一种熊去氧胆酸的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种熊去氧胆酸的制备方法。

背景技术

熊去氧胆酸简称UDCA，是名贵中药熊胆主要成分,能增加胆汁酸分泌，能抑制胆固醇合成，能增加肝脏过氧化化氢酶活性，可降低肝脏和血清中三酰甘油浓度，在慢性肝脏疾病中具有免疫调节作用，因此，用于治疗胆结石、胆汁淤积性肝病、脂肪肝、原发性胆汁性肝硬化、各型肝炎、中毒性肝障碍、胆囊炎、胆道炎和胆汁性消化不良、胆汁返流性胃炎、眼部疾病等。

目前，关于熊去氧胆酸的制备方法主要为：1、熊胆提取：最初中药熊胆为割取熊胆囊制成，之后采取人工养殖活熊取胆，但周期长、收率低、舆论争议大，现已被淘汰；2、合成法：目前主流工艺为从猪、鸡鸭鹅胆膏中提取鹅去氧胆酸，再经化学法或酶法，氧化、还原得到熊去氧胆酸，合成路线如下：

熊去氧胆酸等药物市场逐年增长，但全球动物饲养数量有限，即胆汁和鹅去氧胆酸原料数量供应十分紧张，亟待开发开发的起始物料或新工艺路线，以满足熊去氧胆酸市场增长及需求。

在这种大环境下，逐渐兴起采用胆酸替代鹅去氧胆酸为原料合成熊去氧胆酸，如专利 CN201910657023，但该专利的工艺路线长，从而导致成本高，且过程中使用危险性较高的 Raney Ni，使用臭味很大的硫醇衍生物，污染严重，合成路线如下：

因此，为弥补熊去氧胆酸的合成工艺的技术空白，发明人现提供一种熊去氧胆酸的制备方法以解决前面提到的相关问题。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种熊去氧胆酸的制备方法，以胆酸为起始原料，原料供应充足且成本低、适合工业化规模应用，生产流程短，工艺过程温和安全，副反应少。

本发明采用的技术方案如下：

为实现上述目的，本发明提供一种熊去氧胆酸的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)胆酸在7α-羟基类固醇脱氢酶、12α-羟基类固醇脱氢酶、辅酶、辅酶再生体系、水溶液的作用下发生氧化反应得到7,12酮基-石胆酸，选择性氧化原理如下式所示：

(2)7,12酮基-石胆酸在7β-羟基类固醇脱氢酶、辅酶、辅酶再生体系的作用下发生还原反应得到12酮基-熊去氧胆酸，选择性还原原理如下式所示：

(3)12酮基-熊去氧胆酸脱12位羰基得到熊去氧胆酸。

优选地，所述步骤(1)中，7α-羟基类固醇脱氢酶和12α-羟基类固醇脱氢酶同时添加，或先后添加催化反应。

优选地，所述步骤(1)中，辅酶为NAD或NADP，辅酶再生体系为核黄素还原酶/氧气体系或醇脱氢酶/丙酮体系或乳酸脱氢酶/丙酮酸体系。

优选地，所述步骤(1)具体为：配置7α-羟基类固醇脱氢酶、12α-羟基类固醇脱氢酶、 NAD辅酶、核黄素以及核黄素还原酶的混合溶液，然后与胆酸水溶液混合溶解，控制pH在7.5～9.0，通入空气或氧气氧化反应，得到7,12酮基-石胆酸。

优选地，所述步骤(1)中，各原料在所形成的混合溶液中的浓度为：胆酸浓度为 10～100g/L，7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)酶活2～200U/ml，12α-羟基类固醇脱氢酶 (12α-HSDH)酶活2～200U/ml，NAD辅酶浓度为0.005～0.1g/L，核黄素浓度为0.05～1g/L，核黄素还原酶酶活2～200U/ml。

优选地，所述步骤(2)中，辅酶为NAD或NADP，辅酶再生体系为葡萄糖脱氢酶/葡萄糖体系。

优选地，所述步骤(2)具体为：配置7β-羟基类固醇脱氢酶，葡萄糖脱氢酶(GDH)，NADP辅酶，葡萄糖的混合溶液，然后与7,12酮基-石胆酸水溶液混合，控制pH在6.5～7.8，还原得到12酮基-熊去氧胆酸。

优选地，所述步骤(2)中，各原料在所形成的混合溶液中的浓度为：7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)酶活1～200U/ml，葡萄糖脱氢酶(GDH)酶活0.7～200U/ml，NADP辅酶浓度为0.005～0.1g/L，葡萄糖摩尔浓度为12酮基-熊去氧胆酸摩尔浓度为1～3倍，7,12酮基 -石胆酸水溶液浓度为10～100g/L。

优选地，所述步骤(3)具体为：将12酮基-熊去氧胆酸与乙二醇或三乙二醇、氢氧化钠或氢氧化钾、水合肼混合，加热反应得到熊去氧胆酸。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1.本发明以胆酸为起始原料，胆酸目前处于相对过剩的状态，其供应充足且成本低、适合工业化规模应用。

2.本发明采用酶法和化学法结合工艺制备熊去氧胆酸，大大缩短了生产流程，使周期更短，成本低。

3.本发明得两步酶法工艺是在水中常温反应的，使得工艺过程更加温和安全，副反应少。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种熊去氧胆酸的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)制备7,12酮基-石胆酸

将25克胆酸加入175ml水中，加入2.52克氢氧化钠，搅拌溶清得胆酸水溶液；

配置含7α-HSDH酶、12α-HSDH酶、核黄素还原酶、NAD辅酶的水溶液共1000ml，溶液中7α-HSDH酶活浓度达到20U/ml，12α-HSDH酶20U/ml,核黄素还原酶酶活40U/ml， NAD辅酶浓度0.04g/L；再加入0.3克核黄素，控温在28±2℃，按1L/min的流量通入空气；控制pH在8.0～8.3，加入胆酸水溶液，继续通气搅拌反应生成7,12酮基-石胆酸，加毕2 小时后，每小时HPLC监控一次转化率，直至转化率≥97％；

当转化率≥97％后，过滤，滤液加热至40℃，加入20％浓度稀硫酸，调节pH至3.0～5.0，析出固体，过滤干燥，得7,12酮基-石胆酸26克。

(2)制备12酮基-熊去氧胆酸

将26克7,12酮基-石胆酸加入175ml水中，加入2.52克氢氧化钠，搅拌溶清得7,12酮基-石胆酸水溶液；

配置7β-HSDH酶、GDH酶、NADP辅酶水溶液共1000ml，溶液中7β-HSDH酶活浓度达到20U/ml，GDH酶5U/ml，NADP辅酶浓度0.02g/L；再加入22.03克葡萄糖，控温在 26±2℃，控制pH在6.5～7.4，加入7,12酮基-石胆酸水溶液，反应加毕2小时后，每小时 HPLC监控一次转化率，直至转化率≥99％；

当转化率≥99％后，过滤，滤液加热至40℃，加入20％浓度稀硫酸，调节pH至3.0～6.0，析出固体，过滤干燥，得12酮基-熊去氧胆酸26.5克。

(3)制备熊去氧胆酸

向反应瓶中加入49.75克三乙二醇、12.36克氢氧化钾、24.37ml水合肼(80％浓度)、加入26.5克12酮基-熊去氧胆酸，搅拌加热至内温180℃至反应完全；反应完后关闭加热，加入248.77ml水，降温至80℃以下，过滤，滤液用20％稀硫酸常温下调pH至3.0～6.0，搅拌1h过滤，滤饼用水淋洗至中性，干燥得26克熊去氧胆酸粗品。

熊去氧胆酸粗品参照专利CN201711277931.6精制纯化，得熊去氧胆酸纯品。

实施例2

一种熊去氧胆酸的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)制备7,12酮基-石胆酸

将50克胆酸加入350ml水中，加入3.42克氢氧化钠，搅拌溶清得胆酸水溶液；

配置含7α-HSDH酶、12α-HSDH酶、核黄素还原酶、NAD辅酶的水溶液共1000ml，溶液中7α-HSDH酶活浓度达到40U/ml，12α-HSDH酶40U/ml,核黄素还原酶酶活60U/ml， NAD辅酶浓度0.06g/L；再加入0.5克核黄素，控温在28±2℃，通入空气，控制溶氧在 10％～70％；控制pH在8.0～8.3，加入胆酸水溶液，继续通气搅拌反应生成7,12酮基-石胆酸，加毕2小时后，每小时HPLC监控一次转化率，直至转化率≥98％；

当转化率≥98％后，过滤，滤液加热至50℃，加入20％浓度稀硫酸，调节pH至3.0～5.0，析出固体，过滤干燥，得7,12酮基-石胆酸53克。

(2)制备12酮基-熊去氧胆酸

将53克7,12酮基-石胆酸加入350ml水中，加入3.42克氢氧化钠，搅拌溶清得7,12酮基-石胆酸水溶液；

配置7β-HSDH酶、GDH酶、NADP辅酶水溶液共1000ml，溶液中7β-HSDH酶活浓度达到40U/ml，GDH酶12U/ml，NADP辅酶浓度0.04g/L；再加入45.7克葡萄糖，控温在 26±2℃，控制pH在6.5～7.4，加入7,12酮基-石胆酸水溶液，反应加毕2小时后，每小时 HPLC监控一次转化率,直至转化率≥99.5％；

当转化率≥99.5％后，过滤，滤液加热至50℃，加入20％浓度稀硫酸，调节pH至3.0～6.0，析出固体，过滤干燥，得12酮基-熊去氧胆酸54克。

(3)制备熊去氧胆酸

向反应瓶中加入98.47克三乙二醇、25.67克氢氧化钾、51.48ml水合肼(80％浓度)、加入54克12酮基-熊去氧胆酸，搅拌加热至内温200℃至反应完全；反应完后关闭加热，加入510.64ml水，降温至80℃以下，过滤，滤液用20％稀硫酸常温下调pH至3.0～6.0，搅拌1h过滤，滤饼用水淋洗至中性，干燥得53.2克熊去氧胆酸粗品。

熊去氧胆酸粗品参照专利CN201711277931.6精制纯化，得熊去氧胆酸纯品。

实施例3

一种熊去氧胆酸的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)制备7,12酮基-石胆酸

将75克胆酸加入500ml水中，加入7.15克氢氧化钠，搅拌溶清得胆酸水溶液；

配置含7α-HSDH酶、12α-HSDH酶、核黄素还原酶、NAD辅酶的水溶液共1000ml，溶液中7α-HSDH酶活浓度达到80U/ml，12α-HSDH酶80U/ml，核黄素还原酶酶活100U/ml， NAD辅酶浓度0.08g/L；再加入0.6克核黄素，控温在28±2℃，按1.5L/min的流量通入空气；控制pH在8.0～8.3，加入胆酸水溶液，继续通气搅拌反应生成7,12酮基-石胆酸，加毕2小时后，每小时HPLC监控一次转化率，直至转化率≥98％；

当转化率≥98％后，过滤，滤液加热至60℃，加入20％浓度稀硫酸，调节pH至3.0～5.0，析出固体，过滤干燥，得7,12酮基-石胆酸78克。

(2)制备12酮基-熊去氧胆酸

将78克7,12酮基-石胆酸加入500ml水中，加入7.15克氢氧化钠，搅拌溶清得7,12酮基-石胆酸水溶液；

配置7β-HSDH酶、GDH酶、NADP辅酶水溶液共1000ml，溶液中7β-HSDH酶活浓度达到80U/ml，GDH酶20U/ml，NADP辅酶浓度0.08g/L；再加入64克葡萄糖，控温在26±2℃，控制pH在6.5～7.4，加入7,12酮基-石胆酸水溶液，反应加毕2小时后，每小时HPLC监控一次转化率，直至转化率≥99％；

当转化率≥99％后，过滤，滤液加热至60℃，加入20％浓度稀硫酸，调节pH至3.0～6.0，析出固体，过滤干燥，得12酮基-熊去氧胆酸80克。

(3)制备熊去氧胆酸

向反应瓶中加入152.26克三乙二醇、35.78克氢氧化钾、72.54ml水合肼(80％浓度)、加入80克12酮基-熊去氧胆酸，搅拌加热至内温180℃至反应完全；反应完后关闭加热，加入735.62ml水，降温至80℃以下，过滤，滤液用20％稀硫酸常温下调pH至3.0～6.0，搅拌1h过滤，滤饼用水淋洗至中性，干燥得76克熊去氧胆酸粗品。

熊去氧胆酸粗品参照专利CN201711277931.6精制纯化，得熊去氧胆酸纯品。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。