生物活性组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及组合物技术领域，尤其是涉及一种生物活性组合物及制备方法和应用。

背景技术

皮肤是人体的第一道防线，具有重要的屏障功能。化妆品是直接、反复用于人体皮肤、黏膜等的制剂，频繁的化妆品使用易导致其中的金属残留在皮肤中并直接与之作用，或者通过皮肤吸收进入血液，在人体中累积并对不同器官造成毒害。除此以外，紫外线、环境污染、过度清洁和不正确的护理操作均可损伤皮肤屏障，导致皮肤脆弱、敏感等一系列问题。当皮肤屏障受到损伤时，化学物质和微生物容易渗透到皮肤中并引起皮炎、皮肤干燥等。

近年来，用于清洁和修复皮肤屏障的组合物或功能性化妆品已经引起了关注。但目前大多采用卸妆或界面制剂擦拭清洗残余的化妆品，对金属离子去除效果较差。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种生物活性组合物，通过调控干细胞分泌物的组分，促进损伤周围干细胞增殖分化，同时添加石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒，提供抑菌、吸附重金属和去除核沾染效果，模拟细胞外基质及其微环境，促进表皮组织的修复与再生。

本发明提供的生物活性组合物，包括干细胞分泌物和石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒，两者的质量比为（5-20）：（1-10）。

进一步的，本发明提供的生物活性组合物包括按质量百分比计的如下组分：干细胞分泌物0.5-2%，石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒0.1-1%，酵母溶胞物0.1-0.4%，积雪草根提取物0.1-0.5%，迷迭香提取物0.05-0.15%，海藻糖0.1-0.4%，EDTA二钠0.01-0.02%，水80-99%。

进一步的，本发明提供的生物活性组合物，其特征在于，包括按质量百分比计的如下组分：干细胞分泌物0.5-2%，石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒0.1-1%，酵母溶胞物0.1-0.4%，积雪草根提取物0.1-0.5%，迷迭香提取物0.05-0.15%，海藻糖0.1-0.4%，EDTA二钠0.01-0.02%，透明质酸钠0.5-2.5%，棕榈酰四肽-7 0.1-0.6%，烟酰胺0.1-0.3%，泛醇0.02-0.07%，黄原胶0.02-0.06%，甘油3-5%，丁二醇2-6%，水80-93.3%。

进一步的，所述干细胞分泌物按照以下步骤制备而成：先将碘海醇与脐带干细胞共培养，再加入药物同时施加X射线辐照培养，然后弃去培养液并清洗后加入无血清培养基继续培养，最后收集细胞培养液，富集后得到干细胞分泌物。

进一步的，X射线的强度为0.5-4 Gy，优选为0.5-2 Gy；

优选地，所述药物包括白藜芦醇、地塞米松、TN14003冻干粉、T140冻干粉或AMD3100冻干粉中的至少一种；

优选地，所述药物选自20-60 μM白藜芦醇、0.2-0.5 μM地塞米松，0.2-2 μMTN14003冻干粉，0.2-2 μM T140冻干粉或0.2-1 μM AMD3100冻干粉中的至少一种。

进一步的，碘海醇的质量浓度为2-100 μg/mL，优选为10-20 μg/mL；

优选地，碘海醇与脐带干细胞共培养1-2天后再加入药物；

优选地，X射线辐照后培养的时间为1-4天；

优选地，加入无血清培养基后培养的时间为1-4天。

进一步的，所述石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒按照以下步骤制备而成：（a）将二异氰酸酯修饰到石墨烯表面;

（b）加入聚丙烯酸，使得聚丙烯酸的羧基与石墨烯表面的二异氰酸酯反应，得到双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒;

（c）用交联活化剂活性双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒，继而使短肽RADA16-A与双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒反应，得到石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒。

进一步的，在步骤（c）中，石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒与短肽RADA16-A的质量比为1：（0.5-1）；

优选地，所述石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒的反应浓度为10-15 mg/mL；

优选地，所述聚丙烯酸的数均分子量为5000-10000；

优选地，在步骤（b）中，先将短肽RADA6-A溶解于有机溶剂中，调节pH至6.5-7.5，再与活化的双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒反应；

优选地，所述交联活化剂包括EDC和NHS。

本发明的目的之二在于提供上述生物活性组合物的制备方法，包括以下步骤：将各组分混合均匀，得到生物活性组合物。

本发明的目的之三在于提供上述生物活性组合物在制备修复皮肤损伤的护肤品、化妆品或药物中的应用；

优选地，所述皮肤损伤包括放射性皮肤损伤。

本发明提供的生物活性组合物过调控干细胞分泌物的组分，募集内源干细胞到达损伤区域，提高损伤修复效果；同时，添加生物活性石墨烯-RADA16-A纳米颗粒，通过与干细胞分泌物相互协同，能够模拟细胞外基质表面结构，促进细胞的迁移和增殖，为细胞增殖和分化提供适宜的微环境，并允许结构内营养物质、氧气和代谢产物的转移，提供抑菌、吸附重金属和去除核沾染效果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

放射治疗作为一种临床常用的局部治疗方法，被广泛应用于癌症患者的治疗。放射线在作用于肿瘤组织的同时也会对照射区域及照射周围正常组织产生损伤，皮肤损伤就是放射治疗最常见的并发症之一。放射性皮肤损伤创面难愈合、易复发一直是困扰肿瘤临床放射治疗的难题。此外，放射性物质泄漏会造成核沾染，接触人体后会导致最大的组织器官皮肤受损，因此需要发展有效的吸附去除放射性物质的技术，改善受损皮肤组织的修复效果。

因此研发一种具有促进皮肤损伤修复，尤其是研发针对难以修复的放射性皮肤损伤修复的药剂，具有重要的经济和医学价值。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种生物活性组合物，包括干细胞分泌物和石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒，两者的质量比为（5-20）：（1-10）。

在本发明中，典型但非限制性的，干细胞分泌物和石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒的质量比如为5:1、8:1、10:1、12:1、15:1、18:1、20:1、5:2、5:3、1:1、5:8或1:2。

氧化石墨烯（GO）是石墨烯的重要衍生物，其基面及边缘含有多种亲水性含氧基团，因此GO能够均匀分散在水中并形成稳定的GO悬浮液。此外，GO巨大的表面积，丰富的含氧基团和π电子使得GO具有较强的吸附能力，可作为吸附剂有效去除面部的重金属离子、可吸入微粒以及彩妆残留物等。

RADA16是较成熟的自组装纳米短肽材料，单元序列 (Ac-RADARADARADARADA-NH

干细胞是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，具有强大的组织修复与再生能力。干细胞因子作为无细胞治疗的替代方法，规避了干细胞移植治疗中存在的免疫排斥、干性维持、细胞衰老和致癌等风险。其中间充质干细胞(MSCs)是在皮肤损伤与修复研究领域中运用范围最广的干细胞之一，其分泌因子促进细胞增殖从而起到对皮肤损伤的修复作用。

本发明提供的生物活性组合物过调控干细胞分泌物的组分，募集内源干细胞到达损伤区域，提高损伤修复效果；同时，添加生物活性石墨烯-RADA16-A纳米颗粒，通过与干细胞分泌物相互协同，能够模拟细胞外基质表面结构，促进细胞的迁移和增殖，为细胞增殖和分化提供适宜的微环境，并允许结构内营养物质、氧气和代谢产物的质量转移，提供抑菌、吸附重金属和去除核沾染效果。

在本发明的一种优选方案中，本发明提供的生物活性组合物包括按质量百分比计的如下组分：干细胞分泌物0.5-2%，石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒0.1-1%，酵母溶胞物0.1-0.4%，积雪草根提取物0.1-0.5%，迷迭香提取物0.05-0.15%，海藻糖0.1-0.4%，EDTA二钠0.01-0.02%，水80-99%。

典型但非限制性的，在本发明提供的生物活性组合物中，干细胞分泌物的质量占比如为0.5%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、1.8%或2%；石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒的质量占比如为0.1%、0.2%、0.5%、0.8%或1%；酵母溶胞物的质量占比如为0.1%、0.15%、0.2%、0.3%或0.4%；积雪草根提取物的质量占比如为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%或0.5%；迷迭香提取物的质量占比如为0.05%、0.08%、0.1%、0.12%或0.15%，海藻糖的质量占比如为0.1%、0.15%、0.2%、0.3%或0.4%；EDTA二钠的质量占比如为0.01%、0.012%、0.015%、0.018%或0.02%，水的质量占比如为80%、85%、90%、95%或99%。

酵母菌溶胞物能够帮助生成肌肤内部水分核心成分透明质酸，改善易粗糙、干燥的肌肤，调理角质。

积雪草提取物含有积雪草酸和羟基积雪草酸，对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌具有一定的抑制作用，同时还具有明显的抗炎作用，能够提高和修复肌肤自身屏障功能，从而防止和纠正肌肤免疫功能紊乱。另外，积雪草根提取物还具有愈合伤口和疤痕、抗衰老、抗氧化和美白的功效。

迷迭香提取物的主要成分为迷迭香酚、鼠尾草酚和鼠尾草酸，具有较强的抗氧化活性。其抗氧化作用原理可分为自由基终止剂、还原剂、螯合剂和单线态氧抑制剂。

海藻糖能有效地保护表皮细胞膜结构，活化细胞，调理肌肤，令肌肤健康自然、有弹性。表皮细胞在高温、高寒、干燥、强紫外线辐射等环境下，极易失去水分而使皮肤受损，海藻糖在这种情况下能够在细胞表层形成一层特殊的保护膜，保持皮肤原有营养和水分，避免皮肤晒伤及黑色素沉淀，有效抵抗皮肤老化现象；从膜上析出的粘液可温和滋润肌肤，使肌肤莹亮、光泽和柔嫩。

EDTA二钠是乙二胺四乙酸的缩写，是一种重要的防腐剂和络合剂，用于络合金属离子。

本发明提供的生物活性组合物加入酵母溶胞物、积雪草根提取物、迷迭香提取物、海藻糖和EDTA二钠与干细胞分泌物及石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒相互协同，具有更为优异的促进皮肤修复，抑制皮肤氧化，保持皮肤水润和美白的功效。

在本发明的进一步优选方案中，本发明提供的生物活性组合物，包括按质量百分比计的如下组分：干细胞分泌物0.5-2%，石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒0.1-1%，酵母溶胞物0.1-0.4%，积雪草根提取物0.1-0.5%，迷迭香提取物0.05-0.15%，海藻糖0.1-0.4%，EDTA二钠0.01-0.02%，透明质酸钠0.5-2.5%，棕榈酰四肽-7 0.1-0.6%，烟酰胺0.1-0.3%，泛醇0.02-0.07%，黄原胶0.02-0.06%，甘油3-5%，丁二醇2-6%，水80-93%。

典型但非限制性的，在本发明提供的生物活性组合物中，棕榈酰四肽-7的质量占比如为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%或0.6%；烟酰胺的质量占比如为0.1%、0.15%、0.2%、0.25%或0.3%；泛醇的质量占比如为0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%或0.07%;黄原胶的质量占比如为0.02%、0.03%、0.04%、0.05%或0.06%；甘油的质量占比如为3%、3.5%、4%、4.5%或5%；丁二醇的质量占比如为2%、3%、4%、5%或6%，水的质量占比如为80%、82%、85%、88%、90%、91%、92%、93%或93.3%。

棕榈酰四肽-7具有独特的保护皮肤作用，可保持皮肤滋润光滑，细腻柔嫩，富有弹性，具有防皱、抗皱、美容保健和恢复皮肤生理功能的作用。

烟酰胺具有皮肤美白、抗衰老和改善皮肤平能功能、保湿、控油与缩小毛孔和治疗痤疮。

黄原胶是国际上集增稠、悬浮、乳化、稳定于一体，性能最优越的生物胶。

泛醇又称泛肽醇，维生素原B5，对皮肤具有保湿、抗炎、润湿和刺激细胞分裂等作用。

甘油的主要功效是保湿、滋养肌肤以及美白，甘油涂抹在肌肤的表面，能够快速滋润肌肤，并形成一层保护膜，锁住肌肤的水分，此外，还能促进皮肤细胞的代谢，并淡化肌肤的色素沉着。

本发明的进一步优选方案中，通过在本发明提供的生物活性组合物中加入透明质酸钠、棕榈酰四肽-7、烟酰胺、泛醇和黄原胶以进一步增强其修复皮肤的能力，以及更好的抑制皮肤氧化，保持皮肤水润和美白的功效。

[干细胞分泌物]

在本发明的一种优选方案中，干细胞分泌物按照以下步骤制备而成：

先将碘海醇与脐带干细胞共培养，再加入药物同时施加X射线辐照培养，然后弃去培养液并清洗后加入无血清培养基继续培养，最后收集细胞培养液，富集后得到干细胞分泌物。

本发明提供的干细胞分泌物的制备方法通过在制备过程中加以药物和X射线联合使用诱导，使得干细胞分泌物中SDF-1趋化因子能够高水平表达，能够更好的诱导内源干细胞在创伤区域富集，提高骨损伤修复效果。

在本发明的一种优选方案中，当碘海醇的质量浓度为2-100 μg/mL时，易于与脐带干细胞进行共培养，尤其是当碘海醇的质量浓度为10-20 μg/mL时，更易于与脐带干细胞进行共培养。

典型但非限制性的，用于与脐带干细胞进行共培养的碘海醇的质量浓度如为2、5、8、10、20、50、80或100 μg/mL。

在本发明的一种优选方案中，药物诱导同时施加的X射线辐照强度为0.5-4 Gy时，得到的干细胞分泌物中SDF-1趋化因子的表达水平较高，尤其是当X射线辐照强度为0.5-2Gy时，得到的干细胞分泌物SDF-1趋化因子的表达水平更高。

典型但非限制性的，药物诱导同时施加的X射线的辐照强度如为0.5 Gy、0.8 Gy、1Gy、1.2 Gy、1.5 Gy、1.8 Gy、2 Gy、2.5 Gy、3 Gy、3.5 Gy或4 Gy。

在本发明的一种优选方案中，药物包括但不限于白藜芦醇、地塞米松、TN14003冻干粉、T140冻干粉或AMD3100冻干粉中的任意一种或至少两种的混合物。

在本发明的进一步优选方案中，药物选自20-60 μM白藜芦醇、0.2-0.5 μM地塞米松，0.2-2 μM TN14003（Arg-Arg-Natl-Cys-Tyr-Cit-Lys -d-Lys-Pro-Tyr-Arg-Cit-Cys-Arg-NH

在本发明的一种优选方案中，在制备干细胞分泌物时，碘海醇与脐带干细胞共培养1-2天后再加入药物以及同时施加X射线辐照，以更利于脐带干细胞分泌干细胞分泌物，提高SDF-1趋化因子的表达水平。

在本发明的一种优选方案中，X射线辐照后培养的时间为1-4天，以使得药物联合X射线更利于诱导脐带干细胞分泌SDF-1等趋化因子的水平。

在本发明的一种优选方案中，加入无血清培养基后培养的时间为1-4天，以利于脐带干细胞分泌SDF-1等趋化因子的表达水平更高。

在本发明一种典型但非限制性的实施方案中，干细胞分泌物按照如下步骤制备而成：

(1)获取脐带干细胞：将脐带从无菌容器中取出放置于一次性平皿中，使用手术剪将脐带剪成约2 cm/段；用含肝素钠的生理盐水洗净血液，纵向剪破脐带，去除3条血管及外皮，洗净内部的血液；将脐带组织切成2.0-4.0 mm

(2)脐带干细胞培养传代：取生长状况良好的人体胚胎间充质干细胞，用含青霉素和链霉素双抗的DMEM/F12 +10%的胎牛血清培养基培养脐带干细胞，细胞铺板后放置在细胞孵育箱中37℃、5% CO

(3)药物诱导和辐照：干细胞传代至P5-P10，将2-100 μg/mL碘海醇与脐带干细胞共培养1-2天，加入药物并施加0.5-4 Gy的X射线辐照，继而培养1天后，弃去培养液并用PBS缓冲液清洗2次；加入无血清培养基继续培养1-4天。

(4)离心富集：收集细胞培养液，高速离心（20,000-50,000 rpm），富集干细胞分泌物并在4℃下保存备用。

当生物活性物质为干细胞分泌物时，生物活性物质的质量指的是干细胞分泌物的干重。

干细胞分泌物干重的测试方法为：将富集得到的干细胞分泌物用纯水洗涤3次后，-30℃预冻，-80～-60℃冷冻干燥后称重。

[石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒]

在本发明中，石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒的化学结构中，聚丙烯酸通过二异氰酸酯与石墨烯偶联，RADA16-A通过酰胺键与聚丙烯酸偶联。

在本发明的一种优选方案中，石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒按照以下步骤制备而成：

（a）将二异氰酸酯修饰到石墨烯表面;

（b）加入聚丙烯酸，使得聚丙烯酸的羧基与石墨烯表面的二异氰酸酯反应，得到双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒;

（c）用交联活化剂活性双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒，继而使短肽RADA16-A与双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒反应，得到石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒。

优选地，在步骤（c）中，石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒与短肽RADA16-A的质量比为1：（0.5-1）,以保证短肽的浪费。

典型但非限制性的，石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒与短肽RADA16-A的质量比如为1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9或1:1。

优选地，在步骤（c）中，石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒的反应浓度为10-15 mg/mL，以更优利于与短肽RADA16-A纳米颗粒发生反应。

典型但非限制性的，石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒的反应浓度如为10 mg/mL、11 mg/mL、12 mg/mL、13 mg/mL、14 mg/mL或15 mg/mL。

优选地，在步骤（b）中，聚丙烯酸的数均分子量为5000-10000时，更利于聚丙烯酸的羧基与石墨烯表面的二异氰酸酯反应，生成双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒。

典型但非限制性性的，聚丙烯酸的数均分子量如为5000、5500、6000、7000、8000、9000或10000。

优选地，在步骤（b）中，先将短肽RADA6-A溶解于有机溶剂中，调节pH至6.5-7.5，再与活化的双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒反应，更利于将短肽RADA6-A通过酰胺键连接到双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒上。

典型但非限制性的，溶解短肽RADA6-A的有机溶剂为二甲基亚砜（DMSO）的水溶液；交联活化剂包括但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和羟基琥珀酰亚胺（NHS）。

优选地，在步骤（a）中，所采用的二异氰酸酯为六亚甲基二异氰酸酯，二异氰酸酯一端的异氰酸根与氧化石墨烯表面的羧基或羟基反应，以连接到氧化石墨烯表面。聚丙烯酸使二异氰酸酯氧化后的石墨烯修饰上多羧基基团，使其功能化。

优选地，步骤（a）中，所采用的石墨烯的粒径为200-500 nm。

优选地，步骤（a）中，二异氰酸酯和石墨烯的质量比为10:1。

优选地，石墨烯和聚丙烯酸的质量比为10:1。

在本发明一种典型但非限制性的实施方案中，石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：

（1）将二异氰酸酯修饰到石墨烯表面，在50-150℃下反应，分离固态产物并充分洗涤；

（2）向步骤（1）得到的产物加入聚丙烯酸，在50-150℃下反应，使聚丙烯酸的羧基与氧化石墨烯表面的二异氰酸酯反应，将固态产物自反应混合物中分离出来，并以有机溶剂充分洗涤得到双亲性石墨烯；

（3）用EDC和NHS酯活化双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒，继而将短肽RADA16-A溶解于二甲基亚砜 (DMSO) 的水溶液中，用三乙胺调节溶液pH到6.5-7.5，再与活化的双亲性石墨烯-聚丙烯酸反应，石墨烯-聚丙烯酸/RADA16-A的质量比为1:0.5-1:1，石墨烯-聚丙烯酸反应浓度为10-15 mg/mL；

（4）离心洗涤，去除未反应短肽和偶联剂，得到所述石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了上述生物活性组合物的制备方法，包括以下步骤：将各组分混合均匀，得到生物活性组合物。

本发明提供的生物活性组合物的制备方法工艺简单，操作方便，适于实现规模化生产，有效降低制备成本。

根据本发明的第三个方面，本发明提供了上述生物活性组合物在制备皮肤损伤的护肤品、化妆品或药物中的应用。

上述皮肤损伤包括但不限于放射性皮肤损伤。

为了本领域技术人员理解，下面结合实施例和对比例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。

一、干细胞分泌物

（一）X射线强度对干细胞分泌物中SDF-1表达水平的影响

实施例1

本实施例提供了一种干细胞分泌物，按照以下步骤富集得到：

（1）获取脐带干细胞：将脐带从无菌容器中取出放置于一次性平皿中，使用手术剪将脐带剪成约2 cm/段；用含肝素钠的生理盐水洗净血液，纵向剪破脐带，去除3条血管及外皮，洗净内部的血液；将脐带组织切成2.0-4.0 mm

（2）脐带干细胞培养传代：取生长状况良好的人体胚胎间充质干细胞，用含青霉素和链霉素双抗的DMEM/F12 +10%的胎牛血清培养基培养脐带干细胞，细胞铺板后放置在细胞孵育箱中37℃、5% CO

（3）药物诱导和辐照：干细胞传代至P8，将10 μg/mL碘海醇与脐带干细胞共培养1天，加入0.5 μM地塞米松并施加0.5 Gy的X射线辐照，照射剂量率为143.25 cGy/min，继而培养2天后，弃去培养液并用PBS缓冲液清洗2次；加入无血清培养基继续培养2天。

（4）离心富集：收集细胞培养液，经30,000 rpm离心，富集干细胞分泌物并在4°C下保存备用。

实施例2

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例1的不同之处在于，步骤（3）中，施加2 Gy的X射线照射，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。

实施例3

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例1的不同之处在于，步骤（3）中，施加4 Gy的X射线照射，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。

实施例4

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例1的不同之处在于，步骤（3）中，采用50 μg/mL碘海醇与脐带干细胞共培养，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。

实施例5

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中，施加2 Gy的X射线照射，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。

实施例6

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中，施加4 Gy的X射线照射，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。

实施例7

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例1的不同之处在于，步骤（3）中，采用100 μg/mL碘海醇与脐带干细胞共培养，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。

实施例8

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例7的不同之处在于，步骤（3）中，施加2 Gy的X射线照射，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。

实施例9

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例7的不同之处在于，步骤（3）中，施加4 Gy的X射线照射，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。

对比例1

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例1的不同之处在于，步骤（3）中未施加X射线辐照。

对比例2

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中未施加X射线辐照。

对比例3

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例7的不同之处在于，步骤（3）中未施加X射线辐照。

试验例1

分别测定实施例1-9及对比例1-3提供的干细胞分泌物中SDF-1的含量，结果如下表1所示，其中，SDF-1含量按照Western blot法检测。

表1

（二）药物及添加剂量对干细胞分泌物SDF-1表达水平的影响

实施例10

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中，加入0.2 μM的地塞米松且未施加X射线辐照，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。

实施例11

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例10的不同之处在于，步骤（3）中，加入0.35 μM的地塞米松，其余步骤及工艺参数均与实施例10相同，在此不再赘述。

实施例12

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例10的不同之处在于，步骤（3）中，加入0.5 μM的地塞米松，其余步骤及工艺参数均与实施例10相同，在此不再赘述。

实施例13

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中，加入20 μM的白藜芦醇且未施加X射线辐照，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。

实施例14

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例13的不同之处在于，步骤（3）中，加入40 μM的白藜芦醇，其余步骤及工艺参数均与实施例13相同，在此不再赘述。

实施例15

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例13的不同之处在于，步骤（3）中，加入60 μM的白藜芦醇，其余步骤及工艺参数均与实施例13相同，在此不再赘述。

实施例16

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中，加入0.2 μM的TN14003冻干粉且未施加X射线辐照，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。

实施例17

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例16的不同之处在于，步骤（3）中，加入1 μM的TN14003冻干粉，其余步骤及工艺参数均与实施例16相同，在此不再赘述。

实施例18

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例16的不同之处在于，步骤（3）中，加入2 μM的TN14003冻干粉，其余步骤及工艺参数均与实施例16相同，在此不再赘述。

实施例19

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中，加入0.2 μM的T140冻干粉且未施加X射线辐照，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。

实施例20

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例19的不同之处在于，步骤（3）中，加入1 μM的T140冻干粉，其余步骤及工艺参数均与实施例19相同，在此不再赘述。

实施例21

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例19的不同之处在于，步骤（3）中，加入2 μM的T140冻干粉，其余步骤及工艺参数均与实施例19相同，在此不再赘述。

实施例22

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例4的不同之处在于，步骤（3）中，加入0.2 μM的AMD3100冻干粉且未施加X射线辐照，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。

实施例23

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例22的不同之处在于，步骤（3）中，加入0.6 μM的AMD3100冻干粉，其余步骤及工艺参数均与实施例22相同，在此不再赘述。

实施例24

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例22的不同之处在于，步骤（3）中，加入1 μM的AMD3100冻干粉，其余步骤及工艺参数均与实施例22相同，在此不再赘述。

对比例4

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例10的不同之处在于，步骤（3）中，未加入药物直接进行，其余步骤及工艺参数均与实施例10相同，在此不再赘述。

试验例2

分别测定实施例10-24及对比例4提供的干细胞分泌物中SDF-1的含量，结果如下表2所示，其中，SDF-1含量按照Western blot法检测。

表2

（三）X射线照射后培养时间对干细胞分泌物SDF-1表达水平的影响

实施例25

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例1的不同之处在于，步骤（3）中，采用20 μg/mL碘海醇与脐带干细胞共培养2天后，加入40 μM的白藜芦醇且同时施加0.5 Gy剂量的X射线照射，照射剂量率为143.25 cGy/min，照射后培养时间为1天，其余步骤及工艺参数均与实施例1相同，在此不再赘述。

实施例26

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例25的不同之处在于，步骤（3）中，X射线照射后培养时间为2天，其余步骤及工艺参数均与实施例25相同，在此不再赘述。

实施例27

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例25的不同之处在于，步骤（3）中，X射线照射后培养时间为4天，其余步骤及工艺参数均与实施例25相同，在此不再赘述。

实施例28

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例25的不同之处在于，步骤（3）中，施加1 Gy剂量的X射线照射，照射剂量率为143.25 cGy/min，照射后培养时间为1天，其余步骤及工艺参数均与实施例25相同，在此不再赘述。

实施例29

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例28的不同之处在于，步骤（3）中，X射线照射后培养时间为2天，其余步骤及工艺参数均与实施例28相同，在此不再赘述。

实施例30

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例28的不同之处在于，步骤（3）中，X射线照射后培养时间为4天，其余步骤及工艺参数均与实施例28相同，在此不再赘述。

实施例31

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例25的不同之处在于，步骤（3）中，施加2 Gy剂量的X射线照射，照射剂量率为143.25 cGy/min，照射后培养时间为1天，其余步骤及工艺参数均与实施例25相同，在此不再赘述。

实施例32

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例31的不同之处在于，步骤（3）中，X射线照射后培养时间为2天，其余步骤及工艺参数均与实施例31相同，在此不再赘述。

实施例33

本实施例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例33的不同之处在于，步骤（3）中，X射线照射后培养时间为4天，其余步骤及工艺参数均与实施例33相同，在此不再赘述。

对比例5

本对比例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与实施例25的不同之处在于，步骤（3）中，未施加X射线照射，加入40 μM的白藜芦醇培养1天，其余步骤及工艺参数均与实施例25相同，在此不再赘述。

对比例6

本对比例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与对比例5的不同之处在于，步骤（3）中，加入40 μM的白藜芦醇培养2天，其余步骤及工艺参数均与对比例5相同，在此不再赘述。

对比例7

本对比例提供了一种干细胞分泌物，其制备方法与对比例5的不同之处在于，步骤（3）中，加入40 μM的白藜芦醇培养4天，其余步骤及工艺参数均与对比例5相同，在此不再赘述。

试验例3

分别测定实施例25-33及对比例5-7提供的干细胞分泌物中SDF-1的含量，结果如下表3所示，其中，SDF-1含量采用ELISA法检测。

表3

从表3中实施例25-33与对比例5-6的对比可以看出，第1天2 Gy组SDF-1略有下降，4 Gy组SDF-1显著降低；第2天2 Gy组SDF-1明显恢复并逐渐升高，而4 Gy组SDF-1进一步下降；至第4天，4 Gy组几乎不能测出SDF-1，而2 Gy组SDF-1的含量为所有组别中最高的一组。

各组对应时间点比较：0.5 Gy组随着照射后培养时间延长SDF-1表达水平呈缓慢增长，其SDF-1含量与对比例5-7相比略有提高；2 Gy组的SDF-1含量在第1天有所下降，在第2天即明显回升，直至第4天SDF-1含量升高至明显超过对照组；4 Gy组中的SDF-1含量持续降低直至测不出。

通过表3中的数据显示说明，较小剂量(0.5 Gy)X射线辐射后SDF-1含量随着时间推移逐渐升高，对比例5-7组略有提升。而2 Gy剂量X射线辐射后，SDF-1含量先下降，后回升恢复至对照组水平之后持续上升。而较大剂量(4 Gy)X射线辐射后SDF-1显著下降，在随后的时间内依然未见恢复，直至最后完全检测不到。

二、石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒

实施例34

本实施例提供了一种石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒，按照以下步骤制备而成：

（1）将10 g六亚甲基二异氰酸酯与1 g石墨烯（粒径为350 nm）在无水DMF溶液中，于80℃下反应24 h。

（2）然后向反应液中加入10 g聚丙烯酸（分子量为7500），在于80℃下反应24 h，最后将产物用DMF洗涤数次以除去包括未反应的双亲性聚合物在内的各类附着物，得到双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒。

（3）将5 mg双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒用EDC和NHS酯活化，继而将3.75mgRADA16-A溶解于DMSO的水溶液中，用三乙胺调节溶液pH到7，再与活化的双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒反应，石墨烯-聚丙烯酸反应浓度为12.5 mg/mL。

（4）离心洗涤，去除未反应短肽和偶联剂，得到石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒。

实施例35

本实施例提供了一种石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒，按照以下步骤制备而成：

（1）将10 g六亚甲基二异氰酸酯与1 g石墨烯（粒径为200 nm）在无水DMF溶液中，于50℃下反应24 h。

（2）然后向反应液中加入10 g聚丙烯酸（分子量为5000），在于50℃下反应24 h，最后将产物用DMF洗涤数次以除去包括未反应的双亲性聚合物在内的各类附着物，得到双亲性石墨烯-聚丙烯纳米颗粒。

（3）将5 mg双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒用EDC和NHS酯活化，继而将2.5mgRADA16-A溶解于DMSO的水溶液中，用三乙胺调节溶液pH到7.5，再与活化的双亲性石墨烯-聚丙烯酸反应，石墨烯-聚丙烯酸反应浓度为10 mg/mL。

（4）离心洗涤，去除未反应短肽和偶联剂，得到石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒。

实施例36

本实施例提供了一种石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒，按照以下步骤制备而成：

（1）将10 g六亚甲基二异氰酸酯与1 g石墨烯（粒径为500 nm）在无水DMF溶液中，于150℃下反应24 h。

（2）然后向反应液中加入10 g聚丙烯酸（分子量为10000），在于150℃下反应24 h，最后将产物用DMF洗涤数次以除去包括未反应的双亲性聚合物在内的各类附着物，得到双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒。

（3）将5 mg双亲性石墨烯-聚丙烯酸纳米颗粒用EDC和NHS酯活化，继而将5mgRADA16-A溶解于DMSO的水溶液中，用三乙胺调节溶液pH到6.5，再与活化的双亲性石墨烯-聚丙烯酸反应，石墨烯-聚丙烯酸反应浓度为15 mg/mL。

（4）离心洗涤，去除未反应短肽和偶联剂，得到石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒。

对比例8

本对比例提供了一种石墨烯的溶液，其由1 g石墨烯（粒径为350 nm）溶解于DMF溶液中制备而成。

对比例9

本对比例提供了一种RADA16-A的溶液，其由2.5 mgRADA16-A溶解于DMSO的水溶液制备而成。

试验例4

将实施例34-36提供的双亲性石墨烯聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒以及及对比例8-9提供的石墨烯的溶液和RADA16的溶液分别制备成质量浓度为1%的水溶液，然后分别将实施例34-36以及对比例8-9制备成的水溶液投入100 mg/L的亚甲基蓝(MB)、无水硫酸铜和氯化铅溶液各50 mL中。使用0.1 mol/L的NaOH溶液和乙酸调节溶液pH，放入一定温度下的恒温振荡器中进行静态吸附实验，振荡速率为120 r/min。一定时间后取出样品，将样品静置至完全沉淀后，取上层清液，用分光光度法(λ= 664 nm)测MB溶液吸光度，用220FS型火焰原子吸收光谱(AAS，美国Varian公司)测定Cu

式中:Co和Ce分别为MB初始质量浓度和平衡质量浓度，mg/mL；D为去除率，%。

结果如下表4所示。

表4

从表4结果可以看出，实施例34-36提供的双亲性石墨烯-聚丙烯酸-RADA-16纳米颗粒对于MB和重金属离子Cu

试验例5

分别将实施例34-36提供的双亲性石墨烯聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒以及及对比例8-9提供的石墨烯的溶液和RADA16的溶液进行革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、突变杆菌、大肠杆菌、肠炎双球菌、绿脓杆菌和伤寒杆菌的抑菌试验，测定最低抑菌浓度（MIC）,结果如表5所示，同时设定了空白对照组作为对比。

表5

试验例6

初步探索实施例34提供的石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度，分别将实施例34提供的石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒配置成质量浓度为0.1%、0.25%、0.5%、1%、2%不同浓度的8 h菌落数计数实验。结果如表6所示。

操作步骤为：取金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大肠杆菌（ATCC25922）传代培养，用PBS溶液制成约 1×10

表6

从表6可以看出,对于金黄色葡萄球菌，实施例34提供的石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒质量浓度大于0.5%时均有较好的抑菌活性；对于大肠杆菌，实施例34提供的石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒质量浓度大于0.25%时有较好的抑菌活性。

三、生物活性组合物

实施例37

本实施例提供了一种生物活性组合物，包括按质量百分比计的如下组分：去离子水80％、丁二醇6％、甘油5％、干细胞分泌物2％，石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒1%，透明质酸钠2.5％，1，2-己二醇1％、棕榈酰四肽-7 0.6％、酵母菌溶胞物0.4％、烟酰胺0.3％、海藻糖0.4％、积雪草根提取物0.5％、迷迭香提取物0.15％、泛醇0.07％、黄原胶0.06％、EDTA二钠0.02％。

本实施例提供的生物活性组合物由各组分在20℃下搅拌均匀制备得到。

实施例38

本实施例提供了一种生物活性组合物，包括按质量百分比计的如下组分：去离子水93％、丁二醇2％、甘油3％、干细胞分泌物0.5％，石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒0.1%，透明质酸钠0.5％，1，2-己二醇0.3％、棕榈酰四肽-7 0.1％、酵母菌溶胞物0.1％、烟酰胺0.1％、海藻糖0.1％、积雪草根提取物0.1％、迷迭香提取物0.05％、泛醇0.02％、黄原胶0.02％、EDTA二钠0.01％。

本实施例提供的生物活性组合物由各组分在45℃下搅拌均匀制备得到。

实施例39

本实施例提供了一种生物活性组合物，包括按质量百分比计的如下组分：去离子水86.5％、丁二醇4％、甘油4％、干细胞分泌物1.2％，石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒0.6%，透明质酸钠1.5％，1，2-己二醇0.65％、棕榈酰四肽-7 0.35％、酵母菌溶胞物0.25％、烟酰胺0.2％、海藻糖0.25％、积雪草根提取物0.3％、迷迭香提取物0.1％、泛醇0.045％、黄原胶0.04％、EDTA二钠0.015％。

本实施例提供的生物活性组合物由各组分在30℃下搅拌均匀制备得到。

对比例10

本对比例提供了一种生物活性组合物，其与实施例39的不同之处在于，未加入干细胞分泌物，石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒的质量占比为1.8%。

对比例11

本对比例提供了一种生物活性组合物，其与实施例39的不同之处在于，未加入石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒，干细胞分泌物的质量占比为1.8%。

对比例12（空白对照组）

本对比例提供了一种生物活性组合物，其与实施例39的不同之处在于，未加入石墨烯-聚丙烯酸-RADA16-A纳米颗粒和干细胞分泌物。

试验例7

取60只SD大鼠，随机分为6组，每组10只。各组接受臀背部皮肤照射(采用6 meV电子线，总剂量30 Gy，照射野3 cm×3 cm，单次剂量率500 cGy/min)，照射后第23天开始，1-3组分别采用实施例37-39提供的生物活性组合物均匀涂抹创面，4-6组分别采用对比例10-12组提供的生物活性组合物均匀涂抹创面，1次/d，连用6次，阴性对照组不进行任何治疗。从第1次涂抹开始每4 d观察1次创面面积（ cm

表7

试验例8

招募60名受试志愿者，随机分为A、B、C、D、E、F四组，每组10人。A组每日早晚涂抹（实施例37）两次，B组每日早晚涂抹（实施例38）两次，C组每日早晚涂抹（实施例36）两次，D组每日早晚涂抹（对比例10）两次，E组每日早晚涂抹（对比例11）两次，F组每日早晚涂抹（对比例12）两次，六组受试志愿者对所涂抹面膜的种类未知。一个月后对产品肤质改善效果做总体评价。肤质改善效果评价分为三个等级，无明显效果（0-3分）效果一般（4-6分）效果显著（7-10分）。每组成员根据自我使用感受进行打分，收集数据取平均数。结果如表8所示。

表8

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。