一种基于数字微流控技术的自动化噬菌体淘选平台

技术领域

本发明涉及基于噬菌体展示的自动化淘选平台和淘选实施方案，属于数字微流控技术领域。

背景技术

分子识别是生理和病理活动的分子基础，大部分复杂的生理病理活动都依赖于分子识别。噬菌体展示技术是研究分子识别的有效方法之一。噬菌体展示技术通过基因工程将外源基因插入到噬菌体基因组中，使外源肽或抗体融合表达在噬菌体表面(Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,14428-14437)。噬菌体表面的其展示肽或抗体可以直接针对不同靶标进行亲和筛选，其展示肽或抗体的序列可以很容易地通过噬菌体基因测序获取。到目前为止，已通过噬菌体展示技术鉴定了大量亲和配体，其靶标范围广泛，包括小分子、DNA、蛋白质、细胞、细菌、组织切片，甚至纳米材料等，广泛应用于生物传感、疫苗开发、体外和体内成像、靶向递送和治疗等领域(Biotechnol.J.2016,11,732-745)。

为了获得亲和配体，噬菌体展示技术一般通过亲和筛选方法(也称生物淘选)逐轮富集相应噬菌体，它包括多轮反筛、正筛、洗涤、洗脱和扩增的循环过程。然而，多轮生物淘选带来了重复性高、耗时长、操作劳动密集、试剂消耗大等问题，限制了新型配体的开发进程。

因此，需要开发一种适合配体开发的技术。

发明内容

本发明依托数字微流控技术，针对传统噬菌体展示技术亲和筛选中的重复性高、耗时长、操作劳动密集、试剂消耗大等问题，提出一种自动化噬菌体淘选平台，具有自动化、集成化、解放劳动力、试剂消耗少等优势。

本发明的技术方案之一为：

一种基于数字微流控技术的自动化噬菌体淘选平台，其特征在于：包括数字微流控芯片，所述的数字微流控芯片包括驱动电极阵列、过渡电极、洗涤液储液槽、培养基储液槽和洗涤液储液槽、正筛磁珠储液槽、中和液储液槽和反筛磁珠储液槽，以及包括用于控制驱动电极阵列、各储液槽、各过渡电极通断电的辅助电极；所述的过渡电极包括第一过渡电极和第二过渡电极，各储液槽分别通过第一过渡电极和至少一第二过渡电极和所述的驱动电极阵列连接，并通过第一过渡电极、第二过渡电极和驱动电极的断电和通电从各储液槽产生液滴至驱动电极阵列；

还包括用于控制驱动电极阵列中的磁珠的磁铁，驱动电极阵列中任意三个连接的驱动电极通过通电和断电以及磁铁的配合产生包含磁珠的小液滴和不包含磁珠的液滴；

以及包括用于加热微流控芯片的电加热片。

优选地，本发明所述的数字微流控芯片包括上、下级板两部分，采用四层双面胶间隔，通过夹具固定，与控制系统连接使用。上级板是Teflon AF1600疏水化的导电氧化铟锡(ITO)玻璃。下极板以石英玻璃为基底，于其上溅射约300nm的铬导电层，光刻约11.7μm的SU-8 1040介质层、最后涂覆约200nm的Teflon AF 1600疏水层。

优选地，集成电路为数字微流控电路控制系统。软件操纵经由数模转化单元传递给电路板，再经过正弦波发生器、功率放大器和高压交流开关矩阵处理后，通过PCB板弹簧顶针将信号传递至芯片接触电极。

优选地，磁铁为圆锥体状的磁铁。

优选地，驱动电极阵列包括27个驱动电极，每个面积4mm×4mm；各储液槽为接触电极，每个接触电极面积6mm×8mm。每个第一过渡电极面积3mm×2mm),每个过渡电极面积2mm×2mm。

优选地，驱动电极间隔为40μm。

优选地，驱动电极阵列中的电极引线为蛇形，走线设计为线中线方式，电极引线宽度为60μm。

优选地，培养基储液槽、洗涤液储液槽和酸洗液储液槽，各储液槽分别通过一第一过渡电极和第二过渡电极和所述的驱动电极阵列连接以分别生成大液滴；正筛磁珠储液槽、中和液储液槽和反筛磁珠储液槽，各储液槽分别通过第一过渡电极和两个第二过渡电极和所述的驱动电极阵列连接以分别生成小液滴。优选地，所述的大液滴为8μL，所述的小液滴为2μL。

优选地，以2×2的四个驱动电极为一个液滴孵育单位，通过不间断的液滴环形运动操纵15～17μL液滴的孵育。

优选地，所述芯片可实现三个上述液滴孵育单位的同时运行。

优选地，驱动电极阵列中的任意三个串联的驱动电极和磁铁组成一磁分离模块，利用各驱动电极选择性通电/断电策略，实现液滴的不均匀分裂，使大部分磁珠滞留在小液滴中，实现高磁珠保留率、高洗涤效率的磁分离。

优选地，本发明的磁分离过程如下所述：将圆锥体磁铁放置在芯片上方，使磁铁边缘与电极边缘、液滴边缘相切。来回拖动磁珠液滴，使得液滴中各处的磁珠被吸引到E2和E3交界处的液滴边缘。随后按顺序开启E2和E1，保证磁珠仍在液滴边缘。开启E3，并迅速关闭E2，液滴分裂后得到两个不均一的液滴，在E3上留下一个包含磁珠的小液滴，在E1上留下一个大的上清液滴，实现高效磁分离。其中E2驱动电极为位于中间的驱动电极。

优选地，采用磁珠修饰靶标蛋白与反筛蛋白，从而实现集成化的筛选流程。

优选地，采用0.2M甘氨酸-盐酸,1mg/mL BSA,pH 2.2作为酸洗液，上述四电极循环孵育10min作为洗脱条件。

优选地，采用0.1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸,pH 9.0作为中和液，洗脱与中和液体积为5:1或4:1，可较完全地中和洗脱体系。

优选地，筛选参数可灵活调整。随着选择轮数的增加，正筛蛋白投入量和孵育时间逐渐减少，洗涤次数、反筛蛋白投入量和孵育时间逐渐增加。

本发明还提供了如前所述的自动化生物淘选应用，其运用于筛选亲和多肽或亲和抗体。包括如下步骤：

步骤A：将稀释好的噬菌体文库导入微流控芯片的驱动电极阵列；

步骤B：将各试剂分别负载于数字微流控芯片的各储液槽内；

步骤C：按一定次序进行电极的通断电控制，反筛磁珠储液槽生成反筛磁珠液滴；噬菌体文库与反筛磁珠孵育，孵育后，磁分离去除磁珠，保留未结合的噬菌体液滴；

步骤D：正筛磁珠储液槽生成正筛磁珠液滴。将剩余的噬菌体液滴与正筛磁珠孵育。孵育后，磁分离保留磁珠。

步骤E：洗涤液储液槽生成洗涤液液滴。与磁珠彻底混合后，磁分离保留磁珠，去除清洗液。此为一次洗涤。

步骤F：按步骤E所述洗涤方法，洗涤多次，最后一次保留磁珠，去除洗涤液。

步骤G：酸洗液储液槽生成酸洗液液滴。将磁珠重悬于酸洗液中，孵育10min。随后，快速磁分离并去除磁珠，保留上清液。

步骤H：中和液储液槽生成中和液液滴。将上清液与中和缓冲液迅速混合。

步骤I：培养基储液槽生成培养基液滴。将液滴与培养基混合，培养5小时。

重复步骤B-步骤I完成第二轮筛选，重复步骤B-步骤H完成第三轮筛选。

优选地，随着选择轮数的增加，阳性孵育时间逐渐减少，洗涤次数逐渐；阴性孵育时间逐渐增加。

本发明与现有技术相比，其优势在于：

(1)依托数字微流控技术，本发明可以实现对液体更加精确的时空控制，自动化和集成化的流程取代了传统方法的繁琐人工操作，解放劳动力，可拓展到多靶标并行筛选。

(2)依托数字微流控技术，本发明可在16小时内自动化地完成3轮生物淘选，而传统方法需要近一周的手动操作。

(3)由于数字微流控可精确操纵小体积液体，本发明的试剂消耗量仅为传统方法的3％，节约成本。

(4)本发明中集成的磁分离部件磁珠保留率高，从而保留大部分结合序列，保证自动化筛选成功率。

附图说明

图1为本发明数字微流控芯片剖面结构示意图

图2为本发明芯片的整体结构俯视图。

图3为本发明芯片的电极边缘引线放大图(对应图2中A处)。

图4为本发明芯片的液滴生成单元局部图。

图5为本发明磁分离模块工作时的液滴分裂图。

图6为本发明的温控模块工作示意图。

图7为本发明磁分离部件的洗涤效率。

图8为本发明磁分离部件的磁珠保留率。

图9本发明实施实例的筛选结果图。

附图标记

1玻璃基底 2 ITO 3疏水层 4四层双面胶 5疏水层 6介质层 7电极层 8玻璃基底9辅助电极 10培养基储液槽 11洗涤液储液槽12酸洗液储液槽 13正筛磁珠储液槽 14中和液储液槽 15反筛磁珠储液槽 16储液槽 17第一过渡电极 18第二过渡电极 19驱动电极20通电电极 21圆锥状磁铁 22磁珠 23上极板 24下极板 25电加热片

具体实施方式

下面结合附图以自动化多肽淘选平台为例，对本发明进行进一步细致描述。

该自动化淘选平台由四部分构成，包括数字微流控芯片、集成电路、磁分离模块和温控模块。参见图1和图2，数字微流控芯片从上到下依次包括玻璃基底1、ITO(氧化铟锡)层2、疏水层3、间隔层(四层双面胶)4、疏水层5、介质层6、电极层7和玻璃基底8。

其中，参见图2，电极层7包括位于中间的27个驱动电极19组成的驱动电极阵列，这27个驱动电极19上下三排排列，每排9个。在该阵列的上方，从左至右依次间隔设有洗涤液储液槽11、培养基储液槽10和酸洗液储液槽12。在该阵列的下方，从左至右依次间隔设有正筛磁珠储液槽13、中和液储液槽14和反筛磁珠储液槽15。在本实施例中，各储液槽(10-15)实际上为电极。通过挪动上极板，露出部分接触电极，直接将液体滴在接触电极上，通电后因为接触角变化液体能停留在电极上而作为储液槽使用。

同时参见图4Ⅰ，每个上排的接触电极16(代表培养基储液槽10、洗涤液储液槽11、洗涤液储液槽12)向下设有第一过渡电极17，过渡电极17向下通过第二过渡电极18连接到驱动电极阵列，洗涤液储液槽11、培养基储液槽10、酸洗液储液槽12连接的位置依次为阵列上排最左侧、中间位置和最右侧的驱动电极19。

同时参见图4Ⅱ，每个下排的接触电极16(代表正筛磁珠储液槽13、中和液储液槽14、反筛磁珠储液槽15)向上设有第一过渡电极17，第一过渡电极17向上通过上下串联的两个第二过渡电极18连接到驱动电极阵列。正筛磁珠储液槽13、中和液储液槽14、反筛磁珠储液槽15连接的位置依次为阵列下排最左侧、中间位置和最右侧的驱动电极19。

驱动电极19设有27个，每排九个，排成三排，足以执行正筛、反筛、洗涤、洗脱和培养等复杂液滴操纵。

辅助电极整列位于洗涤液储液槽11、培养基储液槽10和酸洗液储液槽12的上方，辅助电极整列包括48个辅助电极9，分为3排，每排16个，各储液槽(10至15)、各第一过渡电极17，各第二过渡电极18和各驱动电极19分别由一辅助电极通过导电线路控制。

执行液滴处理时，各储液槽(10至15)和过渡电极(第一过渡电极17和第二过渡电极18)只作为液滴生成单元使用，其余的液滴操纵，包括正筛、反筛、洗涤和洗脱的液滴混合、磁分离等均在驱动电极阵列的27个驱动电极19上完成。

参见附图3，电极的线路设计采用蛇形引线L1和线中线L2走线方式。所有电极边缘均采取蛇形引线L1，这样能够增加液滴移动的流畅性。而被电极包围的电极上采用线中线L2，使得没有露出来的电极也能接上引线。

参见附图4，每个驱动电极19面积为4mm×4mm,每个第一过渡电极面积为3mm×2mm,第二过渡电极18面积为2mm×2mm，每个储液池16面积为6mm×8mm。采用选择性通电/断电策略，通过一套液滴生成单位，可以生成2μL/单元和8μL/单元的两种液滴。以附图4Ⅱ为例，生成2μL液滴的通断电策略分为两步：首先，通电电极16、17和下方的18，上方的18断电，使液滴位于电极16、17和下方的18；其次，保持电极16和下方的18通电，断电电极17，并迅速通电上方的18和电极19，使得液滴在电极17处断裂，保留电极18上的小液滴，体积约2μL。生成8μL液滴的通断电策略分为两步：首先，通电电极17、两个18和19，使液滴位于电极17、两个18和19；其次，保持19通电，迅速通电电极16并断电电极17和两个18，使得液滴在电极17、18处断裂，保留电极19上的大液滴，体积约8μL。

图4Ⅰ则主要用于生成8μL的液滴。首先，通电电极16、17、18和19，其次，保持电极16和19通电，断电电极17和18，使得液滴在电极17、18处断裂，保留电极19上的大液滴，体积约8μL。

参见附图5，磁分离部件包括依次连接的E1、E2和E3三个电极，E1、E2、E3可以为驱动电极阵列中任意三个连接的驱动电极19。工作流程如下所述：将圆锥体磁铁21放置在芯片上方，液滴位于E1和E2上，液滴内混合有磁珠22，使磁铁边缘与电极E2-E3相邻边缘、液滴边缘相切。来回拖动磁珠液滴，使得液滴中各处的磁珠被吸引到液滴边缘。随后按顺序开启E2和E1，保证磁珠仍在液滴边缘。开启E3，并迅速关闭E2，液滴分裂后得到两个不均一的液滴，在E3上留下一个包含磁珠的小液滴，在E1上留下一个大的上清液滴。

参见附图6，温控模块包括上极板23、下极板24和位于下极板下方的电加热片25。其中，上极板23包括玻璃基底1、ITO(氧化铟锡)层2和疏水层3，下极板24包括疏水层5、介质层6、电极层7和玻璃基底8。上、下极板，采用四层双面胶4间隔，通过夹具固定，与控制系统连接使用。温控模块的工作流程如下所述：将控温的电加热片25紧贴芯片的下极板24下方，用电热偶进行测温校准，通过温度控制器调整所需温度。

作为本发明的优选实施方式，本发明用于靶向肝配蛋白A型受体2(EphA2)自动化多肽淘选的具体工作过程为：

1)正、反筛磁珠分别采用EphA2、HSA修饰的甲苯磺酰基磁珠。采用0.1％w/vTween-20和0.5％w/v Tween 20的Tris缓冲液作为洗涤液。

噬菌体文库采用洗涤液十倍稀释的10μL phD12噬菌体文库，总体积100μL。

2)稀释好的噬菌体文库先导入芯片的驱动电极阵列，噬菌体文库可以先通过任一储液槽加入。所有的试剂都被装入相应的储液槽。参见图2和图4Ⅱ，通过培养基储液槽10、洗涤液储液槽11和酸洗液储液槽12分别可以生成培养基液滴、洗涤液液滴和酸洗液液滴，每种液滴8μL。参见图2和图4Ⅰ，通过正筛磁珠储液槽13、中和液储液槽14、反筛磁珠储液槽15分别可以生成正筛磁珠液滴、中和液液滴和反筛磁珠液滴，每种液滴2μL。

3)反筛磁珠储液槽15生成2μL反筛磁珠液滴。并和噬菌体文库混合。噬菌体文库与反筛磁珠孵育20min，孵育后，磁分离去除磁珠，弃去磁珠，保留未结合的噬菌体液滴。

4)正筛磁珠储液槽13生成2μL正筛磁珠液滴。将剩余的噬菌体液滴与2μL正筛磁珠孵育60min。孵育后，磁分离保留磁珠，磁珠停留在原驱动电极19孵育处。磁分离见图5。

5)洗涤液储液槽11生成16μL洗涤液液滴，在驱动电极19上与磁珠彻底混合后，磁分离保留磁珠，去除洗涤液。此为一次洗涤。

6)共洗涤6-8次，最后一次保留磁珠，去除洗涤液。

7)酸洗液储液槽12生成8μL酸洗液液滴。将磁珠重悬于酸洗液中，孵育10min。随后，快速磁分离并去除磁珠，保留上清液。

8)中和液储液槽14生成2μL中和液液滴。将上清液与2μL中和缓冲液迅速混合。

9)培养基储液槽10生成20μL培养基液滴。将液滴与培养基混合，培养5小时。

10)重复步骤2)-8)完成第二轮筛选，重复步骤2)-步骤7)完成第三轮筛选。随着选择轮数的增加，阳性孵育时间从60分钟减少到30分钟，洗涤时间从6次逐渐增加到8次。阴性孵育时间从20分钟逐渐增加到30分钟。

如附图7-8所示，采用本发明的磁分离方式，经过三次洗涤后，可去除99％的非特异吸附，与芯片外的传统洗涤方式效率相当。经过八次洗涤后，本发明的磁珠保留率约为91.8％，与芯片外的传统磁分离方式(95.2％)磁珠保留率相当。

如附图9所示，采用本发明的自动化噬菌体淘选平台获得了EphA2富集文库，对其中任意30个单克隆进行表征，所有的单克隆均对EphA2表现出了较高的亲和力，说明了本平台成功富集到了EphA2结合序列。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明白，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换、具体方式的选择等，均属于本发明的保护范围和公开范围之内。