一种靶向敲减Rip3基因表达的shRNA、重组载体及其应用

技术领域

本发明属于肝脏疾病治疗研究技术领域，尤其涉及一种靶向敲减Rip3基因表达的shRNA、重组载体及其应用。

背景技术

急性肝损伤可由肝细胞变性和细胞死亡所致。细胞死亡可由不同的方式介导，包括凋亡、自噬、坏死、程序性坏死、焦亡、铁死亡和角质形成。因此，控制肝细胞死亡是治疗或者预防肝脏疾病的有效措施。程序性坏死(necroptosis)是一种由死亡信号介导的caspases非依赖性的细胞死亡模式，是一个高度调控过程。

肝脏作为人体重要的解毒与消化器官，易暴露于损伤因素中。因其含有丰富的内质网(ER)，在受到刺激时易产生内质网应激(ERS)来促进细胞内环境恢复平衡。ERS被认为参与急性和慢性肝病的发病机制，如各种肝炎、脂肪变性、胆汁淤积、纤维化和肝细胞癌。ERS可通过影响细胞凋亡及程序性坏死与肝损伤密切相关。

调节Rip3基因表达有利于研究Rip3信号在肝损伤中的作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向敲减Rip3基因表达的shRNA、重组载体及其应用；本发明提供的shRNA构建重组载体后能够敲减Rip3基因的表达，适用于肝内内质网应激相关的小鼠模型研究中，利于进一步了解Rip3基因表达在肝损伤中的作用；从而为临床防治肝脏疾病提供新思路和靶点。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种靶向敲减Rip3基因表达的shRNA，所述shRNA靶向的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了一种靶向敲减Rip3基因表达的重组载体，包括骨架载体pAAV8和上述技术方案所述的shRNA。

本发明提供了上述技术方案所述的shRNA或上述技术方案所述的重组载体在制备肝损伤的动物模型中的应用。

优选的，所述动物包括小鼠。

优选的，所述肝损伤包括由肝内内质网应激相关的肝损伤。

优选的，将所述靶向敲减Rip3基因表达的重组载体导入动物体内。

优选的，所述靶向敲减Rip3基因表达的重组载体共导入2次，间隔时间为45～55h。

优选的，所述靶向敲减Rip3基因表达的重组载体每次导入的量为0.5～1.5×10

本发明的有益效果：本发明提供的靶向敲减Rip3基因表达的shRNA以及重组载体，能够应用于肝损伤模型小鼠的肝内内质网应激相关研究中，从而为临床防治肝脏疾病提供新思路和靶点。本发明所述shRNA(短发夹RNA)能够与相应的mRNA结合，由特异的核酸酶结合并降解mRNA，从而实现编码Rip3基因的表达敲低。在本发明实施例中，予Rip3 shRNA预干预后，成功敲低Rip3基因的表达，通过Rip3基因敲减能减轻CCL

附图说明

图1为本发明提供的重组载体的结构示意图；

图2为对重组载体中插入的shRNA序列进行测序比对鉴定结果；

图3为靶向敲减Rip3 shRNA小鼠血清中ALT水平变化；

图4为靶向敲减Rip3shRNA小鼠血清中TBil水平变化；

图5为靶向敲减Rip3 shRNA小鼠肝脏组织的HE染色图；

图6为小鼠肝组织坏死面积的统计结果；

图7为通过免疫印迹法检测靶向敲减Rip3 shRNA小鼠肝脏中RIP3、p-RIP3和p-MLKL蛋白的表达；

图8为通过免疫印迹法检测靶向敲减Rip3 shRNA小鼠肝脏中、Casepase-12和CHOP蛋白的表达。

具体实施方式

本发明提供了一种靶向敲减Rip3基因表达的shRNA，所述shRNA靶向的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：5’-GGACCCAGAGCTGTTATTTGA-3’。

在本发明中，所述shRNA的核苷酸序列优选如SEQ ID No.2所示：3’-CCTGGGTCTCGACAATAAACT-5’。

在本发明中，所述shRNA(短发夹RNA)能够与相应的mRNA结合，由特异的核酸酶结合并降解mRNA，从而实现编码Rip3基因的表达敲低。

本发明还提供了一种靶向敲减Rip3基因表达的重组载体，包括骨架载体pAAV8和上述技术方案所述shRNA。在本发明中，所述骨架载体的类型优选包括沉默腺相关病毒，进一步优选为pAAV8或携带绿色荧光的腺相关病毒(AAV)载体。本发明实施例所述pAAV8骨架载体优选为AAV-U6-shRNA-CAG-EGFP，购自北京合生基因科技有限公司。

本发明还提供了上述技术方案所述的shRNA、上述技术方案所述的重组载体在制备肝内内质网应激的小鼠模型中的应用。

在本发明中，优选的将所述靶向敲减Rip3基因表达的shRNA或重组载体导入动物体内。在本发明中，所述动物优选包括小鼠。在本发明中，所述靶向敲减RIP3蛋白的重组载体优选的共导入2次，间隔时间优选为45～55h，更优选为48h。在本发明中，所述靶向敲减RIP3蛋白的重组载体每一次导入的用量优选为0.5～1.5×10

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.质粒结构图谱如图1所示。由北京合生基因科技有限公司完成该质粒的构建：

1.1 RNA靶点设计：针对目的基因序列(Rip3基因，gene ID：56532)，遵循RNAi靶点设计原则，设计多个RNAi靶点序列，选择最优靶点构建目的载体。除了针对目的基因的靶点序列外，也使用一些无义序列作为RNAi阴性对照。

1.2.载体酶切：酶切骨架载体(AAV-U6-shRNA-CAG-EGFP，北京合生基因科技有限公司)，对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带：

酶切体系:

1.3.目的序列合成及退火：根据目的序列及骨架载体序列，设计引物序列；先合成单链引物序列，然后退火成双链DNA。

反应程序为:95℃3min，95℃到25℃缓慢冷却，例如-1℃/30s。

1.4.退火产物与载体进行连接

1.5.转化涂板：连接后产物5-10μL转化至100μL感受态，42℃金属浴，热激1min,冰上迅速预冷2min，在超净工作台中，加入600μL无抗培养基，37℃摇床振荡培养1h，取适量菌液涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。

1.6.阳性克隆摇菌及质粒提取；挑选3-4个单菌落摇菌，加入相应抗性培养基摇菌过夜(8mL LB液体培养基)，然后参照质粒抽提试剂盒进行质粒抽提。

1.7.质粒质控(目的基因测序)：完成干扰腺相关病毒质粒构建后，针对目的基因序列测序，并比对鉴定(图2)，以获得构建正确的质粒。

2.实验小鼠随机分为4组，每组12只小鼠；

1)Rip3 shRNA组：予pAAV8-Rip3 shRNA预干预+橄榄油；

2)Control shRNA组：予pAAV8-control shRNA(control shRNA：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3’，SEQ ID No.3)预干预+橄榄油；

3)四氯化碳组：予pAAV8-control shRNA预干预+四氯化碳；

4)Rip3 shRNA+四氯化碳组：予pAAV8-Rip3 shRNA预干预+四氯化碳。

3.实验过程

1)进行的是pAAV8-Rip3 shRNA和pAAV8-control shRNA的转导，具体步骤如下：

通过静脉可视小鼠尾静脉注射固定器固定小鼠，充分固定并暴露尾静脉，选择尾巴的外侧为常规静脉注射部位，应避开腹侧动脉；注射时斜面向上并倾斜45°进针，尽可能由小鼠尾部远端致近端。

75％的酒精消毒尾部静脉注射部位(用热纱布敷局部静脉显露效果更佳)，予尾静脉注射的pAAV8-Rip3 shRNA(1×10

2)在pAAV8-Rip3 shRNA和pAAV8-control shRNA转导6周后，小鼠四氯化碳组分别予以腹腔注射四氯化碳(1mL/kg)，对照组小鼠分别腹腔注橄榄油(0.05mL/10g)，分别干预24h。

3)小鼠注射橄榄油或四氯化碳溶液干涉结束后，通过在4L安乐死盒中吸入CO

4实验结果

1)每只实验小鼠取血1～1.5mL，采用速率法测定血清ALT水平，采用重氮试剂法测定血清TBil水平。测定结果如图3～图4所示。

由图3和图4可知，予Rip3 shRNA预干预6周，随后予CCl

结果表明，靶向敲减Rip3基因会降低小鼠血清ALT水平和TBil水平并减轻肝损伤，由此可知，肝内RIP3降低有利于减轻肝损伤。

2)断颈处死小鼠，充分暴露、解剖，取肝脏组织0.5cm×0.5cm做病理切片HE染色。借助CaseViewer2.2软件，可1-400倍任意倍数放大后进行观察。选取切片的目的区域进行100倍成像，成像时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致，行坏死面积测量，结果如图5和图6所示。

由图6可知，Rip3 shRNA+CCL

结果表明，靶向敲减Rip3基因组肝细胞坏死显著减轻，提示RIP3敲减后可以改善小鼠肝损伤，对小鼠肝细胞有保护作用。

3)并在肝右叶取出肝组织50mg放入5mL加有50μLPMSF液的免疫沉淀测定裂解缓冲液中进行匀浆，接着用细胞超声破碎仪在4℃下进一步破碎组织至澄清。然后4℃通过12000rpm离心5min，取上清液加入1/5体积的上样缓冲液(5×)充分混合，在100℃的沸水中煮10min，待其冷却后放入-20℃冰箱备用。通过免疫印迹法(westernblot，WB)检测小鼠肝脏RIP3、P-RIP3、P-MLK、CHOP、casepase-12的表达，结果如图7、图8。

由图7可知，Rip3 shRNA预干预小鼠6周，随后予CCl

由图8可知，Rip3 shRNA预干预小鼠6周，随后予CCl

图7和图8表明，Rip3基因敲减可以减轻CCL

由以上实施例可知，通过Rip3基因敲减能减轻CCL

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 遵义医科大学附属医院

<120> 一种靶向敲减Rip3基因表达的shRNA、重组载体及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

ggacccagag ctgttatttg a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

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