一种同时检测百日咳杆菌及其耐药突变位点的方法和试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，更具体的涉及一种同时检测百日咳杆菌及其耐药突变位点的方法和试剂盒。

背景技术

百日咳是由百日咳杆菌引起的一种严重急性呼吸道传染病，百日咳的特征为典型性痉挛性咳嗽，伴有鸡鸣样回声。百日咳疫苗的广泛接种，虽然使该病的发病率明显下降，但由于疫苗接种产生的抗体随年龄增长而下降，孕妇体内的抗体传送给胎儿很少，因此小婴儿对百日咳的抵抗力仍然很弱，或未达疫苗接种年龄，导致小于6月龄婴儿百日咳的发病率明显较其他年龄组高。另外，疫苗接种产生的抗体随年龄增长而下降，耐药百日咳杆菌菌株的出现和传播等，导致已接种疫苗的青少年和成人患百日咳的人数逐渐增多，局部地区出现爆发或者流行，再加上耐药百日咳杆菌菌株的出现和传播，形成了百日咳再现现象，使人们对百日咳的防控面临新的挑战。值得注意的是，已接种疫苗的青少年和成人患百日咳的人数逐渐增多，其临床症状并不典型，常被忽视，并且可以作为传染源威胁幼儿健康。因此，加强对百日咳及耐药情况的监测显得非常重要。

以红霉素为代表的大环内酯类抗生素是治疗百日咳及预防性服药的首选抗生素，如红霉素、阿奇霉素、罗红霉素或克拉霉素等。疗效与用药早晚有关，卡他期应用抗生素可以减轻甚至不发生痉咳，进入痉咳期后应用，则不能缩短百日咳的临床过程，但可以缩短排菌期及预防继发感染。但是，1994年全球首株红霉素耐药的百日咳杆菌在美国被发现，并引起了广泛关注。随着世界范围内多种细菌耐药问题的日趋严重，我国百日咳杆菌也出现了耐大环内酯类抗生素的现象。为了更好的指导临床用药，百日咳杆菌核酸的检测和耐药突变位点的检出可以有目的针对百日咳患者和耐药患者使用不同的治疗药物。

百日咳杆菌的传统实验室检测方法主要有细菌培养、血清学试验、常规分子生物学方法等。以细菌培养法为金标准，其具有较高的特异性，但其培养技术复杂且敏感性受到抗菌药物使用、病程、标本转运条件、标本质量及培养操作方法等多种因素的影响，导致其灵敏度低、阳性率低、且耗时长，，不适用于早期病原体感染的快速诊断。

目前市场上百日咳病原学检测方法主要是酶联免疫吸附法，检测百日咳毒素(PT)抗体，单份血清常用PT-IgG抗体检测，但应充分考虑患儿年龄和免疫状态；此外，一般取疑似患者发病初期与恢复期2份血清标本，且PT-IgG滴度出现显著升高(>2～4倍)来确定是否有感染百日咳杆菌。但特异性IgG阳性只能表明有相应细菌感染，不能用于早期感染判断和疗效监测,且病程在10天左右才能检测阳性率高，取样时间也较长，商品化的试剂盒缺乏标准化的判断指标，这都不利于百日咳杆菌的早期诊断和快速诊断。此外，还可因免疫反应较弱而出现假阴性，这对一些免疫缺陷，免疫系统尚未发育完善的患儿存在一定的局限性，；另外，细菌特异性抗体检测只能检测百日咳杆菌感染而不能区分耐药与否。

实时PCR，又称荧光定量PCR，是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新型核酸定量技术，并随荧光PCR仪的推出而得到广泛应用。该技术在常规的PCR基础上运用荧光共振能量转移现象，加入荧光标记探针，巧妙的把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，在PCR指数扩增期间，通过连续监测荧光信号的强弱来及时测定特异产物的量，并据此推断目的基因的初始量，可以快速获得特异性检测结果。

目前研究表明，百日咳杆菌红霉素耐药现象与其基因组23S rRNA基因Ⅴ区中的一个核苷酸位点突变有关，即A2047G。之后的多篇报道都证实：发生红霉素或大环内酯类抗生素耐药的百日咳杆菌中，均有23S rRNA基因的A2047G突变发生。目前，针对单碱基变异，多数只能通过荧光定量PCR的熔解曲线或测序方法来检测，分别利用单碱基的变异对熔解温度的影响即Tm值检测(一般野生型与突变型的Tm值相差0.24℃)来判断结果，但对仪器以及操作人员的要求很高；而测序方法需要对扩增产物开盖，限制性片段酶切电泳观察，依据条带大小来判断是否发生突变，或者再进行一代测序与标准株比对序列判断是否发生突变，此法很容易对实验室造成污染。因此，针对百日咳杆菌耐药区域23S rRNA可变区域A2047G的单碱基突变的检测仍然是一个技术难点。

在现有技术中，CN 103667512A公开了一种从标本中对百日咳鲍特菌红霉素耐药性进行快速检测的引物及检测方法，该方法无法直接判断是否为百日咳杆菌发生突变，需先借助其他方法判断是否为百日咳杆菌，在此基础上，对百日咳鲍特菌23S rRNA基因包括2047位点两侧的可变区域设计引物，才能实现对百日咳杆菌红霉素耐药性的检测。该方法虽然也是针对百日咳耐药23s rRNA区域设计，但其采用测序方法，需要经过普通PCR扩增，再经一代测序方法，最后依据测序峰图以及与标准株序列进行比对来判断是否发生突变。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种同时检测百日咳杆菌DNA及其耐药突变位点的荧光PCR检测体系，可在同一反应管全封闭的扩增体系中，直接判读结果，区分待测样品是百日咳杆菌还是耐药百日咳杆菌，从而指导临床正确使用抗生素，防止抗生素的滥用。该方法节省检测时间和成本，且检测准确度高，灵敏度高，特异性好，精密度好。

本发明的解决方案如下：

本发明是一种同时检测百日咳杆菌及其耐药突变位点的方法，包括如下步骤：将待测样本DNA和内标加入荧光PCR反应液中进行扩增反应，再根据荧光信号检测通道的Ct值对反应结果进行判读，所述判读按如下方法进行：

(1)当百日咳杆菌核酸荧光信号检测通道的Ct值＞26.00时，按照如下进行判读：

当①内标检测Ct值≤36.00，②百日咳杆菌核酸荧光信号检测通道的荧光信号增长，呈典型的S型曲线，且Ct值≤36.00，③百日咳杆菌耐药突变位点的荧光信号检测通道的荧光信号无明显扩增曲线时，则说明所述待测样本DNA为百日咳杆菌DNA，但未发生A2047G耐药突变；

当①内标检测Ct值≤36.00，②百日咳杆菌核酸和百日咳杆菌耐药突变位点荧光信号检测通道的荧光信号均增长，均呈典型的S型曲线，且Ct值均≤36.00时，则说明所述待测样本DNA为百日咳杆菌DNA，且发生A2047G耐药突变；

当①内标检测Ct值≤36.00，②百日咳杆菌核酸荧光信号检测通道Ct值＞36.00，且无典型的S型曲线时，则说明待测样本DNA不是百日咳杆菌DNA；

(2)当百日咳杆菌核酸荧光信号检测通道的Ct值≤26.00时，按照如下进行判读：

当①内标检测Ct值≤36.00，②百日咳杆菌核酸荧光信号检测通道的荧光信号增长，呈典型的S型曲线，③且当百日咳杆菌核酸荧光信号检测通道Ct值≤26.00，百日咳杆菌耐药突变位点荧光信号检测通道有扩增曲线时；则需要通过计算百日咳杆菌核酸荧光信号与百日咳杆菌耐药突变位点荧光信号的Ct差值ΔCt来区分百日咳杆菌是否发生突变阳性：

当ΔCt≤6时，则说明所述待测样本DNA为百日咳杆菌且发生A2047G耐药突变；

当ΔCt＞6时，则说明所述待测样本DNA为百日咳杆菌且未发生A2047G耐药突变。

优选的，所述荧光PCR反应液包括如下组分：

(1)引物组：所述引物组中各条引物浓度均为0.6μM；

(2)探针组：所述探针组中各条探针浓度均为0.3μM；

(3)Taq DNA聚合酶：浓度为1.5U/反应；

(4)反应缓冲液：dNTP浓度为0.2mM，MgCl

优选的，所述引物组包括：引物BP-F4：用于检测百日咳杆菌核酸的正向引物，如序列表中SEQ ID NO.1所示序列；引物BP-R4：用于检测百日咳杆菌核酸的反向引物，如序列表中SEQ ID NO.2所示序列；引物MBP-F4：用于检测百日咳杆菌耐药突变位点的正向引物，如序列表中SEQ ID NO.4所示序列；引物MBP-R2：用于检测百日咳杆菌耐药突变位点的反向引物，如序列表中SEQ ID NO.5所示序列。

优选的，所述探针组包括：探针BP-P2-FAM：用于检测百日咳杆菌核酸的探针，如序列表中SEQ ID NO.3所示序列；探针MBP-P2-VIC：用于检测百日咳杆菌耐药突变位点的探针，如序列表中SEQ ID NO.6所示序列；所述百日咳杆菌核酸荧光信号检测通道为所述探针BP-P2-FAM中的FAM的荧光检测通道；所述百日咳杆菌耐药突变位点荧光信号检测通道为所述探针MBP-P2-VIC中的VIC的荧光检测通道。

优选的，所述内标为β-珠蛋白基因(HBB)，所述内标的引物探针为：正向引物β-Globin-F1，如序列表中SEQ ID NO.7所示；反向引物β-Globin-R2，如序列表中SEQ ID NO.8所示；探针β-Globin-CY5，如序列表中SEQ ID NO.9所示。

优选的，所述扩增反应条件为：94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性10s，55℃退火延伸35s，共反应40个循环。

本发明还提供了用于上述百日咳杆菌及其耐药突变位点的检测方法的试剂盒，所述试剂盒包含百日咳杆菌检测用的荧光PCR反应液和内标。

优选的，所述荧光PCR反应液包括如下组分：

(1)引物组：所述引物组中各条引物浓度均为0.6μM；所述引物组包括：引物BP-F4：用于检测百日咳杆菌核酸的正向引物，如序列表中SEQ ID NO.1所示序列；引物BP-R4：用于检测百日咳杆菌核酸的反向引物，如序列表中SEQ ID NO.2所示序列；引物MBP-F4：用于检测百日咳杆菌耐药突变位点的正向引物，如序列表中SEQ ID NO.4所示序列；引物MBP-R2：用于检测百日咳杆菌耐药突变位点的反向引物，如序列表中SEQ ID NO.5所示序列；

(2)探针组：所述探针组中各条探针浓度均为0.3μM；所述探针组包括：探针BP-P2-FAM：用于检测百日咳杆菌核酸的探针，如序列表中SEQ ID NO.3所示序列；探针MBP-P2-VIC：用于检测百日咳杆菌耐药突变位点的探针，如序列表中SEQ ID NO.6所示序列；

(3)Taq DNA聚合酶：浓度为1.5U/反应；

(4)反应缓冲液：dNTP浓度为0.2mM，MgCl

(5)所述内标的引物探针：正向引物β-Globin-F1，如序列表中SEQ ID NO.7所示；反向引物β-Globin-R2，如序列表中SEQ ID NO.8所示；探针β-Globin-CY5，如序列表中SEQID NO.9所示。

优选的，所述内标为β-珠蛋白基因(HBB)片段。

本发明的有益效果：

(1)能在2小时内同时特异性的检出百日咳杆菌核酸阳性及耐药性，节省时间和成本，且准确度高，灵敏度高，特异性好，精密度好：本发明利用荧光定量PCR的方法进行特异性扩增，再利用待测样本的扩增产物在不同两通道的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数(Ct)差值，区分待测样本是百日咳杆菌还是耐药百日咳杆菌，不仅能特异性地检出百日咳杆菌感染，还能指导临床正确使用抗生素，防止抗生素的滥用。

(2)有效防止假阳性结果：现有公开文献均以启动子区域作为百日咳杆菌的靶区，由于此区域与其他鲍特菌属的副百日咳杆菌序列比较相近，如不加考虑，容易引起假阳性，本发明在引物探针的设计上特别有意识地避开副百日咳杆菌序列的检测，以达到防止假阳性的效果。

附图说明

图1为特异性试验中检测阳性对照百日咳杆菌和其他病原体的扩增曲线图；

图2为不同梯度浓度的百日咳杆菌的灵敏度试验的结果图；

图3为不同梯度浓度的耐药百日咳杆菌的灵敏度试验的结果图；

图4为10

图5为10

图6为本检测方法中的引物探针的优化实验结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅做示例说明。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要，选择其他相应试剂以实现本发明的目的。

实施例1：本发明试剂盒组成的一个优选实施例

利用Blast工具对Genbank和国内外文献中的百日咳杆菌核酸及耐药突变位点基因组序列进行分析，分别选择百日咳杆菌毒素特有的基因启动子区域、百日咳杆菌耐药区域23S rRNA可变区域A2047G的单碱基突变位点作为检测靶序列，并针对这两个检测靶序列设计和合成多套引物和探针，同时针对阳性质控品人β-珠蛋白基因的保守区域设计特异性的引物和探针，结果见表1。引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，包括百日咳杆菌的检测探针(5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团)；百日咳杆菌耐药突变位点探针(5’端标记VIC荧光报告基团，3’端标记BHQ1荧光淬灭基团)；内标β-珠蛋白基因(HBB)探针，(荧光报告基团为CY5，荧光淬灭基团为BHQ2)。

本实施例用于同时检测百日咳杆菌及其耐药突变位点的试剂盒，包含百日咳杆菌检测用的荧光PCR反应液和内标。

所述荧光PCR反应液包括如下组分：

(1)引物组：所述引物组中各条引物浓度均为0.6μM；所述引物组包括：引物BP-F4：用于检测百日咳杆菌核酸的正向引物，如序列表中SEQ ID NO.1所示序列；引物BP-R4：用于检测百日咳杆菌核酸的反向引物，如序列表中SEQ ID NO.2所示序列；引物MBP-F4：用于检测百日咳杆菌耐药突变位点的正向引物，如序列表中SEQ ID NO.4所示序列；引物MBP-R2：用于检测百日咳杆菌耐药突变位点的反向引物，如序列表中SEQ ID NO.5所示序列；

(2)探针组：所述探针组中各条探针浓度均为0.3μM；所述探针组包括：探针BP-P2-FAM：用于检测百日咳杆菌核酸的探针，如序列表中SEQ ID NO.3所示序列；探针MBP-P2-VIC：用于检测百日咳杆菌耐药突变位点的探针，如序列表中SEQ ID NO.6所示序列；

(3)Taq DNA聚合酶：浓度为1.5U/反应；

(4)反应缓冲液：dNTP浓度为0.2mM，MgCl

(5)所述内标的引物探针：正向引物β-Globin-F1，如序列表中SEQ ID NO.7所示；反向引物β-Globin-R2，如序列表中SEQ ID NO.8所示；探针β-Globin-CY5，如序列表中SEQID NO.9所示。

所述内标为β-珠蛋白基因(HBB)片段。

表1.引物和探针序列表

对表1中引物和探针的名称解释说明如下：

BP-F4：百日咳杆菌核酸的正向引物；

BP-R4：百日咳杆菌核酸的反向引物；

MBP-F4：百日咳杆菌耐药突变位点检测正向引物；

MBP-R2：百日咳杆菌耐药突变位点检测反向引物；

β-Globin-F1：β-珠蛋白基因(HBB)正向引物；

β-Globin-R2：β-珠蛋白基因(HBB)反向引物；

BP-P2-FAM：百日咳核酸检测探针序列；

MBP-P2-VIC：百日咳耐药突变点检测探针序列；

β-Globin-CY5：β-珠蛋白基因(HBB)的检测探针序列。

实施例2：本发明试剂盒组成的第二个优选实施例

在实施例1的基础上，本实施例的百日咳杆菌核酸及耐药突变位点检测试剂盒(Taqman荧光探针法)组成如下表：

本试剂盒还可以根据需求搭配定量标准品试剂盒。

实施例3：本发明建立的百日咳杆菌核酸及耐药突变位点PCR检测方法的一个优选实施例

本发明建立的百日咳杆菌核酸及耐药突变位点PCR检测方法的一个优选实施例如下行：

1、待测样本基因组DNA提取

取50μL口咽拭子待测样本和阴性对照(Hep-2)，均短暂离心后取上清，选用广东和信健康科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20150194号)提取核酸，严格按照说明书操作。

2、20μL百日咳杆菌及耐药检测扩增反应液的配制

按如下组分配制20μL百日咳杆菌及耐药检测的扩增反应液：

(1)实施例1中的引物组和内标的引物：浓度均为0.6μM；

(2)实施例1中的探针组和内标的探针：浓度均为0.3μM；

(3)Taq DNA聚合酶：浓度为1.5U/反应；

(4)反应缓冲液：dNTP浓度为0.2mM，MgCl

3、实时荧光定量PCR检测

将步骤1中处理得到的5μL待测样本DNA加入步骤2中配制的反应液中，盖紧管盖，短暂离心。将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测。同时检测FAM/VIC/CY5三种荧光的信号值，其中FAM荧光指示百日咳杆菌，VIC荧光指示耐药突变(A2047G)，CY5荧光指示阳性质控品β-globin，在每个循环中55℃反应35秒的过程中进行荧光采集。具体循环参数设定如下：

4、根据相关仪器的软件对反应结果进行分析

(1)分析条件设置：根据分析后图像调节基线(Baseline)的start值和end值，可根据试验情况自动或手动调节阈值，一般情况下start值可变范围在1～10，end值可变范围在5～20。

(2)记录仪器自动分析计算出的样本Ct值。

(3)结果判读：

Ⅰ.检测无效：若内标检测为阴性，也就是内标的Ct值＞36.00，则说明该样本的检测无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。

Ⅱ.检测有效：阳性对照在FAM、VIC荧光通道荧光信号均有明显增长，呈典型的S型曲线，且Ct值均≤30.00；在CY5荧光通道荧光信号无明显增长，且无明显S型扩增曲线。

Ⅲ.当百日咳杆菌的荧光信号FAM通道的Ct值＞26.00时，按照如下进行结果判读：

当①内标检测为阳性，也就是Ct值≤36.00，②FAM荧光通道荧光信号有明显增长，呈典型的S型曲线，且Ct值≤36.00，③VIC无明显扩增曲线时；则说明待测样本为百日咳杆菌DNA，但未发生A2047G耐药突变。

当①内标检测为阳性，也就是Ct值≤36.00，②FAM和VIC荧光通道荧光信号有明显增长，呈典型的S型曲线，且Ct值≤36.00；则说明待测样本为百日咳杆菌DNA，且发生A2047G耐药突变。

当①内标检测为阳性，也就是Ct值≤36.00时，②FAM荧光通道Ct值＞36.00且无典型的S型曲线，则说明待测样本中不含百日咳杆菌的DNA。

Ⅳ.当FAM通道Ct值≤26.0时，按照如下进行结果判读：

当①内标检测为阳性，也就是Ct值≤36.00，②在FAM荧光通道荧光信号有明显增长，呈典型的S型曲线，且当FAM通道Ct≤26.00，在VIC荧光通道有较弱的扩增曲线，需要通过计算FAM与VIC的Ct差值ΔCt来区分百日咳杆菌是否发生突变阳性：

当ΔCt≤6时，则说明所述待测样本DNA为百日咳杆菌且发生A2047G耐药突变；

当ΔCt＞6时，则说明所述待测样本DNA为百日咳杆菌且未发生A2047G耐药突变。

Ⅴ.若需要定量检测，可通过5个浓度梯度的定量标准品的Ct值大小和5个浓度绘制标准曲线，将待测样本Ct值代入该标准曲线则可以的得到定量检测结果。

实施例4：本发明百日咳杆菌核酸及耐药突变位点检测方法和试剂盒的应用

1、特异性验证

按照实施例3的方法，对从ATCC购买的副百日咳鲍特菌、支气管炎鲍特菌、以及临床分离出的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、腺病毒3型、腺病毒7型、巨细胞病毒、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，鼻病毒，副流感病毒1型、副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒A型、肺炎支原体、干酪乳杆菌、大肠埃希氏菌、变形杆菌、福氏志贺氏菌灭活后，取50uL上述待测的病原体溶液和试剂盒阴、阳性对照，选用广东和信健康科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20150194号)提取核酸，使用实施例1所述的试剂盒进行检测，来验证本试剂盒能否只特异性检出百日咳杆菌。

结果如图1所示，图1为特异性试验中检测阳性对照百日咳杆菌和其他病原体的扩增曲线图，由图1可见，本交叉反应试验中，除阳性对照百日咳杆菌有扩增曲线，其他病原体菌无扩增曲线。图1结果说明本检测试剂盒特异性方面，与同种属，感染部位相同或感染症状相似的其他病原体，包括副百日咳鲍特菌、支气管炎鲍特菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、腺病毒3型、腺病毒7型、巨细胞病毒、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，鼻病毒，副流感病毒1型、副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒A型、肺炎支原体、干酪乳杆菌、大肠埃希氏菌、变形杆菌、福氏志贺氏菌均不会发生交叉反应。

2、灵敏度检测

将浓度为10

结果如图2和3所示，图2为不同梯度浓度的百日咳杆菌的灵敏度试验的结果；图3为不同梯度浓度的耐药百日咳杆菌的灵敏度试验的结果；由图2和图3的结果可见，本方法的最低检出限约为10CFU/μL，具有较高的灵敏度。

3、精密度(重复性)检测

将浓度为10

(1)提取10

(2)使用实施例3所述的方法对该浓度水平的样本进行20次重复检测。

(3)结果分析：检测结果进行变异系数(CV)的计算，CV(％)＝SD/MN*100％，(SD为标准偏差；MN为平均值)

结果如图4和图5，图4为10

4、模拟临床样本的检测，确定ΔCt的阳性判断值

发明人发现，高浓度的野生型百日咳杆菌的VIC通道的Ct值大于FAM通道的Ct值，即定义两荧光通道的Ct差值为ΔCt＝VIC-FAM。

将浓度为1.0×10

表2.使用第一批试剂盒模拟临床样本确定ΔCt的阳性判断值的检测结果

用SPSS软件对本实施例中的62个数据进行ROC曲线分析，以确定ΔCt的阳性判断值。ROC曲线分析以上统计结果表明，Youden指数最大所对应的Ct差值(ΔCt)为6.005，取整为6。

对上述待测样本重复检测62次的检测结果表明，当FAM通道的Ct≤26.0时，均满足两通道Ct差值＞6.0的结果，以此推论，当样本中的野生型百日咳杆菌浓度较高(Ct≤26.0)，且FAM与VIC的Ct差值ΔCt＞6时，可以判断为百日咳杆菌阳性且未发生突变，避免出现误判为耐药。

5、引物探针的优化实验

1)设计对照引物及对照探针；

2)根据百日咳杆菌基因的启动子靶区域不同位置设计的对比的引物探针如下：

上游引物序列：P-F1：5’-GCATGAACGCTCCTTCG-3’；

下游引物序列：P-R1：5’-ATCCCGTCTTCCCCTCTG-3’；

探针序列：P-P1：FAM-5’-CGTGCTGACCCCCCTGCCA-3’BHQ1。

将25例百日咳杆菌临床样本(测序结果为百日咳杆菌阳性)按照实施例2的方法进行检测，同时用实施例2中的检测百日咳杆菌的引物对和探针(BP-F4，BP-R4，BP-P2-FAM)进行平行实验，结果如图6，图6为本检测方法中的引物探针的优化实验结果图。由图6可见，25例百日咳杆菌临床样本中仅15例为百日咳杆菌阳性，表明对比引物探针的阳性检出率远远低于本发明的实施例2的阳性检出率。此外，按照实施例2的方法进行检测，同时用实施例2中的检测百日咳杆菌的引物对和探针(BP-F4，BP-R4，BP-P2-FAM)，进行平行实验，结果对比引物探针的检测灵敏度为100CFU/μL，也低于本发明的实施例2的10CFU/μL的灵敏度(见本实施例中的第2个实验：灵敏度检测实验)。以上表明，实施例2中优化的引物探针是本发明灵敏度的最优选择。

尽管以上所述仅为本发明的较佳实施方式，但本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，凡依本发明申请专利范围所做的变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。例如，使用Taqman技术以外的其他标记体系，如分子信标MB探针，MGB探针，荧光双杂交探针等荧光标记技术；或根据需要采用本发明实施示例之处的荧光集团和荧光淬灭基团之外的其他标记物质，如ROX，TET，HEX，JOE，TEXAS RED等标记物，以及使用染料嵌合法SYBR Green等不饱和染料及其他饱和dsDNA染料的高分辨熔解曲线法，此外，使用本发明所述的特异性引物探针序列，或与本发明涉及引物探针同源性超过75％均属于本发明保护范围内，因为本领域技术人员所了解的改变和惯用手段的替换均属于本发明保护范围内。

序列表

<110> 广东和信健康科技有限公司

<120>一种同时检测百日咳杆菌及其耐药突变位点的方法和试剂盒

<160> 9

<210> 1

<211> 24

<212> BP

<213> BP-F4

<400> 1

gtacaaaacc ctcgattatt cctt 24

<210> 1

<211> 22

<212> BP

<213> BP-R4

<400> 2

ggtgcctatt ttacggatca ca 22

<210> 1

<211> 23

<212> BP

<213> BP-P2-FAM

<400> 3

tcccgctact gcaatccaac acg 23

<210> 1

<211> 21

<212> MBP

<213> MBP-F4

<400> 4

atctaccrgc ggctagacgt g 21

<210> 1

<211> 19

<212> MBP

<213> MBP-R2

<400> 5

gatggctccc tcgaatctg 19

<210> 1

<211> 29

<212> MBP

<213> MBP-P2-VIC

<400> 6

accccatgaa cctttactgt agctttgca 29

<210> 1

<211> 23

<212> β-Globin

<213> β-Globin-F1

<400> 7

ggtttgaagt ccatctccta agc 23

<210> 1

<211> 22

<212> β-Globin

<213> β-Globin-R2

<400> 8

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<210> 1

<211> 25

<212> β-Globin

<213> β-Globin-CY5

<400> 9

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