核酸药物复合体以及其用途

发明领域

本揭露是关于一种核酸药物复合体，且特别是关于抗PD-L1适体的核酸药物复合体以及其用途。

发明背景

计划性死亡-1(programmed death-1，PD-1)为活化T细胞表现的共同刺激者，在免疫系统中进行负向调控(negative regulation)，可抑制T细胞的活化及增生。PD-L1为PD-1的配体(ligand)，PD-L1具有免疫抑制性，PD-L1会表现在一些非淋巴组织的血管内皮系统的抗原表现细胞上，例如树突细胞(dendritic cell，DC)、巨噬细胞(macrophage)以及B细胞上。再者，由于PD-L1亦表现于许多肿瘤细胞、基质细胞以及免疫细胞上，因此若将PD-1及PD-L1的结合阻断，可有效强化免疫反应且具有抗肿瘤的效果。以抗PD-1与抗PD-L1抗体调控的免疫检查点阻断疗法(checkpoint blockade immunotherapy)已应用于临床治疗。

另一方面，CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide，CpG ODN)为一系列具有强效免疫活化效果的脱氧核苷酸，可有效活化多种免疫细胞、引发免疫反应并有显著抗癌效果。然而，肿瘤内注射(intratumoral injection，IT)为目前安全且有效给予CpG寡脱氧核苷酸的给药方式，此情形使得CpG寡脱氧核苷酸可应用的适应症受到限制。

目前的免疫疗法常采用多种药物并用的方式进行，例如并用抗PD-L1抗体与CpG寡脱氧核苷酸，然而，药物并用可能产生许多潜在的风险，也会造成患者的负担。因此，发展出具有有效抗癌效果且可单独给药的免疫疗法仍为医药领域致力研究的课题之一。

发明内容

根据本揭露一些实施例，提供一种核酸药物复合体，其包含抗PD-L1适体的核酸序列以及可活化TLR-9的CpG寡核苷酸序列，抗PD-L1适体结合至PD-L1，CpG寡核苷酸序列结合至TLR9受体。CpG寡核苷酸序列由第一片段以及第二片段所组成，且抗PD-L1适体的核酸序列插入于第一片段以及第二片段之间。

根据本揭露一些实施例，提供一种前述之核酸药物复合体的用途，其系用于制备治疗癌症的药物。

根据本揭露一些实施例，提供一种医药组合物，包含前述之核酸药物复合体以及医药上可接受之载体。

为让本揭露之特征、或优点能更明显易懂，下文特举出较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。

附图简述

第1A图显示根据本揭露一些实施例中，使用流式细胞仪对样品unstained(负控制组)、AptPDL1-n05、AptPDL1-n07、AptPDL1-1A、AptPDL1-2A及AptPDL1-3A进行PD-L1结合亲和性的分析结果；

第1B图显示根据本揭露一些实施例中，使用流式细胞仪对样品AptPDL1-A4、AptPDL1-45mer(PBS*)、AptPDL1-45mer(SELEX)(正控制组)、AptPDL1-45mer(SELEX，600nM)(正控制组)及CpG-L0-PS进行PD-L1结合亲和性的分析结果；

第2图显示根据本揭露一些实施例中，第1A图及第1B图使用流式细胞仪检测的实验结果的量化数据；

第3图显示根据本揭露一些实施例中，使用ELISA技术对样品cell only(负控制组)、45mer、n05、n07、1A、2A、3A及A4进行PD-L1结合亲和性的分析结果；

第4图显示根据本揭露一些实施例中，使用HEK293小鼠TLR9报导系统对样品CpG-L0-PS、ApDC5-PS、ApDC5-7PS、PDL1-CpG30-PS、PDL1-CpG29-9PS及ApDC-A21B进行TLR9活化能力的分析结果；

第5图显示根据本揭露一些实施例中，使用HEK293小鼠TLR9报导系统对样品CpG-L0-PS、ApDC5-PS、ApDC-A21B、ApDC-A21A、ApDC-B21B及ApDC-A33B进行TLR9活化能力的分析结果；

第6A图至第6D图显示根据本揭露一些实施例中，核酸药物复合体的二级结构示意图；

第7图显示根据本揭露一些实施例中，使用4T1鼠乳腺癌同源肿瘤模型，分析施用样品Vehicle(负控制组)、PDL1 mAb、AptPDL1+CpG及ApDC5-PS对小鼠的肿瘤体积及存活率的影响；

第8图显示根据本揭露一些实施例中，使用4T1鼠乳腺癌同源肿瘤模型，分析施用样品CpG-L0-PS及ApDC-A21B对小鼠的肿瘤体积的影响。

实施方式

以下针对本揭露实施例的核酸药物复合体作详细说明。应了解的是，以下之叙述提供许多不同的实施例或例子，用以实施本揭露一些实施例之不同样态。以下所述特定的组件及排列方式仅为简单清楚描述本揭露一些实施例。当然，这些仅用以举例而非本揭露之限定。

除非另外定义，于本文中使用的全部用语(包含技术及科学用语)具有与本揭露所属技术领域的技术人员通常理解的相同涵义。能理解的是，这些用语例如在通常使用的字典中定义用语，应被解读成具有与相关技术及本揭露的背景或上下文一致的意思，而不应以一理想化或过度正式的方式解读。为了使本揭露的内容更容易理解，提供以下术语及用词的定义。

术语「寡核苷酸」、「聚核苷酸」、「核酸」及「核酸分子」在本文中可交替使用，指的是具有任意长度的核苷酸聚合物，可包含单股DNA(ssDNA)、双股DNA(dsDNA)、单股RNA(ssRNA)及双股RNA(dsRNA)。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸。核苷由嘌呤(腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)或其衍生物)或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)或其衍生物)碱基与糖键结组成。DNA中的四种核苷单元(或碱基)称为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷及脱氧胞苷。RNA中的四种核苷单元(或碱基)称为腺苷、鸟苷、尿苷及胞苷。核苷酸为核苷之磷酸酯。

术语「CpG」及「CG」在本文中可交替使用，指的是由磷酸二酯键分隔开的胞嘧啶及鸟嘌呤。根据本揭露实施例，寡核苷酸可包含一或多个未经甲基化的CpG二核苷酸。根据本揭露一些实施例，寡核苷酸为寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)。

术语「计划性死亡配体-1」，亦称为「PD-L1」、「表面抗原分化丛274(cluster ofdifferentiation 274，CD274)」或「B7同源体-1(B7 homolog-1，B7-H1)」，指的是于人类中由CD274基因编码的蛋白质。人类PD-L1为40kDa 1型跨膜蛋白，其主要作用于抑制免疫系统。PD-L1结合于经活化的T细胞、B细胞及骨髓细胞上的受体PD-1以调节活化或抑制。PD-L1亦对共刺激性分子CD80(B7-1)具有显著亲和力。PD-L1与T细胞上的受体PD-1结合可传递一种讯号，所述讯号可抑制T细胞受体调控的IL-2产生及T细胞增殖的活化。PD-L1可视为检查点(checkpoint)，且其在肿瘤中的上升表现有助于抑制T细胞调控的抗肿瘤反应。根据本揭露实施例，PD-L1可为源自哺乳类动物的PD-L1，例如，可为源自人类的PD-L1。

术语「癌症」指的是哺乳动物中细胞群体由不受调控的细胞生长表征的生理学病状。术语「肿瘤」指的是任何由过度细胞生长或增殖产生的组织块状物，包含良性(非癌性)或恶性(癌性)肿瘤，包含癌前病灶。

术语「免疫反应」包含来自先天性免疫系统及后天性免疫系统的反应，其包含细胞调控的免疫反应或体液免疫反应。免疫反应包含T细胞及B细胞反应，以及来自免疫系统的其他细胞例如自然杀手(natural killer，NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞等的反应。

再者，术语「治疗」指的是使经诊断的病理性病状或病症治愈、减缓、症状减轻及/或进程停止的治疗性措施，以及预防及/或减缓目标病理性病状或病症的发展的预防性措施。因此，需要治疗的个体可包含已经患有病症者、易患有病症者以及待预防病症者。根据本揭露实施例，若具有癌症或肿瘤的患者显示以下情况中的一或多者，则代表个体被成功地治疗：免疫反应增加、抗肿瘤反应增加、免疫细胞的细胞溶解活性增加、免疫细胞的肿瘤细胞杀伤增加、癌细胞数目减少或完全不存在；肿瘤尺寸减小；抑制或不存在癌细胞浸润至周边器官中；抑制或不存在肿瘤或癌细胞转移；抑制或不存在癌症生长；缓解一或多种与具体癌症相关的症状；降低致病率及死亡率；改良生活质量；降低致瘤性；或降低癌症干细胞的数目或出现频率等。

根据本揭露一些实施例，提供一种核酸药物复合体，其包含结合至PD-L1的抗PD-L1适体(aptamer)的核酸序列以及结合至TLR9(Toll-like receptor 9)受体的CpG寡核苷酸序列，且抗PD-L1适体的核酸序列插入于CpG寡核苷酸序列的第一片段以及第二片段之间。本揭露实施例提供的新型态核酸药物复合体结合可活化TLR-9的CpG寡核苷酸序列与抗PD-L1适体，其具有肿瘤标靶性以及多重免疫调节活性，可透过静脉内注射进行全身性给药，并且可单独给药，取代多药物并用的免疫疗法。

根据一些实施例，抗PD-L1适体的核酸序列与序列辨识号：1至9之任一者所示的序列具有至少85％的相似度，例如可具有，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相似度，但不限于此。根据一些实施例，抗PD-L1适体由序列辨识号：1至9之任一者所示之核酸序列所组成。根据一些实施例，抗PD-L1适体的核酸序列中的核苷酸会配对产生特定的二级结构，抗PD-L1适体可藉由此种二级结构与PD-L1结合，阻断PD-1及PD-L1的结合位，藉此可维持或强化抗肿瘤的免疫反应。

根据一些实施例，核酸药物复合体包含前述之抗PD-L1适体的核酸序列以及CpG寡核苷酸序列，CpG寡核苷酸序列可结合至TLR9受体，CpG寡核苷酸序列可强烈活化TLR9，促使干扰素(interferon)的产生，诱发抗肿瘤或抗病毒等免疫反应。根据一些实施例，CpG寡核苷酸为寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)。根据一些实施例，CpG寡核苷酸序列与序列辨识号：10至23之任一者所示之核酸序列可具有至少85％的相似度，例如可具有，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相似度，但不限于此。根据一些实施例，CpG寡核苷酸序列可由第一片段以及第二片段所组成。根据一些实施例，CpG寡核苷酸序列之第一片段以及第二片段为择自由序列辨识号：10至23之任一者所示之核酸序列。

换言之，根据一些实施例，由CpG寡核苷酸序列之第一片段以及第二片段所共同构成的序列与序列辨识号：10至23之任一者所示之核酸序列可具有至少85％的相似度，例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相似度，但不限于此。根据一些实施例，CpG寡核苷酸序列之第一片段以及第二片段共同构成了序列辨识号：10至23之任一者所示的核酸序列，亦即，CpG寡核苷酸序列为序列辨识号：10至23之任一者所示的核酸序列。

值得注意的是，根据本揭露实施例，抗PD-L1适体的核酸序列插入于CpG寡核苷酸序列的第一片段以及第二片段之间，使得核酸药物复合体可同时具有肿瘤标靶性以及多重免疫调节活性。根据一些实施例，抗PD-L1适体的核酸序列以及CpG寡核苷酸序列可透过连接符(linker)进行连接。根据一些实施例，抗PD-L1适体的核酸序列以及CpG寡核苷酸序列亦可不需额外设计连接符进行连接。

根据一些实施例，CpG寡核苷酸序列之第一片段的长度与CpG寡核苷酸序列之第二片段的长度的比例为约1:15至15:1，或约1:10至10:1，例如，CpG寡核苷酸序列之第一片段的长度与CpG寡核苷酸序列之第二片段的长度的比例可为约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1或2:1，但不限于此。根据一些实施例，CpG寡核苷酸序列的长度(亦即，由第一片段的长度以及第二片段的长度所相加的总长度)范围约为15个核苷酸至40个核苷酸，或约20个核苷酸至35个核苷酸，或约20个核苷酸至30个核苷酸，例如可为约，21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸，但不限于此。

此外，根据一些实施例，CpG寡核苷酸序列可包含一或多个未经甲基化的CpG基序(motif)。根据一些实施例，CpG寡核苷酸序列中的CpG基序可有85％至100％为未经甲基化，例如，可有约88％、90％、92％、95％、98％等为未经甲基化，但不限于此。根据一些实施例，CpG寡核苷酸序列中的CpG基序可全部皆为未经甲基化。此外，根据一些实施例，CpG寡核苷酸序列包含经修饰的磷酸二酯键(phosphodiester bond)，例如硫代磷酸酯键(phosphorothioate bond)，藉此可降低核酸药物复合体被生物体内的酵素降解的风险，提升核酸药物复合体的稳定性。根据一些实施例，硫代磷酸酯键的数量可占CpG寡核苷酸序列的磷酸二酯键的数量约70％至100％，或约80％至100％，例如可为，85％、90％或95％，但不限于此。根据一些实施例，CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均可被修饰为硫代磷酸酯键。根据一些实施例，CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均可被修饰为硫代磷酸酯键。

根据一些实施例，核酸药物复合体的核酸序列与序列辨识号：29至34之任一者所示的序列具有至少85％的相似度，例如可具有86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相似度，但不限于此。根据一些实施例，核酸药物复合体系由序列辨识号：29至34之任一者所示之核酸序列所组成。

详细而言，序列辨识号：29的核酸序列是由序列辨识号：1的抗PD-L1适体以及序列辨识号：10的CpG寡核苷酸序列组合而成，序列辨识号：1的核酸序列可插入于序列辨识号：10的核酸序列之间，将序列辨识号：10分为具有15个核苷酸的第一片段以及具有15个核苷酸的第二片段，且序列辨识号：10的CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均可被修饰为硫代磷酸酯键。

序列辨识号：30的核酸序列是由序列辨识号：2的抗PD-L1适体以及与序列辨识号：10的CpG寡核苷酸序列具有96％相似度的序列(5端添加2个T，3端的第二个A改为T)组合而成，序列辨识号：2的核酸序列可插入于与序列辨识号：10的CpG寡核苷酸序列具有96％相似度的序列之间，将此序列分为具有17个核苷酸的第一片段以及具有15个核苷酸的第二片段，且此序列中仅位于5端及3端的两个磷酸二酯键可被修饰为硫代磷酸酯键。

序列辨识号：31的核酸序列是由序列辨识号：3的抗PD-L1适体以及序列辨识号：10的CpG寡核苷酸序列组合而成，序列辨识号：3的核酸序列可插入于序列辨识号：10的核酸序列之间，将序列辨识号：10分为具有15个核苷酸的第一片段以及具有15个核苷酸的第二片段，且序列辨识号：10的CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均可被修饰为硫代磷酸酯键。

序列辨识号：32的核酸序列是由序列辨识号：3的抗PD-L1适体以及序列辨识号：22的CpG寡核苷酸序列组合而成，序列辨识号：3的核酸序列可插入于序列辨识号：22的核酸序列之间，将序列辨识号：22分为具有15个核苷酸的第一片段以及具有15个核苷酸的第二片段，且序列辨识号：22的CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均可被修饰为硫代磷酸酯键。

序列辨识号：33的核酸序列是由序列辨识号：3的抗PD-L1适体以及序列辨识号：23的CpG寡核苷酸序列组合而成，序列辨识号：3的核酸序列可插入于序列辨识号：23的核酸序列之间，将序列辨识号：23分为具有15个核苷酸的第一片段以及具有15个核苷酸的第二片段，且序列辨识号：23的CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均可被修饰为硫代磷酸酯键。

序列辨识号：34的核酸序列是由序列辨识号：7的抗PD-L1适体以及序列辨识号：10的CpG寡核苷酸序列组合而成，序列辨识号：7的核酸序列可插入于序列辨识号：10的核酸序列之间，将序列辨识号：10分为具有15个核苷酸的第一片段以及具有15个核苷酸的第二片段，且序列辨识号：10的CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均可被修饰为硫代磷酸酯键。

再者，根据一些实施例，前述之核酸药物复合体可用于制备治疗癌症的药物。此外，根据一些实施例，提供一种医药组合物，其包含前述之核酸药物复合体以及医药上可接受之载体，此医药组合物可用于治疗癌症。例如，根据一些实施例，可将有效量之前述包含核酸药物复合体的医药组合物施用于需要的个体。根据一些实施例，个体可包含哺乳类动物，例如，小鼠、大鼠、天竺鼠、兔子、狗、猫、猴子、猩猩或人类等，但不限于此。根据一些实施例，所述个体可为人类。根据一些实施例，医药组合物可藉由静脉内(intravenous)注射、肿瘤内注射(intratumoral)与皮下注射(subcutaneous)进行给药，但不限于此。根据一些实施例，所述医药组合物可藉由静脉内(intravenous)注射进行给药。

根据一些实施例，前述癌症可包含结肠癌、乳癌、肺癌、胰脏癌、肝癌、胃癌、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、膀胱癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、血癌、大肠癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、子宫颈癌或神经胶质瘤，但不限于此。

根据一些实施例，医药组合物可呈现溶液或悬浮液形式。或者，医药组合物可为脱水固体(例如冷冻干燥或喷雾干燥的固体)。根据一些实施例，医药组合物可为无菌且对个体无毒性的。再者，根据一些实施例，前述医药上可接受之载体可包含赋形剂、增溶剂、缓冲剂、稳定剂或防腐剂，但不限于此。

例如，赋形剂可包含溶剂，根据一些实施例，医药组合物可包含水性媒剂作为溶剂。水性媒剂例如可包含无菌水、盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水或林格氏溶液(Ringer'ssolution)，但不限于此。根据一些实施例，增溶剂为帮助在冷冻或喷雾干燥期间及/或在储存期间稳定核酸药物复合体且防止其降解之保护剂。增溶剂例如可包含糖(单醣、双醣及多醣)，例如蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇或葡萄糖，但不限于此。再者，根据一些实施例，缓冲剂可控制pH值以防止核酸药物复合体在加工、储存等期间发生降解。缓冲液例如可包含盐类，例如乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或硫酸盐，但不限于此。缓冲液例如亦可包含胺基酸，例如精胺酸、甘胺酸、组胺酸或离胺酸，但不限于此。根据一些实施例，稳定剂例如可包含右旋糖、甘油、氯化钠、甘油或甘露糖醇，但不限于此。根据一些实施例，防腐剂例如可包含抗氧化剂或抗微生物剂，但不限于此。

此外，根据本揭露一些实施例，提供一种套组，其包含前述医药组合物以及记载使用方法的说明书。包含医药组合物的套组系经适当包装。根据一些实施例，套组可进一步包含用于施用医药组合物的装置(例如，注射器及针头、喷雾器、或干燥粉末吸入装置等)。

为了让本揭露之上述及其它目的、特征、及优点能更明显易懂，下文特举数实施例以及比较例，作详细说明如下，然其并非用以限定本揭露之内容。

实施例

实施例1：体外的(in vitro)PD-L1结合亲和性测试-流式细胞仪分析

使用胰蛋白酶(trypsin)收集表达老鼠PD-L1(mPD-L1)的CT-26细胞以及表达人类PD-L1(hPD-L1)的CHO-K1细胞，沉淀、洗涤并重新悬浮约2×10

流式细胞仪的分析结果如第1A图及第1B图所示，图中的样品unstained代表未经染色的细胞，可作为负控制组(negative control)；图中的样品AptPDL1-n05、AptPDL1-n07、AptPDL1-1A、AptPDL1-2A、AptPDL1-3A及AptPDL1-A4分别代表序列辨识号：4、5、6、7、8及9所示之抗PD-L1适体，它们的浓度均为100nM；样品AptPDL1-45mer(PBS*)代表序列辨识号：24所示之抗PD-L1适体，其并未被配制于细胞染色缓冲液中，而是被配制于经调整的PBS缓冲液(含有钙离子及镁离子的DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)，添加1.33mM的KCl)中，浓度为100nM，并且，AptPDL1-45mer系作为已知的对照序列；样品AptPDL1-45mer(SELEX)代表藉由SELEX技术筛选得到的序列辨识号：24所示之抗PD-L1适体，浓度为100nM，可作为正控制组(positive control)；样品AptPDL1-45mer(SELEX，600nM)代表藉由SELEX技术筛选得到的序列辨识号：24所示之抗PD-L1适体，可作为正控制组(positive control)；样品CpG-L0-PS代表不与PD-L1亲和之核酸序列，可作为负控制组。

如第1A图及第1B图所示，样品AptPDL1-n05、AptPDL1-n07、AptPDL1-1A、AptPDL1-2A、AptPDL1-3A、AptPDL1-A4及AptPDL1-45mer(PBS*、SELEX、600nM)均显示往右偏移的波峰，表示它们对于PD-L1均具有结合亲和性。

请参照第2图，第2图显示第1A图及第1B图的流式细胞仪的实验结果的量化数据，如第2图所示，相较于CpG-L0-PS(序列辨识号：10)，样品AptPDL1-n05(序列辨识号：4)、AptPDL1-n07(序列辨识号：5)、AptPDL1-1A(序列辨识号：6)、AptPDL1-2A(序列辨识号：7)、AptPDL1-3A(序列辨识号：8)、AptPDL1-A4(序列辨识号：9)及AptPDL1-45mer(PBS*、SELEX、600nM)(序列辨识号：24)几乎均显示提升的PD-L1结合亲和性。

实施例2：体外的PD-L1结合亲和性测试-细胞结合分析

将表达PD-L1的MDA-MB-231细胞以1×10

ELISA的分析结果如第3图所示，图中的样品cell only代表未表达PD-L1的细胞，可作为负控制组；图中的样品45mer、n05、n07、1A、2A、3A及A4分别代表序列辨识号：24、4、5、6、7、8及9所示之抗PD-L1适体，样品的浓度均为700nm，均配制于经调整的PBS缓冲液(含有钙离子及镁离子的DPBS，添加1.33mM的KCl)中。

如第3图所示，样品45mer(AptPDL1-45mer，序列辨识号：24)、n07(AptPDL1-n07，序列辨识号：5)、1A(AptPDL1-1A，序列辨识号：6)、2A(AptPDL1-2A，序列辨识号：7)、3A(AptPDL1-3A，序列辨识号：8)及A4(AptPDL1-A4，序列辨识号：9)均具有高荧光强度，对于PD-L1具有结合亲和性。

实施例3：核酸药物复合体的TLR9的活化能力分析-HEK293小鼠TLR9报导系统

将表达小鼠TLR9的HEK-Blue细胞(InvivoGen)培养于完整的DMEM(Dulbecco'smodified Eagle's medium)培养基中，DMEM中补充有100μg/ml的Normocin、30μg/ml的Blasticidin及100μg/ml的Zeocin(均为InvivoGen)。HEK-Blue细胞包含分泌型的胎盘碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase，SEAP)报导系统，此系统与TLR9作用后产生色度变化(colorimetric change)。

HEK-Blue检测混合物(用于SEAP侦测的细胞培养基，InvivoGen)用于检测SEAP的存在，SEAP与藉由NF-κB活化的TLR9讯号传导相关。检测混合物包含用于细胞生长的营养物质及颜色基底，当被SEAP水解时会产生颜色变化。当表达小鼠TLR9的HEK 293细胞(InvivoGen)达到60-80％的汇集(confluency)时，将其收集，离心并重新悬浮于检测混合物中。将细胞(72 000)接种至96孔盘(180μl)的每个孔中。接着，将细胞与20μl的PBS(未刺激；作为负控制组)、CpG-L0-PS(作为正控制组)或于PBS中的不同浓度的核酸药物复合体样品于二重复(duplicate)的孔中组合处理，并在37℃下于5％CO

对TLR9活化能力的分析结果如第4图所示，图中的样品CpG-L0-PS对应于序列辨识号：10(未连接抗PD-L1适体)，且CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均被修饰为硫代磷酸酯键；样品ApDC5-PS对应于序列辨识号：25，其表示CpG寡核苷酸序列连接在抗PD-L1适体序列的5端的态样，且CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均被修饰为硫代磷酸酯键，其具有例如第6B图所示的构型(其中A及B示意地表示CpG寡核苷酸序列的第一片段及第二片段的位置，以方便理解抗PD-L1适体与CpG寡核苷酸序列的位置关系)；样品ApDC5-7PS对应于序列辨识号：26，其表示CpG寡核苷酸序列连接在抗PD-L1适体序列的5端的态样，且CpG寡核苷酸序列中仅部分的磷酸二酯键被修饰为硫代磷酸酯键，其具有例如第6D图所示的构型；样品PDL1-CpG30-PS对应于序列辨识号：27，其表示CpG寡核苷酸序列连接在抗PD-L1适体序列的3端的态样，且CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均被修饰为硫代磷酸酯键，其具有例如第6C图所示的构型；样品PDL1-CpG29-9PS对应于序列辨识号：28，其表示CpG寡核苷酸序列连接在抗PD-L1适体序列的3端的态样，且CpG寡核苷酸序列中仅部分的磷酸二酯键被修饰为硫代磷酸酯键，其具有例如第6D图所示的构型；样品ApDC-A21B对应于序列辨识号：31，其表示抗PD-L1适体序列插入于CpG寡核苷酸序列中的态样，且CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均被修饰为硫代磷酸酯键，其具有例如第6A图所示的构型。

根据第4图的结果，可得到样品CpG-L0-PS(序列辨识号：10)的EC

由此可知，相较于CpG寡核苷酸序列连接在抗PD-L1适体序列的5端或3端的态样，抗PD-L1适体序列插入于CpG寡核苷酸序列中的核酸药物复合体具有较佳的TLR9活化能力。此外，CpG寡核苷酸序列中仅部分的磷酸二酯键被修饰为硫代磷酸酯键的态样容易形成互补的双股结构，此种态样的核酸药物复合体的TLR9活化能力会降低。

接着，请参照第5图，第5图显示另一实施例中核酸药物复合体对TLR9活化能力的分析结果，其实验内容与第4图大致相同。第5图中的样品CpG-L0-PS对应于序列辨识号：10(未连接抗PD-L1适体)，且CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均被修饰为硫代磷酸酯键；样品ApDC5-PS对应于序列辨识号：25，其表示CpG寡核苷酸序列连接在抗PD-L1适体序列的5端的态样，且CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均被修饰为硫代磷酸酯键，其具有例如第6B图所示的构型；样品ApDC-A21B对应于序列辨识号：31，其表示抗PD-L1适体序列插入于CpG寡核苷酸序列中的态样，且CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均被修饰为硫代磷酸酯键，其具有例如第6A图所示的构型；样品ApDC-A21A对应于序列辨识号：32，其表示抗PD-L1适体序列插入于CpG寡核苷酸序列中的态样，且CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均被修饰为硫代磷酸酯键，其具有类似第6A图所示的构型，但片段A及片段B的序列相同；样品ApDC-B21B对应于序列辨识号：33，其表示抗PD-L1适体序列插入于CpG寡核苷酸序列中的态样，且CpG寡核苷酸序列中的所有磷酸二酯键均被修饰为硫代磷酸酯键，其具有类似第6A图所示的构型，但片段A及片段B的序列相同；样品ApDC-A33B对应于序列辨识号：30，其表示抗PD-L1适体序列插入于CpG寡核苷酸序列中的态样，且寡核苷酸序列中仅部分的磷酸二酯键被修饰为硫代磷酸酯键。

根据第5图的结果，可得到样品CpG-L0-PS(序列辨识号：10)的EC

相较于样品ApDC5-PS(序列辨识号：25)，抗PD-L1适体序列插入于CpG寡核苷酸序列中的样品ApDC-A21B(序列辨识号：31)、ApDC-A21A(序列辨识号：32)及ApDC-B21B(序列辨识号：33)具有较低的EC

实施例4：核酸药物复合体于动物模型体内的(in vivo)抗肿瘤功效分析

使用4T1鼠乳腺癌同源肿瘤模型(syngeneic tumor model)进行体内抗肿瘤疗效研究。将4T1(5x10

根据第7图显示的结果，经样品ApDC5-PS(序列辨识号：25)处理的肿瘤体积明显较低，其抗肿瘤功效比并用CpG寡核苷酸以及抗PD-L1适体(AptPDL1+CpG)的态样好，也比单独注射抗小鼠PD-L1抗体(PDL1 mAb)的态样好。并且，注射样品ApDC5-PS的小鼠存活率亦明显提升，于肿瘤细胞接种后的25天后仍有100％的存活率。

再者，第8图显示于另一实施例中核酸药物复合体的抗肿瘤功效分析结果，其实验内容与第7图大致相同。第8图中的样品CpG-L0-PS对应于序列辨识号：10(未连接抗PD-L1适体)；样品ApDC-A21B对应于序列辨识号：31，其为抗PD-L1适体序列插入于CpG寡核苷酸序列中的态样。如第8图所示，相较于样品CpG-L0-PS，样品ApDC-A21B具有较佳的抗肿瘤功效，具有改善的药效。

承前述，本揭露实施例提供的新型态核酸药物复合体结合CpG寡核苷酸序列与抗PD-L1适体，其具有肿瘤标靶与免疫检查点阻断活性，可增加核酸药物复合体于肿瘤的累积与肿瘤微环境的免疫细胞毒杀效果，并且具有刺激多种免疫细胞活化的能力，可增加肿瘤微环境的免疫细胞活化与聚集。此外，本揭露实施例提供的核酸药物复合体具有比单纯混用CpG寡核苷酸以及抗PD-L1适体更佳的抗肿瘤药效。

虽然本揭露的实施例及其优点已揭露如上，但应该了解的是，任何所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本揭露之精神和范围内，当可作更动、替代与润饰。再者，每一申请专利范围构成个别的实施例，且本揭露之保护范围也包括各个申请专利范围及实施例的组合。本揭露之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。

序列表

<110> 财团法人工业技术研究院

<120> 核酸药物复合体以及其用途

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体

<400> 1

cacatcaact cattgataga caatgcgtcc 30

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体

<400> 2

ccacatcaac tcattgatag acaatgcgtc caccg 35

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体

<400> 3

actcattgat agacaatgcg t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体

<400> 4

agcgattgat agacaatcgc t 21

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体

<400> 5

atgaactcat tcatacacaa tgcgtg 26

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体

<400> 6

gttgtttttt cactcattga tagacaatgc gt 32

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体

<400> 7

agttatgctt tccccctctt tgatagacaa 30

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体

<400> 8

gaacaaaggt attagacatc ttgatagaca a 31

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体

<400> 9

actcattgat agacaatgcg tgcccgcagc 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG序列

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(29)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 10

tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaat 30

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(19)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 11

tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人类

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(23)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 12

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(2)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (15)..(19)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 13

ggggtcaacg ttgagggggg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(19)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 14

tccatgacgt tcctgatgct 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> Bovine

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(21)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 15

tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人类

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(22)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 16

tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人类

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(21)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 17

tgactgtgaa cgttcgagat ga 22

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> multi-species

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(25)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 18

tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 26

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> multi-species

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(28)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 19

tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcgg 29

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人类

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(20)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 20

tcgtcgaacg ttcgagatga t 21

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人类

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(24)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 21

tcgaacgttc gaacgttcga acgtt 25

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG序列

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(29)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 22

tcgaacgttc gaacgtcgaa cgttcgaacg 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG序列

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(29)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 23

ttcgaacgtt cgaatttcga acgttcgaat 30

<210> 24

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体

<400> 24

acgggccaca tcaactcatt gatagacaat gcgtccactg cccgt 45

<210> 25

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体-CpG序列

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(29)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 25

tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaat cacatcaact cattgataga caatgcgtcc 60

<210> 26

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体-CpG序列

<220>

<221> misc_difference

<222> (2)..(2)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (6)..(6)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (10)..(10)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (14)..(14)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (18)..(18)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (22)..(22)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (26)..(26)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 26

tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaat cacatcaact cattgataga caatgcgtcc 60

<210> 27

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体-CpG序列

<220>

<221> misc_difference

<222> (31)..(59)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 27

cacatcaact cattgataga caatgcgtcc tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaat 60

<210> 28

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体-CpG序列

<220>

<221> misc_difference

<222> (33)..(33)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (37)..(37)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (41)..(41)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (45)..(45)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (49)..(49)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (53)..(53)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (57)..(59)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 28

cacatcaact cattgataga caatgcgtcc ttcgaacgtt cgaacgttcg aacgttcgaa 60

<210> 29

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体-CpG序列

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(14)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (46)..(59)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 29

tcgaacgttc gaacgcacat caactcattg atagacaatg cgtccttcga acgttcgaat 60

<210> 30

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体-CpG序列

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(2)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (66)..(66)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 30

tttcgaacgt tcgaacgcca catcaactca ttgatagaca atgcgtccac cgttcgaacg 60

ttcgatt 67

<210> 31

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体-CpG序列

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(14)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (37)..(50)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 31

tcgaacgttc gaacgactca ttgatagaca atgcgtttcg aacgttcgaa t 51

<210> 32

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体-CpG序列

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(14)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (37)..(50)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 32

tcgaacgttc gaacgactca ttgatagaca atgcgttcga acgttcgaac g 51

<210> 33

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体-CpG序列

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(13)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (36)..(49)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 33

tcgaacgttc gaatactcat tgatagacaa tgcgtttcga acgttcgaat 50

<210> 34

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗PD-L1适体-CpG序列

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)..(14)

<223> 硫代磷酸酯键

<220>

<221> misc_difference

<222> (46)..(59)

<223> 硫代磷酸酯键

<400> 34

tcgaacgttc gaacgagtta tgctttcccc ctctttgata gacaattcga acgttcgaat 60