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重组酵母细胞

文献发布时间：2023-06-19 11:39:06

本申请要求于2018年11月19日提交的美国申请第62/769,169号的优先权权益，所述美国申请的内容通过引用整体并入本文。

本申请包含根据“按照专利合作条约(PCT)在国际专利申请中呈现核苷酸和氨基酸序列表的标准(Standard for the Presentation of Nucleotide and Amino AcidSequence Listings in International Patent Applications Under the PatentCooperation Treaty(PCT))”ST.25以ASC II文本(.txt)文件呈计算机可读形式(CRF)的核苷酸和氨基酸序列表。序列表在以下鉴别出，并且以全文引用的方式并且出于所有目的并入本申请的本说明书中。

技术领域

本发明涉及用于高产率蛋白质表达的重组酵母细胞。本发明进一步涉及关于所述重组酵母细胞的细胞培养、关于培养所述重组酵母细胞的蛋白质制备方法以及所述重组酵母细胞的用途。

背景技术

法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii)(以前被称为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))是一种易于操作和培养的单细胞微生物。法夫驹形氏酵母是一种真核生物，其能够进行由高级真核细胞进行的许多翻译后修饰，如蛋白水解加工、折叠、二硫键形成和糖基化。因此，相比于无法像真核细胞那样进行翻译后修饰的细菌系统，优选法夫驹形氏酵母系统作为表达宿主细胞。进一步地，在细菌系统中，如果蛋白质在无活性的包涵体中产生，则蛋白质可能会丢失。已经证明，与许多细菌系统相比，法夫驹形氏酵母系统可提供更高的蛋白质表达水平。因此，可以将需要翻译后修饰的外来蛋白质产生为法夫驹形氏酵母中的生物活性分子，并且法夫驹形氏酵母已被用于产生多种重组蛋白。

现有技术中公开的表达菌株包含CBS7435(Küberl等人(2011)《生物技术杂志(JBiotechnol)》154:312-320；)、GS115(DeSchutter等人(2009)《自然生物技术(NatBiotechnol)》27:561-566)和DSMZ 70382(Mattanovich等人(2009)《微生物细胞工厂(Microb Cell Factories)》8:29)。

尽管如此，仍需要优化的重组酵母细胞以允许高产率的蛋白质表达和有效的蛋白质回收。

发明内容

本发明人已经开发了一种重组酵母细胞，由于启动子和前导肽的特定组合，所述重组酵母细胞能够实现高产率的蛋白质表达。

具体地说，本发明涉及一种包括至少第一表达盒的重组酵母细胞，所述第一表达盒包括

(a)启动子，所述启动子包括根据SEQ ID No:1到8中任一个所述的核酸序列或其功能片段或与根据SEQ ID No:1到8中任一个所述的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列，其可操作地连接至

(b)编码前导肽的核酸序列，所述前导肽包括根据SEQ ID No:9到15中任一个所述的氨基酸序列或与根据SEQ ID No:9到15中任一个所述的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；以及

(c)编码重组蛋白的核酸序列。

所述重组酵母细胞可以进一步包括第二表达盒，所述第二表达盒包括

(c)编码所述重组蛋白的核酸序列。

所述重组酵母细胞可能缺乏至少一个标志物基因，并且可以包括编码所述标志物的重组核酸序列。

在一个实施例中，所述标志物基因是营养缺陷型标志物基因，其可以选自由以下组成的组：ura3、his4、ade2、arg4、ade1、ura5、met2、lys2、pro3和tyr1。

在一个实施例中，所述标志物基因是抗生素抗性标志物基因，其可以选自由以下组成的组：博莱霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、G418抗性基因和潮霉素抗性基因。

所述重组酵母细胞可能缺乏第一标志物基因和第二标志物基因，并且可以包括编码所述第一标志物的重组核酸序列和编码所述第二标志物的重组核酸序列。

在一个实施例中，所述第一表达盒和任选的所述第二表达盒被稳定整合到所述酵母细胞的基因组中。

所述第一标志物基因和所述第二标志物基因可以独立的选自营养缺陷型标志物基因，所述营养缺陷型标志物基因可以独立地选自由以下组成的组：ura3、his4、ade2、arg4、ade1、ura5、met2、lys2、pro3和tyr1。

所述第一标志物基因和所述第二标志物基因可以独立的选自抗生素抗性标志物基因，所述抗生素抗性标志物基因可以独立地选自由以下组成的组：博莱霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、G418抗性基因和潮霉素抗性基因。

第一营养缺陷型标志物基因可以是his4，而第二营养缺陷型标志物基因可以是ura3。

在一个实施例中，ura3的缺乏是由于部分或全部ura3基因的缺失。

在一个实施例中，编码所述第一营养缺陷型标志物的核酸序列选自由以下组成的组：

(a)根据SEQ ID No:25所述的核酸序列；

(b)与根据SEQ ID No:25所述的核酸序列具有至少65％同一性的核酸序列；

(c)编码根据SEQ ID No:27所述的多肽的核酸序列；以及

(d)编码与根据SEQ ID No:27所述的多肽具有至少80％同一性的多肽的核酸序列；和/或

其中编码所述第二营养缺陷型标志物的核酸序列选自由以下组成的组：

(a)根据SEQ ID No:26所述的核酸序列；

(b)与根据SEQ ID No:26所述的核酸序列具有至少65％同一性的序列；

(c)编码根据SEQ ID No:28所述的多肽的核酸序列；以及

(d)编码与根据SEQ ID No:28所述的多肽具有至少80％同一性的多肽的核酸序列。

所述重组蛋白可以是酶、肽、抗体或其抗原结合片段、蛋白质抗生素、融合蛋白、疫苗或疫苗样蛋白质或颗粒、生长因子、激素或细胞因子，并且所述酶可以是脂肪酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶或植酸酶。

在一个实施例中，所述脂肪酶选自：

(a)具有根据SEQ ID No:23所述的氨基酸序列的脂肪酶；

(b)具有与根据SEQ ID No:23所述的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的脂肪酶；

(c)在对应于SEQ ID NO:23的位置23、33、82、83、84、85、160、199、254、255、256、258、263、264、265、268、308或311的位置上具有一个或多个氨基酸取代的脂肪酶；

(d)由根据SEQ ID No:24所述的核酸序列编码的脂肪酶；以及

(e)由编码与根据SEQ ID No:23所述的多肽序列具有至少80％序列同一性的脂肪酶的任何核酸序列编码的脂肪酶。

所述酵母细胞可以来自甲基营养型酵母物种，或者可以是法夫驹形氏酵母细胞。

本发明进一步涉及一种包括本文所述的重组酵母细胞的培养物。

本发明进一步涉及一种用于产生重组蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在合适的培养基中培养如本文所述的重组酵母细胞；以及

(b)获得所述重组蛋白。

本发明进一步涉及如本文所述的重组酵母细胞用于产生重组蛋白的用途。

附图说明

图1)具有法夫驹形氏酵母表达盒的表达载体，所述表达盒包括启动子、信号肽、所关注的基因(GOI)和终止子。

图2)在发酵条件下，在用不同法夫驹形氏酵母表达盒(1-4)转化的菌株中表达了各种脂肪酶。菌株1和菌株2在甲醇诱导条件下生长，而菌株3和菌株4在无甲醇条件下生长。示出了来自最终发酵液的上清液中的蛋白质染色凝胶。

在菌株1中，表1所示的脂肪酶LIP062在根据SEQ ID No:8所述的启动子的控制下表达，并与根据SEQ ID No:14所述的信号序列融合。

在菌株2中，表1所示的脂肪酶LIP167在根据SEQ ID No:8所述的启动子的控制下表达，并与根据SEQ ID No:15所述的信号序列融合。

在菌株3中，表1所示的脂肪酶LIP134在根据SEQ ID No:1所述的启动子的控制下表达，并与根据SEQ ID No:10所述的信号序列融合。

在菌株4中，表1所示的脂肪酶LIP173在根据SEQ ID No:1所述的启动子的控制下表达，并与根据SEQ ID No:10所述的信号序列融合。

具体实施方式

尽管将针对特定实施例描述本发明，但是该描述不应被理解为限制性的。

在详细描述本发明的示例性实施例之前，给出对于理解本发明而言重要的定义。除非另有说明或从定义的性质显而易见，否则这些定义适用于本文所述的所有方法和用途。

如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一个/种(a/an)”也包含各自的复数，除非上下文另外明确指出。在本发明的上下文中，术语“约(about)”和“大约(approximately)”表示本领域技术人员将理解以仍然确保所讨论特征的技术效果的精度范围。该术语通常表示与所指示的数值的偏差为±20％，优选地为±15％，更优选地为±10％，并且甚至更优选地为±5％。

应当理解，术语“包括”不是限制性的。出于本发明的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包括”的优选实施例。如果在下文中组被定义为包括至少一定数量的实施例，则这意味着还涵盖优选地仅由这些实施例组成的组。

此外，说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”“(b)”“(c)”“(d)”等用于区分相似要素，而不一定用于描述顺序或时间次序。应该理解的是，如此使用的术语在适当情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施例能够以不同于本文描述或说明的其它顺序操作。在术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”“(b)”“(c)”“(d)”、“i”、“ii”等涉及方法或用途或测定的步骤的情况下，步骤之间不存在时间或时间间隔的连贯性，即，这些步骤可以同时执行，或者在这些步骤之间可能存在几秒钟、几分钟、几小时、几天、几周、几个月甚至几年的时间间隔，除非在上文或下文中提出的申请中另有说明。

应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案、试剂等，因为这些可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限制。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

术语“酵母细胞”具有其典型含义。合适的酵母细胞可以选自由以下组成的属组：毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、阿克氏酵母属(Arxula)、汉逊酵母属(Hansenula)、汉逊酵母属(Ogatea)、耶氏酵母属(Yarrowia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酿酒酵母属(Saccharomyces)和驹形氏酵母属(Komagataella)。优选地，酵母细胞来自驹形氏酵母属。

在一个实施例中，酵母细胞是甲基营养型酵母细胞。如本文所使用的，术语“甲基营养型酵母”包含但不限于例如可以使用还原的一碳化合物(如甲醇或甲烷)以及不具有碳键的多碳化合物(如二甲基醚和二甲胺)的酵母物种。例如，这些物种可以使用甲醇作为细胞生长的唯一碳源和能量源。不受限制地，甲基营养型酵母物种可以包含例如甲烷八叠球菌属(Methanoscacina)、荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、巴斯德驹形氏酵母(Komagataella pastoris)和法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii)。优选地，宿主细胞是法夫驹形氏酵母细胞。

如本文所使用的，术语“重组酵母细胞”是指酵母细胞含有至少一种核酸序列，其不天然存在于细胞中或天然存在于酵母细胞中，但与在酵母细胞中未天然连接的序列相连，如与编码蛋白质的核酸序列未天然连接的启动子。在本发明的上下文中，重组酵母细胞与天然存在的酵母细胞的不同之处在于，其含有至少一个在天然存在的细胞中不存在的表达盒。

已经用至少第一表达盒转化了本发明的重组酵母细胞，即通过转化过程将第一表达盒引入了酵母细胞。重组宿主细胞中至少第一表达盒的存在可以通过用如PCR或Southern Blot等方法检测启动子的核酸序列的存在来检测。另外或可替代地，可以通过用如蛋白质印迹或免疫荧光等方法检测前导肽或重组蛋白的表达来检测重组宿主细胞中至少第一第二表达盒的存在。

在一个实施例中，用至少第一表达盒转化的酵母细胞缺乏至少一种营养缺陷型标志物。在这种情况下，第一表达盒可以包括编码所述营养缺陷型标志物的核酸序列。可以使用所述营养缺陷型标志物选择重组酵母细胞。

用于转化酵母细胞(具体地说，法夫驹形氏酵母细胞)的合适方法是技术人员已知的，并描述于以下文献中：例如，《毕赤酵母方案(Pichia Protocols)》,第2版,2007,编者：James M.Cregg,ISBN:978-1-58829-429-6。

表达盒通常存在于表达载体中，除表达盒外，所述表达载体还包括使其能够在细菌细胞中进行繁殖和选择的另外的元件，如在细菌细胞中起作用的复制起点和在细菌中起作用的抗生素抗性基因，从而选择转化的细菌。在转化之前，可以用合适的限制酶切割表达载体，以释放表达盒，从而将其转化到酵母细胞中。

在一个实施例中，用第一表达盒和第二表达盒转化重组酵母细胞。第一表达盒和第二表达盒可以分别转化到酵母细胞中。例如，可以将第一表达盒转化到酵母细胞中，并且可以使用第一营养缺陷型标志物来选择转化的细胞，然后将第二表达盒转化到已经用第一表达盒转化的酵母细胞中，并使用第二营养缺陷型标志物选择转化的细胞。

在一个实施例中，在一个转化反应中，将第一表达盒和第二表达盒一起转化到酵母细胞中。在这种情况下，可以同时使用第一营养缺陷型标志物和第二营养缺陷型标志物来选择转化的细胞。

本发明的重组酵母细胞可能缺乏至少第一营养缺陷型标志物基因和任选的第二营养缺陷型标志物基因。缺乏营养缺陷型标志物基因的酵母细胞在编码某种代谢途径所需的酶/因子的基因中具有突变。因此，缺乏某些营养缺陷型标志物基因的酵母细胞不能合成特定的生化产物，因此需要将生化产物补充到生长培养基中。当用包括编码所述营养缺陷型标志物的核酸序列的表达盒转化缺乏一个或多个营养缺陷型标志物基因的酵母细胞时，恢复了在未添加生化产物的培养基中生长的能力。因此，这种营养缺陷型标志物可以用于选择用期望产物转化的酵母细胞。

用于酵母细胞的营养缺陷型标志物基因包含但不限于ura3、his4、ade2、arg4、ade1、ura5、aox1、met2、lys2、pro3和tyr1。

缺乏两个营养缺陷型标志物基因的酵母细胞可以用两个表达盒转化，每个表达盒均包括一个营养缺陷型标志物基因。可以通过筛选在未添加相应生化产品的培养基中生长的细胞来选择转化的细胞。因此，可以选择用两个表达盒转化的酵母细胞。

在一个实施例中，第一营养缺陷型标志物基因是his4。His4缺陷型细胞需要在其生长培养基中存在组氨酸才能生长。因此，用编码His4的核酸序列转化的细胞能够在没有组氨酸的培养基上生长。His4缺陷型法夫驹形氏酵母菌株GS115可从Life Technologies

在一个实施例中，第二营养缺陷型标志物基因是ura3。ura3缺陷型细胞JC254描述于以下文献中：Cregg等人(1998)《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》103:17-26。ura3缺陷型细胞需要在其生长培养基中存在尿嘧啶或尿苷才能生长。因此，用编码Ura3的核酸序列转化的细胞能够在没有尿嘧啶或尿苷的培养基上生长。ura3缺陷型细胞JC254描述于以下文献中：Cregg等人(1998)《分子生物学方法》103:17-26。

在本发明的上下文中，ura3缺陷型菌株可以是具有部分或全部ura3基因缺失的菌株。

在一个实施例中，重组酵母菌株是缺乏ura3的GS115菌株。优选地，重组酵母菌株是具有部分ura3基因缺失的GS115菌株。

术语“核酸”、“核酸序列”或“核酸分子”具有其通常的含义，并且可以包含但不限于例如多核苷酸(如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))、寡核苷酸、通过聚合酶链反应(PCR)生成的片段以及通过连接、切割、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中的任何一种生成的片段。糖修饰包含例如用卤素、烷基、胺和叠氮基代替一个或多个羟基，或者糖可以被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可以被空间上和电子上相似的结构代替，如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基部分的修饰的实例包含烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶或其它众所周知的杂环取代基。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此类连接的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯、苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯等。核酸可以是单链或双链的。

术语“分离的核酸分子”是指已经与其天然缔合的环境(如基因组)分离的核酸分子。

本发明中使用的核酸序列进一步涵盖密码子优化的序列。通过系统地改变重组DNA中的密码子来优化核酸，以使其在不同于分离核酸的细胞的宿主细胞中表达，使得密码子与用于表达的生物体中的密码子使用模式相匹配，从而增强被表达的蛋白质的产率。然而，密码子优化的序列编码具有与天然蛋白相同的氨基酸序列的蛋白。

如本文所使用的，术语“编码(coding for)或(encoding)”具有其通常的含义，并且可以包含但不限于例如多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中的核苷酸特定序列的性质，以用作合成其它大分子(如确定的氨基酸序列)的模板。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。

如本文所使用的，术语“前导肽”是指指导蛋白质分泌的肽。从细胞分泌的蛋白质的前导肽位于蛋白质的N端，一旦新生蛋白质链跨过粗糙的内质网开始输出，该前导肽就会从成熟的蛋白质上被切割下来。前导肽使被表达的蛋白质能够运输到质膜或穿过质膜，从而易于分离和纯化被表达的蛋白质。通常，在蛋白质被转运到质膜上或穿过质膜后，前导肽通过专门的细胞肽酶从蛋白质上被切割下来。

在一个实施例中，前导肽包括SEQ ID No:9到15中任一个所示的氨基酸序列。在一个实施例中，前导肽是根据SEQ ID No:9到15中任一个所述的前导肽的功能变体。如果变体前导肽与蛋白质的融合导致重组宿主细胞将所述蛋白质分泌到上清液中(与未修饰的前导肽与所述蛋白质的融合基本上相同)，则前导肽的功能变体与未修饰的序列具有基本上相同的前导活性。基本上相同的分泌是指表达前导肽的功能变体的宿主细胞的上清液中蛋白质的量是表达未修饰的前导肽的宿主细胞的上清液中蛋白质的量的至少50％或60％，优选地，至少70％或75％，更优选地，至少80％或85％，并且最优选地，至少90％、92％、95％或98％。在一个实施例中，前导肽包括SEQ ID No:9所示的氨基酸序列。

本发明中使用的前导肽可以由根据SEQ ID No:16到22中任一个所述的核酸序列编码，或由与根据SEQ ID NO:16到22中任一个所述的核酸序列具有至少80％同一性且编码根据SEQ ID NO:9到15中任一个所述的前导肽的功能变体的核酸序列编码。

“序列同一性”、“％序列同一性”、“％同一性”、“％一致性”或“序列比对”是指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的比较或第一核酸序列与第二核酸序列的比较，并基于该比较计算为百分比。这一计算结果可以描述为“一致百分比”或“ID百分比”。

通常，序列比对可用于通过两种不同方法之一来计算序列同一性。在第一种方法中，在最终序列同一性计算中，将单个位置的不匹配项和单个位置的空位均计为不一致位置。在第二种方法中，在最终序列同一性计算中，将单个位置的不匹配项计为不一致位置；然而，在最终序列同一性计算中，单个位置的空位不计为(忽略)不一致位置。换句话说，在第二种方法中，在最终序列同一性计算中忽略空位。这两种方法之间的差异(即，将空位计为不一致位置而不是忽略空位)可能会导致两个序列之间的序列同一性值发生变化。

序列同一性由程序确定，所述程序产生比对，并且在最终序列同一性计算中将单个位置的不匹配项和单个位置的空位均计为不一致位置，从而计算同一性。例如程序Needle(EMBOS)，所述程序已实现Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch,1970,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:443-453)，并且所述程序如下根据默认设置计算序列同一性：首先在第一个序列和第二个序列之间产生比对，然后计算比对长度上相同位置的数目，然后将相同残基的数目除以比对长度，然后将该数目乘以100来生成序列同一性百分比[序列同一性百分比＝(相同残基数/比对长度)x 100)]。

可以根据成对的比对计算出序列同一性，所述成对的比对显示全长上的两个序列，因此显示出其全长上的第一序列和第二序列(“全局序列同一性”)。举例来说，程序Needle(EMBOSS)产生这样的比对；序列同一性百分比＝(相同残基数/比对长度)x 100)]。

可以根据仅显示第一序列或第二序列的局部区域的成对的比对计算序列同一性(“局部同一性”)。举例来说，程序Blast(NCBI)产生这样的比对；序列同一性百分比＝(相同残基数/比对长度)x 100)]。

优选地通过使用Needleman和Wunsch的算法(《分子生物学杂志》(1979)48,第443-453页)产生序列比对。优选地，将程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))与程序的默认参数一起使用(空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5，对于蛋白质，矩阵＝EBLOSUM62，而对于核苷酸，矩阵＝EDNAFULL)。然后，可以根据比对计算出序列同一性，所述比对显示全长上的两个序列，因此显示出其全长上的第一序列和第二序列(“全局序列同一性”)。举例来说：序列同一性百分比＝(相同残基数/比对长度)x 100)]。

如本文所使用的，“变体核酸序列”是指与各个亲本序列的核酸序列具有至少n％同一性的核酸序列，其中“n”是介于80和100之间的整数。变体核酸序列包含与亲本核酸序列的全长序列相比具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。变体核酸序列编码具有与亲本核酸序列编码的蛋白质基本上相同的活性的蛋白质。

如本文所使用的，“变体氨基酸序列”是指与各个亲本序列的氨基酸序列具有至少n％同一性的氨基酸序列，其中“n”是介于80和100之间的整数。变体氨基酸序列包含与亲本氨基酸序列的全长序列相比具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。具有变体氨基酸序列的蛋白质具有与亲本氨基酸序列基本上相同的活性。

术语“表达盒”是指含有蛋白质的编码序列和控制序列(如例如可操作连接的启动子)的核酸分子，使得用这些序列转化或转染的宿主细胞能够产生被编码的蛋白质。表达盒可以进一步包括编码标志物(如营养缺陷型标志物)的核酸序列。表达盒可以是载体的一部分或可以整合到宿主细胞染色体中。

表达盒可以进一步含有与编码蛋白质的核酸序列可操作地连接的合适的终止子序列。合适的终止子序列包含但不限于AOX1(醇氧化酶)终止子、CYC1(细胞色素c)终止子和TEF(翻译延伸因子)终止子。