一种基于降落PCR法的实验动物绿脓杆菌快速检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种基于降落(Touch Down)PCR 法的实验动物绿脓杆菌快速检测方法及试剂盒。

背景技术

实验动物是生命科学、医学创新研究的重要组成部分，对保障人类健康、食品安全、生物安全等具有重要意义，实验动物已被广泛应用于生命健康相关的各种科研实验中，如产品质量检定、环境检测等。当前随着科学技术的发展，对实验动物质量提出越来越高的要求，其质量已成为制约性要素，直接影响科研数据的准确性和结论的可靠性，同时也会影响实验人员的健康。实验动物质量控制主要包括：遗传学质量控制、微生物学和寄生虫学质量控制、营养学质量控制、环境生态学质量控制和病理学质量控制等。其中微生物学的质量控制在国内实验动物生产和使用中出现问题状况最为突出。

定期对实验动物进行微生物学检测能最大程度掌握动物健康状况，为实验动物微生物学质量控制提供重要的决策依据。现有的常规细菌检测需要采样、培养、染色、生化反应等多个实验步骤，操作繁琐，检测周期较长且灵敏度低，检测试剂使用有效期短，对检测人员技术水平要求较高，受培养条件限制等问题。

当前，现有的PCR方法检测样本DNA提取步骤繁琐，检测周期长，灵敏度和特异性低。绿脓杆菌在动物肠道繁殖，实验动物检测采集的动物粪便样本构成复杂，普通PCR灵敏度和特异性明显不够。Touch Down PCR作为已知技术虽然已经应用于其他微生物检测，但是目前尚未有文献报道该技术应用于实验动物绿脓杆菌检测。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于Touch Down PCR法的实验动物绿脓杆菌快速检测方法及试剂盒，该方法操作简单，检测周期短，灵敏度高，特异性强。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种基于Touch Down PCR法的实验动物绿脓杆菌快速检测方法，针对绿脓杆菌ETA基因设计合成特异性引物，将待测实验动物的粪便或盲肠内容物使用TE缓冲液混匀，然后煮沸，完成DNA样本制备；

采用Touch Down PCR法对制得的DNA样本进行绿脓杆菌检测，其中：

Touch Down PCR法中PCR退火温度从70℃开始每个循环降低0.5℃进行20 个循环直至达到60℃的退火温度，然后以该退火温度再进行20个循环。

优选地，以绿脓杆菌ETA基因设计合成的特异性引物，包括：

上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，DNA样本制备(PCR模板)制备时间为10min。

优选地，绿脓杆菌的检测下限为3.35×10

本发明还公开了一种快速检测实验动物绿脓杆菌的试剂盒，所述试剂盒中的反应体系为20μL，包括：

2μL 10×T5 Super PCR Mix；

1μL 上游引物；

1μL 下游引物；

1μL DNA样本；

余量 去离子水。

优选地，所述上游引物和下游引物是以绿脓杆菌ETA基因设计合成的特异性引物；其中：

上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述DNA样本是将待测实验动物的粪便或盲肠内容物使用TE缓冲液混匀，然后煮沸制得。

优选地，PCR模板制备时间为10min。

优选地，该试剂盒的PCR条件为：退火温度从70℃开始每个循环降低0.5℃进行20个循环直至达到60℃的退火温度，然后以该退火温度再进行20个循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明建立的检测方法是针对绿脓杆菌ETA基因设计合成特异性引物，利用TouchDown PCR方法检测实验动物绿脓杆菌感染情况。该方法对比国标分离培养、生化鉴定检测方法其检测周期大大缩短，并且操作简单，灵敏度和准确度高。相较于中国实验动物学会团体标准使用试剂盒提取样本DNA进行普通PCR，该方法可以大批量进行样本处理，缩减检测周期和工作量，同时提高了检测灵敏度和特异性。

附图说明

图1为标准菌株用梯度PCR探索最佳退火温度的条带结果；

图2为TE煮沸制备样本梯度PCR扩增结果；

图3为Touch Down PCR联合TE煮沸检测的结果；

图4为标准菌按照梯度稀释后与粪便混合，Touch Down PCR扩增获得检测下限；

图5为Touch Down PCR扩增获得的检测下限细菌涂板计数结果；

图6为Touch Down PCR方法检测送样动物粪便的条带结果；

图7为检出的阳性菌在NAC平板培养照片；

图8为NAC平板培养的菌革兰氏染色结果；

图9为NAC平板培养菌氧化酶结果阳性。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

1.特异性引物合成

根据GenBank中公布绿脓杆菌ETA基因设计合成特异性引物(表1)。

表1：绿脓杆菌ETA基因引物序列

2.梯度PCR验证引物特异性

实验室已有绿脓杆菌标准株，按照商品化试剂盒(天根生化科技北京有限公司，LoT#P4323)说明书提取绿脓杆菌基因组。

商品化试剂盒说明书的操作步骤如下：

使用前请现在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，缓冲液GFA中加入异丙醇，加入体积请参照瓶上的标签。具体步骤如下：

1)称取粪便样本180～220mg至2ml离心管中，并将管子置于冰上。

注意：如果是液体样本则转移200μL至离心管中。

2)向样本中加入500μL缓冲液SA，100μL缓冲液SC，15μL Proteinase K， 0.25g的研磨珠，间歇震荡1min至样本充分混匀或使用TGrinder H24组织研磨均质仪(OSE-TH-01)混匀(6M/S的速度振荡30s，间隔30s，共2个循环)。

3)70℃孵育15min，孵育期间振荡2-3次。

注意：对于较难破壁的革兰氏阳性菌，可将温度提高至95℃以促进裂解。

4)涡旋15sec，12000rpm(～13400xg)离心3min，转移上清液至新的离心管中，加入10μL的RNase A，振荡混匀后室温放置5min。

5)加入200μL缓冲液SH，振荡均匀，置冰上5min。

6)12000rpm(～13400xg)离心3min。

7)将上一步所得上清液转移至新的1.5ml离心管，加入等体积的缓冲液GFA (使用前先检查是否已加入异丙醇)。

8)将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)， 12000rpm(～13400xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。

9)向吸附柱CR2中加入500μL缓冲液GD(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。

10)向吸附柱CR2中加入700μL漂洗液PW(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(～13400xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。

11)重复操作步骤10)。

12)将吸附柱CR2放回收集管中，12000rpm(～13400xg)离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR2置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。

13)将吸附柱CR2转移入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12000rpm(～13400xg)离心2min，将溶液收集到离心管中。

注意：为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CR2 中，室温放置2min，12000rpm(～13400xg)离心2min。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH 值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

将提取的细菌DNA作为模板，进行退火温度从60℃到50℃的梯度PCR。反应体系为20μL，内含2μL 10×T5 Super PCR Mix(Colony)，上下游引物(10μmol/L) 各1μL，DNA模板1μL，去离子水补足到20μL进行PCR扩增。确定退火温度为 60℃，该温度特异性高，扩增效率理想(图2)。

3.模拟实验动物感染制备样本同时探索快速制样方法

为了建立大批量实验动物快速检测方法，缩短样本处理时间势在必行。将绿脓杆菌标准株和实验动物盲肠内容物充分混匀，模拟实验动物体内感染情况。尝试500μL TE重悬样本煮沸10min，3000rpm离心10min取上清作为模板进行退火温度为60℃的PCR扩增。反应体系为20μL，内含2μL 10×T5 Super PCR Mix (Colony)，上下游引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板1μL，去离子水补足到 20μL进行PCR扩增。受盲肠内容物构成复杂和模板制备方法改变，PCR条带不清晰，出现杂带，影响结果判定(图3)。

4.Touch Down PCR联合TE煮沸制备模板检测绿脓杆菌

受盲肠内容物构成复杂和模板制备方法改变，PCR条带不清晰，出现杂带，我们对PCR条件进行优化。反应体系为20μL，内含2μL 10×T5 Super PCR Mix (Colony)，上下游引物(10μmol/L)各1μL，TE煮沸制备DNA模板1μL，去离子水补足到20μL。Touch Down PCR退火温度从70℃开始每个循环降低0.5℃进行20个循环，直至达到60℃退火温度，然后以此退火温度进行20个循环。解决了PCR条带不清晰，出现杂带问题(图4)。

5.绿脓杆菌检测下限确定

将绿脓杆菌标准株梯度稀释后与动物盲肠内容物混匀，500μL TE重悬样本煮沸10min，3000rpm离心10min取上清作为模板进行Touch Down PCR。反应体系为20μL，内含2μL10×T5 Super PCR Mix(Colony)，上下游引物(10μmol/L) 各1μL，TE煮沸制备DNA模板1μL，去离子水补足到20μL进行梯度PCR(图 5)。将检测下限对应的标准株涂平板进行菌落计数(图6)，确定检测下限为3.35 ×10

6.检测方法和国标比对

应用新建立的Touch Down PCR方法对实验动物进行大规模筛查，拟筛查绿脓杆菌感染阳性鼠。对筛查出的1例阳性鼠(图7)盲肠内容物在NAC液体培养基37℃培养24h进行分离筛选，未产生绿色色素。按照国标要求将菌株转接至 NAC琼脂平皿，37℃培养24h，在NAC琼脂平皿产生扁平，边缘不齐呈锯齿状 2-3mm菌落，同时产生绿色色素(图8)。菌株转接至血平板37℃培养24h后，进行革兰氏染色和氧化酶试验。结果显示该菌株呈现革兰氏阴性，菌体呈杆状长短不一(图9)，氧化酶阳性。按照国标GB/T 14926.17—2001，革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性同时产生绿色色素，确认该样本为革兰氏阳性，与本发明建立的Touch DownPCR检测结果一致。

综上所述，本发明针对绿脓杆菌ETA基因设计合成特异性引物，通过TE煮沸样本联合Touch Down PCR建立实验动物绿脓杆菌快速检测方法。该方法是将实验动物盲肠内容物或者粪便用TE缓冲液混匀煮沸10min快速制备DNA模板，采用Touch Down PCR检测实验动物体内绿脓杆菌。TE缓冲液是弱碱性，对DNA 的碱基有保护性，DNA在TE中的稳定性较好，不易破坏其完整性，不易产生开环及断裂。TE煮沸制备DNA模板方法简单、快速，可同时大批量制备DNA模板。Touch Down PCR每个循环降低0.5/1℃，直至达到“Touch Down”退火温度，然后以此退火温度进行10-20个循环。温度的升高提高了PCR扩增的特异性，因此先用高温扩增，保证扩增的严谨性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率，此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点竞争。解决了PCR条带不清晰，出现杂带的问题。该方法灵敏度高，特异性强。

该方法与国标分离鉴定生化培养方法相比，从72h的检测周期缩短至3h以内，操作简单，灵敏度高，特异性强。与中国实验动物学会团体标准比较，省去繁琐试剂盒提取DNA，大大缩减工作量，同时提高检测特异性和灵敏度。TE煮沸联合Touch Down PCR灵敏度高，样本含有3.35×10

序列表

<110> 中国人民解放军空军军医大学

<120> 一种基于降落PCR法的实验动物绿脓杆菌快速检测方法及试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacaacgccc tcagcatcac cagc 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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