并使离子交换树脂再生并释放出期望产物。在产物回收管线240中从分离区230中去除现在分离的期望产物。

本文引用的所有参考文献(包含出版物、专利申请和专利)均通过引用特此并入，其程度如同每篇参考文献被单独并且具体地指出通过引用并入并且在本文中被整体阐述。本说明书中对任何现有技术的提及不是并且不应被视为承认现有技术形成了任何国家中所涉及领域中公知常识的一部分。

除非本文中另外指明或明显与上下文相矛盾，否则在描述本公开的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”以及类似的指代词应被解释为涵盖单数和复数两者。除非另外指出，否则术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”应解释为开放式术语(即，意味着“包含但不限于”)。术语“基本上由……组成”将组合物、过程或方法的范围限制在特定的材料或步骤，或者限制在那些对组合物、过程或方法的基本和新颖特性没有实质性影响的材料或步骤。替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。如本文所使用的，术语“约”是指所指定范围、值或结构的±20％，除非另有指示。

除非本文中另有指示，否则本文中对值的范围的叙述仅旨在用作单独地指出落入所述范围内的每个单独的值的速记方法并且每个单独的值并入本说明书中，如同所述值在本文中被单独地叙述一样。例如，除非另有指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围、整数范围、大小范围或厚度范围应被理解为包含所叙述范围内的任何整数的值并且在适当的情况下包含其分数(如整数的十分之一和百分之一)。

除非本文中另有指示或明显与上下文相矛盾，否则本文所描述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有实例或示范性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本公开，而不对本公开的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为将任何未要求保护的元件指示为实践本公开所必须的。

本文描述了本公开的不同实施例。在阅读上述描述后，对本领域的普通技术人员而言，那些实施例的变化可能变得显而易见。诸位发明人预期技术人员可以在适当时采用此类变型，并且诸位发明人旨在使本公开以与本文具体描述的方式不同的其它方式来进行实践。因此，在适用法律允许的情况下，本公开包含所附权利要求中叙述的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有指示或明显与上下文相矛盾，否则本公开涵盖上述要素在其所有可能变型中的任何组合。

第一实施例是一种用于从发酵液中分离靶组分的方法，所述方法包括：

a.使气体底物和微生物发酵以生成包括所述微生物和所述靶组分的发酵液；

b.在连续离子交换模拟移动床中将所述发酵液通入到具有离子交换树脂的分离单元；

c.通过与所述树脂的离子交换选择性地保留所述靶组分并使所述微生物通过所述连续离子交换模拟移动床；以及

d.使所述离子交换树脂再生并回收所述靶组分。

根据第一实施例所述的方法，其中所述靶组分是低分子量有机酸的共轭碱。

根据第一实施例所述的方法，其中所述靶组分是乙酸盐、乳酸盐或两者。

根据第一实施例所述的方法，其中所述连续离子交换模拟移动床是膨胀床。

根据第一实施例所述的方法，其中所述离子交换树脂是强阴离子交换树脂。

根据第一实施例所述的方法，其中所述微生物衍生自选自由以下组成的组的亲代微生物：伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜喊菌、长生布劳特氏菌、食甲基丁酸杆菌、醋酸梭菌、产乙醇梭菌、食一氧化碳梭菌、克氏梭菌、德氏梭菌、蚁酸醋酸梭菌、扬氏梭菌、马氏梭菌、拉氏梭菌、粪味梭菌、粘液真杆菌、热自养穆尔氏菌、热醋穆尔氏菌、普氏产醋杆菌、卵形鼠孢菌、森林土壤醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌和凯伍热厌氧菌。

根据第一实施例所述的方法，其中所述微生物是梭菌属的成员。

根据第一实施例所述的方法，其中所述微生物衍生自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌或克氏梭菌。

根据第一实施例所述的方法，其中所述气体底物是工业废气、工业尾气、衍生自气化废物的合成气、衍生自气化生物质的合成气或其任何组合。

根据第一实施例所述的方法，其中所述靶组分发生反应以形成一种或多种产物。

根据前述实施例所述的方法，其中所述靶化合物是乙酸盐，并且所述一种或多种产物是乙酸乙烯酯。

根据前述实施例所述的方法，其进一步包括使所述乙酸乙烯酯反应以形成聚乙酸乙烯酯或聚乙烯醇。

根据前述实施例所述的方法，其进一步包括使所述聚乙酸乙烯酯或聚乙烯醇反应以形成聚合物、共聚物、粘合剂、涂料、油漆、薄膜、织物、泡沫、电线绝缘体或电缆绝缘体。

第二实施例是一种用于从发酵液中分离靶组分的方法，所述方法包括：

a.使气体底物和微生物发酵以生成包括所述微生物和所述靶组分的发酵液；

b.将所述发酵液通入到第一分离区以将包括所述微生物的所述发酵液的第一部分分离并再循环到生物反应器；

c.将所述发酵液的第二部分通入到包括离子交换树脂的第二分离区；

d.通过与所述树脂的离子交换选择性地保留所述靶组分并使剩余部分通过所述第二分离区；以及

e.用再生物使所述离子交换树脂再生并回收所述靶组分。

根据第二实施例所述的方法，其中所述再生物包括所述剩余部分的至少一部分或衍生自所述剩余部分。

根据第二实施例所述的方法，其中所述靶组分是低分子量有机酸的共轭碱。

根据第二实施例所述的方法，其中所述靶组分是乙酸盐、乳酸盐或两者。

根据第二实施例所述的方法，其中所述离子交换树脂是强阴离子交换树脂。

根据第二实施例所述的方法，其中所述气体底物是工业废气、工业尾气、衍生自气化废物的合成气、衍生自气化生物质的合成气或其任何组合。

根据第二实施例所述的方法，其中所述靶组分发生反应以形成一种或多种产物。

根据前述实施例所述的方法，其中所述靶化合物是乙酸盐，并且所述一种或多种产物是乙酸乙烯酯。

根据前述实施例所述的方法，其进一步包括使所述乙酸乙烯酯反应以形成聚乙酸乙烯酯或聚乙烯醇。

根据前述实施例所述的方法，其进一步包括使所述聚乙酸乙烯酯或聚乙烯醇反应以形成聚合物、共聚物、粘合剂、涂料、油漆、薄膜、织物、泡沫、电线绝缘体或电缆绝缘体。

第三实施例是一种生物转化设备，所述生物转化设备包括：

a.生物反应器系统，所述生物反应器系统包括进入生物反应器的入口和离开所述生物反应器的出口，所述生物反应器含有培养基和微生物以代谢底物中的碳源并产生产物；以及

b.分离区，所述分离区包括与所述生物反应器的所述出口流体连通的第一入口、模拟移动床构型中的离子交换树脂床、与再生物来源流体连通的第二入口、与所述生物反应器系统流体连通的出口以及产物出口。

根据第三实施例所述的生物转化设备，其中所述离子交换树脂床是离子交换树脂膨胀床。

第四实施例是一种生物转化设备，所述生物转化设备包括：

a.生物反应器系统，所述生物反应器系统包括进入生物反应器的入口和离开所述生物反应器的出口，所述生物反应器含有培养基和微生物以代谢底物中的碳源并产生产物；

b.第一分离区，所述第一分离区包括与所述生物反应器的所述出口流体连通的入口、用于分离微生物生物质的膜、与所述生物反应器流体连通的渗余物出口以及渗透物出口；以及

c.第二分离区，所述第二分离区包括与所述第一分离区的所述渗透物出口流体连通的第一入口、至少一个离子交换树脂床、与再生物来源流体连通的第二入口、与所述再生物来源流体连通的出口以及产物出口。